一種大白花杓蘭葉片愈傷組織再生植株誘導培養基的製作方法
2023-10-06 21:53:29
本發明涉及一種植物再生植株誘導培養基。
背景技術：
野生珍稀花卉大白花杓蘭(Cypripedium macranthum Sw.f.)為杓蘭屬中的一個重要變種，多年生宿根植物，分布於我國東北。株高35～50cm，根狀莖粗壯，莖生葉3～6枚，廣橢圓形。花大型，長3～5cm，有香氣，單生於莖頂。花梗稍彎，花純白色。唇瓣似女士的託鞋，故又稱託鞋蘭。大白花杓蘭能散發香氣，花形奇異，具有極高的觀賞價值。大白花杓蘭生於海拔400～2400米的林下、林緣或草坡上腐殖質豐富和排水良好之地。在中國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、山東、臺灣以及日本、朝鮮半島和俄羅斯均有分布。因其為野生花卉，適應北方嚴寒氣候，可露地越冬，因此特別適合高緯度城市園林種植，而且與其他園林花卉配置具有畫龍點睛的效果。
但大白花杓蘭一般每隔三年才分株一次，繁殖係數低，嚴重的制約了大白花杓蘭的廣泛種植。目前採用現有再生誘導培養基(如MS培養基或1/2MS培養基)培養大白花杓蘭存在植株分化率低問題，植株分化率僅為30％～50％。
技術實現要素：
本發明是為了解決大白花杓蘭自然繁殖係數低，且現有再生誘導培養基培養植株分化率低問題，而提供的一種大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基。
大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基成分包括大量元素組分、微量元素組分和有機質組分，pH值為5.5～6.0；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中H3BO3的濃度為6.2mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為22.3mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為8.6mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.025mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.25mg/L；
有機質組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L。
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養基成分包括大量元素組分、微量元素組分、有機質組分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖，pH值為5.8；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中H3BO3的濃度為3.1mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為11.15mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.012mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.125mg/L；
有機質組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L；
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養基中吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.05mg/L、蔗糖的濃度為0.5mg/L。
培養基中還包括苄氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片誘導分化培養基；其中，培養基中苄氨基腺嘌呤的濃度為1.0mg/L、激動素的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
培養基中還包括苄氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片繼代培養基；其中，培養基中苄氨基腺嘌呤的濃度為0.05mg/L、激動素的濃度為0.2mg/L、萘乙酸的濃度為0.5mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
本發明培養基用於大白花杓蘭葉片的再生植株誘導培養，加入特定的激素分別形成誘導分化和繼代培養基。利用野生珍稀花卉大白花杓蘭幼葉作為外植體在本發明培養基上進行分化誘導、繼代增殖、生根，從而獲得再生植株，具有組織資源豐富，可快速、高效的繁育出大量種苗的特點。
利用本發明大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基對大白花杓蘭幼葉進行再生植株誘導培養，大白花杓蘭幼葉在本發明誘導分化培養基上很容易被誘導形成愈傷組織，愈傷組織誘導率可達到90％以上；再將誘導出的淡綠色愈傷組織轉接至本發明繼代培養基上進行繼代培養，愈傷組織誘導成植株的機率高，再生植株誘導率(即植株分化率)可達70％。以MS培養基為基礎培養基的再生植株誘導培養，大白花杓蘭幼葉的植株分化率僅為50％。以1/2MS培養基為基礎培養基的再生植株誘導培養，大白花杓蘭幼葉的植株分化率僅為30％。
具體實施方式
本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。
具體實施方式一：本實施方式獲得大白花杓蘭葉片再生植株：
一、大白花杓蘭葉片的採集與處理
大白花杓蘭採自黑龍江省江山嬌實驗林場，母本為多年生草本，生長健壯；外植體類型為當年生葉片，採集季節為大白花杓蘭生長季節5月中上旬，採集時間選在晴朗的上午9～10點進行。將採集的葉片放置冷藏箱中備用。
二、消毒方法
將低溫冷藏的葉片取出，先將葉片用洗滌劑作表面清洗，去除表面塵土，再清水衝洗，然後放在超淨工作檯上用75％的乙醇滅菌10s，再無菌水衝洗3～5次，之後用0.1％的升汞液消毒5min，再無菌水衝洗3～5次，而後放在濾紙上吸乾表面水分備用。
三、用解剖刀將經過消毒處理的葉片分割成0.5～1cm×0.5～1cm小塊，接種到培養基上，每瓶接種3～5個，每個處理重複3次。接種後採用光照培養和暗培養相結合的方法。光照培養光源採用日光燈，培養室內白天溫度為24～28℃，照明12～14h，光照強度15μmol·m-2·s-1～20μmol·m-2·s-1，暗培養溫度控制在24～26℃。先暗培養7d後轉入光照培養。
大白花杓蘭幼葉先在誘導分化培養基上被誘導形成愈傷組織，再將誘導出的淡綠色愈傷組織轉接至繼代培養基上進行培養。步驟四分成三組，第一組採用本發明大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基，第二組採用MS培養基，第三組採用1/2MS培養基，三組培養基中誘導分化、繼代培養、生根培養採用相同的激素，且激素含量相同。
第一組培養基pH值為5.8。第一組大白花杓蘭葉片再生植株生根培養基成分包括大量元素組分、微量元素組分、有機質組分、吲哚丁酸、萘乙酸和蔗糖；
大量元素組分由NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中NH4NO3的濃度為400mg/L、KNO3的濃度為1050mg/L、KH2PO4的濃度為170mg/L、MgSO4·7H2O的投加濃度為370mg/L、CaCl2·2H2O的投加濃度為210mg/L；
微量元素組分由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O和CuSO4·5H2O組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中H3BO3的濃度為3.1mg/L、MnSO4·4H2O的投加濃度為11.15mg/L、ZnSO4·7H2O的投加濃度為4.3mg/L、Na2MoO4·2H2O的投加濃度為0.012mg/L、CuSO4·5H2O的投加濃度為0.125mg/L；
有機質組分由Na2·EDTA、FeSO4·7H2O、環已六醇、維生素B3、鹽酸硫胺素、鹽酸呲哆素、氨基乙酸組成，大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中Na2·EDTA的濃度為37.3mg/L、FeSO4·7H2O的投加濃度為27.8mg/L、環已六醇的濃度為100mg/L、維生素B3的濃度為0.5mg/L、鹽酸硫胺素的濃度為0.1mg/L、鹽酸呲哆素的濃度為0.5mg/L、氨基乙酸的濃度為2mg/L；
大白花杓蘭葉片再生植株生根培養基中吲哚丁酸的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.05mg/L、蔗糖的濃度為0.5mg/L。
培養基中還包括苄氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片誘導分化培養基；其中，培養基中苄氨基腺嘌呤的濃度為1.0mg/L、激動素的濃度為0.1mg/L、萘乙酸的濃度為0.1mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
培養基中還包括苄氨基腺嘌呤、激動素、萘乙酸和蔗糖作為大白花杓蘭葉片繼代培養基；其中，培養基中苄氨基腺嘌呤的濃度為0.05mg/L、激動素的濃度為0.2mg/L、萘乙酸的濃度為0.5mg/L、蔗糖的濃度為200mg/L。
試驗結果：
第一組愈傷組織誘導率均達到90％以上，再生植株誘導率(即植株分化率)為70％。
第二組愈傷組織誘導率均達到50％以上，再生植株誘導率(即植株分化率)為50％。
第三組愈傷組織誘導率均達到20％以上，再生植株誘導率(即植株分化率)為30％。
本發明大白花杓蘭葉片再生植株誘導培養基中無機鹽的濃度低於現有MS培養基、高於1/2MS培養基無機鹽濃度，符合大白花杓蘭葉片器官分化的需要，大幅提高了大白花杓蘭葉片誘導再生植株的成功率，而且與MS培養基相比可節省約30％的成本。
實驗對比發現第一組芽增殖明顯高於第二組和第三組。
第一組獲得的組培苗移栽植株生長與性狀測定，種性純度達98％以上，表現出高度一致性和豐產性，能夠達到快速繁殖優良大白花杓蘭種苗的目的。