伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法
2023-10-05 00:03:04 1
伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法
【專利摘要】本發明公開了一種伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法；所述伏立諾他能夠促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein；本發明還涉及前述伏立諾他促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法，包括如下步驟：在海綿共生土麴黴發酵的過程中添加伏立諾他。本發明在搖瓶水平上，於第4天添加終濃度為900μM的伏立諾他，24天後，(+)-Terrein的產量達到5.58g/L，較未添加時的產量為4.31g/L，提高了49.8%，(+)-Terrein的產量有較為顯著的提高；本發明方法簡單，容易實現，效率高，效果顯著，有較好的應用前景。
【專利說明】伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein 的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種提高真菌代謝產物產量的方法，具體是伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法。
【背景技術】
[0002](+)-Terrein (土麴黴酮)是由6_羥基蜂蜜曲菌素經過後修飾而成的環戊烯酮類化合物，1935年首次從土麴黴中分離得到。(+) -Terrein有著良好的生物活性，如抗細菌和真菌、抑制雜草生長、抑制腫瘤細胞血管新生素的分泌、促進成骨細胞與鈦支架融合、抑制黑色素合成、抑制皮膚角質增生、抑制牙髓細胞炎症反應還有乳腺癌細胞毒性等等。其在農業、美容、醫藥等方面廣泛的應用前景使得我們有必要提高其單位產量為後續更深入的研究提供原料基礎。
[0003]目前報導中，通過傳統的搖瓶發酵培養優化,在Aspergillus terreus PF26中 (+)-Terrein 的產量倉泛達至Ij 3.71 g/L (Ying Yin, et al.Medium optimization for the high yield production of single(+)-Terrein by Aspergillus terreus strain PF26derived from marine sponge Phakellia fusca2012, 47 (5):887-891);在優化後的培養基的基礎上添加聚酮合成途徑的促進劑檸檬酸鈉使得搖瓶上(+)-Terrein的產量倉泛提高至1J 5.38g/L (Yin Y，et al.Enhanced production of (+) -Terrein in fed-batch cultivation of Aspergillus terreus strain PF26with sodium citrate.World Journal of Microbiology and Biotechnology2013; 29 (3): 441-446.),但有必要進一步提高其產量。表觀遺傳修飾劑能夠調苄基因的轉錄水平從而影響代謝，本發明從促進土麴黴基因的轉錄水平著手，添加表觀遺傳修飾劑至土麴黴的發酵液中以期提高(+)-Terrein產量。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種伏立諾他的用途及促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法。
[0005]本發明的目的是通過 以下技術方案實現的:
[0006]第一方面，本發明涉及到一種伏立諾他作為促進劑的用途，所述伏立諾他能夠促進海綿共生土麴黴合成(+)_Terrein。
[0007]第二方面,本發明還涉及前述伏立諾他促進海綿共生土麴黴合成(+)_Terrein的方法，包括如下步驟:在海綿共生土麴黴發酵的過程中添加伏立諾他。
[0008]優選地，包括如下步驟:發酵海綿共生土麴黴，向發酵液中添加伏立諾他，即可促進(+)-Terrein的合成。
[0009]優選地，所述海綿共生土麴黴為土麴黴(Aspergillus terreus) PF26CGMCC N0.5208。
[0010]優選地，所述發酵使用的培養基的製備方法包括如下步驟:每IL純水對應取如下質量的各組分:28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og 穀氨酸鈉、10.0Og氯化銨、3.90g硫酸鈉，之後將所述組分溶於1L純水中，即得。[0011]優選地，所述發酵採用搖瓶發酵，在發酵的第4天，添加伏立諾他。[0012]優選地，所述添加伏立諾他具體為，發酵液中伏立諾他的終濃度為900 μm。[0013]優選地，所述添加伏立諾他具體為:稱取適量的伏立諾他，溶解於DMSO中，使得伏立諾他的濃度為0.18Μ，之後採用無菌濾膜過濾，得到伏立諾他母液，之後添加於發酵液中。[0014]優選地，所述無菌濾膜的孔徑為0.22 μm。[0015]與現有技術相比，本發明具有的有益效果為:[0016](I)本發明在搖瓶水平上，於第4天添加終濃度為9 O O μm的伏立諾他，2 4天後，(+)-Terrein的產量達到5.58g/L，較未添加時的產量為4.31g/L，提高了 49.8%， (+)-Terrein的產量有較為顯著的提高。[0017](2)本發明方法簡單，容易實現，效率高，效果顯著，有較好的應用前景。【專利附圖】
【附圖說明】[0018]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、 目的和優點將會變得更明顯:[0019]圖1不同的表觀遺傳修飾劑對土麴黴產(+)_Terrein的影響圖；[0020]圖2不同濃度伏立諾他時對土麴黴產(+)-Terrein的影響圖；[0021]圖3為不同時間添加900 μm的伏立諾他時對土麴黴產(+)_Terrein的影響圖。【具體實施方式】[0022]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明的保護範圍。[0023]以下實施例中涉及(+)-Terrein的具體為土麴黴Aspergillus terreus菌株 PF26,分離自中國南海永興島Phakellia fusca海綿,其保藏信息為:該菌株已於2011年 8月31日遞交CGMCC中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC N0.5208 ;地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編: 100101。[0024]實施例1、確定添加的表觀修飾劑的種類[0025]選擇阿扎胞苷和伏立諾他作為候選促進劑。[0026]培養基的配製:28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og穀氨酸鈉、10.0Og氯化銨、3.90g硫酸鈉溶於IL純水。[0027]阿扎胞苷母液的配製:準確稱量阿扎胞苷並將其溶解於DMSO中，濃度為0.10M，採用0.22 μm的無菌濾膜對其過濾得無菌阿扎胞苷母液。[0028]伏立諾他母液的配製:準確稱量伏立諾他並將其溶解於DMSO中，伏立諾他的濃度為0.18M，採用0.22 μm的無菌濾膜對其過濾得無菌伏立諾他母液。[0029]以上述培養基對土麴黴進行發酵，菌種接種量為4 X IO6個孢子/mL，250mL三角瓶中裝液量為100mL，28°C、180rpm的恆溫搖床中培養，pH自然，於培養的第2天向發酵液中分別添加終濃度為500 UM (500 u L母液)的阿扎胞苷和伏立諾他。
[0030]採用HPLC法測定(+)-Terrein含量，圖1所示為海綿共生土麴黴在添加不同種類的表觀修飾劑後(+)-Terrein的產量，由圖1可知:對照組、添加阿扎胞苷組、添加伏立諾他組的(+)-Terrein含量分別為:4.30g/L、3.00g/L、4.80g/L。添加伏立諾他時，促進效果較為明顯，由此，以伏立諾他作為較優促進劑添加至發酵液中。
[0031]實施例2、單因素實驗確定伏立諾他的最佳添加濃度和添加時間
[0032]上述實施例1確定伏立諾他作為較優促進劑，在此基礎上研究其添加濃度和添加時間對(+)-Terrein產量的影響。
[0033]研究伏立諾他的最佳添加濃度，設置4個濃度梯度，分別為500 ii M，900 ii M， 1300 u M，1700 u M0對土麴黴進行發酵，於培養的第2天分別添加終濃度為500 u M，900 u M， 1300 PM，1700 ii M的伏立諾他，第24天測量(+)-Terrein含量及菌體乾重。結果如圖2所示，第2天添加900 u M的伏立諾他時，(+) -Terrein產量為5.21g/L，較對照組的4.31g/L， 提高了 21%，由此以900 u M作為伏立諾他的最佳添加濃度。
[0034]在此基礎上，研究伏立諾他的最佳添加時間，對土麴黴進行發酵，於培養的第0，2， 4,7,12天分別添加終濃度為900 u M的伏立諾他，於第24天測量(+) -Terrein含量及菌體乾重。結果如圖3所示，於第4天添加900 ii M伏立諾他時，(+)-Terrein產量為5.58g/L， 較對照組的4.31g/L，提高了 39.8%。
[0035]由上，伏立諾他的最佳添加策略為:發酵第4天，添加900 u M的伏立諾他。採用這種方法，(+)-Terrein產量較對照提高了 39.8%。
[0036]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明並不局限於上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的範圍內做出各種變形或修改，這並 不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1.一種伏立諾他作為促進劑的用途，其特徵在於，所述伏立諾他能夠促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein。
2.一種促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法，其特徵在於，包括如下步驟:在海綿共生土麴黴發酵的過程中添加伏立諾他。
3.如權利要求2所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法,其特徵在於,包括如下步驟:發酵海綿共生土麴黴，向發酵液中添加伏立諾他，即可促進(+)-Terrein的合成。
4.如權利要求3所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法,其特徵在於,所述海綿共生土麴黴為土麴黴(Aspergillus terreus) PF26CGMCC N0.5208。
5.如權利要求3所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法,其特徵在於， 所述發酵使用的培養基的製備方法包括如下步驟:每IL純水對應取如下質量的各組分: 28.41g葡萄糖、23.18g麥芽糖、20.0Og甘露醇、8.52g麥芽提取物、10.0Og穀氨酸鈉、10.0Og 氯化銨、3.90g硫酸鈉，之後將所述組分溶於IL純水中，即得。
6.如權利要求3所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法，其特徵在於，所述發酵採用搖瓶發酵，在發酵的第4天，添加伏立諾他。
7.如權利要求3所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法，其特徵在於，所述添加伏立諾他具體為，發酵液中伏立諾他的終濃度為900 μ Mo
8.如權利要求3所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法,其特徵在於， 所述添加伏立諾他具體為:稱取適量的伏立諾他，溶解於DMSO中，使得伏立諾他的濃度為.0.18Μ，之後採用無菌濾膜過濾，得到伏立諾他母液，之後添加於發酵液中。
9.如權利要求8所述的促進海綿共生土麴黴合成(+)-Terrein的方法,其特徵在於,所述無菌濾膜的孔徑為0.22 μ m。
【文檔編號】C12P7/26GK103497975SQ201310275382
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】肖嵐, 李志勇, 張風麗 申請人:上海交通大學