犬埃裡希氏體的基因和疫苗的製作方法

2023-10-07 00:27:29 2

專利名稱：犬埃裡希氏體的基因和疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及獸醫病原體領域。本發明更具體地涉及細菌的犬病原體犬埃裡希氏體的特定基因的序列，以及該技術在開發疫苗中的應用。
犬埃裡希氏體是小的，專性胞內的革蘭氏陰性細菌。該細菌是犬單核細胞埃裡希病(CME)的致病因子，CME是一種主要感染犬的蜱傳疾病。犬埃裡希氏體最常見的載體是褐色犬蜱Rhipicephalussanguineus。該病最早於1935年描述於阿爾及利亞。隨後，於1962年在美國得以確認，但目前已傳播到世界上的很多地方。在越南戰爭期間，犬單核細胞埃裡希病吸引了很多關注，當時有160條軍犬死於犬埃裡希氏體感染。當前，還沒有抗犬埃裡希氏體的免疫接種措施。該病是威脅生命的疾病，一直是獸醫和寵物擁有者所關心的重要健康問題。
犬單核細胞埃裡希病是傳染性的血液病。該病的主要特徵是細胞血液因子的減少。犬埃裡希氏體在白血細胞(白細胞)中生長和繁殖，最終影響整個淋巴系統，並破壞多個器官。通過靶向白血細胞，這些細胞快速死亡。這些死亡的血細胞主要遷移至脾臟，結果使脾臟腫大。骨髓意識到白血細胞的喪失，開始工作以形成新的健康細胞。骨髓將不成熟的細胞發送出去，這些不成熟的細胞不能適當地工作。這些不成熟的細胞經常模仿白血病患者的那些細胞，因此該病被誤診為白血病。犬單核細胞埃裡希病使犬易患多種癌症。
犬單核細胞埃裡希病分三個時期。第一期即急性期很象是輕微的病毒感染。在急性期，大多數(如果不是全部的話)損害是可逆的，動物可能會恢復。此階段的治療最為有效，迫切需要早期檢測。然而，如果不進行治療，動物會發展成亞臨床(第二)期和/或慢性(第三)期。當動物到達慢性期時，細菌生物體已定居於骨髓內。此期的很多犬遭遇大面積的內出血，或出現致命的併發症，如突然中風，心臟病突發，腎衰竭，脾破裂或肝臟衰竭。
可以在體外，在哺乳動物-衍生的細胞系(DH82)中培養犬埃裡希氏體。連續維持這些細胞是困難的，因為在細胞培養物中必須每兩周添加一次原代單核細胞(骨髓中發現的白血細胞)。培養物生長很慢，而培養基很昂貴。
有關犬埃裡希氏體基因組中的基因的資料主要集中在16S rRNA基因上。以前的工作已測定了該基因的序列，所述基因是埃裡希氏體家族成員以及世界上大多數生物中普遍存在的組分。該基因在所有生物中的高序列同源性使其難以成為疫苗開發的候選基因。如果希望得到抗此致命疾病的疫苗，必須在該基因組中尋找其它基因。
對16S rRNA基因的測序結果表明犬埃裡希氏體與人埃裡希病的新病原體恰菲埃裡希氏體密切相關(98.2％同源性)。當用抗犬埃裡希氏體，恰菲埃裡希氏體和尤氏埃裡希氏體(另一種人埃裡希病的病原體)的抗血清探測時，犬埃裡希氏體的Western印跡是相似的，表明這三種埃裡希氏體之間有密切的抗原關係(Chen等，1994)。
已開發出間接螢光抗體試驗(IFA)用於檢測犬單核細胞埃裡希病。IFA檢測犬血液中抗入侵生物的抗體的存在。不幸的是，該試驗不是總準確。有時，處於急性期的犬被檢測為陰性，因為它們的免疫系統延遲形成抗體。如果慢性期的滴度低的話，會出現另一種錯誤的陰性結果。該試驗的另一個缺點是可發現交叉-反應性。抗犬埃裡希氏體的多克隆抗體可與恰菲埃裡希氏體呈陽性反應，暗中破壞了該試驗的特異性。已使用了另一種試驗，即Giesma塗片來定位犬血液中實際存在的生物體。不幸的是，儘管使用了適當的染色技術和加強的膠片檢查，但經常不能定位生物體。這些試驗可能出現的錯誤使得必須為該疾病提供較好的診斷工具。
由於難以檢測蜱咬傷，早期診斷感染，抑制宿主防禦和該病持久感染的特性，因此犬迫切需要抗犬埃裡希氏體的有效疫苗。
發明簡述本發明公開了犬埃裡希氏體基因的新序列資料。具體地說，已鑑定並測序了一個克隆。在此克隆內已鑑定出4種被稱為ProA，ProB，ORF(功能未知的開放閱讀框)和細胞色素氧化酶同系物的蛋白質。另外，已發現編碼脂蛋白信號肽酶同系物的部分基因。
本發明的實施方案包括用此序列和蛋白質信息生產疫苗。本發明公開的蛋白質的抗原性很強。因此，它們作為疫苗可能是很有用的。通過此項新技術可以製備的疫苗類型包括DNA疫苗，重組疫苗和T細胞表位疫苗。
用抗犬埃裡希氏體的多克隆抗體篩選文庫。多克隆抗體產生自被攜有犬埃裡希氏體的蜱咬過的犬。用大腸桿菌宿主菌株裂解物預吸附多克隆抗體。以1,000個菌落形成單位的密度將文庫鋪於平皿上。將菌落轉移至硝酸纖維素濾膜，用1ml預吸附的多克隆抗體探測每個濾膜。用由與鹼性磷酸酶-綴合的山羊抗-兔IgG(Kirkegaard和PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)組成的第二抗體鑑定陽性菌落，然後，用含有氮藍四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)的底物溶液顯色。將陽性克隆重新篩選3次。
由此篩選方法分離出3個克隆(

圖1)。最長的基因組片段(pCH4)編碼4個完整的基因和1個部分基因。它完整地編碼蛋白質ProA，ProB，ORF和細胞色素氧化酶同系物，並含有脂蛋白信號肽酶同系物的部分序列。ProA和ProB位於單個操縱子上。通過本領域已知的，並列入參考文獻(Chang等，1987；Chang等，1989a；Chang等，1989b；Chang等，1993a；Chang等，1993b)的技術進行限制性內切核酸酶消化作圖和DNA測序。簡單地說，通過在ABI PRISM 377型DNA系統上進行自動化DNA測序來測定DNA序列。通過引物步移測定兩條鏈上的完整核苷酸序列。測序反應的熱循環利用了Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle測序試劑盒。通過使用國家生物技術信息中心(NCBI)的BLAST網絡伺服器，在資料庫中搜索同源蛋白質(Althchul等，1990；Gish等，1993)。序列信息對犬埃裡希氏體基因進行測序。克隆的片段含有5,300個核苷酸，並編碼4種蛋白質。在羧基末端也有一個部分基因。SEQ.ID.NO.1是完整的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.2和3是SEQ.ID.NO.1的核苷酸12至533的翻譯產物，並編碼細胞色素氧化酶同系物。細胞色素氧化酶對毒力至關重要，因此可用於候選疫苗。SEQ.ID.NO.4和5是SEQ.ID.NO.1的核苷酸939至2252的翻譯產物，並編碼ProA。SEQ.ID.NO.6和7是SEQ.ID.NO.1的核苷酸2258至3664的翻譯產物，並編碼ProB。初步證據表明ProA和ProB是蛋白酶。SEQ.ID.NO.8和9是SEQ.ID.NO.1的核苷酸4,121至4,795的翻譯產物，並編碼具有未知功能的蛋白質ORF。SEQ.ID.NO.10和11是SEQ.ID.NO.1的核苷酸4,884至5,300的互補序列的翻譯產物，並編碼脂蛋白信號肽酶同系物的部分序列。脂蛋白信號肽酶是膜蛋白，本性上不大適合疫苗開發。然而，在生產疫苗時，該蛋白質仍值得研究。過量表達ProA，ProB，ORF細胞色素氧化酶和脂蛋白信號肽酶同系物在T7啟動子質粒中過量表達犬埃裡希氏體抗原。pRSET載體允許在T7 RNA聚合酶的存在下在大腸桿菌中進行高水平的表達，所述聚合酶對T7啟動子具有強親和性。將抗原基因亞克隆至pRSET載體之後，將亞克隆轉化至F′大腸桿菌JM109菌株。為了使蛋白質表達水平最高，將轉化子培養至O.D.600＝0.3，暴露於IPTG(1mM)達1小時，然後以每個細胞5-10個噬斑形成單位(pfu)的感染複數(MOI)，用M13/T7噬菌體轉染。時間進程研究表明在誘導後2小時達到最大誘導。
離心收集沉澱物，將細胞重新懸浮於6M胍(PH 7.8)。通過本領域已知的，並列入參考文獻(Chang等，1993c)的技術，用弗式壓碎器破碎細胞，以6000rpm旋轉總裂解物以分離細胞碎片。按廠商(Invitrogen，San Diego，CA)說明，在變性條件下使用固定化金屬離子親和層析(IMIAC)純化每種蛋白質。通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質樣品，用考馬斯藍染色之後進行觀察。疫苗開發在本發明之前，未開發出抗犬埃裡希氏體的疫苗。犬埃裡希氏體是世界上很多地方的犬和密切相關的犬科動物所特有的。北美犬的風險也正在增加，使用本發明可能會每年挽救數千隻犬的生命。極其需要一種犬埃裡希氏體疫苗，該疫苗能引發抗這種蜱傳犬病的細胞-介導的免疫力。DNA疫苗通過將感興趣的基因亞克隆至真核質粒載體，可以構建DNA疫苗。候選載體包括但不限於pcDNA3，pCI，VR1012，和VR1020。該構建體被用作疫苗。
新鑑定的基因中的每一種，ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物可用於產生DNA疫苗(評論見Robinson，1997)。另外，這些蛋白質中的任何免疫活性部分都是潛在的候選疫苗。構建在表達載體中含有這些基因中的某一個的質粒。必須以正確的方向插入基因，從而使基因能在真核啟動子的控制下被表達。可用的啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)即早期啟動子，人組織纖溶酶原激活物(t-PA)基因(鑑定於Degen等，1986)，和人延伸因子α(EF-1α)的啟動子/增強子區域(鑑定於Uetsuki等，1989)。方向由限制性內切核酸酶消化和DNA測序鑑定。
通過對瞬時轉染的COS細胞進行間接免疫螢光染色來證實這些基因產物的表達。將不含這些基因的相同質粒用作對照。將質粒DNA轉化至大腸桿菌DH5α。通過氯化銫梯度純化DNA，通過本領域已知的，並列入參考文獻(Nyika等，1998)的標準技術測定濃度。
一旦純化出載體，將含有DNA的載體懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水溶液，直接注射至犬。可用針頭經肌肉或靜脈內進行接種。或者，可通過本領域已知的，並列入參考文獻(Fynan等，1993)的技術，使用基因槍將包被有DNA的金珠轉運至細胞。此類疫苗的基本原理是經接種的宿主在其細胞中表達質粒DNA，並產生能引起免疫應答的蛋白質。通過此技術，可使用新鑑定的基因中的每一種來產生疫苗。
CpG分子可用作疫苗中的佐劑。該技術是本領域已知的，並列入本文作為參考(Klinman等，1997)。佐劑是輔助抗原或增加針對抗原的免疫應答的物質。基元由未甲基化的CpG二核苷酸組成，所述二核苷酸的側翼有2個5′嘌呤和2個3′嘧啶。已證實含有CpG基元的寡核苷酸可激活免疫系統，從而加強抗原-特異性免疫應答。在本發明中，通過混合CpG寡核苷酸與DNA疫苗，或使CpG基元與質粒DNA物理連接即可利用此效果。重組疫苗為了開發重組疫苗，將每種基因分別亞克隆至過量表達載體上，然後進行純化以用於疫苗開發。在具有強啟動子，如tac，T5或T7啟動子的質粒中表達ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物。或者，將這些蛋白質的免疫活性片段用於開發疫苗。按上述將這些基因中的每一種亞克隆至質粒，並轉化至大腸桿菌菌株。
使用具有強啟動子的載體過量表達重組蛋白質。用於此技術的載體包括pREST(Invitrogen Inc.，CA)，pKK233-3(Pharmacia，CA)和pET系統(Promega，WI)，但也可使用任何具有強啟動子的載體。過量表達之後，純化蛋白質並與佐劑混合。可用的佐劑包括但不限於氫氧化鋁，QuilA或Montamide。通過本領域已知的，並列入參考文獻(Chang等，1993c；Chang等，1995)的技術將純化的蛋白質用作免疫原以免疫犬。簡單地說，在大腸桿菌中表達各種蛋白質，並從中純化蛋白質。然後，用純化的重組疫苗和佐劑肌內或皮下注射犬。注射引發了免疫應答。T細胞表位疫苗由CD8+T淋巴細胞(CTL)介導的直接細胞毒性是抗細胞內病原體防禦的主要機理。這些效應淋巴細胞通過識別與細胞表面上的MHC I類分子相連的短肽來消除感染細胞。外源抗原進入內體途徑，並被呈遞至與II類分子相關的CD4+T細胞，而內源合成的抗原被呈遞至與MHC I類分子相關的CD8+T細胞。犬埃裡希氏體是定居於單核細胞和巨噬細胞的胞內病原體。本發明開發出產生犬埃裡希氏體-特異性CTL反應的新方法，所述CTL反應可從感染動物的單核細胞或巨噬細胞中消除生物體。
增加蛋白質疫苗的保護性反應的策略是用蛋白質的選擇性表位進行免疫。其基本原理是表位疫苗含有最相關的免疫原性肽組分，而不含不相關的部分。因此，需尋找新鑑定的蛋白質中抗原性最高的部分。
為了從新發現的蛋白質中鑑定出T-細胞表位，起初通過進行電子檢索來尋找與已知的T-細胞表位同源的序列。另外，進行充分的T-細胞表位作圖。檢測每一種蛋白質，ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物和部分脂蛋白信號肽酶同系物的免疫原性肽片段。通過本領域已知的技術對T細胞表位進行作圖的方法列入本文作為參考(Launois等，1994；Lee和Horwitz，1999)。簡單地說，在所研究蛋白質的整個長度上合成短的重疊肽序列(9-20個胺基酸)。使用已用感興趣的蛋白質免疫過的健康犬來檢測這些短的肽片段。檢測這些犬的外周血單核細胞的T細胞刺激和IFN-γ誘導特性。那些能引發最強反應的片段是最佳的T-細胞表位候選疫苗。
一旦鑑定出可製備最佳表位的片段，構建支氣管敗血性博德特氏桿菌的重組腺苷酸環化酶，該酶攜有犬埃裡希氏體CD8+T細胞表位。支氣管敗血性博德特氏桿菌的腺苷酸環化酶毒素(CyaA)導致犬病並引發免疫應答。另外，CyaA較適合胞質內靶向。其對應於1706個殘基長的蛋白質N-末端400個胺基酸殘基的催化結構域(AC)可被傳遞至很多真核細胞，包括免疫系統的細胞。毒素內化不依賴於受體-介導的胞吞，這表明催化結構域可直接通過胞質膜傳遞至靶細胞的胞質溶膠。銅綠假單胞菌外毒素A(PE)是另一種毒素，它可通過本領域已知的，列入參考文獻(Donnelly等，1993)的技術用於此方法，將肽或蛋白質傳遞至細胞。
已將外源肽(16個殘基)插入CyaA AC結構域的多個位點，而不會改變其穩定性或催化和鈣調蛋白-結合特性。因此，蛋白質工程可以設計和傳遞特異性刺激CTL的抗原。由於犬埃裡希氏體在單核細胞內持續存在，因此，對特異性CD8+T細胞的誘導在犬埃裡希病控制方面起著重要作用。
已克隆出支氣管敗血性博德特氏桿菌的腺苷酸環化酶(AC)毒素(cya)基因。根據支氣管敗血性博德特氏桿菌的密碼子使用情況，設計合成的雙鏈寡核苷酸，所述寡核苷酸編碼ProA，ProB，ORF細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物的9至20個胺基酸長的I類T細胞表位。將互補寡核苷酸插入克隆的cya AC-編碼序列的高變區。在其它系統中，該技術是本領域已知的，並列入參考文獻(Sebo等，1995；Guermonprez等，1999)。
對攜有嵌合cya基因的重組質粒進行測序以測定插入表位的拷貝數和方向。從測序的質粒中選擇在正確的方向上具有指定為T-細胞表位(CD8+)的完整插入物拷貝的質粒。新的嵌合蛋白質進入真核細胞的能力是確保表位細胞內靶向所必需的(Fayolle等，1996)。
可以兩種方法中的一種產生疫苗。重組嵌合蛋白質可以被純化並用於接種犬。或者，通過等位基因交換產生減毒的支氣管敗血性博德特氏桿菌菌株，通過框內插入腺苷酸環化酶，該菌株攜有T-細胞表位或犬埃裡希氏體基因。等位基因-交換是本領域已知的技術，並列入參考文獻(Cotter和Miller，1994)。
最終，測定用腺苷酸環化酶-ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或脂蛋白信號肽酶同系物嵌合蛋白質免疫的犬中抗犬埃裡希氏體感染的保護作用。用PBS將野生型和重組AC和CyA稀釋至工作濃度，將嵌合蛋白質肌內或皮下注射至犬中。或者，將T-細胞表位框內插入減毒支氣管敗血性博德特氏桿菌菌株的腺苷酸環化酶基因，給犬施用活細菌。
重組抗原是抗多種病原體的人和動物免疫的理想候選抗原。然而，嚴重的缺點是相對於天然抗原而言，重組抗原的免疫原性差。因此，開發新重組疫苗的主要挑戰是擁有能增加抗原免疫原性的新佐劑系統。細胞因子是強有力的免疫調節分子。在本發明中可用作佐劑的細胞因子包括但不限於IL-12(白細胞介素-12)，GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)，IL-1β(白細胞介素-1β)和γ-IFN(γ幹擾素)。
這些細胞因子對免疫的宿主具有消極的副作用，包括致熱原的和/或促炎症的症狀。因此，為了避免整個細胞因子蛋白質的副作用，另一種方法是使用具有所需免疫刺激特性的合成肽片段。IL-1β的九肽序列VQGEESNDK被賦予強有力的免疫-增強特性，在這裡討論它是為了闡明細胞因子增加免疫原性的用途。
將該九肽插入ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物，或部分脂蛋白信號肽酶同系物蛋白質，將其免疫原性與天然蛋白質的相比較。據報導，將該序列插入免疫原性差的重組抗原中可增加免疫後出現強保護性免疫應答的機會。該肽可增強抗T-依賴型和T-非依賴型抗原的體內免疫應答。犬IL-1β序列可模擬完整IL-1β分子的很多免疫調節活性，而明顯缺乏該分子的很多不合乎需要的促炎症特性。使用該策略可增強ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶，部分脂蛋白信號肽酶同系物和其它犬埃裡希氏體抗原的免疫原性。
通過插入包括犬埃裡希氏體的ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶蛋白質的片段，由pBR322質粒衍生得到質粒pYFC199。該質粒含有唯一的HindIII位點，其中可在框內插入編碼外源序列的插入物。退火編碼犬IL-1β163-171肽的兩個互補寡核苷酸AGGCTTGTTCAGGGTGAAGAAGAATCCAACGACAAAAGCTT和AAGCTTTTGTCGTTGGATTCTTCACCCTGAAC TTGCCA，用HindIII切割，並插入pYFC199 HindIII位點。測序攜有嵌合IL-1β基因的重組質粒以測定插入表位的方向。
在犬中檢測重組蛋白質作為疫苗的效力。將純化的蛋白質腹膜內注射至犬。將無特定病原體(SPF)的犬分成5組給一組施用重組的支氣管敗血性博德特氏桿菌腺苷酸環化酶，其攜有衍生自ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物的犬埃裡希氏體CD8+T細胞表位，給一組施用重組的支氣管敗血性博德特氏桿菌腺苷酸環化酶作為對照，給一組施用ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物蛋白質+犬IL-1β163-171插入物，給一組施用衍生自ProA，ProB，ORF，細胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信號肽酶同系物的T細胞表位，給最後一組施用PBS作為陰性對照。
給所有動物免疫4次(每次30-40μg)。最後一次免疫後10天，用107個犬埃裡希氏體攻擊犬。在攻擊後的第5天，將每隻犬的約1ml血液採集至EDTA管中。通過培養和PCR來檢測與對照組相比，免疫組是否消除了生物體。使用衍生自克隆基因的兩個引物擴增這些犬的組織或血液樣品中的基因產物。也可以設計內部引物以用作寡核苷酸探針，與PCR基因產物雜交。
本發明提供了迫切需要的抗犬埃裡希氏體細菌的疫苗。該疫苗可用於保護全世界的犬免患犬單核細胞埃裡希病。
因此，應理解本文所述的本發明的實施方案只是闡明了本發明原理的應用。本文中提到的闡述性實施方案的細節並不想限制權利要求書的範圍，其自身列舉了被認為是本發明所必需的那些特徵。
序列表110常永福120用於疫苗開發的犬埃裡希氏體基因130crf2322150U.S.09/358,3221511999-07-2116011170PatentIn Ver.2.021012115300212DNA213犬埃裡希氏體4001gatcaaataa aatgaaacca agaataagaa acactattta tggattaata gcaataatac 60tatctatgat atgtttagtg tacgcttctg taccactata tagtatattt tgtaaagtaa 120caggttatgg aggtacagta agaacaagta atatatcaaa ttctaaaata ggtaacacta 180ttattaaagt cagatttaat gcagatatac acaaacaact gccatggaaa ttctatccag 240aagtatctca tgtatttgta aaaccaggag aacaaaaatt gattttctac cgcgcagaaa 300atctacttga tgaggacact tcaggaatgg ctgtatataa tgttacacca cataaagtag 360gaaaatattt taataaggta gcttgttttt gtttcaccaa acaaacatta taccctcatc 420aaaaaactat aatgccagta tcatttttta tagatccagc catagaaaca gatcctgaaa 480ctgctgacgt aaaactcatc actctttcat atgtattctt taagtacaaa gaataaactt 540catataccgt acattataaa ctgattaaaa aaaataacta ttaatattga gcaaaataat 600ttatctattc aacagattct tttcaattag agagtattca aaaacactac aactactgct 660tgcaactttc tatcactgat atataaaagt gaaataaatt taaaaaactt tagttttaat 720agaagaattt tattaaaagc tttgaatcaa atttaattac 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Ile Leu Ser Lys Leu Pro Ser Gly Asn Asn225 230 235 240Lys Asn Thr Ile Pro Asp Thr Thr Val Asn Arg Glu Asp Thr Leu Leu245 250 255Tyr Val Gln Arg Asp Val Pro Gln Ser Val Ile Met Phe Ala Thr Asp260 265 270Thr Val Pro Tyr His Ser Lys Asp Tyr His Ala Ser Asn Leu Phe Asn275 280 285Thr Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Asn Ser Ile Leu Met Ile Glu Leu290 295 300Arg Asp Lys Leu Gly Leu Thr Tyr His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Asn305 310 315 320Met Asn His Ser Asn Val Leu Phe Gly Thr Ile Phe Thr Asp Asn Thr325 330 335Thr Val Thr Lys Cys Ile Ser Val Leu Thr Asp Ile Ile Glu His Ile340 345 350Lys Lys Tyr Gly Val Asp Glu Asp Thr Phe Ala Ile Ala Lys Ser Ser355 360 365Ile Thr Asn Ser Phe Ile Leu Ser Met Leu Asn Asn Asn Asn Val Ser370 375 380Glu Ile Leu Leu Ser Leu Gln Leu His Asp Leu Asp Pro Ser Tyr Ile385 390 395 400Asn Lys Tyr Asn Ser Tyr Tyr Lys Ala Ile Thr Ile Glu Glu Val Asn405 410 415Lys Ile Ala Lys Lys Ile Leu Ser Asn Glu Leu Val Ile Ile Glu Val420 425 430Gly Lys Asn Asn Asn Ile Asn Gly Lys Gln Ile Asp 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Phe Tyr Ile Asn Asn Leu His Trp Pro Val Phe Asn Leu100 105 110Ala Asp Ser Phe Ile Phe Leu Gly Ile Val Ile Ile Met Ala Lys Ser115 120 125Asn Asn His Met Lys Gln Ile Asn Cys Asn Ser130 13權利要求
1.含有選自下列的所述DNA的重組DNAa)編碼具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；b)編碼具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；c)編碼具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；d)編碼具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；e)編碼具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；和f)編碼能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的蛋白質的上述DNA的任何部分。
2.權利要求1的重組DNA，其中所述DNA編碼至少一種免疫原性表位。
3.含有選自下列的所述蛋白質的重組蛋白質a)具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質；b)具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質；c)具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質；d)具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質；e)具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質；和f)能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的上述蛋白質的任何部分。
4.權利要求3的重組蛋白質，其中所述蛋白質包括至少一種免疫原性表位。
5.疫苗，其中所述疫苗保護犬抗犬埃裡希氏體感染。
6.權利要求5的疫苗，其含有a)載體，該載體能表達插入所述載體中的重組DNA，使得當在適當宿主中提供所述載體時可以表達重組蛋白質；和b)插入所述載體中的重組DNA，其中所述DNA選自i.編碼具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；ii.編碼具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iii.編碼具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iv.編碼具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；v.編碼具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；和vi.編碼能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的蛋白質的上述DNA的任何部分。
7.權利要求6的疫苗，其中所述DNA進一步含有編碼CpG基元的DNA。
8.權利要求6的疫苗，其中所述DNA進一步含有選自下列的啟動子a)巨細胞病毒(CMV)即早期啟動子；b)人組織纖溶酶原激活物基因(t-PA)；和c)人延伸因子α(EF-1α)的啟動子/增強子區域。
9.權利要求6的疫苗，其中所述載體選自a)pcDNA3；b)pC1；c)VR1012；和d)VR1020。
10.權利要求6的疫苗，其中通過選自下列的方法將所述疫苗施用於所述宿主a)肌內注射；b)靜脈內注射；和c)基因槍注射。
11.權利要求10的疫苗，其中所述宿主是犬。
12.權利要求5的疫苗，其含有a)選自下列的重組蛋白質i.具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質；和vi.能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的上述蛋白質的任何部分。
13.權利要求12的疫苗，其中所述疫苗進一步含有選自下列的佐劑a)氫氧化鋁；b)QuilA；和c)Montamide。
14.權利要求12的疫苗，其進一步含有與所述重組蛋白質可操作相連的細胞因子。
15.權利要求14的疫苗，其中所述細胞因子選自a)白細胞介素-1β(IL-1β)；b)粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；c)γ幹擾素(γ-IFN)；d)IL-1β蛋白的胺基酸VQGEESNDK；和e)能引發抗犬埃裡希氏體的改善免疫原性反應的上述任何細胞因子的任何部分。
16.權利要求12的疫苗，其中通過選自下列的方法將所述疫苗施用於宿主a)肌內注射；和b)皮下注射。
17.權利要求16的疫苗，其中所述宿主是犬。
18.權利要求5的疫苗，其含有包括T細胞表位的重組蛋白質，其中所述T細胞表位含有選自下列的蛋白質的胺基酸肽片段a)具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質；b)具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質；c)具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質；d)具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質；e)具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質；和f)能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的上述蛋白質的任何部分。
19.權利要求18的疫苗，其中所述胺基酸肽片段含有9至20個胺基酸。
20.權利要求18的疫苗，其進一步含有編碼蛋白質的重組DNA，所述蛋白質能被內化至真核細胞，包括免疫系統的細胞。
21.權利要求20的疫苗，其中所述能內化至真核細胞的蛋白質含有選自下列的毒素a)支氣管敗血性博德特氏桿菌的重組腺苷酸環化酶；和b)銅綠假單胞菌的重組外毒素A(PE)。
22.權利要求18的疫苗，其中通過選自下列的方法將所述疫苗施用於宿主a)肌內注射；和b)皮下注射。
23.權利要求22的疫苗，其中所述宿主是犬。
24.鑑定抗犬埃裡希氏體的T細胞表位的方法，其包括a)在蛋白質的整個長度上合成重疊的肽片段，其中所述蛋白質選自i.具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質；和vi.能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的上述蛋白質的任何部分；b)檢測所述肽片段以測定所述肽片段是否在宿主動物中引發免疫應答；和c)如果所述片段引發了免疫應答，則將所述肽片段鑑定為所述的犬埃裡希氏體T細胞表位。
25.權利要求24的方法，其中所述肽片段含有9至20個胺基酸。
26.產生抗犬埃裡希氏體的疫苗的方法，其包括a)選擇能表達插入所述載體的重組DNA的載體；和b)將重組DNA插入所述載體，使得當在適當宿主中提供所述載體時，可以表達重組蛋白質，其中所述DNA選自i.編碼具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；ii.編碼具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iii.編碼具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iv.編碼具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；v.編碼具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；和vi.編碼能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的蛋白質的上述DNA的任何部分。
27.權利要求26的方法，其中所述DNA進一步含有編碼CpG基元的DNA。
28.權利要求26的方法，其中所述DNA進一步含有選自下列的啟動子a)巨細胞病毒(CMV)即早期啟動子；b)人組織纖溶酶原激活物基因(t-PA)；和c)人延伸因子α(EF-1α)的啟動子/增強子區域。
29.權利要求26的方法，其中所述載體選自a)pcDNA3；b)pC1；c)VR1012；和d)VR1020。
30.權利要求26的方法，其中通過選自下列的方法將所述疫苗施用於所述宿主a)肌內注射；b)靜脈內注射；和c)基因槍注射。
31.權利要求30的方法，其中所述宿主是犬。
32.產生抗犬埃裡希氏體的疫苗的方法，其包括a)選擇能表達插入所述載體的重組蛋白質的載體；b)將重組DNA插入所述載體，使得當將所述載體轉化至細菌菌株時，可以表達所述重組蛋白質，其中所述DNA選自i.編碼具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；ii.編碼具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iii.編碼具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；iv.編碼具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；v.編碼具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質的重組DNA；和vi.編碼能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的蛋白質的上述DNA的任何部分；c)從所述細菌菌株中收集所述重組蛋白質。
33.權利要求32的方法，其中所述疫苗進一步含有選自下列的佐劑a)氫氧化鋁；b)QuilA；和c)Montamide。
34.權利要求32的方法，其中所述疫苗進一步含有選自下列的啟動子a)tac；b)T5；和c)T7。
35.權利要求32的方法，其中所述細菌菌株是大腸桿菌。
36.權利要求32的方法，其中所述載體選自a)pREST；b)pET；和c)pKK233-3。
37.權利要求32的方法，其中所述疫苗進一步含有與所述疫苗可操作相連的細胞因子。
38.權利要求37的方法，其中所述細胞因子選自a)白細胞介素-1β(IL-1β)；b)粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)；c)γ幹擾素(γ-IFN)；d)IL-Iβ蛋白的胺基酸VQGEESNDK；和e)能引發抗犬埃裡希氏體的改善免疫原性反應的上述任何細胞因子的任何部分。
39.權利要求32的方法，其中通過選自下列的方法將所述疫苗注射至所述宿主a)肌內注射；和b)皮下注射。
40.權利要求39的方法，其中所述宿主是犬。
41.產生T細胞表位疫苗的方法，其包括a)選擇包括T細胞表位的重組蛋白質，其中所述T細胞表位含有選自下列的蛋白質的胺基酸肽片段i.具有如SEQ.ID.NO.3所示胺基酸序列的蛋白質；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示胺基酸序列的蛋白質；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示胺基酸序列的蛋白質；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示胺基酸序列的蛋白質；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示胺基酸序列的蛋白質；和vi.能引發抗犬埃裡希氏體免疫應答的上述蛋白質的任何部分；b)從所述蛋白質中鑑定所述T細胞表位；c)將所述T細胞表位摻入能將所述表位表達為蛋白質的構建體；和d)收穫所述蛋白質。
42.權利要求41的方法，其中所述胺基酸肽片段含有9至20個胺基酸。
43.權利要求41的方法，其中能表達所述表位的所述構建體進一步含有編碼蛋白質的重組DNA，所述蛋白質能被內化至真核細胞，包括免疫系統的細胞。
44.權利要求43的方法，其中所述能內化至真核細胞的蛋白質含有選自下列的毒素a)支氣管敗血性博德特氏桿菌的重組腺苷酸環化酶；和b)銅綠假單胞菌的重組外毒素A(PE)。
45.權利要求41的方法，其中通過選自下列的方法將所述疫苗注射至宿主a)肌內注射；和b)皮下注射。
46.權利要求45的方法，其中所述宿主是犬。
全文摘要
本發明提供了得自犬埃裡希氏體基因組的5300個核苷酸的序列。在此克隆片段中,共編碼了4種蛋白質,ProA,ProB,ORF,和細胞色素氧化酶同系物,並且在羧基末端編碼部分脂蛋白信號肽酶同系物。這些蛋白質的抗原特性使它們可用於產生疫苗。本發明的實施方案包括產生DNA疫苗,重組疫苗和T細胞表位疫苗。
文檔編號A61P31/04GK1367832SQ00810608
公開日2002年9月4日 申請日期2000年7月20日 優先權日1999年7月21日
發明者常永福 申請人:科內爾研究基金會