包括修飾的導向部分的嵌合毒素的製作方法

2023-10-07 03:04:44 3

專利名稱：包括修飾的導向部分的嵌合毒素的製作方法
技術領域：
本發明涉及包括修飾的導向部分的嵌合毒素，更具體地說，本發明涉及包括連接到假單胞菌外毒素蛋白質上的表皮生長因子的嵌合毒素，其製備方法及經修飾後提高了受體結合能力和細胞毒活性的嵌合毒素在腫瘤治療中的應用。
可以將衍生於細菌或植物的蛋白質毒素連接到生長因子、細胞因子、激素、抗體或其片段，以及其他細胞導向分子上，構成具有尋靶能力和細胞毒活性的嵌合毒素，以殺傷攜帶特異性受體或抗原的有害細胞。一種很有開發前景的有效治療用毒素是由銅綠色假單菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的假單胞菌外毒素A(PE)單體蛋白質(分子量66KD)。當PE與其他導向因子組成的融合分子中的導向部分與細胞受體結合後，毒素-配體複合物通過胞吞作用經膜凹陷進入細胞膜囊泡，然後泡內質子泵迅速使膜囊泡內環境酸化(pH值降低)。當胞內pH降低至足夠低時，延伸的毒素在胞內蛋白酶(弗林蛋白酶，Purin)作用下，於Arg279和Gly280之間發生斷裂，同時聯繫這個部分(Cys265-Cys287)的二硫橋鍵亦被還原並斷開，從而產生羧基末端37KD片段(Ogata et al．，J．Biol．Chem，26520678-20685，1990；Chiron et al．，J．Biol．Chem．27231707，1991)。然後37KD片段跨膜轉位到高爾基複合體上，並經囊泡穿梭被帶入內質網，進而轉入胞漿內。毒素分子藉助其末端特異序列(REDLK)固著於肽鏈上。內化後，該37KD片段催化氧化態NAD的ADP核糖基化部分向延伸因子2(EF-2)上轉移，使EF-2核糖基化而失活，從而抑制細胞蛋白質的合成，最終導致細胞死亡。
從目前已知的假單胞菌外毒素融合蛋白質殺傷有害細胞(如腫瘤細胞)的上述機理可以看出，決定毒素導向並進而殺傷靶細胞的主要因素包括(1)融合蛋白質分子導向部分與其相應細胞受體的結合能力及穩定性；(2)融合蛋白質的空間構象及對其通過細胞膜向細胞溶膠內轉位的能力；和(3)融合蛋白質在細胞內的適當摺疊，及細胞內弗林蛋白酶裂解PE分子以產生37KD片段的能力。因此，對PE-配體融合蛋白質，特別是其中的毒素部分進行適當地修飾是十分必要的。這些修飾包括分子中一個或多個半胱氨酸的取代、氨基和／或羧基末端一個或多個胺基酸的刪除、加入或取代等。迄今已有許多關於對毒素分子或其部分的修飾和功能分析的報導(參見美國專利5，705，163、5，821．238、5，621，078、5，705，156等)。
然而，當毒素分子如PE66或PE40與導向分子融合後，必然導致融合蛋白質的三維空間結構改變，包括分子摺疊後個別胺基酸之間疏水相互作用甚至氫鍵形成所導致的對整個融合分子的受體結合能力及細胞毒活性的某些影響。為此，本發明人在充分考慮到這些影響的基礎上，試圖對融合蛋白質的導向部分的分子結構以及導向部分的連接方式進行某些修飾和改動，以期改善嵌合分子的受體結合效率及靶細胞殺傷活性。
因此，本發明的一個目的是提供包括連接到截短的毒素分子上的表皮生長因子序列的靶特異性嵌合毒素，特徵在於其中作為導向部分的表皮生長因子序列以兩分子串聯方式連接到截短形式的毒素分子上。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的截短形式的毒素分子是缺失了Ia區的假單胞菌外毒素(PE40)。
根據本發明這一目的的一個優選實施方案，其中所說的作為導向部分的兩分子串聯連接的表皮生長因子序列是缺失了羧基末端3個胺基酸殘基，並且以頭一尾串聯方式連接的表皮生長因子序列。
本發明的另一個目的是提供含有如上文限定的嵌合毒素及一種或多種醫藥上可接受的載體的藥物組合物。
本發明的再一個目的涉及上述藥物組合物在治療惡性增生性疾病中的應用。


圖1顯示用於表達以表皮生長因子(EGF)為導向部分的重組PE40嵌合蛋白質的重組質粒pEGF50×2-PE40的構建策略。
圖2顯示本發明的EGF50×2-PE40(●)和按相似方法製備的EGF-PE40(△)對Hep2細胞的細胞毒活性比較。
圖3顯示本發明的EGF50×2-PE40和按相似方法製備的EGF-PE40置換與A431細胞結合之125I-EGF的能力比較。
本發明涉及修飾的靶特異性嵌合毒素，特別是涉及由表皮生長因子(EGF)與PE40融合而成的融合毒素，其中作為導向部分的EGF分子是以其缺失了C末端3個胺基酸殘基的兩分子串聯形式連接到毒素部分上的。所說的導向部分與表面上帶有EGF受體(EGFR)的靶細胞結合，並且促使融合分子內化到這些靶細胞中之後，融合分子的毒素部分即可有效地殺傷這些靶細胞腫瘤。
表皮生長因子(EGF)是由53個胺基酸組成的單鏈多肽。該因子廣泛存在於人和哺乳動物的體液、汗腺細胞及血小板中，並具有介導上皮細胞生長、促進血管生成，以及促進成纖維細胞和內皮細胞增殖的功能。在許多腫瘤，特別是鱗狀上皮癌及某些腺癌，如喉癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌及乳腺癌發生時，均表現有細胞表面EGF受體的過度表達(如參見Arteaga，CL．et al．，Cancer Res．54(17)4703-4709，1994)。有人發現鱗狀上皮癌的復發及鱗癌病人的存活期與細胞EGF受體的表達水平密切相關(如參見Scambia，G．et al．，Cancer 671347-1351，1991；Yang，D．et al．，Clin．Cancer Res．4993，1998)。另外還有人發現，鱗狀細胞癌組織中表皮生長因子受體(EGFR)的mRNA水平較正常黏膜上皮細胞約高69倍。並且證明了抑制EGFR基因的表達可阻止頭頸部鱗癌細胞的增殖(Rubin，GA，et al．，Oncogene 15(4)409-416，1997)。早在八十年代末便有人使用EGF多肽作為導向分子，用於構建具有腫瘤細胞靶特異性的細胞毒性劑。此後，許多研究者針對毒素部分對整體融合蛋白質的細胞結合活性和細胞毒活性進行了許多深入研究。例如，Lee等人的研究表明，EGF與缺失Ia區的PE[PE(△Ia)，即PE40]結合所形成的融合分子EGF-PE40，較與天然PE66結合所形成的融合分子EGF-PE66具有更好的靶細胞特異性(Lee，CH，et al．，Protein Eng．6(4)433-440，1993)。
然而，考慮到EGF分子的結構特徵，EGF與PE分子融合後所導致的分子摺疊和其對融合蛋白質之三維結構的影響，以及融合蛋白質中作為導向部分的EGF與其細胞受體的結合機率和穩定性等因素，我們試圖在按照現有技術對融合蛋白質的毒素部分進行必要的修飾的同時，特別對導向部分即EGF分子進行某些修飾。這些修飾包括刪除EGF分子羧基末端的3個胺基酸殘基、改變EGF與毒素分子特別是PE40分子間的連接方式。所說的改變導向部分與毒素部分間的連接方式則包括分別構建EGF50-EGF50-PE66、EGF50-EGF50-PE40、EGF50-PE40-EGF50及EGF50-PE40等四種不同結構形式的融合蛋白質，並使用MTT細胞增殖檢測法(參見Mosman，T．，J．Immunol．Methods 6555-64，1983)比較了它們的靶細胞毒活性；使用膜受體結合置換試驗法(參見Riemen et al．，Peptide 8877-885，1987)比較了它們的特異性受體結合活性。這裡使用的縮寫符號EGF50是指缺失C末端3個胺基酸殘基的表皮生長因子多肽。
我們的實驗研究發現，以兩分子頭-尾串聯方式連接的EGF50作為導向部分，所製得的融合蛋白質具有更好的受體結合活性和細胞毒活性。
可使用天然PE分子(分子量為66KD)，作為靶特異性細胞毒性融合蛋白質的毒素部分，以減少嵌合毒素的非特異性細胞結合，進而改善毒素對攜帶EGFR的細胞的靶特異性毒性。另外，也可使用如美國專利5，621，078中所述的第265、287位半胱氨酸，或第265、287、372及379位半胱氨酸分別被丙氨酸取代的PE分子，或者如國際專利申請PCT／IL96／00151中所述的第57、546、247和249位上的一或幾個胺基酸被穀氨酸取代的PE分子。
根據本發明，可以使作為導向因子的EGF直接或間接連接到毒素分子上。如果兩個部分是間接連接的，最好在兩個部分之間插入一個大約10～30個胺基酸的「接頭序列」或間隔臂。所說的接頭序列較好是由5～10個主鏈不超過4個碳原子並且不帶苯環側鏈的中性胺基酸(如丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸)的2～3次重複的串聯重複序列。但考慮到如上文所述的受體結合效率和結合穩定性，以及融合蛋白質的空間結構對受體結合和毒素分子內化的影響因素，最好使用頭-尾串聯的兩分子EGF作為導向部分。在這種情況下，其中一個EGF分子將作為導向分子與細胞膜表面上的受體結合，而另一個分子則起到連接毒素分子的「間隔臂」的作用。
可使用本領域技術人員已知的基因融合技術或化學合成與偶聯技術製備本發明的嵌合毒素蛋白質，但最好是使用基因融合技術。為此，例如可按照已知的DNA操作技術(如參見Sambrook et al．，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)克隆並擴增編碼EGF50和編碼兩分子串聯之EGF50(EGF50×2)的核苷酸序列。然後將擴增的2×EGF50基因按正確方向連接到已經過或未經修飾的PE40分子的5』末端，並將所得嵌合基因插入到適當的表達載體系統中。或者，亦可從攜帶PE40基因的起始質粒(如pVC8)中切出所需的PE40基因，並將其連接到適當的中間載體如pET17b中，然後將攜帶PE40基因的載體與PCR擴增得到的EGF50或2×EGF50基因連接，環化後即得到攜帶EGF50-PE40或EGF2×50-PE40融合基因的重組表達載體。用如此得到表達載體轉化適當的宿主細胞例如大腸桿菌細胞，然後在適當條件下培養被轉化的細胞，以產生所需的融合蛋白質。可使用離子交換層析、大小排阻層析、疏水作用層析以及鹽析、超濾等方法從細胞溶胞產物中分離並純化蛋白質表達產物。產物的分離與純化步驟中，可使用SDS-PAGE法和酶聯免疫吸附法(ELISA)或Western印跡法監測純化產物的存在及其分子大小。
可使用文獻中已描述的各種檢測方法鑑定本發明的2×EGF50-PE40及EGF50-PE40融合蛋白質的性質。這些方法包括(1)ADP核糖基化試驗，該方法是根據EGF2×50-PE40或EGF50-PE40催化延伸因子2的ADP核糖基化的能力檢測其對哺乳動物細胞蛋白質合成的抑制；(2)受體結合試驗，該方法根據2×EGF50-PE40或EGF50-PE40競爭性置換與A431細胞漿膜結合之125I-EGF的能力檢測其特異性受體的結合活性；(3)MTT細胞存活率試驗，該方法是根據活細胞將MTT轉化成蘭紫色甲瓚結晶體的能力檢測腫瘤細胞與2×EGF50-PE40或EGF50-PE40接觸後的存活性。
本發明進一步涉及含有至少一種上述嵌合毒素和一種醫藥上可接受的惰性載體的藥物組合物。可按照製藥工業領域已知的基本原則製備適於胃腸道外途徑給藥的本發明的藥物組合物(例如參見Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed．，Mack Publishing Company，1980)。可通過各種給藥途徑，特別是靜脈內、肌肉內、關節內、腹腔內、鼻內及其他空腔器官內、皮內、皮下等胃腸道外途徑投用本發明的藥物組合物。
可使用本發明的嵌合毒素蛋白質或含有該嵌合毒素蛋白質的藥物組合物作治療藥物，用於治療由可依靠該蛋白質的毒性作用緩解或消除的特定人體細胞引發的各種疾病。一種優選的用途是用於治療其細胞表面上過量表達EGFR之細胞的惡性增生性疾病，如各種組織來源的鱗狀細胞癌。本發明的嵌合毒素或含該嵌合毒素的藥物組合物的治療有效劑量一般將根據疾病的性質、嚴重程度、病人的一般狀況和對藥物的敏感性，以及給藥途徑等因素由臨床醫生確定。
下列實施例旨在進一步闡述本發明，而不構成對本發明待批權利要求的限制。
實施例12×EGF50-PE40嵌合毒素的製備A．分別用攜帶PE40基因的質粒載體pVC8(Chaudhary et al．，PNAS USA 844538-4542，1987)和pET-17b(Novagen)轉化感受態大腸桿菌HB101。將被轉化的細胞鋪塗於含氨苄青黴素(50μg／ml)的普通培養基上37℃保溫過夜。選擇氨苄青黴素抗性菌落進行擴大培養後提取質粒DNA，並用XbaI+EcoRI分別消化質粒pVC8和pET-17b。用低溶點瓊脂糖凝膠分離得到PE40核苷酸編碼序列(1098bp)和較大的pET-17b載體DNA片段(3174bp)。然後在T4 DNA連接酶(Promega)存在下連接兩片段，並用連接反應混合物轉化大腸桿菌HB101。挑取單菌落，並在LB培養基中培養後，快速提取質粒DNA並進行酶切鑑定，然後對酶切鑑定為陽性的中間質粒進行DNA序列分析。將所得到的連接正確的中間質粒定名為pET17b-PE40。
B．使用DNA合成儀(Applied Biosystems Inc．)合成寡核苷酸引物15』-CGCATATGAACTCCGACTCCGAATGTC-3』(SEQ ID NO1)和引物25』-GCCATATGCCACCACTTCAAGTCTCT-3』(SEQ ID NO2)及引物35』-GACTTGAAGTGGTGGAACTCCGACTCCGAA-3』(SEQ ID NO3)。在5％甲醯胺和各50pmol引物1及2存在下，使用5ng pVC8／EGF作為模板，並使用熱循環儀(Perkin Elmer Cetus Instruments)及提供的其他試劑進行聚合酶鏈反應(PCR)95℃變性1分鐘，54℃退火1分鐘，72℃聚合1分鐘，30次循環後，72℃延伸10分鐘。在1．5％低熔點瓊脂糖凝膠上回收長度約160bp的擴增產物EGF50。將5μg純化的EGF50片段加入含100pmol引物3的擴增反應體系中，進行片段串聯連接反應95℃變性1分鐘，63℃退火延伸5分鐘，5次循環後，分別加入50pmol的引物1和引物2，依前述條件擴增並回收長約320bp的擴增產物，即EGF50×2。
C．用NdeI分別酶切擴增的2×EGF50或EGF50片段，以及中間載體pET17b-PE40，並將NdeI酶切的EGF片段插入到用同樣核酸內切酶切割的pET17b-PE40中。然後用連接反應混合物轉化感受態大腸桿菌HB101。
在5％CO2環境下，37℃培養被轉化的細胞。培養後收集Ampr菌落並使用上述寡核苷酸引物，按上文B中所述的反應條件進行PCR鑑定。從PCR鑑定陽性的菌落中提取質粒DNA，再次用PCR方法和酶切方法鑑定重組體中EGF或2×EGF的存在和其連接方向。選擇連接方向正確的重組質粒，分別定名為pETEGF50-PE40和pETEGF50×2-PE40。使用T7測序試劑盒(Pharmacia)進行DNA序列測定，EGF核苷酸編碼序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ IDNO4所示。兩分子串聯的EGF核苷酸編碼序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ ID NO5所示。並根據SEQ ID NO5的DNA序列推導出EGF50×2-PE40的胺基酸序列(SEQ ID NO6)。
D．用如上製備的重組表達載體pET-EGF50×2-PE40轉化大腸桿菌BL21(λDE3)，並在含有氨苄青黴素(Amp)的LB培養基中培養被轉化的大腸桿菌細胞。當培養物的OD600值約為0．6～0．8時加入IPTG至0．4mM以誘導融合蛋白質表達。誘導3小時後離心收集細胞並懸浮於TE緩衝液(20mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA)中，超聲破碎細胞並按Chaudhary等人(文獻出處同上)所述的方法製備周質部分。收集所製得的細胞周質部分，並進行SDS-PAGE檢測和Western印跡分析。在12％聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離並染色後可見一條清晰的相當於52KD的泳帶。Western印跡試驗結果可見與兔抗PE40抗血清和抗EGF抗血清特異性反應的條帶，從而初步證實細胞周質中2×EGF50-PE40嵌合毒素的存在及其分子大小。
依次使用連接到FPLC系統上的Mono Q(HR5／5)陰離子交換柱和SephacrylS-200柱(Pharmacia)純化2×EGF50(或EGF)-PE40。純化中使用0．2-0．3M的NaCl洗脫融合蛋白質，並根據ADP核糖基化活性和細胞毒活性檢測和收集嵌合毒素的活性峰值部分。SDS-PAGE檢測表明，毒素的純度約為97％。使用牛血清白蛋白作為標準品，用福林酚試劑測定蛋白質濃度約為3mg／ml。對SDS-PAGE凝膠進行薄層掃描，表明融合蛋白質約佔菌體總蛋白質的35％。
實施例22×EGF50-PE40嵌合毒素的生物學活性分析細胞毒活性檢測-MTT細胞增殖試驗將人喉癌Hep-2細胞(維持在添加有10％胎牛血清、2mML-穀氨醯胺、50u／ml青黴素和50μg／ml鏈黴素的Eagle氏極限基本培養基(MEM)中，按2×104個細胞／孔的細胞密度加至40孔細胞培養板的各孔內。37℃保溫1小時後，在所有各孔內加入溶於PBS溶液(5mg／ml)，並過濾除菌的MTT(3-(4，5-二甲苯-2-噻唑)2，5-二苯基溴化四唑(Sigma)，並加入2×EGF50-PE40或EGF50-PE40，然後將培養板37℃保溫4小時。保溫後向各孔內加入100μl含10％SDS的10mMHCl溶液，並徹底混合均勻，待所有暗蘭色結晶溶解後(約12小時)，檢測570nm波長處吸光率(OD570)。試驗中以單純MEM培養基作為空白對照，並將其OD570設定為0。
圖2中顯示不同濃度(0．1-1000ng／ml)2×EGF50-PE40(●)和EGF50-PE40(△)對Hep-2細胞的細胞殺傷活性。根據活細胞內的隱酶(琥珀酸脫氫酶)將其攝入的MTT轉化成為蘭紫色結晶體甲瓚的能力，檢測嵌合毒素蛋白質的細胞殺傷活性。結果可見，以兩分子串聯的EGF50作為導向部分的嵌合毒素(2×EGF50-PE40)對Hep-2細胞的EC50值約為50pM，而作為陽性對照的EGF-PE40的EC50值則為大約80pM。而且，隨著毒素濃度的增加，前者的細胞毒活性仍有緩慢增加，而後者則基本上達到細胞毒活性平臺。
在另一項MTT細胞增殖試驗中，我們使用A431腫瘤細胞和正常哺乳動物CHO細胞進一步比較了兩種不同結構形式的融合蛋白質對這些靶細胞的殺傷能力。結果顯示兩種形式的毒素蛋白均對表皮樣腫瘤A431細胞有明顯地殺傷活性，而對正常CHO細胞則基本上沒有可檢測的細胞毒性(數據未示出)。EGF受體結合試驗簡單地說，為了檢測EGF肽與細胞膜表面EGF受體的結合，首先將A431細胞(約106個)懸浮於冰冷的檢測緩衝液(10mM Tris-HCl，pH7．6，lmM DTT，0．1％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中製備細胞勻漿，以2500×g4℃離心15分鐘後收集上清，並再次以22，000×g離心30分鐘(4℃)，然後收集細胞漿膜沉澱物並懸浮於上述緩衝液中4℃保存。
在有或沒有未標記的EGF50或2×EGF50-PE40和EGF50-PE40存在下，將含有50μg漿膜蛋白質的等分樣品(終體積100μl)與5mg放射性碘標記的EGF(125I-EGF，New England Nuclear)4℃保溫2小時。保溫後用上述檢測緩衝液通過Whatman濾膜徹底洗樣品，並用λ計數器檢測漿膜結合的配體。在0．1mM未標記的EGF存在下確定非特異性結合。實驗結果如圖3所示。
圖3顯示部分純化(Mono Q離子交換層析後)的2×EGF50-PE40(○)或EGF50-PE40(△)對A431細胞膜結合的125I-EGF的置換作用。其中B代表在競爭物2×EGF-PE40或EGF以所指出的濃度存在下，與漿膜結合的125I-EGF的量(cpm)；Bo代表沒有競爭物存在時與細胞漿膜結合的125I-EGF的量(cpm)。
從圖3所示的數據可以看出，向膜表面上帶有EGF受體的腫瘤細胞配體-受體反應體系中加入漸增濃度的本發明部分純化的2×EGF-PE40嵌合毒素後，隨著嵌合毒素濃度的增加而逐漸取代細胞膜結合的125I-EGF。而且，與以單分子EGF連接的毒素分子相比，本發明的以兩分子串聯的EGF(2×EGF)表現有更好受體結合能力。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申請人中國人民解放軍農牧大學(Ⅱ)發明名稱包括修飾的導向部分的嵌合毒素(Ⅲ)序列數6(Ⅰ)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID No1CGCATATGAA CTCCGACTCC GAATGTC(2)SEQ ID No2的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度26鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO2GCCATATGCC ACCACTTCAA GTCTCT(2)SEQ ID No3的信息(Ⅰ)序列特徵(E)長度30鹼基對(F)類型核酸(G)鏈型單鏈(H)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO3
GACTTGAAGT GGTGGAACTC CGACTCCGAA(2)SEQ ID NO4的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度1254鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO4ATGAACTCCG ACTCCGAATG TCCATTGTCC CACGACGGTT ACTGTTTGCA CGACGGTGTTTGTATGTACA TCGAAGCTTT GGACAAGTAC GCCTGTAACT GTGTTGTTGG TTACATCGGTGAAAGATGTC AATACAGAGA CTTGAAGTGG TGGCATATGG CCGAAGAGGG CGGCAGCCTGGCCGCGCTGA CCGCGCACCA GGCTTGCCAC CTGCCGCTGG AGACTTTCAC CCGTCATCGCCAGCCGCGCG GCTGGGAACA ACTGGAGCAG TGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCCCTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAAC CAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTGGCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGC GAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCCCGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAG AGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGCAACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGAC GTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCCGGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGC GACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACTGGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGAC GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAACTGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC CGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTCGTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCG GCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGCGCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGG 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GCTGGGAACA ACTGGAGCAGTGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCC CTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAACCAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTG GCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGCGAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCC CGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAGAGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGC AACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGACGTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCC GGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGCGACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACT GGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGACGTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAAC TGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCACCGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTC GTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCGGCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGC GCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGGCGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCG CTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAACCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGT GCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCGAGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTG ACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAGGTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCG CTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAGGAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTC GGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTGATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGC AACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGCATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCC CTGCCGGACT ACGCCAGCCA GCCCGGCAAACCGCCGCGCG AGGACCTGAA GTAA(2)SEQ ID NO6的信息(Ⅰ)序列特徵(A)長度468胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(Ⅱ)分子類型蛋白質(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO6Met-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-His-Met-Ala-Giu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Len-Len-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Len-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Len-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Len-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Len-Thr-Len-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Len-Ile-Gly-His-Pro-Len-Pro-Len-Arg-Len-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Len-Gln-Thr-Ile-Len-Gly-Trp-Pro-Len-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Len-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Len-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Len-Lys-end
權利要求
1．包括連接到截短的假單胞菌外毒素A蛋白質上的EGF序列的嵌合毒素，特徵在於其中作為嵌合分子導向部分的EGF是以兩分子串聯方式連接到截短的毒素分子上的。
2．根據權利要求1的嵌合毒素，其中所說的以兩分子串聯連接的EGF是缺失了C末端3個胺基酸殘基的EGF50。
3．根據權利要求1的嵌合毒素，其中所說的截短的假單胞菌毒素A是缺失了毒素分子中Ia區的PE40。
4．含有根據權利要求1至3中任一項的2×EGF50-PE40嵌合毒素及一種或幾種醫藥上可接受的載體的藥物組合物。
5．根據權利要求4的藥物組合物在治療惡性增生性疾病中的應用。
全文摘要
本發明涉及經過修飾而提高了受體結合活性的靶特異性嵌合毒素,特別是包括與假單胞菌外毒素PE40連接之表皮生長因子序列的嵌合毒素,其特徵在於其中作為導向部分的EGF是兩分子串聯的截短形式的EGF50。本發明進一步涉及所說的嵌合毒素的製備及其在治療惡性增生性疾病,特別是鱗狀細胞癌中的應用。
文檔編號A61K39/104GK1293202SQ9912190
公開日2001年5月2日 申請日期1999年10月13日 優先權日1999年10月13日
發明者朱平, 張國利 申請人:中國人民解放軍農牧大學軍事獸醫研究所