用於特異性檢測抗β-內醯胺抗生素的革蘭氏陰性菌的培養基的製作方法

2023-10-05 12:35:04

專利名稱：用於特異性檢測抗β-內醯胺抗生素的革蘭氏陰性菌的培養基的製作方法
用於特異性檢測抗β_內醯胺抗生素的革蘭氏陰性菌的培養基本發明的領域是通過生物化學手段進行的微生物分析，以及特別是對微生物比如細菌或酵母菌的檢測和鑑定。細菌對抗生素的抗性是一個主要的公共健康問題。感染性微生物對治療的抗性與抗感染分子同時發展，如今成為治療中的主要障礙。這樣的抗性是許多問題的原因，包括實驗室檢測的困難、受限的治療選擇和對臨床結果的有害影響。特別是，致病菌的抗性在過去 20年間快速且不可抑制的增長，成為醫學中當前主要的問題之一。這些生物體所引起的感染使得住院期間延長，並且與治療失敗後的高發病和死亡率相關。在細菌菌株中可以同時涉及幾種抗性機制。其通常被分為3類抗生素對細菌的穿透不足、抗生素被細菌酶系統失活或排出、以及抗生素和細菌靶標之間缺乏親和力。就所涉及的物種和抗生素的數目而言，酶失活是獲得性抗性中最常見的機制。因此，染色體C類頭孢菌素酶目前構成了革蘭氏陰性菌的主要抗性機制之一，表達此酶的細菌對頭孢菌素有抗性。類似地，β-內醯胺酶是由某些細菌表達的酶，其能夠水解β-內醯胺抗生素家族抗生素的基本結構β -內醯胺環中的C-N鍵，以生成對微生物無活性的產物。 幾種內醯胺酶抑制劑(BLI)，如棒酸(CA)、三唑巴坦和舒巴坦，已經被開發出來以增加抗微生物的活性以及拓寬與其相關的內醯胺抗生素譜。它們作為內醯胺酶的自殺性底物起作用，從而防止抗生素的酶降解並使它們對最初有抗性的細菌變得有效。然而，由於菌株持續暴露在抗生素壓力下，細菌通過持續和動態地產生β_內醯胺酶表現出其適應能力，β-內醯胺酶隨著新分子的發展而同時演變。結果，產生高水平染色體C類頭孢菌素酶的革蘭氏陰性菌(提及的為HL Case細菌)，以及產生超廣譜β-內醯胺酶的革蘭氏陰性菌(提及的為ESBL細菌)成為日益增加的威脅，特別是由於所涉及到的細菌種類數目也在增加。HL Case和ESBL細菌不僅對基於第一和第二代頭孢菌素和青黴素的治療具有抗性，而且還對第三代頭孢菌素(C3G)(頭孢噻肟CTX、頭孢他啶CAX，頭孢泊肟CPD，頭孢曲松 CR0)和單醯胺菌素(氨曲南ATM)的治療具有抗性。另一方面，7α-甲氧基頭孢菌素(頭孢黴素頭孢西丁、頭孢替坦)和碳青黴烯(亞胺培南、美羅培南、厄他培南)通常保持其活性。ESBL被β-內醯胺酶抑制劑(BLI)所抑制，這使其可以與其它頭孢菌素酶相區分。這些細菌因而最通常地是同時表現出對幾種治療的抗性，這對於建立相關的治療並避免治療的失敗而言帶來了困難。大腸桿菌(Escherichia coli)因而可以是HLCase 和ESBL。此外，由於ESBL-陽性腸道菌有通過菌株的克隆傳遞或接合質粒轉移而散播抗性的趨勢，這成為控制感染方面的問題。在大多數的研究中，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌 (Klebsiellapneumoniae)仍是最常見的產ESBL的種類。然而,在過去的幾年中,ESBL已極大的擴寬了其宿主種類的範圍。事實上，許多種類的腸道細菌和非發酵革蘭氏陰性菌(如綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))也已經被報導產生ESBL。因此，從公共健康的視角來看，能夠儘快鑑定這樣的微生物以及這樣的抗性機制
就變得至關重要。通常，按照下面的步驟搜尋對治療具有抗性的微生物
1.取可能含有所述微生物的生物樣品；2.接種並溫育培養基(18到48h)以誘導該微生物的指數生長；3.在培養基上精確找到可能有意義的微生物的菌落；4.鑑別該微生物種類；5.鑑定所分析的微生物的抗性機制、其生物學意義，以及任選的適合的療法。此連續的步驟在取可能含有微生物的生物樣品和給出適合患者的療法之間包括相當長的時間。而且，使用者通常必須實施手動將微生物從第一培養基轉移到第二培養基的步驟，這可能導致問題，特別是汙染問題，而且對操作者的健康也有風險。舉例來說，為了檢測超廣譜內醯胺酶(ESBL)在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌菌株中的存在，可以使用如 Jacoby和Han的出版物中描述的擴散技術(J Clin Microbiol. 34(4) :908_11，1996)，然而該技術沒有提供任何關於鑑定所測試的菌株的信息其可以確定細菌是否為產生ESBL的細菌，但它不能區分這樣的細菌是大腸桿菌還是肺炎克雷伯菌。代謝底物也被用於檢測ESBL或HL Case的存在。在這方面，AES實驗室建議使用將含頭孢噻肟的德氏培養基(Drigalski medium)與含頭孢他啶的麥氏培養基相結合的雙片(biplate)培養基。德氏和麥氏培養基使得可以顯示出乳糖酸化、這是非常多的腸道細菌種類中存在的代謝。然而，這樣的培養基使得只可以區分抗性菌株與非抗性菌株，而不能區分表達ESBL的細菌與表達HL Case的細菌。該培養基也不能鑑定具體的細菌種類，還不能例如區別大腸桿菌和肺炎克雷伯菌。在對ESBL之外的抗性機制進行檢測的情況中，可提及的是專利申請EPO卯4560， 其涉及通過將萬古黴素與顯示兩種酶活性(β_葡糖苷酶和吡咯烷酮芳基醯胺酶)的生色培養基相結合，來搜尋萬古黴素抗性腸球菌。然而，此生色培養基僅使得可以確定萬古黴素抗性菌株是否屬於腸球菌(Enterococcus)屬，而不能鑑定種類或所涉及的抗性機制，特別是不能鑑定抗性是獲得性抗性還是野生性抗性。因此，對微生物種類的鑑別，以及隨後的對於其治療抗性的鑑定是漫長而費力的。 當分離物實際上沒有抗性微生物時，如果實驗室給臨床醫生提供了陽性信息，這可能導致不必要和不適當的治療。相反，沒有傳達隨後被確認的陽性信息，會使對患者的隔離(以及可能的適當的治療)的建立延遲一天。這顯示了對快速和可靠的確認測試的需求。因此本發明要通過提供新的診斷工具來改進現有技術，所述診斷工具使得可以在時間、可靠性、以及與所實施療法的相關性方面獲得益處。我們的發明使得可以在單一步驟中鑑定存在於樣品中的革蘭氏陰性菌種類並確認其抗性機制從而為每位患者提出適當的療法。在進一步公開本發明之前，提供下列定義以便於理解本發明。術語「反應培養基」是指含有微牛物如金黃代葡萄球菌的存活和/或生長所需的所有元素的培養基。此反應培養基可以僅作為顯示培養基，或可以作為培養和顯示培養基。在第一種情況下，微生物的培養在接種之前進行，而在第二種情況下，反應培養基也構成培養培養基。反應培養基可以是固體、半固體或液體。術語「固體培養基」是指，例如，凝膠培養基。優選本發明的培養基為凝膠培養基。瓊脂是在微生物學中培養微生物的常規膠凝劑，但可以使用明膠或瓊脂糖。某些製備物是商業可購買的，如Columbia瓊脂、Trypcase-soy 瓊月旨、Mac Conkey 京月旨、Sabouraud 京月旨，或更通常的有 Handbook of Microbiological Media(CRC出版)中所描述的那些。本發明的反應培養基可以包含任選的其他添加劑，例如蛋白腖、一種或多種生長因子、碳水化合物、一種或多種選擇性物質、緩衝溶液、一種或多種膠凝劑等。此反應培養基可以是待用的液體或凝膠形式，即其準備用於在試管或燒瓶中或者在皮氏培養皿上的接種。當其以燒瓶中凝膠的形式提供時，優選在倒入皮氏培養皿之前進行事先的培養基再生 (經100°C (passage ΙΟΟ ))。也可以是粉末形式的培養基或燒瓶中的培養基，其在被倒入皮氏培養皿、試管或燒瓶之前，具有向其中添加的補充物。優選本發明的培養基為選擇性培養基，S卩，含有促進革蘭氏陰性菌生長的化合物的培養基。特別可以提及的是檸檬酸鈉、亞硫酸鈉、抗生素如萬古黴素、抗真菌的如兩性黴素B、納他黴素或放線菌酮、表面活性劑如膽鹽、脫氧膽酸鈉或Tergitols、以及染料如亮綠、結晶紫、品紅、曙紅或亞甲藍。優選本發明的培養基是含有促進超廣譜內醯胺酶 (ESBL)細菌生長的化合物的選擇性培養基。特別可以提及的是頭孢菌素 第一代頭孢菌素，如頭孢氨苄、頭孢噻啶、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢羥氨苄、頭孢西酮、頭孢曲秦、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢乙腈、cefrodaxine、頭孢替唑； 第二代頭孢菌素，如頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢孟多、頭孢克洛、頭孢替坦、頭孢尼西、頭孢替安、氯碳頭孢、頭孢美唑、頭孢丙烯、頭孢雷特； 第三代頭孢菌素，如頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢磺啶、頭孢曲松、頭孢甲肟、拉氧頭孢、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢地嗪、頭孢他美、頭孢匹胺、頭孢哌酮、頭孢泊肟、頭孢布烯、 頭孢地尼、頭孢託侖、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢拉宗； 第四代頭孢菌素，如頭孢吡肟、頭孢匹羅。對於革蘭氏陰性菌，可以特別提及的有下列屬的細菌假單胞菌(I^eudomonas)、 埃西氏菌Escherichia)、沙門氏菌(Salmonella)、志賀氏菌(Shigella)、腸桿菌 (Enterobacter)、克雷伯菌(Klebsiella)、沙雷菌(Serratia)、變形桿菌(Proteus)、彎曲桿菌(Campylobacter)、嗜血菌(Haemophilus)、摩根氏菌(Morganella)、弧菌(Vibrio)、耶爾森氏菌(Yersinia)lif (Acinetobacter)、布蘭漢氏球菌(Branhamella)、奈瑟球菌(Neisseria)、伯霍爾德桿菌(BurWiolderia)、檸檬酸桿菌(Citrobacter)、哈夫尼亞菌 (Hafnia)、愛德華氏菌(Edwardsiella)、氣單胞菌(Aeromonas)、摩拉克氏菌(Moraxella)、 巴斯德菌(Pasteurella)、普羅維登斯菌(ftOvidencia)和軍團菌(Legionella)。表沭「 β -內醯胺抗牛素抗件機制」是指使得微牛物可以使對其的治療部分地或完全地失效而保證其生存的任何類型的方式，其中所述方式與屬於超廣譜內醯胺酶組的酶的表達相關，或者與屬於高水平表達的染色體C類頭孢菌素酶組的酶的表達相關。表沭「用於β -內醯胺抗牛素抗件機制的標記物，，是指使得可以展示這樣的抗件機制的化合物，如頭孢吡肟及其鹽(Masuyoshi S.等，1989-「Comparison of the in vitro and in vivo antibacterial activities of cefepime(BMY-28142)with ceffazidime, cefuzonam, cefotaxime and cefmcnoxime.，，)。表沭「所沭β_內醯胺抗牛素抗件機制之外的抗件機制的抑制劑」是指這樣的化合物，其使得可以間接抑制發展出特定抗性的生物體的生長，而不對表達所述內醯胺抗生素抗性機制的革蘭氏陰性菌產生抑制，如氯唑西林(Jack和RichmOndl970- "A comparative study of eight distinct beta-lactamases synthesized by gram-negative bacteria. 」)用於對C類頭孢菌素酶的抑制。為了本發明的目的，酶或者代謝活性的底 選自可以被水解為這樣的產物的任何底物，所述產物使得可以直接或間接檢測代謝的酶活性，例如特別是糖苷酶(osidase)活性，優選葡萄糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶或半乳糖苷酶活性。其可以是天然或合成底物。底物的代謝引起反應培養基或生物體細胞的物理化學屬性的變化。這樣的變化可通過物理化學方法來檢測，特別是通過操作者眼睛的光學方法、 或者通過光譜、電、磁等儀器的手段。優選其是光學屬性的變化，如吸收、螢光或發光中的改變。作為生色底物，可以特別提及的是基於吲羥、黃酮、茜素、吖唆、七葉亭、吩惡嗪、硝基酚、硝基苯胺、萘酚、兒茶酚、羥基喹啉、香豆素、氨基苯酚或二氯氨基苯酚的底物。優選本發明所使用的是基於吲羥的底物。作為螢光底物，可以特別提及的是基於傘形酮或香豆素的底物，基於試滷靈、吩惡嗪、萘酚、萘胺、2』 -羥基苯基雜環或2』 -氨基苯基雜環的底物，或者基於螢光素的其它底物。優選本發明中使用的底物為5-溴-4-氯-3-吲羥-β -D-吡喃葡萄糖苷，優選與 5-溴-6-氯-3-吲羥-，β_ -D-吡喃半乳糖苷組合。其他可能的底物；β -葡糖苷酶底物 5-溴-6-氯-3-吲羥-β -葡萄糖苷；二羥基黃酮-β -葡萄糖苷；3-羥基黃酮-β -葡萄糖苷，3，4_環己並七葉亭-β-葡萄糖苷(沒有提及3，4_環戊並七葉亭-β-葡萄糖苷？)； 8-羥基喹啉- β -葡萄糖苷；5-溴-4-氯-3-吲羥-N-甲基- β -葡萄糖苷；6-氯-3-吲羥-β -葡萄糖苷；5-溴-3-吲羥-β -葡萄糖苷；5-碘-3-吲羥-β -葡萄糖苷；6-碘-3-吲羥-β -葡萄糖苷；6-氟-3-吲羥-β -葡萄糖苷；茜素-β -葡萄糖苷；硝基苯基-β -葡萄糖苷；4-甲基傘形酮-β -葡萄糖苷；萘酚基苯甲醇-β -葡萄糖苷；吲羥-N-甲基-β -葡萄糖苷；萘基-β -葡萄糖苷；氨基苯基-β -葡萄糖苷；二氯氨基苯基-β -葡萄糖苷；β -半乳糖苷酶底物5-溴-4-氯-3-吲羥-β -半乳糖苷；二羥基-黃酮-β -半乳糖苷；3，4-環己並七葉亭-β -半乳糖苷；8-羥基-喹啉-β -半乳糖苷；5-溴-4-氯-3-吲羥-N-甲基-β -半乳糖苷；6-氯-3-吲羥-β -半乳糖苷；5-溴3-吲羥-β -半乳糖苷；5-碘-3-吲羥-β -半乳糖苷；6-氟-3-吲羥-β -半乳糖苷；茜素-β -半乳糖苷；硝基苯基-β -半乳糖苷；4-甲基傘形酮-β -半乳糖苷；萘酚基苯甲醇-β -半乳糖苷；噴輕-N-甲基-β -半乳糖苷；萘基-β -半乳糖苷；氨基苯基-β -半乳糖苷；二氯氨基苯-β -半乳糖苷；β -葡萄糖醛酸糖苷酶底物5-溴-6-氯-3-吲羥-β -葡萄糖苷酸；二羥基黃酮-β -葡萄糖苷酸；3，4_環己並七葉亭-β-葡萄糖苷酸；8-羥基喹啉-β-葡萄糖苷酸；5-溴-4-氯-3-吲羥-β -葡萄糖苷酸；5-溴-4-氯-3-吲羥-N-甲基-β -葡萄糖苷酸；6-氯-3-吲羥-β -葡萄糖苷酸；5-溴-3-吲羥-β -葡萄糖苷酸；5-碘-3-吲羥-β -葡萄糖苷酸；6-氟-3-吲羥-β-葡萄糖苷酸；茜素-β-葡萄糖苷酸；硝基苯基-β-葡萄糖苷酸；4-甲基傘形酮-β -葡萄糖苷酸；萘酚基苯甲醇-β -葡萄糖苷酸；吲羥-N-甲基-β -葡萄糖苷酸；萘基-β -葡萄糖苷酸；氨基苯基-β -葡萄糖苷酸；二氯氨基苯基-葡萄糖苷酸；α -葡糖苷酶底物，α -半乳糖苷酶底物，酯酶，特別是脂肪酶或磷酸酯酶底物，纖維二糖糖苷酶底物，核糖糖苷酶底物和己糖胺酶底物。本發明的底物可以被用於廣泛的pH範圍，特別是在pH5. 5到10之間，優選6. 5到 10之間。當本發明的培養基包含一種或多種β-葡糖苷酶酶活性的底物時，底物的濃度優選在0. 01到2g/l之間，更優選在0. 02到0. 2g/l之間，而有利地是在0. 05到0. 15g/l之間。這是因為，在此底物濃度，獲得了更好的顏色對比。優選的，所述生色底物選自葡萄糖醛酸糖苷酶底物、β -葡糖苷酶底物和β -半乳糖苷酶底物。術語「^UMM」是指源自生物液體樣本的臨床樣品，或源自任何類型食物的食物樣品。此樣品因而可以是液體或固體，可以以非限制性方式提及的有血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品、或者直腸、鼻、喉、皮膚、傷口或腦脊髓液樣本的臨床樣品，或者來自水的食物樣品，來自飲料如牛奶或果汁的食物樣品，來自酸奶、來自肉類、來自蛋、來自蔬菜、來自蛋黃醬、來自奶酪、來自魚等的食物樣品，或者來自動物飼料的食物樣品，例如特別是來自動物膳食的樣品。在這方面，本發明涉及用於具有β -內醯胺抗生素抗性機制的革蘭氏陰性菌的反
應培養基，其含有· β-內醯胺抗生素抗性機制的標記物，其為頭孢吡肟， 所述β -內醯胺抗生素抗性機制之外的抗性機制的抑制劑。根據本發明一個優選的實施方案，所述抗性機制的抑制劑為氯唑西林。優選氯唑西林的濃度在0. 05到lg/Ι之間，而且更優選在0. 1到0. 3g/l之間。有利的為0. 2g/l。根據本發明一個優選的實施方案，頭孢吡肟的濃度在0. 05到lmg/1之間，更優選在0. 10到0. 5mg/l之間。有利的為0. 25mg/l。根據本發明一個優選的實施方案，反應培養基也包含酶活性或代謝活性的底物， 優選為生色底物。根據本發明一個優選的實施方案，所述生色底物選自葡萄糖醛酸糖苷酶底物、 β-葡糖苷酶底物和β-半乳糖苷酶底物。根據本發明一個優選的實施方案，生色底物的濃度在0. 02到2g/l之間而更優選在0. 03到0. 5g/l之間。有利的為0. lg/1。根據本發明一個優選的實施方案，所述培養基包括至少兩種生色底物的組合。根據第一個實施方案，該組合包括葡萄糖醛酸糖苷酶底物和葡糖苷酶底物。根據第二個實施方案，該組合包括β-半乳糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物。本發明也涉及上文所定義的培養基的用途，其用於檢測對β -內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌，優選檢測超廣譜內醯胺酶(ESBL)細菌。本發明也涉及檢測對β -內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌的方法，其特徵在於包括下列步驟1.提供如上文所定義的反應培養基，2.用待測生物樣品接種所述培養基，3.進行溫育，以及4.檢測對β -內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌的存在。溫育優選在30°C到42°C之間的溫度進行。優選通過使得可以獲得有色或螢光菌落的具體的葡萄糖醛酸糖苷酶、β-葡糖苷酶或β-半乳糖苷酶活性來檢測對β-內醯胺抗生素具有抗性的革蘭氏陰性菌。其他的種類則呈現無色或者與對β-內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌菌落具有不同的顏色或螢光。給出下面的實施例用做解釋而本質上不是為了限制。其使得可以更清楚的理解本發明。實施例1菌株的選擇發明人選擇使得可以評價關於革蘭氏陰性菌種類的抗生素活性的菌株腸道細菌和非發酵桿菌。特別的，使用了產ESBL菌株、產高水平頭孢菌素酶的菌株(HL Case)和沒有特別抗性特點的菌株(稱為野生型)。培養基的製備所測試的培養基是由ChromID CPS培養基(bioMerieux ref43541)的蛋白腖基礎組成，高壓蒸汽滅菌後向該融化的培養基中加入300mg/l氯唑西林，並且對培養基T 加入％ig/ml頭孢泊肟，對培養基A 加入0. 25mg/L的頭孢吡肟，對培養基B 加入;3mg/l的頭孢孟多，以及對培養基C 加入3mg/ml的頭孢呋辛。培養基的接種通過使用0. 5McF的細菌懸液進行3區劃線法來接種培養基。隨後在37°C將該培養基溫育M小時。培養基的讀取在18小時和M小時溫育後目視觀察該培養基。根據下面的尺度評價生長密度以及顯色和顯色強度。-或0，沒有生長或沒有酶活性的表達(即，未顯色)+ 弱生長或弱酶活性++ 非常強的生長密度或強酶活性(非常強的顯色)結果
權利要求
1.用於具有β-內醯胺抗生素抗性機制的革蘭氏陰性菌的反應培養基，其含有 用於β-內醯胺抗生素抗性機制的標記物，其是頭孢吡肟， 所述β-內醯胺抗生素抗性機制之外的抗性機制的抑制劑。
2.權利要求I的反應培養基，特徵在於所述抗性機制的抑制劑為氯唑西林。
3.權利要求I或2的反應培養基，特徵在於頭孢吡肟的濃度在O.05到lmg/1之間，更優選在O. I到O. 5mg/l之間。
4.權利要求1-3之一的反應培養基，還包含酶活性或代謝活性的底物，優選為生色底物。
5.權利要求4的反應培養基，其中所述生色底物選自葡萄糖醛酸糖苷酶底物、β-葡糖苷酶底物和半乳糖苷酶底物。
6.權利要求I到5任一項的反應培養基用於檢測對β-內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌的用途。
7.權利要求6的用途，其中所述對β_內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌為超廣譜 β-內醯胺酶(ESBL)細菌。
8.用於檢測對β_內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌的方法，特徵在於其包括下列步驟a)提供權利要求1-5任一項的反應培養基，b)用待測生物樣品接種所述培養基，c)進行溫育，以及d)檢測對β_內醯胺抗生素具抗性的革蘭氏陰性菌的存在。
全文摘要
本發明涉及用於對β-內醯胺抗生素具有抗性機制的革蘭氏陰性菌的反應培養基，所述反應培養基包括用於β-內醯胺抗生素抗性機制的標記物，其為頭孢吡肟，所述β-內醯胺抗生素抗性機制之外的抗性機制的抑制劑。
文檔編號C12Q1/04GK102597259SQ201080033448
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月13日 優先權日2009年7月27日
發明者G·贊巴阿迪 申請人:生物梅裡埃公司