一種無菌松材線蟲的培養方法

2023-10-05 02:17:49 2

專利名稱：一種無菌松材線蟲的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種無菌松材線蟲的培養方法。
背景技術：
松材線蟲病(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner Buhrer)Nickle)是松樹上的一種毀滅性病害，主要由松墨天牛(Monochamus alternatusHope)傳播，可為害黑松(Pinus thunbergii)、赤松(P.densiflora)、溼地松(Pelliottii)、馬尾松(P.massoniana)等近40種松樹。松材線蟲病使得松樹植株大量死亡，流行成災，它已給我國的林業生產造成了嚴重的威脅。
雖然早在20世紀初就有關於松材線蟲病的記載，但直到進入70年代才開始對該病害進行較為深入的研究，並取得了一些成果。然而，對松材線蟲引起松樹枯萎的機理至今尚無為大多數人所接受的解釋，尤其對松材線蟲攜帶的細菌在松材線蟲病中的作用更是看法不一。在我國，趙博光教授對松材線蟲病的致病機理作了比較系統的研究，提出松材線蟲病是由松材線蟲和其攜帶的致病細菌共同侵染引起的複合侵染性病害，而且確定了致病細菌是松樹線蟲病的主要致萎因素。目前，對松材線蟲攜帶細菌產生的毒素的研究在國內外均有較多報導，但真正關於毒素的分離純化的研究則相對較少。
植物線蟲雖然和昆蟲同屬動物，但它在侵染、危害和研究方法上更近於真菌、細菌等其它植物病原物，所以習慣上把植物線蟲病害的研究包含於植物病理學範圍之內。
根據植物病理學的經典法則-柯赫氏法則，要對由病原物引起的植物病害進行研究時，獲得病原物的純培養是整個研究的關鍵。因此，要對植物線蟲病害進行研究，首先就要獲得大量的線蟲。獲得大量足夠的松材線蟲純培養，無論是對松材線蟲本身生物化學、生理學或是對松材線蟲與其攜帶的致病細菌關係以及其攜帶的致病細菌的致萎毒素的研究，是至關重要的。
線蟲大量培養的方法主要有三種，即單生物培養、多生物培養和純培養。
目前對松材線蟲病進行人工培養的方法多是單異活體培養，即單生物培養，其方法主要有兩種，一種是以真菌為食料培養(Mamiya，1975 Behavior ofBursaphelenchus lignicolus in the wood of pine seedlings andpathological responses of pine to nematode infection.Trans.86th.Mty.Jpn.For.Soc.，285-286；清原友也，1970マツ材線蟲の侵入と繁殖.81回日林講，255-256)，另一種則利用植物組織培養技術培養松樹愈傷組織，然後以松樹愈傷組織為食料培養(Tamura H.Mamiya Y.1979 Reproductipn ofBursaphelenchus lignicolus on pine callus.Nematologica.25149-151)。
引起松材線蟲病的松材線蟲屬於散滑刃屬線蟲(Bursaphelenchus)，能夠以多種真菌為食，易於在多種真菌培養基上培養繁殖(Dozono et al.，1974；Kobayashi et al.，1974，1975；Kondo et al.，1978)。因此，以真菌為食料的單異活體培養法，是培養松材線蟲最主要的方法。自從清原友也(清原友也.(1970)マツ材線蟲の侵入と繁殖.81回日林講，255-256)開始用絲狀真菌培養松材線蟲用於接種實驗以來，研究用松材線蟲基本上都採用PDA平面培養基上生長的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)為食料真菌來培養繁殖。在25℃溫度下，約4-5天松材線蟲可完成一代(Mamiya Y.(1975)Behavior ofBursaphelenchus lignicolus in the wood of pine seedlings andpathological responses of pine to nematode infection.Trans.86th.Mty.Jpn.For.Soc.，285-286)。關於松材線蟲單異活體培養的研究大都以此為基礎，進行方法的改進曹越，沈伯葵(曹越，沈伯葵.(1996)人工培養條件下松材線蟲提取物的毒性研究.南京林業大學學報，20(4)13-16)分別以灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和松梢枯病菌(Sphaeropsis sapinea)為食料真菌，以PDA-真菌、玉米粒-真菌為培養基，培養松材線蟲，結果表明無論食料真菌是灰葡萄孢(Botrytis cinerea)還是松梢枯病菌(Sphaeropsissapinea)，玉米粒-真菌培養基都要比常規的平面的PDA-真菌培養基上的線蟲產量都要高。Yasuharu Mamiya(Yasuharu Mamiya.(1990)Effects of FattyAcids Added to Media on the Population Growth of Bursaphelenchusxylophilus(NematodaAphelenchoididae).Appl.Ent.Zool.，25(2)299-309)將油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸加入用於培養松材線蟲的真菌培養基中，發現油酸能提高松材線蟲的產卵量。曾永三(曾永三.馮志新.(1996)松材線蟲的人工培養研究.促愷農業技術學院學報，9(1)44-49)等以純的松木屑或松木屑-PDA培養線蟲，並對松木屑進行三種不同的處理，即不經消毒、表面消毒、和完全消毒，結果發現線蟲在無菌的培養基上線蟲完全不能繁殖，在有菌培養基上能繁殖，而且繁殖線蟲的效果與真菌的數量成正相關；在用不同的食料真菌培養線蟲時，發現長喙殼菌(Ceratocystis sp)、毛殼菌(Chaetomium sp)和鐮刀菌(Fusarium sp)的培養效果要明顯優於常用的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和盤多毛孢菌(Pestalotia sp)。
目前，關於松材線蟲的無異培養的報導並不多。在國外，由Bolla及其同事於1982年提出了一種利用培養無菌松材線蟲的方法(Bolla RI，JordanW.(1982b)Cultivation of the pine wilt nematode，Bursaphelenchusxylophilus，in axenic culture media.J.Nematol.，14(3)377-381)，該方法是用SP/YE補充培養基(SP/YE supplemented medium)和改進的新小杆線蟲屬培養基(modified Caenorhabditi medium)對松材線蟲進行培養。Bolla等發現，線蟲種群數量增長一倍所需時間，前者為後者的1/2；線蟲所能達到的最大種群數量，前者比後者大1.5-2倍。以此研究結果為基礎，曹越(曹越，沈伯葵。(1996)人工培養條件下松材線蟲提取物的毒性研究。南京林業大學學報，20(4)13-16)在對松材線蟲進行無異培養時，採用了SP/YE補充培養基，也取得了較好的培養效果。然而無論是Bolla(1982b)或是曹越(1996)的研究都顯示，在培養中出現線蟲種群達到最大值後開始下降的現象。這與在自然感病的松樹死亡前後，也出現類似的松材線蟲種群規模開始減小的現象一致(Kondo E，Ishibashi N.(1978)Ultractructural differences betweenthe propagative and dispersal forms in pine wood nematode，Bursaphelenchus lignicolus，with reference to the survival.Appl.Entomol.Zool.，131-11)。Bolla(1982出處見前)等用100mM NaOH每天調節培養線蟲的SP/YE補充培養基，也未能延長線蟲種群增長的階段。上述培養方法，相對以前的方法而言，取得了良好的結果，但都存在如下的不足之處1、配方所用材料價格較貴，且不易配齊，2、培養出的無菌松材線蟲個體大小和繁殖率較野生松材線蟲用相應的真菌或黑松愈傷組織低得多，3、培養中出現線蟲種群達到最大值後開始迅速下降的現象。目前尚不了解該現象的原因，因此尚無解決方法。
現有最接近的技術為郭道森(郭道森，叢培江，李麗，趙博光.(2002)松材線蟲攜帶細菌的數量的測定及無菌松材線蟲的培養.青島大學學報，15(4)29-31)等報導的在黑松愈傷組織上培養無菌松材線蟲方法，該方法是利用植物組織培養技術培養松樹愈傷組織，然後以愈傷組織來培養線蟲。該方法比常用的方法要有效，既克服了食料真菌法操作繁瑣、易汙染、難以排除食料真菌或消毒劑對實驗結果可能產生影響等缺點，又較無異活體培養法所用培養周期短，產量要高。目前在國內培養無菌松材線蟲多採用此方法。
該方法的具體步驟是1.培養黑松愈傷組織選取黑松成熟種子，用自來水衝洗乾淨，剝去種皮，於75％乙醇溶液中浸40s，再在0.1％HgCI2溶液中處理4min，無菌水衝洗5次，剝除胚乳，取出成熟胚，置於愈傷組織誘導培養基上於25℃下黑暗培養。待愈傷組織長出後移至含適量激素的1P2MS固體培養基上繼代培養(高蓉，趙博光.防止黑松外質體及其愈傷組織褐變的方法[J].南京林業大學學報，2001，25(5)75-77.)。
2.松材線蟲的無菌處理和培養經接種試驗選出致病力較強的Nt和Nm兩個蟲株作為供試蟲株，其中Nt來自黑松，Nm來自馬尾松。培養在灰葡萄孢菌上的松材線蟲，採用貝曼漏鬥法分離。獲得的松材線蟲先用3％H2O2處理10min，再用0.5％硫酸鏈黴素和0.5％硫酸慶大黴素各處理2h。每次處理後均用無菌水換洗3次。在體視顯微鏡下，用滅過菌的細針挑取經上述處理的線蟲20～30條，移至黑松愈傷組織上，置25℃下黑暗培養。將培養出的線蟲先用牛肉膏蛋白腖培養基檢驗，確係無菌後再用黑松愈傷組織繼代培養。試驗時，用無菌水衝洗出無菌松材線蟲，製成16000條/mL的線蟲懸液。用滅過菌的微量進樣器取線蟲懸液25μL(含線蟲400條)，滴在培養於三角燒瓶內的鮮重為3g的愈傷組織表面，每一蟲株接種30瓶，置25℃下黑暗培養。
該方法的不足之處在於1、從培養獲得的松材線蟲的體積、數量及線蟲產卵量等生長、繁殖指標方面看，較自然感病的松樹中的松材線蟲尚有不能令人滿意之處。2、該方法仍不便於大規模的工業化生產。

發明內容
本發明旨在克服現有技術的不足之處，提供一種能大量、快速、方便而成本又低的無菌松材線蟲的培養方法。
本發明的技術解決方案如下
從自然條件下松材線蟲攜帶的細菌中分離選取螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株。
該細菌菌株的生物學特性(1)培養性狀菌落形態B619菌株在10～41℃的NB培養液中均可生長，菌落圓形，淡黃色，半透明，不產生色素，表面溼潤、光滑、邊緣整齊。以25～35℃生長為好；在pH4～4.5的NB培養液中不生長，在pH5～9範圍內均可生長，最適pH7～8。個體形態細胞杆狀，有些細胞內有空泡，大小0.5～0.6×1.0～2.0μm。革蘭氏染色陰性反應，運動，生有一根極生鞭毛。無莢膜。
(2)生理生化特徵革蘭氏反應陰性，嚴格好氧生長，在休-利夫森氧化發酵培養基上呈氧化產酸反應。不產生色素。細胞內有聚β-羥基丁酸鹽顆粒。接觸酶和氧化酶皆陽性。不產生精氨酸雙水解酶。水解明膠，不利用硝酸鹽厭氧生長，不產卵磷脂酶。不水解澱粉。能利用葡萄糖、木糖、核糖、肌醇和β-丙氨酸生長，但不利用海藻糖和酒石酸鹽生長。
該菌株已於2004年9月5日保藏在中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NoM 204065。
1、將上述菌株進行培養獲得細菌活菌體細胞。
2、將上述獲得細菌活菌體細胞進行滅活處理從而獲得死細胞，備用。
3、分離、培養松材線蟲並製備無菌松材線蟲卵，備用。
4、培養黑松愈傷組織，備用。
5、將上述獲得黑松愈傷組織進行滅活處理從而獲得死黑松愈傷組織，備用。
6、無菌條件下，以步驟2~5獲得的各備用材料按下列比例與適量的無菌水配製成不同的培養液無菌乾燥的死愈傷組織∶死細菌(質量比)為5~100∶1活愈傷組織∶死細菌(質量比)為100~2000∶17、向步驟6獲得的任一培養液中加入步驟5中製備好的無菌松材線蟲卵，置於溫度15-40℃，暗培養4-20d後，得所需的無菌松材線蟲。
以下對上述各步驟做進一步詳述步驟1中細菌菌體的培養可採用通用的NA培養基進行平板培養或斜面培養。培養方法為常用的培養方法。如稱取NA營養瓊脂粉32g溶於1000mL蒸餾水中，在電爐上加熱煮沸，然後分裝於試管中，於121℃、1.05kg/cm2滅菌20min，用平板培養。工業生產時可用NB液體培養基進行培養。培養後用細菌濾膜(膜孔直徑約0.5μ)將培養後的培養液過濾。得細菌菌體。
上述培養過程中，培養基的PH值為7.0±0.2、溫度28±0.1℃、斜面培養時間為48h，液體培養時間為4天。
步驟2中螢光假單胞菌死細胞的獲得可採用化學方法或冷凍乾燥，紫外線照射等物理學方法獲得。通過化學方法中的滅菌劑對步驟1所得的細菌菌體進行處理，或將步驟1所得的細菌菌體(菌液)在無菌條件下，通過低溫冷凍、乾燥，得無菌乾燥的死細菌，或將步驟1所得的細菌菌體(菌液)置於紫外線下照射從而獲得死細菌。如採用化學方法中的三氯甲烷法，具體做法如下a.將培養得到的菌體細胞置於試管或燒瓶中，用滅過菌的脫脂棉浸適量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入試管或燒瓶口，後塞上棉塞；置於無菌室內約2-4h；b.2h後，用無菌鑷子取出浸有三氯甲烷脫脂棉，將試管口或燒瓶口敞開，在無菌室內放置2-4h，待試管中的三氯甲烷揮發盡後，用接種環取1環菌苔，接入已製備好的NA斜面培養基上，置於28℃的恆溫培養箱中培養48h；c.48h後觀察上述NA斜面培養基上是否有細菌生長，若沒有，則表明細菌已被三氯甲烷殺死，死細菌可備用；否則重新滅菌。
採用上述化學方法中的三氯甲烷法是便於工業化生產的最佳方法之一。該方法簡單、有效。
步驟3中無菌松材線蟲卵的製備可採用已知的方法培養松材線蟲，待其產卵，採用升汞、抗菌素等殺菌劑分離獲得無菌卵。採用H2O2是一個優選的方法。實驗證明，H2O2相對於升汞、抗菌素等不僅殺菌效果好、且由於卵與線蟲對H2O2的抗性差別較大，所以使用高濃度的H2O2可以完全殺滅細菌而不影響卵的孵化率。其具體做法如下a.分離松材線蟲將在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培養的松材線蟲用貝曼漏鬥法分離。把分離到的松材線蟲離心，鑑定，備用；b.將上述離心，鑑定後的松材線蟲加在事先製備好的2％的平板瓊脂培養基上，用封口膜封好培養皿，置入27℃的恆溫培養箱中培養6-24h；
c.在培養期間，觀察松材線蟲的產卵情況；當線蟲產卵量達到實驗所需要求時，在無菌條件下，用滅過菌的吸管吸適量無菌水將瓊脂培養基上的松材線蟲及其中的卵全部洗到滅過菌的離心管中，滴入30％的H2O2(與卵懸液的體積比為1∶1)，在15℃下靜置10min，在顯微鏡下觀察線蟲的死亡情況；d.待線蟲大部分死亡，用無菌水衝洗3-5遍，每次加無菌水後，搖勻後放在離心機上離心3-4min，待衝淨離心管中雙氧水後，用無菌的200目不鏽鋼過濾篩過濾，重複過濾4-6次，直至將大部分線蟲過濾掉為止；e.用事先製備好的NA斜面培養基檢查線蟲卵有無細菌；如果出現細菌，則放棄本次實驗而重新進行。
步驟4中黑松愈傷組織的培養可採用已知的培養方法培養黑松愈傷組織。如下列方法a.培養基的配製採用1/2MS培養基為基本培養基，附加KT 4.0mg/L，BA 4.0mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調節pH值為5.86，再加入瓊脂粉6.5g/L，加熱溶解後分裝於100mL的三角瓶中，於121℃，1.05kg/cm2滅菌15min，得到黑松愈傷組織誘導的培養基。
b.採用1/2MS培養基為基本培養基，附加NAA 0.5mg/L，IBA 0.1mg/L，GA3 1.0mg/L，2，4-D 1.0mg/L，LH 100mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/LNaOH的調節pH值為5.86，再加入瓊脂粉6.5g/L，加熱溶解後分裝於100mL的三角瓶中，於121℃，1.05kg/cm2滅菌15min，得到黑松愈傷組織繼代培養用的培養基。若調節pH值後不添加瓊脂粉，分裝滅菌後得到黑松單細胞振蕩培養用的液體培養基。
c.黑松愈傷組織的誘導將黑松種子分別裝在50mL的小燒杯中，加入少量洗潔精，用紗布封緊杯口，在流水下衝洗乾淨。去殼後以無菌水衝洗3次，75％的乙醇溶液表面消毒3次，每次40s，再用無菌水衝洗3次，之後用0.1％升汞溶液處理4min，無菌水衝洗5次。在超淨工作檯上，用滅過菌的鑷子在滅過菌的培養皿中剝除胚乳，取出成熟胚，將其接入愈傷組織誘導培養基，每瓶接4-6個，置於27℃培養箱內黑暗培養。經過10d左右，將生長良好，即未被汙染和未發生褐變的個體轉移到繼代培養基中保持和增殖。
d.黑松愈傷組織的繼代培養在無菌操作室中，將愈傷組織切成黃豆大小的組織塊，接入繼代培養基上，每個三角瓶中接入3-4塊，置於27±2℃恆溫箱中暗培養，每隔20-30d繼代培養一次。
步驟5中死的黑松愈傷組織的獲得可採用化學方法或冷凍乾燥，紫外線照射等物理學方法獲得。通過化學方法中的滅活劑如溴乙烷對步驟4中獲得的黑松愈傷組織進行處理，也可將步驟4所得的黑松愈傷組織在無菌條件下，通過低溫冷凍、乾燥，得無菌乾燥的死黑松愈傷組織，或將其置於紫外線下照射從而獲得。低溫冷凍、乾燥法是便於工業化生產的最佳方法之一。該方法簡單、所獲得的黑松愈傷組織便於使用、保存、運輸。具體做法如下將以上步驟得到新鮮的黑松愈傷組織，在無菌條件下，置於-40℃下12h低溫冷凍乾燥，取出後置室溫下解凍，進行冷凍乾燥，得無菌乾燥的愈傷組織。
步驟6中培養液的製備無菌條件下，用獲得的各備用材料按比例混合併加入到適量的無菌水中配製成不同的培養液。
該步驟中，優選配製比例為死愈傷組織∶死細菌(質量比)為20~75∶1活愈傷組織∶死細菌(質量比)為400~1500∶1以該比例配製而成的培養液較符合松材線蟲的營養需要，因而松材線蟲的生長發育較好。
該步驟中，最佳配製比例為死愈傷組織∶死細菌(質量比)為40~60∶1活愈傷組織∶死細菌(質量比)為800~1200∶1以該比例配製而成的培養液更為符合松材線蟲的營養需要，因而松材線蟲的生長發育最好。
步驟7中松材線蟲的培養向上述任一培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵，置於15-40℃下，暗培養4-20d後，得所需的健康無菌松材線蟲。該步驟中，較佳培養條件為溫度為23-31℃，暗培養，培養時間4-10d。該培養條件較適宜於松材線蟲的生長發育。因而每代松材線蟲的培養所需時間也較短。該步驟中，最佳培養溫度為25℃-28℃，暗培養，培養時間4-5d。該培養條件最適宜於松材線蟲的生長發育。因而每代松材線蟲的培養所需時間也最短。
本發明採用上述技術方案培養無菌松材線蟲比現有的方法要有效，個體與野生松材線蟲在帶菌情況下培養的個體大小相同或稍大，其繁殖率也較高，因而產量和質量都較現有技術更高。
採用由死愈傷組織與死細菌、無菌水配製培養液培養松材線蟲的方法是適合於大規模的工業化生產的最佳方法，研究表明，該方法相對於用步驟6中其它培養液能明顯促進松材線蟲的生長發育。同時，該方法無論從死愈傷組織、死細菌的保存還是從它們的使用、運輸而言，都有利於大規模的工業化生產。
本發明的優越性在方便性上也有充分的體現，眾所周知，無論愈傷組織、細菌的培養還是保存既需要相當的條件又需要相當的技術和時間。要培養出無菌松材線蟲，都必須做這些大量的前期工作，非常複雜。本發明通過工業化生產出得無菌乾燥的死愈傷組織與死細菌，保存非常方便，根本無需考慮愈傷組織是否發生褐變等問題。使用也非常方便，隨時需要培養松材線蟲，隨時按比例配製培養液，隨時培養。
以下通過下列對比實驗顯現本發明在培養效果上的優點對比實驗1螢光假單胞菌GcM5-1A對松材線蟲產卵量的影響(1)以上述方法依次製備無菌松材線蟲卵、死螢光假單胞菌、配製NA斜面培養基、螢光假單胞菌菌種活化、死螢光假單胞菌的製備，並按下列方法獲得細菌懸液a.無菌條件下，用接種環挑取活的螢光假單胞菌GcM5-1A 15環(內徑約為1mm)，懸浮於30ml無菌水中，搖勻，備用。
b.無菌條件下，用上述同一接種環(經灼燒後)挑取死的螢光假單胞菌GcM5-1A 15環，懸浮於30ml無菌水中，搖勻，備用。
(2)準備40個無菌小培養皿(r＝1cm，h＝1cm)，8個無菌大培養皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，將每5個小培養皿放入1個大培養皿中，然後分成三組，其中兩組各有3個大培養皿，分別用記號筆標記為L組(living bacteria)和D組(deadbacteria)；剩下一組有2個大培養皿，標記為C組(control)；(3)用無菌的自製毛細吸管向每個小培養皿中加入2個已製備好的無菌松材線蟲卵；(4)然後向L組的小培養皿中各加入1.5ml的活螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向D組的小培養皿中各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；C組中小培養皿各加入1.5ml無菌水；(5)在無菌室內完成上述步驟後，用封口膜將所有大培養皿的口封好，然後放入27℃的恆溫箱中培養；(6)5d後，在無菌室內觀察各組內小培養皿的情況，連續觀察5d，記錄各天觀察到的小線蟲數，並將已統計的小線蟲用毛細吸管挑出；用統計的線蟲總量作為觀察期內的線蟲繁殖量，進行處理與對照間的顯著性檢驗(由SPSS11.5分析)。
連續觀察5d後，記錄各組的小線蟲總數，作為觀察期間內線蟲的繁殖量。對結果進行統計分析後，結果如下表1螢光假單胞菌GcM5-1A對松材線蟲產卵量的影響處理 N(線蟲各處理線蟲產卵量平對數) 均信±標準差(個)無菌水 3 8.67±2.08a活螢光假單胞菌 5 34.20±5.97b死螢光假單胞菌 5 35.40±81b注數字右上角的字母為Duncan’s多重比較檢驗結果，字母不同表示兩者之間差異達到顯著水平。(α＝0.05)(下同)從表1可以看出，加入死螢光假單胞菌GcM5-1A培養的松材線蟲的產卵量平均值最大，各觀察組內松材線蟲產卵量的差異不大；加入活螢光假單胞菌GcM5-1A培養的松材線蟲的產卵量平均值比死螢光假單胞菌GcM5-1A培養的松材線蟲的產卵量平均值稍小，但各觀察組內松材線蟲產卵量的差異較大；用無菌水培養的松材線蟲產卵量平均值較前兩者都小。
由表1顯著性檢驗結果可知用經三氯甲烷處理後的死螢光假單胞菌GcM5-1A與活螢光假單胞菌GcM5-1A分別培養的松材線蟲的產卵量都與用無菌水培養的松材線蟲產卵量有顯著差異，說明兩者都對松材線蟲的產卵量有顯著的促進作用；但分別用兩者培養的松材線蟲的產卵量之間沒有顯著差異，說明螢光假單胞菌GcM5-1A是否死亡對松材線蟲的產卵量沒有顯著影響。
對比實驗2黑松愈傷組織和螢光假單胞菌幾種不同培養介質對松材線蟲產卵量的影響以前述方法依次進行製備無菌松材線蟲卵、死螢光假單胞菌、配製NA斜面培養基、螢光假單胞菌菌種活化、死螢光假單胞菌的製備、黑松愈傷組織的製備並獲得細菌懸液，然後，a.準備90個無菌小培養皿(r＝1cm，h＝1cm)，18個無菌大培養皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，將每5個小培養皿放入1個大培養皿中，然後分成七組，其中三組各有4個大培養皿，分別用記號筆標記為DD組(dead calli+dead bateria)、LL組(living calli+living bacteria)、LC組(living calli)、LCDB組(livingcalli+dead bacteria)；剩下三組各有2個大培養皿，分別標記為DB組(deadbateria)、DC組(dead calli)和C組(control)；b.用無菌吸管向每個小培養皿中滴入1.0ml的黑松愈傷組織液體繼代培養基；c.用無菌自製毛細吸管向每個小培養皿中(LC組的15個小培養皿除外)加入2個已製備好的無菌松材線蟲卵；d.用無菌自製毛細吸管向LC組的每個小培養皿中加入2個未經無菌處理的松材線蟲卵；後又依次各加入0.01g活黑松愈傷組織，1.5ml無菌水；e.向LL組的小培養皿中各加入0.01g再向小培養皿中各加入1.5ml的活螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向DD組的小培養皿中各加入0.01g死黑松愈傷組織，後又各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向LCDB組的小培養皿中各加入0.01g的未經冷凍的活愈傷組織，後又各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向DC組的小培養皿中各加入0.01g死黑松愈傷組織，1.5ml無菌水；向DB組中各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；C組中各加入1.5ml無菌水；f.在無菌室內完成上述步驟後，用封口膜將所有大培養皿的口封好，然後放入27℃的恆溫箱中培養；g.5-7d後，在無菌室內觀察各組內小培養皿的情況，連續觀察5d，記錄各天觀察到的小線蟲數，並將已統計的小線蟲用毛細吸管挑出；用統計的線蟲總量作為觀察期內的線蟲繁殖量，進行處理與對照間的顯著性檢驗(由SPSS11.5分析)。
連續觀察5d後，記錄各組的小線蟲總數，作為觀察期間內線蟲的繁殖量。對結果進行統計分析後，結果如下
表2黑松愈傷組織和螢光假單胞菌的幾種不同培養介質對松材線蟲產卵量的影響處理 N(線 各處理線蟲產卵量平蟲對數)均值±標準差(個)無菌水4 9.00±2.94a死愈傷組織5 35.00±6.82b死細菌4 42.00±4.97bc死細菌加死愈傷組織6 48.00±13.6c死細菌加活愈傷組織6 48.60±5.18bc活愈傷組織(有菌卵)7 49.71±11.38c活細菌加活愈傷組織6 54.83±9.20c表2可以看出，以活黑松愈傷組織加活螢光假單胞菌培養的松材線蟲產卵量最多，然後依次是活黑松愈傷組織培養的有菌卵、死細菌加活愈傷組織、死螢光假單胞菌加死黑松愈傷組織、死螢光假單胞菌、死黑松愈傷組織，無菌水培養的產卵量最少。其中用死螢光假單胞菌加死黑松愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲產卵量在各觀察組內的差異最大，對照無菌水培養的松材線蟲產卵量在各觀察組內的差異最小，其它培養介質的松材絲蟲產卵量在各觀察組內都有一定的差異。
由表2的顯著性檢驗結果，可以看出分別用活黑松愈傷組織加活螢光假單胞菌與死螢光假單胞菌加死黑松愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的無菌松材線蟲的產卵量之間沒有顯著差異，同樣三者都與用活黑松愈傷組織培養的有菌松材線蟲的產卵量之間沒有差異，但上述四種培養介質均與用其它介質培養的無菌松材線蟲的產卵量之間具有顯著性差異，說明這四種培養介質能明顯地促進松材線蟲的產卵。用死黑松愈傷組織培養的無菌松材線蟲的產卵量與前三種培養介質之間有差異，但差異不顯著；用死黑松愈傷組織培養的無菌松材線蟲的產卵量和用死細菌培養的無菌松材線蟲的產卵量之間沒有明顯差異，但相對於無菌水也有顯著促進松材線蟲產卵的作用。
對比實驗3黑松愈傷組織和螢光假單胞菌幾種不同培養介質對松材線蟲生長發育的影響以前述方法依次進行製備無菌松材線蟲卵、死螢光假單胞菌、配製NA斜面培養基、螢光假單胞菌菌種活化、死螢光假單胞菌的製備、黑松愈傷組織的製備並獲得細菌懸液，然後，a.準備25個無菌小培養皿(r＝1cm，h＝1cm)，5個無菌大培養皿(r＝5cm，h＝1.5cm)，將每5個小培養皿放入1個大培養皿中，然後分成五組，分別用記號筆標記為DD組(dead calli+dead bateria)、LCDB組(living calli+deadbacteria)、LB組(living bacteria)、LC組(living calli)DB組(deadbateria)；b.用無菌吸管向LC組每個小培養皿中滴入1.0ml的黑松愈傷組織液體繼代培養基；c.用毛細吸管向每個小培養皿中加入20個上述已製備好的無菌松材線蟲卵；後又各加入0.01g活黑松愈傷組織，1.5ml無菌水；d.向LC組的小培養皿中各加入0.01g活黑松愈傷組織，向DB組的小培養皿中各加入1.5ml的活螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向DD組的小培養皿中各加入0.01g死黑松愈傷組織，後又各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向LCDB組的小培養皿中各加入0.01g活黑松愈傷組織，後又各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；向DB組中各加入1.5ml的死螢光假單胞菌GcM5-1A懸液；e.在無菌室內完成上述步驟後，用封口膜將所有大培養皿的口封好，然後放入27℃的恆溫箱中培養；f.5-7d後，在無菌室內觀察各組內小培養皿的情況，從各組中挑出第一代雌雄成蟲各20條，用顯微目鏡測微尺測量各代雌雄成蟲的體長，直徑；然後用毛細吸管另從各組的小培養皿中吸出第一代成蟲繁殖的小線蟲20條放入按a-e步驟準備好的下一批培養皿中，進行培養；按上述同樣的步驟與方法觀察測量第二代雌雄成蟲各20條，根據體長、體直徑計算兩代雌雄成蟲的體積；公式為2П×(d/2)2×(1/2)/3，其中d為線蟲的體直徑，l為線蟲的體長。將測得的結果作統計分析，進行各處理間的顯著性檢驗(由SPSS11.5分析)。
1、第一代雌雄成蟲的觀察測量結果(1)不同培養介質對松材線蟲雌成蟲的體長、體直徑及體積的影響表3不同培養介質對松材線蟲雌成蟲體長的影響培養介質 N 體長平均值±標準差(mm)活愈傷組織 20 0.729800±0.0558047a活細菌 20 0.855200±0.0273026b死細菌 20 0.858700±0.0218080b死細菌加死愈傷組織 20 0.880450±0.0195542c死細菌加活愈傷組織 20 0.890530±0.0206628c從表3可以看出，用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長的平均值是最大的，然後依次是死細菌、活細菌；而且這四種培養介質培養的松材線蟲雌蟲體長在各自組內的個體差異都不大。用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長平均值最小，但在其組內體長個體差異較大。由顯著性檢驗結果可知死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體長均有明顯差異；死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體長之間沒有明顯差異；活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體長之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體長的增長。
表4不同培養介質對松材線蟲雌成蟲體直徑的影響培養介質 N體直徑平均值±標準差(mm)活愈傷組織20 0.028130±0.0019445a活細菌20 0.030860±0.0044518b死細菌20 0.032670±0.0025695b死細菌加死愈傷組織20 0.039510±0.0040150c死細菌加活愈傷組織20 0.040320±0.0041623c從表4可以看出，用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑的平均值最大，但其個體間體直徑差異較大；然後依次是死細菌、活細菌，其中加活細菌培養的雌線蟲體直徑個體差異較加死細菌培養的雌蟲體直徑個體差異大；用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑平均值最小，其組內體直徑個體差異也最小。
由表4顯著性檢驗結果可知死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體直徑均有明顯差異；死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織兩者間明顯差異；無活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體直徑之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體直徑的增加。
表5不同培養介質對雌松材線蟲成蟲體積的影響培養介質 N 體積平均值±標準差(mm3)活愈傷組織 20 0.00015322±0.000096122a活細菌 20 0.00021915±0.000073201b死細菌 20 0.00024207±0.000040577b死細菌加死愈傷組織 20 0.00036475±0.000075644c死細菌加活愈傷組織 20 0.00036589±0.000078332c由表5可知用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積的平均值最大，然後依次是死細菌、活細菌、活愈傷組織。就組內個體體積差異而言，死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織與活細菌三種介質較大，死細菌與活愈傷組織兩種培養介質較小。從表5顯著性檢驗結果可以看出死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體積均有明顯差異；活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體積之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體積的增大。
綜合以上結果可以看出用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲的體長、體直徑和體積的平均值都是最大的，而且與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體長、體直徑和體積均有明顯差異，說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲的生長發育。
(2)不同培養介質對松材線蟲雄成蟲的體長、體直徑及體積的影響表6不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體長的影響培養介質 N 體長平均值±標準差(mm)活愈傷組織 200.625300±0.0349060a活細菌 200.654700±0.0286321b死細菌 200.670450±0.0340239bc死細菌加死愈傷組織 200.685100±0.0218051c死細菌加活愈傷組織 200.689000±0.0221331c從表6可以看出各種不同培養介質培養的松材線蟲雄蟲在各組內個體間體長上的差異都不是很大，其中用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長組內差異是最小的。用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的雄松材線蟲的體長的平均值最大，用死細菌、活細菌培養的松材線蟲雄蟲體長平均值較大，用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長平均值最小。顯著性檢驗結果表明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長與用活細菌、活愈傷組織兩種介質培養的松材線蟲雄蟲體長均有明顯差異，但與用死細菌培養的松材線雄蟲體長差異不明顯。用活細菌、死細菌兩種介質培養的松材線蟲雄蟲體長之間沒有明顯差異，但兩者與用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲體長之間差異顯著。以上結果說明用死細菌、死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織三種培養介質較用活愈傷組織、活細菌培養更能促進松材線蟲雄蟲體長的增長。
表7不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體直徑的影響培養介質 N體直徑平均值±標準差活愈傷組織20 0.024325±0.0019404a活細菌20 0.026795±0.0028153b死細菌20 0.028970±0.0021428c死細菌加死愈傷組織20 0.030735±0.0028077d死細菌加活愈傷組織20 0.031864±0.0029002d由表7可知各種不同培養介質培養的第一代松材線蟲雄蟲在各組內個體間體直徑的差異不大，其中用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體直徑組內差異是最小的。可以看出，用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的雄松材線蟲的體直徑的平均值是最大的，用死細菌、活細菌培養的松材線蟲雄蟲體直徑平均值較大，用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長平均值最小。從顯著性檢驗結果看出用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體直徑與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體直徑均有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種更能促進松材線蟲雄蟲體直徑的增寬。
表8不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體積的影響培養介質 N體積平均值±標準差(mm3)活愈傷組織20 0.00009823±0.000022354a活細菌20 0.00012536±0.000032230b死細菌20 0.00014912±0.000030663c死細菌加死愈傷組織20 0.00017151±0.000037063d死細菌加活愈傷組織20 0.00017842±0.000032419d表8可以看出，各種不同培養介質培養的第一代松材線蟲雄蟲在各組內個體間體積的差異均不大。由表8可知用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體積的平均值是最大的，然後依次是死細菌、活細菌、活愈傷組織。顯著性檢驗結果表明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體積與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體積均有明顯差異；說明用死細菌加死愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雄蟲的體積的增大。
綜合以上體長、體直徑和體積結果可以看出用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長、體直徑和體積的平均值都是最大的，而且與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體長、體直徑和體積均有明顯差異，說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雄蟲的生長發育。
2、第二代雌雄成蟲的觀察測量結果(1)不同培養介質對松材線蟲雌成蟲的體長、體直徑及體積的影響表9不同培養介質對松材線蟲雌成蟲體長的影響培養介質 N 體長平均值±標準差(mm)活愈傷組織20 0.727800±0.0390541a活細菌20 0.859500±0.0253782b死細菌20 0.866900±0.0208071b死細菌加死愈傷組織20 0.887900±0.0149628c死細菌加活愈傷組織20 0.888300±0.0168961c由上表可知用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長的平均值最大，然後依次是死細菌、活細菌，而且這三種培養介質培養的松材線蟲雌蟲體長在各自組內的個體差異都不大；用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長平均值最小，但在其組內體長個體差異較大。從表9的顯著性檢驗結果可以看出死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體長均有明顯差異；活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體長之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體長有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體長的增長。
表10不同培養介質對松材線蟲雌成蟲體直徑的影響培養介質 N 體直徑平均值±標準差(mm)活愈傷組織 20 0.028255±0.0022004a活細菌 20 0.033005±0.0053815b死細菌 20 0.034675±0.0021396b死細菌加死愈傷組織 20 0.040115±0.00038162c死細菌加活愈傷組織 20 0.041232±0.00039002c從表10可以看出，用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑的平均值最大，但其個體間體直徑差異較大；然後依次是死細菌、活細菌、活愈傷組織，其中加活細菌培養的雌線蟲體直徑個體差異較加死細菌培養的雌蟲體直徑個體差異大；活愈傷組織組內體直徑個體差異也最小。由顯著性檢驗結果可知死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體直徑均有明顯差異；活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體直徑之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體直徑有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體直徑的增長。
表11不同培養介質對松材線蟲雌成蟲體積的影響培養介質 N 體積平均值±標準差(mm3)活愈傷組織 200.00015407±0.000031141a活細菌 200.00025349±0.000090026b死細菌 200.00027461±0.000040206b死細菌加死愈傷組織 200.00037834±0.000071672c死細菌加活愈傷組織 200.00038258±0.000073289c
從表11可以看出用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積的平均值最大，然後依次是死細菌、活細菌、活愈傷組織。就組內個體體積差異而言，死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織與活細菌三種介質較大，死細菌與活愈傷組織兩種培養介質較小。由顯著性檢驗結果可知死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體積均有明顯差異；活細菌與死細菌兩種介質培養的松材線蟲雌蟲體積之間沒有明顯差異，但兩者均與用活愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲體積有明顯差異。以上結果說明用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲體積的增大。
綜合以上體長、體直徑和體積的結果可以看出用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雌蟲的體長、體直徑和體積的平均值都是最大的，而且與其它三種介質培養的松材線蟲雌蟲體長、體直徑和體積均有明顯差異，說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雌蟲的生長發育。
表12不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體長的影響培養介質 N 體長平均值±標準差(mm)活愈傷組織 20 0.631300±0.0380264a活細菌 20 0.656300±0.0282398b死細菌 20 0.676500±0.0327197c死細菌加死愈傷組織 20 0.686650±0.0235468c死細菌加活愈傷組織 20 0.693385±0.0233442c從表12可以看出各種不同培養介質培養的松材線蟲雄蟲在各組內個體間體長上的差異都不是很大，其中用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長組內差異是最小的；其中用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的雄松材線蟲的體長的平均值是最大的，然後依次是死細菌、活細菌、活愈傷組織。由顯著性檢驗結果可見用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長與用死細菌培養的松材線蟲雄蟲體長之間沒有明顯差異，但前三者均與用活細菌、活愈傷組織兩種介質培養的松材線雄蟲體長之間有明顯差異。用活細菌培養的松材線蟲雄蟲體長與用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲體長之間差異也顯著。以上結果說明用死細菌、死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織三種培養介質較用活愈傷組織、活細菌培養更能促進松材線蟲雄蟲體長的增長。
表13不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體直徑的影響培養介質 N 體直徑平均值±標準差活愈傷組織 20 0.024525±0.0027493a活細菌 20 0.026895±0.0028153b死細菌 20 0.028975±0.0021584c死細菌加死愈傷組織 20 0.031010±0.0027493d死細菌加活愈傷組織 20 0.033221±0.0028474d由表13可知各種不同培養介質培養的第二代松材線蟲雄蟲在各組內個體間體直徑的差異不大，其中用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體直徑組內差異最小。用死細菌加死愈傷組織培養的雄松材線蟲的體直徑的平均值最大，然後依次是死細菌、活細菌，用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體直徑平均值最小。從顯著性檢驗結果看出用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體直徑與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體直徑均有明顯差異。以上結果說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種培養介質更能促進松材線蟲雄蟲體直徑的增長。
表14不同培養介質對松材線蟲雄成蟲體積的影響培養介質 N 體積平均值±標準差(mm3)活愈傷組織 200.00010222±0.000032505a活細菌 200.00012657±0.000032311b死細菌 200.00015041±0.000030316c死細菌加死愈傷組織 200.00017493±0.000037205d死細菌加活愈傷組織 200.00018987±0.000038026d由表14可知用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體積的平均值最大，然後依次是用死細菌和用活細菌培養的松材線蟲雄蟲用活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體積的平均值最小。從顯著性檢驗結果可以看出用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體積與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體積均有明顯差異；說明用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雄蟲體積的增大。
綜合以上體長、體直徑和體積的結果可以看出用死細菌加活愈傷組織、死細菌加死愈傷組織培養的松材線蟲雄蟲的體長、體直徑和體積的平均值都是最大的，而且與其它三種介質培養的松材線蟲雄蟲體長、體直徑和體積均有明顯差異，說明用死細菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養松材線蟲較其它三種介質更能促進松材線蟲雄蟲的生長發育。
綜合以上各實驗結果可見，從黑松愈傷組織對松材線蟲產卵量的影響的研究結果來看，無論是經冷凍處理失活的黑松愈傷組織或活黑松愈傷組織，與無菌水相比，兩者都能明顯地促進松材線蟲的產卵；但用兩者培養的松材線蟲的產卵量之間沒有明顯差異，說明黑松愈傷組織是否失活對松材線蟲的產卵量沒有顯著影響。
用經三氯甲烷處理後的死螢光假單胞菌GcM5-1A與活螢光假單胞菌GcM5-1A分別培養的松材線蟲的產卵量都與用無菌水培養的松材線蟲產卵量有顯著差異，說明兩者都對松材線蟲的產卵量有顯著的促進作用；但分別用兩者培養的松材線蟲的產卵量之間沒有顯著差異，說明螢光假單胞菌GcM5-1A是否死亡對松材線蟲的產卵量沒有顯著影響。
從分別單獨用死黑松愈傷組織、單獨用死螢光假單胞菌、死螢光假單胞菌加死愈傷組織、活愈傷組織加活螢光假單胞菌、死愈傷組織加活螢光假單胞菌以及活愈傷組織(培養有菌松材線蟲卵)等幾種不同介質培養的松材線蟲的產卵量情況可以看出和無菌水相比較，以上所有的培養介質都能明顯促進松材線蟲的產卵；其中用死螢光假單胞菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織、活愈傷組織加活螢光假單胞菌以及活愈傷組織(加有菌卵)四種培養介質培養的松材線蟲的產卵量之間沒有明顯差異，而四者培養松材線蟲的產卵量都較單獨用死螢光假單胞菌培養松材線蟲的產卵量要大，不過差異不明顯，但四者培養松材線蟲的產卵量均明顯大於單獨用死黑松愈傷組織培養的松材線蟲產卵量。以上結果表明，在松材蟲的產卵過程中，螢光假單胞菌的作用較黑松愈傷組織的作用大；用死螢光假單胞菌加死黑松愈傷組織可能比單獨用黑松愈傷組織培養無菌松材線蟲更能促進無菌松材線蟲的產卵。
對分別用活黑松愈傷組織、死螢光假單胞菌、活螢光假單胞菌以及死螢光假單胞菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織五種介質培養的第一代和第二代的松材線蟲雌雄成蟲體長、體直徑及體積進行觀察測定，結果表明，無論是第一代還是第二代，用死螢光假單胞菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養的松材線蟲雌雄成蟲的體長、體直徑和體積都明顯大於用其它三種介質培養的松材線蟲雌雄成蟲的體長、體直徑和體積，說明與其它三種介質相比，死螢光假單胞菌加死愈傷組織、死細菌加活愈傷組織能明顯促進松材線蟲的生長發育。
從實驗的研究結果可以看出，用死螢光假單胞菌加死黑松愈傷組織、死細菌加活愈傷組織培養無菌松材線蟲較單獨用活黑松愈傷組織培養無菌松材線蟲更能促進松材線蟲的產卵量和其生長發育，是一種比單獨用活黑松愈傷組織更好的培養無菌松材線蟲的方法。該方法比單獨用黑松愈傷組織培養無菌松材線蟲在線蟲產卵量及生長繁殖方面更好。
具體實施例方式以下通過具體的實施例對本發明作進一步描述實施例11、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株的培養及處理(1)NA斜面培養基的製備稱32g營養瓊脂粉(NA)溶於1000ml蒸餾水中，煮沸，分裝於試管中，後在121℃，1.05kg/cm2的滅菌鍋中滅菌15min，倒斜面，備用。(2)菌種活化將在4℃冰箱中保存的螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株，無菌條件下接到斜面培養基上，放在27℃恆溫培養箱中培養2d，後放入4℃冰箱中冷藏保存，備用。(3)細菌的培養將在4℃冰箱中保存的螢光假單胞菌GcM5-1A菌株，在無菌操作室中用接種環取1環，接入NA斜面培養基50ml中，置於30℃恆溫振蕩器(128r/min)上培養48h。(4)死螢光假單胞菌的製備a.在無菌室內，用滅過菌的脫脂棉浸適量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入試管口，後塞上棉塞；置於無菌室內約2h；b.2h後，用無菌鑷子取出浸有三氯甲烷脫脂棉，將試管口敞開，在無菌室內放置2-4h，待試管中的三氯甲烷揮發盡後，用接種環取1環菌苔，接入已製備好的NA斜面培養基上，置於28℃的恆溫培養箱中培養48h；c.48h後觀察上述NA斜面培養基上是否有細菌生長，若沒有，則表明細菌已被三氯甲烷殺死，死細菌可備用；否則放棄本次實驗並重新進行。
2、培養黑松愈傷組織(1)培養基的配製採用1/2MS培養基為基本培養基，附加KT 4.0mg/L，BA 4.0mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調節pH值為5.86，再加入瓊脂粉6.5g/L，加熱溶解後分裝於100mL的三角瓶中，於121℃，1.05kg/cm2滅菌15min，得到黑松愈傷組織誘導的培養基。
採用1/2MS培養基為基本培養基，附加NAA 0.5mg/L，IBA 0.1mg/L，GA31.0mg/L，2，4-D 1.0mg/L，LH 100mg/L，蔗糖30g/L，用1mol/L的HCl和1mol/LNaOH的調節pH值為5.86，再加入瓊脂粉6.5g/L，加熱溶解後分裝於100mL的三角瓶中，於121℃，1.05kg/cm2滅菌15min，得到黑松愈傷組織繼代培養用的培養基。若調節pH值後不添加瓊脂粉，分裝滅菌後得到黑松單細胞振蕩培養用的液體培養基。
(2)黑松愈傷組織的誘導將黑松種子分別裝在50mL的小燒杯中，加入少量洗潔精，用紗布封緊杯口，在流水下衝洗乾淨。去殼後以無菌水衝洗3次，75％的乙醇溶液表面消毒3次，每次40s，再用無菌水衝洗3次，之後用0.1％升汞溶液處理4min，無菌水衝洗5次。在超淨工作檯上，用滅過菌的鑷子在滅過菌的培養皿中剝除胚乳，取出成熟胚，將其接入愈傷組織誘導培養基，每瓶接4-6個，置於27℃培養箱內黑暗培養。經過10d左右，將生長良好，即未被汙染和未發生褐變的個體轉移到繼代培養基中保持和增殖。
(3)黑松愈傷組織的繼代培養在無菌操作室中，將愈傷組織切成黃豆大小的組織塊，接入繼代培養基上，每個三角瓶中接入3-4塊，置於27℃恆溫箱中暗培養，每隔20-30d繼代培養一次。
3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備a.分離松材線蟲將在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培養的松材線蟲用貝曼漏鬥法分離。把分離到的松材線蟲離心，鑑定，備用；b.將上述離心，鑑定後的松材線蟲加在事先製備好的2％的平板瓊脂培養基上，用封口膜封好培養皿，置入27℃的恆溫培養箱中培養6-24h；c.在培養期間，觀察松材線蟲的產卵情況；當線蟲產卵量達到實驗所需要求時，在無菌條件下，用滅過菌的吸管吸適量無菌水將瓊脂培養基上的松材線蟲及其中的卵全部洗到滅過菌的離心管中，滴入30％的H2O2(與卵懸液的體積比為1∶1)，在15℃下靜置10min，在顯微鏡下觀察線蟲的死亡情況；d.待線蟲大部分死亡，用無菌水衝洗3-5遍，每次加無菌水後，搖勻後放在離心機上離心3-4min，待衝淨離心管中雙氧水後，用無菌的200目不鏽鋼過濾篩過濾，重複過濾4-6次，直至將大部分線蟲過濾掉為止；e.用事先製備好的NA斜面培養基檢查線蟲卵有無細菌；如果出現細菌，則放棄本次實驗而重新進行。
(2)製備培養液f.無菌條件下，稱取10mg上述愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。
(3)松材線蟲的培養g.用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵h.將上述培養液置於40℃下，暗培養20d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例21、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A菌株的培養及處理(1)NB液體培養基的製備稱取96g營養肉湯(NB)溶於3000ml蒸餾水中，煮沸，分裝於三角瓶中；在121℃，1.05kg/cm2的滅菌鍋中滅菌15min，備用。(2)菌種活化。方法同實施例1。(3)細菌的培養在無菌條件下，將活化的螢光假單胞GcM5-1A菌株接入NB液體培養基中，按每50ml NB液體培養基中接入1ml活化菌株，置於30℃恆溫振蕩器(128r/min)上培養4d。(4)死細菌的獲得將步驟(3)得到的細菌，在無菌條件下，置於-40℃下12h低溫冷凍乾燥，取出後置室溫下解凍，進行冷凍乾燥，得無菌乾燥的死細菌。備用2、培養黑松愈傷組織以與實施例1相同的方法培養黑松愈傷組織，然後，將以上步驟得到的黑松愈傷組織，在無菌條件下，置於-40℃下12h低溫冷凍乾燥，取出後置室溫下解凍，進行冷凍乾燥，得無菌乾燥死的的愈傷組織。備用3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取10mg上述死愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於15℃下，暗培養20d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例31、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例12、培養黑松愈傷組織，方法同實施例13.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取200mg上述活愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於23℃下，暗培養10d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例41、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例12、培養黑松愈傷組織，方法同實施例13.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。
(2)製備培養液無菌條件下，稱取40mg上述活愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於31℃下，暗培養10d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例51、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例22、培養黑松愈傷組織，方法同實施例13.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取150mg上述活愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於25℃下，暗培養4d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例61、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例2
2、培養黑松愈傷組織，方法同實施例13.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取80mg上述活愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於28℃下，暗培養4d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例71、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例22、培養黑松愈傷組織，方法同實施例13.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取120mg上述活愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於15℃下，暗培養20d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例81、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例12、培養並獲得死的黑松愈傷組織，方法同實施例23.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1(2)製備培養液無菌條件下，稱取0.5mg上述死愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於40℃下，暗培養20d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例91、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例22、培養並獲得死的黑松愈傷組織，方法同實施例1，得到黑松愈傷組織後，冷凍乾燥，得無菌乾燥的愈傷組織。
3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取2mg上述乾燥的死愈傷組織和0.1mg上述死螢光假單胞菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於23℃下，暗培養10d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例101、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例12、培養並獲得死的黑松愈傷組織，方法同實施例2。得到黑松愈傷組織後，冷凍乾燥，得無菌乾燥的死愈傷組織。
3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取7.5mg上述乾燥的死愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於31℃下，暗培養10d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例111、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例1。
2、培養並獲得死的黑松愈傷組織，方法同實施例2。得到黑松愈傷組織後，冷凍乾燥，得無菌乾燥的愈傷組織。
3.松材線蟲的無異培養無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例1。(2)製備培養液無菌條件下，稱取4mg上述乾燥的死愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於25℃下，暗培養4d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例121、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例1。
2、培養並獲得死的黑松愈傷組織，方法同實施例2。得到黑松愈傷組織後，冷凍乾燥，得無菌乾燥的愈傷組織。
3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，方法同實施例2。(2)製備培養液無菌條件下，稱取6mg上述乾燥的死愈傷組織和0.1mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵。將上述培養液置於28℃下，暗培養4d後，得所需的無菌松材線蟲。
實施例131、螢光假單胞菌GcM5-1A菌株的培養及處理，方法同實施例1
2、培養並獲得死的黑松愈傷組織同實施例1步驟得到黑松愈傷組織後，將新鮮的無菌愈傷組織在無菌條件下，通過溴乙烷對步驟4中獲得的黑松愈傷組織進行處理(方法同實施例1)，得無菌的死愈傷組織。乾燥，得無菌乾燥的死愈傷組織，備用。
3.松材線蟲的無異培養(1)無菌松材線蟲卵的製備，採用已知的方法培養松材線蟲，待其產卵，採用升汞分離獲得無菌卵。其具體方法是將線蟲卵在75％的乙醇中浸30s，移入0.1％HgCI2溶液表面消毒1min，滅菌水換洗3次。得無菌松材線蟲卵。(2)製備培養液無菌條件下，稱取10mg上述乾燥的死愈傷組織和0.01mg上述死細菌，加入2ml無菌水，或按上述比例配製培養液。(3)松材線蟲的培養用無菌吸管向上述培養液中加入已製備好的無菌松材線蟲卵，將上述培養液置於26℃下，暗培養5d後，得所需的無菌松材線蟲。
當然，在本發明的發明構思下，本發明有多種實施形式，如，本領域技術人員閱讀本說明書後毋需付出創造性勞動即可再現出，在此就不詳述了。
在此還需指出的是，沿用本發明的發明構思，以本發明技術解決方案中步驟4獲得的活愈傷組織或步驟5所獲得的死愈傷組織與步驟1所獲得的活細菌按與步驟6中的相同比例配製的培養液帶菌的松材線蟲，相對於現有培養帶菌的松材線蟲技術而言，同樣更有效，其個體大小、繁殖率、產量和質量都較
權利要求
1.一種無菌松材線蟲的培養方法，包括下列的步驟(1)以常規培養細菌方法培養培養螢光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)GcM5-1A CCTCC NoM 204065獲得細菌活菌體細胞，並對其進行滅活處理從而獲得死細胞，備用；(2)製備無菌松材線蟲卵，備用；(3)培養黑松愈傷組織，備用；(4)無菌條件下，以步驟1、3獲得的各備用材料混合併按下列比例與適量的無菌水配製成不同的培養液黑松愈傷組織∶死細菌(質量比)為100~2000∶1(5)向步驟5獲得的任一培養液中加入步驟2中製備好的無菌松材線蟲卵，置於溫度15-40℃，暗培養4-20d後，得所需的無菌松材線蟲。
2.一種無菌松材線蟲的培養方法，包括下列的步驟(1)以常規培養細菌方法培養螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5-1A CCTCC NoM 204065獲得細菌活菌體細胞，並對其進行滅活處理從而獲得死細胞，備用；(2)製備無菌松材線蟲卵，備用；(3)培養黑松愈傷組織；(4)將上述獲得黑松愈傷組織進行滅活處理從而獲得無菌乾燥的死黑松愈傷組織，備用；(5)無菌條件下，以步驟1、4獲得的各備用材料按下列比例混合併與適量的無菌水配製成不同的培養液死愈傷組織∶死細菌(質量比)為5~100∶1(6)向步驟5獲得的任一培養液中加入步驟2中製備好的無菌松材線蟲卵，置於溫度15-40℃，暗培養4-20d後，得所需的無菌松材線蟲。
3.根據權利要求1或2任一所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述步驟1中採用化學方法中的三氯甲烷法對所獲得的細菌活菌體細胞進行滅活處理從而獲得死細胞，具體做法如下a.將培養得到的菌體細胞置於試管或燒瓶中，用滅過菌的脫脂棉浸適量三氯甲烷(浸透但不滴下)塞入試管或燒瓶口，後塞上棉塞；置於無菌室內約2-4h；b.2h後，用無菌鑷子取出浸有三氯甲烷脫脂棉，將試管口或燒瓶口敞開，在無菌室內放置2-4h，待試管中的三氯甲烷揮發盡後，用接種環取1環菌苔，接入已製備好的NA斜面培養基上，置於28℃的恆溫培養箱中培養48h；c.48h後觀察上述NA斜面培養基上是否有細菌生長，若沒有，則表明細菌已被三氯甲烷殺死，死細菌可備用；否則重新滅菌。
4.根據權利要求1或2任一所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於步驟2中採用H2O2殺死線蟲並分離從而獲得蟲卵，具體做法如下a.分離松材線蟲將在灰葡萄孢(Botryis cinerea)上培養的松材線蟲分離，把分離到的松材線蟲離心，鑑定，備用；b.將上述離心，鑑定後的松材線蟲加在事先製備好的2％的平板瓊脂培養基上，用封口膜封好培養皿，置入27℃的恆溫培養箱中培養6-24h；c.在培養期間，觀察松材線蟲的產卵情況；當線蟲產卵量達到實驗所需要求時，在無菌條件下，用滅過菌的吸管吸適量無菌水將瓊脂培養基上的松材線蟲及其中的卵全部洗到滅過菌的離心管中，滴入30％的H2O2(與卵懸液的體積比為1∶1)，在15℃下靜置10min，在顯微鏡下觀察線蟲的死亡情況；d.待線蟲大部分死亡，用無菌水衝洗3-5遍，每次加無菌水後，搖勻後放在離心機上離心3-4min，待衝淨離心管中雙氧水後，用無菌的200目不鏽鋼過濾篩過濾，重複過濾4-6次，直至將大部分線蟲過濾掉為止；e.用事先製備好的NA斜面培養基檢查線蟲卵有無細菌；如果出現細菌，則放棄本次實驗而重新進行。
5.根據權利要求1或2任一所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述方法的最後一個步驟中的培養溫度為23-31℃，暗培養時間為4-10d。
6.根據權利要求1或2任一所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述方法的最後一個步驟中的培養溫度為25-28℃，暗培養時間為4-5d。
7.根據權利要求1所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述培養液的製備步驟中，愈傷組織與死細菌的質量比為400～1500∶1。
8.根據權利要求1所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述培養液的製備步驟中，愈傷組織與死細菌的質量比為800～1200∶1。
9.根據權利要求2所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述培養液的製備步驟中，無菌乾燥的死愈傷組織與死細菌的質量比為20～75∶1。
10.根據權利要求2所述的無菌松材線蟲的培養方法，其特徵在於所述培養液的製備步驟中，無菌乾燥的死愈傷組織與死細菌的質量比為40～60∶1。
全文摘要
本發明涉及一種無菌松材線蟲的培養方法，包括①培養螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)GcM5－1A CCTCC NoM 204065滅活處理從而獲得死細胞；②培養黑松愈傷組織；③滅活獲得死黑松愈傷組織；④製備無菌松材線蟲卵備用；⑤無菌條件下，按比例配製死/活愈傷組織與死細菌與適量的無菌水成不同的培養液；⑥向獲得的任一培養液中加入製備好的無菌松材線蟲卵，置於溫度15－40℃下暗培養4－20d得所需的無菌松材線蟲。本發明方法培養的松材線蟲其產量和質量都較現有技術更高，同時，該方法便於大規模的工業化生產。
文檔編號A01H15/00GK1644035SQ20041006547
公開日2005年7月27日 申請日期2004年12月2日 優先權日2004年12月2日
發明者趙博光 申請人:趙昕