骨形態發生蛋白的治療用途的製作方法

2023-10-07 04:07:59

本發明涉及選自骨形態發生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形態發生蛋白9(BMP9)變體的多肽，用於治療血管疾病或呼吸道疾病。本發明還涉及新的BMP9變體和包含所述多肽的藥物組合物。
背景技術：
：：血管疾病是大中型肌性動脈的病理狀態，並且由內皮細胞功能障礙引發。由於諸如病原體、氧化的LDL顆粒和其他炎症刺激因子，內皮細胞變得活化。這導致內皮細胞特性的改變：內皮細胞開始分泌細胞因子和趨化因子，並在其表面上表達粘附分子。這又導致白血細胞(單核細胞和淋巴細胞)的募集，白血細胞可以滲透血管壁。用由內皮細胞產生的細胞因子以及募集的白血細胞刺激平滑肌細胞層導致平滑肌細胞增殖並向血管腔遷移。該過程導致血管壁增厚，形成由增殖的平滑肌細胞、巨噬細胞和各種類型淋巴細胞組成的斑塊。該斑塊引起血流阻塞，導致到達靶器官的氧和營養物的量的減少。在最後階段，所述斑塊也可破裂，導致凝塊形成，並因此導致中風。呼吸道疾病是包括影響在高等生物體中使得能夠進行氣體交換的器官和組織的病理狀況的醫學術語，並且包括上呼吸道、氣管、支氣管、細支氣管、肺泡、胸膜和胸膜腔、以及呼吸神經和肌肉的狀況。呼吸道疾病的範圍從輕度和自限性(如普通感冒)到危及生命的實體(如細菌性肺炎、肺栓塞和肺癌)。肺動脈高壓(PAH)是一種罕見的血管疾病，目前還無藥可醫。遺傳性和特發性肺動脈高壓(PAH)的特徵在於前毛細血管肺動脈的狹窄和閉塞，繼發於平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞的增殖和凋亡抵抗(Morrell等人，(2009)JAmCollCardiol54，S20-31)。所導致的肺血管阻力的增加導致肺動脈壓力的嚴重升高，導致右心室肥大以及最終由右心力衰竭引起的死亡(Gaine和Rubin(1998)Lancet352,719-725)。在2000年，在編碼骨形態發生蛋白II型受體(BMPR-II)的基因中對雜合種系突變的鑑定(Lane等人，NatGenet26，81-84(2000)；Deng等(2000)AmJHumGenet67，737-744)為可遺傳PAH的病理生物學提供了重要的見解。隨後的研究還在15-40％的特發性PAH病例中鑑定了BMPR-II突變(Thomson等人(2000)JMedGenet37，741-745)，以及BMPR-II的表達降低作為在人(Atkinson等人(2002)Circulation105，1672-1678)和動物模型(Long等(人2009)Circulation119，566-576)中非遺傳性PAH的特徵。遺傳證據也強烈影響內皮細胞作為PAH中的關鍵起始細胞類型。先前的研究已經顯示，內皮中的BMPR-II的條件缺失足以在一定比例的小鼠中誘導PAH(Hong等人(2008)Circulation118,722-730)，並且在齧齒動物模型中內皮BMPR-II信號傳導的拯救能預防或逆轉實驗性肺高壓(Reynolds等人(2012)EurRespirJ39，329-343；Reynolds等人(2007)AmJPhysiolLungCellMolPhysiol292，L1182-1192；Spiekerkoetter等(2013)JClinInvest123，3600-3613)。最近，已經顯示用BMP9對內皮BMPR-II的選擇性增強逆轉了肺動脈高壓(Long等人(2015)NatureMedicine21，777-785)。此外，現已報導了在PAH患者中，I型受體ALK-1(Trembath等人(2001)NEnglJMed345，325-334)和III型受體輔助蛋白，內皮糖蛋白(Harrison等人，2003)JMedGenet40，865-871)，這兩者幾乎僅在內皮上表達。雖有這個證據，PAH的病理生物學中內皮功能障礙的確切性質和在這一過程中BMP信號的參與仍然是爭論點。儘管已建立的PAH的特徵在於作為阻塞性細胞損傷組分的肺內皮細胞的過度克隆增殖(Yeager等人(2001)CircRes88，E2-E11)，但是在人類(Teichert-Kuliszewska等(2006)CircRes98，209-217)和動物疾病模型(Wilson等人(1992)CritRevToxicol22，307-325；Taraseviciene-Stewart等(2001)FasebJ15，427-438)兩者中疾病病理學的啟動與內皮細胞凋亡的矛盾性增加相關。另外的研究已經確定了在血管通透性惡化中的內皮BMPR-II損失和穿過血管壁的白細胞的轉運改變中的作用(Burton等人(2011)Blood117，333-341；Burton等(2011)Blood118，4750-4758；Kim等人(2013)ArteriosclerThrombVascBiol33，1350-1359)。雖然使用肺動脈平滑肌細胞(PASMC)的體外研究已經證明濃度增加的BMP配體可以克服與BMP信號傳導通路中的突變相關的功能喪失(Yang等人(2008)CircRes102，1212-1221)，到目前為止，沒有研究在體內治療性地遞送BMP配體，從而為PAH治療的這種方法提供概念證明。由四種II型受體、五種I型受體和超過二十種BMP配體構成的BMP信號轉導家族的複雜性(Miyazono等人(2005)CytokineGrowthFactorRev16，251-263)可以解釋此類研究的缺乏。鑑定選擇性靶向肺內皮的適當配體提出了重大挑戰。最近，發現BMPR-II形成與ALK-1的信號複合物，並且特異性地響應於微小血管內皮細胞中的BMP9和10(David等人(2007)Blood109，1953-1961)。WO2005/113590描述了BMP10拮抗劑用於治療心臟病症的用途。WO2013/152213描述了BMP9和/或BMP10多肽用於提高脊椎動物中的紅細胞和/或血紅蛋白水平的用途。WO2006/130022描述了BMPRII的激動劑或拮抗劑，其可用於調節雌性哺乳動物的卵泡生成和排卵率。WO2010/114833描述了用於治療心臟疾病的藥物組合物，其包括骨形態發生蛋白。WO94/26893描述了BMP-10蛋白、其製備方法及其在治療骨和軟骨缺損以及傷口癒合和相關組織修復中的用途。WO95/24474和WO96/39431描述了人BMP-10多肽和編碼這樣的多肽的DNA(RNA)，所述多肽被聲稱可用於誘導骨的重新形成。WO93/00432和WO95/33830描述了BMP-9蛋白，其製備方法及其在治療骨和軟骨缺損、傷口癒合和相關組織修復以及肝生長和功能中的用途。WO2010/115874描述了通過給與愛佩琳(apelin)/APJ靶向藥物來治療肺動脈高壓的方法。WO2009/114180和WO2014/160203描述了被聲稱在調節細胞生長、分化、增殖和凋亡中有用的BMP信號傳導的小分子抑制劑，因此可用於治療與BMP信號傳導相關的疾病或病症，包括炎症、心血管疾病、血液疾病、癌症和骨病，以及用於調節細胞分化和/或增殖。小分子抑制劑也被聲稱在降低ApoB-100或LDL的循環水平中是有用的，以及在治療或預防如下疾病中是有用的：獲得性或先天性高膽固醇血症或高脂蛋白血症；與脂質吸收或代謝缺陷相關的疾病、病症或症候群；或由高脂血症引起的疾病、病症或症候群。因此，需要為血管和呼吸道疾病，特別是肺動脈高壓(PAH)提供有效的治療。技術實現要素：根據本發明的第一方面，提供了選自骨形態發生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形態發生蛋白9(BMP9)變體的多肽，用於血管疾病或呼吸道疾病的治療。根據本發明的又一方面，提供了治療血管疾病或呼吸道疾病的方法，其包括將治療有效量的選自骨形態發生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形態發生蛋白9(BMP9)變體的多肽給藥至需要其的受試者。根據本發明的又一方面，提供了包含BMP10或缺乏成骨活性的BMP9變體的藥物組合物，用於血管疾病或呼吸道疾病的治療。根據本發明的又一方面，提供了具有SEQIDNO：5的胺基酸序列的BMP9變體。根據本發明的另一方面，提供了具有SEQIDNO：6的胺基酸序列的BMP9變體。根據本發明的另一方面，提供了包含本文定義的BMP9變體的藥物組合物。附圖說明圖1.pro.BMP9和pro.BMP10的表達載體和系統。圖2.非成骨BMP9變體的產生。A.BMP9合成和翻譯後加工的示意圖。B-D.在誘導ID1和ID2表達(B和C)中，兩種BMP9變體(D366A和D408A)具有與在內皮細胞中的野生型相當的信號傳導活性，但在C2C12細胞中缺乏成骨信號傳導活性(D)。圖3.比較BMP9和BMP10的內皮細胞信號傳導活性和C2C12細胞成骨活性。A-C：BMP9和BMP10具有相似的信號傳導活性HMEC-1。血清飢餓後，用指定濃度的BMP9或BMP10處理HMEC-1細胞。處理8小時後，提取mRNA，並通過定量PCR測量ID1、ID2或BMPR-II的表達水平。使用β2-微球蛋白作為對照，並繪製相對於未處理樣品的倍數變化。示出了平均值±SEM，N＝2；D.與BMP9類似，BMP10還可以保護hPAEC抵抗TNFɑ-CHX誘導的細胞凋亡。方法如圖3A所示，N＝1；E.BMP9和BMP10以類似的程度抑制內皮細胞增殖。用在EBM2/2％FBS中的BMP9或BMP10(均來自R&DSystems公司)處理HPAEC24小時。將細胞與0.5μCi/孔3H-胸腺嘧啶孵育最後6小時。然後裂解細胞，並通過液體閃爍計數測量3H-胸腺嘧啶攝取。N＝1個實驗，4個孔的平均值±SEM。F.與BMP9不同，BMP10沒有作為C2C12細胞中ALP活性測量的可檢測到的成骨活性。將C2C12細胞用指定濃度的BMP9或BMP10處理64小時。將細胞在1％TritonX-100/PBS中裂解，並使用顯色磷酸酶底物4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(Sigma，S0942)測量細胞裂解物中的ALP活性，並在酶標儀(platereader)中在405nm處測量可溶性產物。在所有測定中，BMP9和BMP10均購自R&DSystems公司。Pro.BMP9在內部生產，並且使用購自R&D系統的BMP9作為標準通過ELISA來測定其濃度(成熟配體)。圖4.內部生成的pro.BMP10是具有完全活性的。A.BMP10合成和翻譯後加工的示意圖。B.表達BMP10的條件培養基，用抗BMP10抗體(R&DSystems公司)印跡。C.非還原SDS-PAGE顯示來自S200凝膠過濾柱的pro.BMP10的純化。前結構域和BMP10的一致性已經通過蛋白質印跡和質譜肽圖譜驗證。D和E.通過監測Smad1/5/8磷酸化和ID1/2/3基因表達，比較pro.BMP10與HMEC-1中的BMP9和BMP10(來自R&DSystems公司)的信號能力。方法如圖3A至C所示。D中的BMP濃度為0.05、0.1、1、5ng/ml，並且處理時間為1小時。示出了平均值±SEM，N＝2。圖5.BMP9丙氨酸掃描突變形成的總結。產生24個BMP9變體，並在HMEC-1細胞中測試ID1基因誘導，以及在C2C12細胞中測試鹼性磷酸酶活性。所有結果均相對於野生型(WT)BMP9標準化，示出了三個實驗的平均值。「-」表示未處理的細胞。圖6.BMP變體可以誘導hPAEC中的BMPR2基因表達。圖7.BMPD408A變體可以挽救hPAEC中由TNFa/CHX誘導的早期凋亡。圖8.BMP9和BMP10抑制膠原:纖連蛋白基質中血液過度生長內皮細胞(BOEC)管形成。(A)用DAPI和FITC-ULEX染色的膠原凝膠中的BOEC管的代表性圖像。當僅在培養基中時形成網絡(2％BBM2＝含有2％FBS的EBM2)。添加遞增濃度的BMP9抑制BOEC網絡形成。(B)對3個獨立實驗確定的BOEC網絡參數進行定量，證明BMP9以濃度依賴性方式抑制管的長度和數量、分支和環的形成。(C)BMP9和BMP10，兩種配體都抑制BOEC管的形成。具體實施方式根據本發明的第一個方面，提供了選自骨形態發生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形態發生蛋白9(BMP9)變體的多肽，用於血管疾病或呼吸道疾病的治療。本發明涉及骨形態發生蛋白的治療用途，其保持內皮細胞信號傳導活性(例如，其可通過誘導ID1、ID2和/或BMPR-II基因表達來證明)，但缺乏成骨活性(例如，其可以通過小鼠成肌細胞細胞系C2C12中的鹼性磷酸酶(ALP)的活性測量)。例如，本文公開的BMP10和BMP9變體不僅維持內皮細胞信號傳導活性，而且協同地缺乏成骨活性。因此，由於缺乏促進骨形成的能力，本文公開的天然BMP10和BMP9變體代表比天然BMP9更理想的激動劑，用於治療血管疾病或呼吸道疾病，特別是PAH。本文中提及的「BMP10」和「骨形態發生蛋白10」是指屬於由BMP10基因(具有SEQIDNO：1所示的序列)編碼的TGF-β超家族蛋白質的人多肽，並且其具有SEQIDNO：2中所示的424個胺基酸的序列，其中胺基酸殘基1至21包含信號肽，胺基酸殘基22至316包含前肽，並且胺基酸殘基317至424包含成熟BMP10。本文中提及的「BMP9變體」和「骨形態發生蛋白9變體」是指屬於由BMP9基因(具有SEQIDNO：3所示的序列)編碼的TGF-β超家族蛋白質的人多肽，並且其具有SEQIDNO：4所示的429個胺基酸的序列的變體，其中胺基酸殘基1至22包含信號肽，胺基酸殘基23至319包含前肽，並且胺基酸殘基320至429包含成熟BMP9。為了避免疑問，應該強調的是，這樣的BMP9變體必須保持內皮細胞信號傳導活性，但缺乏成骨活性。提及的「變體」包括BMP9的天然、非突變或野生型序列的遺傳變異。這種遺傳變異的實例包括選自以下的突變：置換、缺失、插入等。本文所用的「缺乏成骨活性」或「缺成成骨活性」是指包含SEQIDNO：4的序列的一個或多個突變的BMP9變體，其導致成骨活性的消除、最小化和/或抑制(例如，其可以通過小鼠成肌細胞細胞系C2C12中的鹼性磷酸酶(ALP)活性測量)。有利的BMP9變體是保持內皮特異性信號傳導的那些(即，通過在HMEC-1細胞中的ID1基因表達來測量，與野生型BMP9相比具有至少0.75倍ID1誘導的那些)，並且其具有較低的成骨活性值(即，通過小鼠成肌細胞細胞系C2C12中的ALP活性來測量，與野生型BMP9相比小於0.5倍)。更期望的BMP9變體是保持內皮特異性信號傳導的那些(即，通過在HMEC-1細胞中的ID1基因表達來測量，與野生型BMP9相比具有至少0.75倍ID1誘導的那些)，以及可忽略的成骨活性(即，通過小鼠成肌細胞細胞系C2C12中的ALP活性來測量，與野生型BMP9相比小於0.1倍)。最理想的BMP9變體是具有增加的內皮特異性信號傳導的那些(即，通過在HMEC-1細胞中的ID1基因表達來測量，與野生型BMP9相比具有更高的ID1誘導水平的那些)，以及可忽略的成骨活性(即，通過小鼠成肌細胞細胞系C2C12中的ALP活性來測量，與野生型BMP9相比小於0.1倍)。在一個實施方案中，所述血管疾病選自：肺高壓；肺動脈高壓；遺傳性毛細血管擴張症；動脈粥樣硬化；和肝肺症候群。在另一個實施方案中，所述血管疾病選自：肺高壓；肺動脈高壓；遺傳性毛細血管擴張症；和肝肺症候群。在另一個實施方案中，所述血管疾病選自肺動脈高壓。在一個實施方案中，所述呼吸道疾病選自：阻塞性肺病，如慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支氣管炎和肺氣腫；肺血管疾病，如肺水腫和肺出血；呼吸衰竭和呼吸窘迫症候群，如急性肺損傷和急性呼吸窘迫症候群；和間質性肺病，如特發性肺纖維化。在一個實施方案中，所述多肽是BMP10。因此，根據本發明的另一方面，提供了BMP10用於在血管疾病或呼吸道疾病的治療中使用。本文提供了這樣的數據，其示出了在誘導ID1、ID2和BMPR-II基因表達中BMP10與BMP9一樣有效(參見圖3A至3C)。此外，本文已示出在保護hPAEC抵抗TNFɑ-CHX誘導的細胞凋亡中BMP10表現出與BMP9相同的抗凋亡活性(參見圖3D)。然而，至關重要的是，與BMP9不同，BMP10在測試的最高濃度下不誘導任何ALP活性(參見圖3F)。在另一個實施方案中，所述多肽為包含SEQIDNO:2的胺基酸序列的BMP10。在另一個實施方案中，所述多肽為由SEQIDNO:1的核苷酸序列編碼的BMP10。在另一個實施方案中，所述多肽是BMP10的前結構域結合形式(pro.BMP10)。本文提供了這樣的數據，其證明pro.BMP10複合物是非常穩定的(參見圖4B和4C)，並且可能是用於治療血管和呼吸道疾病(例如PAH)的優選形式。在另一個實施方案中，pro.BMP10包含前肽序列與非共價結合的成熟BMP10序列，所述前肽序列包含SEQIDNO:2的殘基22-316的胺基酸序列，所述成熟BMP10序列包含SEQIDNO:2的殘基317-424的胺基酸序列。在另一個實施方案中，所述pro.BMP10包括含有兩個所述前肽序列和兩個所述成熟BMP10序列的四聚體。在一個實施方案中，所述多肽是缺乏成骨活性的BMP9變體。因此，根據本發明的另一方面，提供了缺乏成骨活性的BMP9變體，其用於血管疾病或呼吸道疾病的治療。在另一個實施方案中，所述多肽是BMP9的前結構域結合形式的變體(pro.BMP9)。在另一個實施方案中，pro.BMP9的變體包括以下的變體：前肽序列與非共價結合的成熟BMP9序列，所述前肽序列包含SEQIDNO:4的殘基23-319的胺基酸序列，所述成熟BMP9序列包含SEQIDNO:4的殘基320-429的胺基酸序列。在另一個實施方案中，所述pro.BMP9包括含有兩個所述前肽序列和兩個所述成熟BMP9序列的四聚體。在一個實施方案中，所述缺乏成骨活性的BMP9變體包括SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換、缺失或插入突變體。在另一個實施方案中，所述缺乏成骨活性的BMP9變體包括SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換突變體。在另一個實施方案中，SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換突變體包含以下一個或多個置換(例如一個、兩個三個突變等)：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自以下具有SEQIDNO:4的BMP9變體之一：H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A。在另一個實施方案中，所述SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換突變體包含以下一個或多個置換(例如一個、兩個三個突變等)：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自以下具有SEQIDNO:4的BMP9變體之一：H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。本文提供了這樣的數據，其證明這些突變序列維持內皮特異性信號傳導的有益效果並且大大降低了成骨信號傳導(通過當與圖5中的野生型BMP9相比時，至少0.75倍ID1誘導和小於0.5倍的ALP活性證明)。在另一個實施方案中，所述SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換突變體包含以下一個或多個置換(例如一個、兩個三個突變等)：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自以下具有SEQIDNO:4的BMP9變體之一：F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A。本文提供了這樣的數據，其證明這些突變序列維持內皮特異性信號傳導的有益效果，但是缺乏成骨信號傳導(通過當與圖5中的野生型BMP9相比時，至少0.75倍ID1誘導和可忽略的ALP活性(即小於0.1倍)證明)。在另一個實施方案中，所述SEQIDNO：4的胺基酸序列的置換突變體包含以下一個或兩個置換(即一個或兩個突變)：D366A或D408A。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自以下具有SEQIDNO:4的BMP9變體之一：D366A或D408A。本文提供了這樣的數據，其證明這些突變序列維持BMP9的有益效果，但是不能啟動成骨信號傳導，並且因此通過在體內給予BMP9而去除骨形成的潛在風險(參見圖2所示的結果)。本文還提供了這樣的數據，其證明這些突變序列具有增加的內皮特異性信號傳導，但缺乏成骨信號傳導(通過當與圖5中的野生型BMP9相比時，大於1倍的ID1誘導和可忽略的ALP活性(即小於0.1倍)證明)。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自SEQIDNO：4的D408ABMP9變體。本文提供了這樣的數據，其證明該突變序列已經示出能夠拯救由腫瘤壞死因子ɑ(TNFɑ)和環己醯亞胺(CHX)誘導的PAEC早期凋亡(見圖7所示的結果)。在另一個實施方案中，缺乏成骨活性的BMP9變體選自包含SEQIDNO：5的胺基酸序列的D366ABMP9變體或包含SEQIDNO：6的胺基酸序列的D408ABMP9變體。應當理解，本文公開的BMP9變體構成之前未知的多肽，因此形成本發明的新方面。因此，根據本發明的另一方面，提供了包含SEQIDNO：5的胺基酸序列的BMP9變體。根據本發明的另一方面，提供了包含SEQIDNO：6的胺基酸序列的BMP9變體。儘管可以單獨給予活性多肽，但其優選作為藥物組合物(例如製劑)存在。在一個實施方案中，這是無菌藥物組合物。本發明進一步提供如上定義的藥物組合物，以及製備這樣的藥物組合物的方法，所述藥物組合物包含(例如混合)本發明的至少一種多肽、和一種或多種藥學上可接受的賦形劑、以及任選的其它治療劑或預防劑。因此，根據本發明的另一方面，提供了包含BMP10或缺乏成骨活性的BMP9變體的藥物組合物，其用於治療血管疾病或呼吸道疾病。根據本發明的另一方面，提供了藥物組合物，其包含本文定義的BMP9變體，如包含SEQIDNO：5的胺基酸序列的D366ABMP9變體或包含SEQIDNO：6的胺基酸序列的D408ABMP9變體。藥學上可接受的賦形劑可以選自例如載體(例如固體、液體或半固體載體)、助劑、稀釋劑、填料或填充劑、成粒劑、包衣劑、控釋劑、粘結劑、崩解劑、潤滑劑、防腐劑、抗氧化劑、緩衝劑、懸浮劑、增稠劑、調味劑、甜味劑、掩味劑、穩定劑或藥物組合物中常規使用的任何其它賦形劑。用於各種類型的藥物組合物的賦形劑的實例將在下面更詳細地闡述。本文所用的術語「藥學上可接受」涉及在合理的醫學判斷範圍內，適用於與受試者(例如人)的組織接觸的化合物、材料、組合物和/或劑型，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應或其它問題或併發症，具有合理的利益/風險比。每種載體、賦形劑等在與製劑的其它成分相容的意義上也必須是「可接受的」。可以根據已知技術配製含有本發明多肽的藥物組合物，參見例如Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，PA，USA。藥物組合物可以是適合於口服、腸胃外、局部、鼻內、支氣管內、舌下、眼部、耳部、直腸、陰道內或經皮給藥的任何形式。當組合物用於腸胃外給藥時，它們可以配製用於靜脈內、肌內、腹膜內、皮下給藥，或通過注射、輸注或其它遞送方式直接遞送到靶器官或組織中。遞送可以通過彈丸注射、短期輸注或長期輸注，並且可以通過被動遞送或通過利用合適的輸注泵或注射器泵。適於腸胃外給藥的藥物製劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、共溶劑、表面活性劑、有機溶劑混合物、環糊精絡合劑、乳化劑(用於形成和穩定乳液製劑)、用於形成脂質體的脂質體組分、用於形成聚合凝膠的可凝膠化聚合物、凍幹保護劑和尤其用於使活性成分以可溶形式穩定並使製劑與預期接受者的血液等滲的試劑的組合。用於腸胃外給藥的藥物製劑還可以採取水性和非水性無菌混懸劑的形式，其可以包括懸浮劑和增稠劑(R.G.Strickly，SolubilizingExcipientsinoralandinjectableformulations，PharmaceuticalResearch，Vol21(2)2004，p201-230)。應當理解，包含本發明的BMP10或BMP9變體的基因治療在本發明的範圍內。例如，將編碼BMP10或BMP9變體核苷酸序列的載體給藥至宿主人類受試者，導致BMP10或BMP9變體多肽的內源性表達(例如在肝臟中的內源性表達)從而釋放到循環中。因此，根據本發明的另一方面，提供了包含編碼BMP10或BMP9變體的核苷酸序列的載體，其用於治療血管疾病或呼吸道疾病。在另一個實施方案中，載體包含SEQIDNO：1的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述載體是病毒載體。在另一個實施方案中，所述病毒載體選自：逆轉錄病毒、腺病毒、慢病毒、單純皰疹、牛痘和腺相關病毒。在另一個實施方案中，所述載體是病毒載體，是腺相關病毒。在一個替代性實施方案中，所述載體是非病毒載體。非病毒載體的使用具有優於使用病毒載體的許多優點，如容易大規模生產和在宿主中的低免疫原性。非病毒基因治療方法的實例包括：裸DNA的注射、電穿孔、基因槍、聲穿孔、磁性轉染，以及寡核苷酸、脂質複合物、樹狀聚合物和無機納米顆粒的使用。所述製劑可以存在於單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿、小瓶和載藥注射器，並且可以儲存在僅需要加入無菌液體載體的冷凍乾燥(凍幹)條件下，所述無菌液體載體例如是注射用水，在臨用前直接使用。通過凍幹本發明的多肽可以製備所述藥物製劑。凍幹是指冷凍乾燥組合物的過程。因此，本文中冷凍乾燥和凍幹作為同義詞使用。即用注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和片劑製備。用於胃腸外注射的本發明的藥物組合物還可以包括藥學上可接受的無菌水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及在即將使用前復原成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉末。合適的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或載體的實例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纖維素及其合適的混合物、植物油(如葵花籽油、紅花油、玉米油或橄欖油)、和可注射的有機酯(如油酸乙酯)。例如通過使用增稠劑或包衣材料如卵磷脂、通過在分散體的情況下維持所需的顆粒大小、以及通過使用表面活性劑可以維持適當的流動性。本發明的組合物還可以含有助劑，如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可通過包含各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等來確保防止微生物的作用。還可能需要包括調節張力的試劑，如糖、氯化鈉等。可注射藥物形式的延長吸收可以通過包含延遲吸收的試劑，如單硬脂酸鋁和明膠來實現。在本發明的一個具體實施方案中，藥物組合物是適於靜脈內給藥的形式，例如通過注射或輸注。對於靜脈內給藥，所述溶液可以直接給藥，或者可以在給藥前注射到輸液袋(含有藥學上可接受的賦形劑，如0.9％鹽水或5％葡萄糖)中。在另一個具體的實施方案中，藥物組合物是適於皮下(s.c.)給藥的形式。適合於口服給藥的藥物劑型包括片劑(包衣或未包衣的)、膠囊(硬或軟殼)、囊片、丸劑、錠劑、糖漿劑、溶液劑、粉劑、顆粒劑、酏劑和混懸劑、舌下片劑、晶片(wafers)或貼片(如口腔貼片)。因此，片劑組合物可含有單位劑量的活性多肽以及惰性稀釋劑或載體，如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇；和/或非糖來源的稀釋劑，如碳酸鈉、磷酸鈣、碳酸鈣；或纖維素或其衍生物，如微晶纖維素(MCC)、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素；以及澱粉，如玉米澱粉。片劑還可以含有這樣的標準成分，如粘結和成粒劑(如聚乙烯吡咯烷酮)、崩解劑(例如可溶脹交聯聚合物，如交聯羧甲基纖維素)、潤滑劑(例如硬脂酸鹽)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸酯)、抗氧化劑(例如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)以及泡騰劑(如檸檬酸鹽/碳酸氫鹽混合物)。這樣的賦形劑是公知的，不需要在此詳細討論。片劑可以設計成在與胃液接觸時釋放藥物(立即釋放片劑)、或在長期時間內或在胃腸道的特定區域以受控方式釋放(控釋片劑)。膠囊製劑可以是硬明膠或軟明膠品種，並且可以含有固體、半固體或液體形式的活性組分。明膠膠囊可以由動物明膠、或其合成或植物來源的等同物形成。固體劑型(例如，片劑、膠囊等)可以是包衣的或未包衣的。包衣可以用作保護膜(例如聚合物、蠟或塗劑)，或用作控制藥物釋放的機制，或用於美學或識別目的。包衣(例如EudragitTM型聚合物)可被設計成在胃腸道內的期望位置釋放活性成分。因此，可以選擇包衣以便在胃腸道內的特定pH條件下降解，從而在胃中或在迴腸、十二指腸、空腸(jejenum)或結腸中選擇性釋放多肽。代替包衣或除包衣之外，所述藥物可以存在於包含控釋劑的固體基質中，例如釋放延遲劑，其可以適於以受控的方式在胃腸道中釋放多肽。或者，所述藥物可以存在於聚合物包衣中，例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣，其可以適於在胃腸道中在不同酸度或鹼度的條件下選擇性釋放多肽。或者，所述基質材料或緩釋包衣可以是可溶蝕的聚合物(例如馬來酸酐聚合物)的形式，當劑型通過胃腸道時，其基本上被連續地侵蝕。在另一個替代方案中，包衣可以設計成在腸道中在微生物作用下分解。作為另一種替代方案，活性多肽可以配製在提供多肽釋放的滲透控制的遞送系統中。可以根據本領域技術人員熟知的方法製備滲透釋放和其它延遲釋放或持續釋放製劑(例如基於離子交換樹脂的製劑)。本發明的多肽可以與載體一起配製並以納米顆粒的形式給藥，納米顆粒的表面積增加有助於它們的吸收。此外，納米顆粒提供直接滲透到細胞中的可能性。納米顆粒藥物遞送系統描述於2006年3月13日公開的RamBGupta和UdayB.Kompella編輯的「NanoparticleTechnologyforDrugDelivery」，InformaHealthcare，ISBN9781574448573。藥物遞送的納米顆粒也描述於J.Control.Release,2003,91(1-2),167-172，以及Sinha等，Mol.CancerTher.August1,(2006)5,1909。藥物組合物通常包含約1％(w/w)至約95％(w/w)的活性成分和99％(w/w)至5％(w/w)的藥學上可接受的賦形劑或賦形劑的組合。特別地，所述組合物包含約20％(w/w)至約90％(w/w)的活性成分和80％(w/w)至10％的藥學上可接受的賦形劑或賦形劑的組合。藥物組合物包含約1％至約95％，特別是約20％至約90％的活性成分。根據本發明的藥物組合物可以是例如單位劑量形式，如以安瓿、小瓶、栓劑、載藥注射器、糖錠、片劑或膠囊的形式。藥學上可接受的賦形劑可以根據製劑的期望物理形式來選擇，並且可以例如選自稀釋劑(例如固體稀釋劑，如填料或填充劑；以及液體稀釋劑，如溶劑和助溶劑)、崩解劑、緩衝劑、潤滑劑、流動助劑、釋放控制劑(例如，釋放延遲或延遲聚合物或蠟)、粘結劑、成粒劑、顏料、增塑劑、抗氧化劑、防腐劑、調味劑、掩味劑、張力調節劑和包衣劑。本領域技術人員將具有選擇用於製劑中的適當量的成分的專門知識。例如，片劑和膠囊劑通常含有0-20％崩解劑、0-5％潤滑劑、0-5％流動助劑和/或0-99％(w/w)填料/或填充劑(取決於藥物劑量)。它們還可以含有0-10％(w/w)聚合物粘合劑、0-5％(w/w)抗氧化劑、0-5％(w/w)顏料。緩釋片劑另外含有0-99％(w/w)釋放控制(例如延遲)聚合物(取決於劑量)。片劑或膠囊劑的膜包衣通常含有0-10％(w/w)聚合物、0-3％(w/w)顏料和/或0-2％(w/w)增塑劑。腸胃外製劑通常含有0-20％(w/w)緩衝液、0-50％(w/w)助溶劑和/或0-99％(w/w)注射用水(WFI)(取決於劑量和是否冷凍乾燥)。用於肌內貯庫的製劑還可以含有0-99％(w/w)的油。用於口服給藥的藥物組合物可以通過將活性成分與固體載體混合，如果需要將所得混合物制粒，並且如果需要或必要，在加入適當的賦形劑後將混合物加工成片劑、糖衣丸芯或膠囊劑。它們也可以摻入聚合物或蠟質基質中，所述聚合物或蠟質基質允許活性成分以測得的量擴散或釋放。也可以將本發明的多肽配製成固體分散體。固體分散體是兩種或更多種固體的均勻的極細分散相。一種固體分散體類型，固溶體(分子分散體系)在製藥技術中是公知的(參見(Chiou和Riegelman，J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971))，並且在提高溶解速率和提高水難溶性藥物的生物利用度中是有用的。本發明還提供了包括上述固溶體的固體劑型。固體劑型包括片劑、膠囊劑、咀嚼片劑和可分散片劑或泡騰片劑。可以將已知的賦形劑與固溶體混合以提供所需的劑型。例如，膠囊劑可以含有與(a)崩解劑和潤滑劑，或(b)崩解劑、潤滑劑和表面活性劑混合的固溶體。此外，膠囊劑可以含有填充劑，例如乳糖或微晶纖維素。片劑可以包含與至少一種崩解劑、潤滑劑、表面活性劑、填充劑和助流劑混合的固溶體。咀嚼片劑可包含與填充劑、潤滑劑，以及如果需要的話另外的甜味劑(例如人造甜味劑)以及合適的調味劑混合的固溶體。也可以通過將藥物和合適的聚合物的溶液噴射到惰性載體，如糖珠(「non-pareils」)的表面上形成固溶體。這些珠隨後可以填充到膠囊中或壓成片。藥物製劑可以在單個包裝(通常為泡罩包裝)中以包含整個治療過程的「患者包裝(patientpacks)」呈現給患者。患者包裝具有優於傳統處方的優點，其中藥劑師從大宗供應中為患者分配藥品，在於患者總是能夠獲取包含在患者包裝中的通常在患者處方中缺失的藥品說明書(packageinsert)。已經顯示藥品說明書的包含可以改善患者對醫師指示的依從性。用於局部使用和鼻遞送的組合物包括軟膏劑、霜劑、噴霧劑、貼劑、凝膠劑、液滴劑和插入物(例如眼內插入物)。可以根據已知的方法配製這樣的組合物。用於直腸或陰道內施用的製劑的實例包括陰道栓劑和栓劑，其可以例如由含有活性多肽的成形的可模塑或蠟質材料形成。活性多肽的溶液也可用於直腸給藥。用於通過吸入給藥的組合物可以採用可吸入粉末組合物或液體或粉末噴霧劑的形式，並且可以使用粉末吸入器裝置或氣溶膠分配裝置以標準形式給藥。這種裝置是公知的。對於通過吸入給藥，所述粉末製劑通常包含活性多肽以及惰性固體粉末稀釋劑(如乳糖)。本發明的多肽通常以單位劑型存在，因此通常含有足夠的多肽以提供所需水平的生物學活性。例如，製劑可以含有1ng至2g的活性成分，例如，從1ng至2mg的活性成分。在這些範圍內，多肽的具體子範圍為0.1mg至2g活性成分(更通常為10mg至1g，例如50mg至500mg)，或1μg至20mg(例如1μg至10mg，例如0.1mg至2mg的活性成分)。對於口服組合物，單位劑型可含有1mg至2g，更典型地為10mg至1g，例如50mg至1g，例如100mg至1g的活性多肽。以足以實現所需治療效果的量將活性多肽給藥至需要其的患者(例如人或動物患者)。根據本發明的又一方面，提供了一種治療血管疾病或呼吸道疾病的方法，其包括將治療有效量的選自骨形態發生蛋白10(BMP10)或缺乏成骨活性的骨形態發生蛋白9(BMP9)變體給藥至需要其的受試者。以下研究闡明本發明：縮寫ActR-IIA(B)：激活素IIA型(B)受體；ALK1,2,3,6：激活素受體樣激酶1、2、3、6；ALP：鹼性磷酸酶；BMP：骨形態發生蛋白；BMPR-II：骨形態發生蛋白II型受體；ECD：細胞外結構域；FBS：胎牛血清；HMEC-1：人類微血管內皮細胞；hPAEC：人肺動脈內皮細胞；MSC：間充質幹細胞；PAH：肺動脈高壓；pro.BMP9：前結構域結合的BMP9；pro.BMP10：前結構域結合的BMP10；以及qPCR：定量PCR。材料和方法產生重組人pro.BMP9和pro.BMP10將包含人前原BMP9(pre-pro-BMP9)的開放閱讀框的全長cDNA克隆到表達載體pCEP4的HindIII和XhoI位點之間(參見圖1)。類似地，將人前原BMP10(pre-pro-BMP10)的全長cDNA克隆到表達載體pCEP4的XhoI和BamHI位點之間(參見圖1)。通過DNA測序驗證插入物。使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene公司)產生Pro.BMP9變體，並通過DNA測序驗證所有突變。在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM培養基中，使用聚乙烯亞胺將含有前原BMP9(或前原BMP10)的質粒轉染到HEK-EBNA細胞中。共轉染表達人弗林蛋白酶的質粒以促進pro-BMP9和pro-BMP10的加工。第二天為細胞更換為無血清的CDCHO培養基，3-4天後收穫條件培養基(media)。通過蛋白質印跡法，分別使用抗BMP9(MAB3209，R&DSystems公司)、抗BMP9前結構域(AF3879，R&DSystems公司)或抗BMP10(MAB2926，R&DSystems公司)證實條件培養基中pro.BMP9和pro.BMP10的身份。為了純化pro.BMP10，將1-5升條件培養基上樣到用50mMTris.HCl，pH7.4、50mMNaCl預平衡的Q-Sepharose柱上。用NaCl梯度(50-2000mM)洗脫已結合的蛋白質。通過非還原SDS-PAGE分析級分，合併含有pro.BMP10的級分並濃縮，然後上樣到S200凝膠過濾柱上。來自S200柱的Pro.BMP10純度超過90％，並且通過凝膠內消化和質譜鑑定進一步證實了BMP10前結構域和成熟BMP10的身份。通過定量PCR(qPCR)進行信號測定和在內皮細胞中的Smad1/5/8磷酸化對於信號測定，通過ELISA使用R&DBMP9作為標準物測定pro.BMP9的濃度；並通過蛋白質印跡法和ImageJ，使用R&DBMP10作為標準物對pro.BMP10的濃度進行定量。血清飢餓後，用指定濃度的BMP配體處理HMEC-1細胞。處理8小時後，提取mRNA，並通過定量PCR測量ID1、ID2或BMPR-II的表達水平。使用β2-微球蛋白作為對照並繪製相對於未處理樣品的倍數變化。示出了平均值±SEM，N＝2。對於Smad1/5/8磷酸化測定，將經血清飢餓的HMEC-1細胞用指定濃度的BMP配體處理1小時，並通過將培養皿置於乾冰上來停止信號傳導。加入裂解緩衝液(125mMTris·HCl，pH6.8、2％SDS和10％甘油)，並使用DCTM蛋白測定(Bio-Rad公司)測定總細胞裂解物中的蛋白質濃度。將25-35μg總細胞蛋白用於免疫印跡，並通過抗pSmad1/5/8抗體(CellSignaling公司，產品號9516)監測Smad1/5/8的磷酸化。α-微管蛋白用作上樣對照。小鼠成肌細胞系C2C12中鹼性磷酸酶(ALP)的活性將C2C12細胞以20,000細胞/孔接種在含有10％FBS的DMEM中的24孔板中。48小時後，用含有0.25％FBS的DMEM使細胞靜止16小時，並用指定濃度的BMP配體處理64小時。將細胞在1％TritonX-100/PBS中裂解，並使用DCTM蛋白測定(Bio-Rad公司)測定細胞裂解物中的總蛋白濃度。使用顯色磷酸酶底物4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(Sigma公司，S0942)測量細胞裂解物中的ALP活性，並在酶標儀上在405nm下測量可溶性產物。在所有測定中，對照BMP9和BMP10購自R&DSystems公司。結果BMP9信號傳導以及支持其在PAH中的治療潛力的數據BMP9和BMP10被鑑定為孤兒受體(orphanreceptor)ALK1的配體(David等人(2007)Blood109(5):1953-1961)。在內皮細胞中，它們誘導相似的一組基因，包括ID1、ID2和BMPRII。BMP9在肝臟中合成(Miller等人(2000)J.Biol.Chem.275(24):17937-17945；Bidart等人(2012)Cell.Mol.LifeSci.69(2):313-324)，以2-10ng/ml循環並且唯一確認的在活性濃度下BMP循環(Herrera和Inman(2009)BMCCellBiol.10：20；David等(2008)Circ.Res.102(8)：914-922)。BMP9是血管靜止因子，在體外抑制EC遷移、增殖和血管生成，從而促進血管穩定性(David等人(2008)，同上)。BMP9變體的基因工程保留內皮保護特性，但沒有骨形成活性儘管通過選擇性激活內皮受體治療心血管疾病的潛能，BMP9也可以在間充質幹細胞(MSC)和C2C12成肌細胞中發出信號。在測試的14種BMP中，發現BMP9在體外具有最高的成骨信號傳導和體內骨形成活性(Kang等人GeneTher.11(17):1312-1320；Luther等(2011)Curr.GeneTher.11(3):229-240)。對於BMP9的成骨活性，需要ALK1和ALK2兩者(Luo等人(2010)J.Biol.Chem.285(38):29588-29598)，但是在成骨活性的背景中BMP9與ALK1和ALK2的相互作用的性質的是未知的。雖然ALK2也由血管內皮細胞表達(Upton等人(2008)Mol.Pharmacol.73(2):539-552)，但ALK1是在這些細胞中介導BMP9應答的主要I型受體(Upton等人(2009)J.Biol.Chem.284(23):15794-15804；Scharpfenecker等(2007)J.CellSci.120(Pt6):964-972)。已經在MSC中研究了BMP9-成骨活性所需的II型受體。已經顯示所有三種II型BMP受體，BMPR-II、ActR-IIA和ActR-IIB的顯性負性突變體的表達可以抑制BMP9誘導的成骨活性，其中顯性負性ActR-IIB是最有效的(Wu等人(2010)ActabiochimicaetbiophysicaSinica42(10):699-708)。發明人假設通過突變BMP9上的I型和II型受體結合位點，可以產生保留ALK1結合但喪失ALK2結合的BMP9變體。這樣的BMP9變體可能保留內皮保護功能，但缺乏成骨活性。本發明人已經鑑定了兩種這樣的保持內皮細胞信號傳導活性的BMP9變體，如通過誘導ID1和ID2基因表達但缺乏成骨信號傳導活性來證實，這是在C2C12細胞中通過鹼性磷酸酶測定評價得到的(圖2)。由於這些BMP9變體(D366A和D408A)在內皮細胞中具有正常的信號傳導活性，它們可能在體內維持有益的效果，但是它們不能啟動成骨信號傳導並因此通過在體內給藥BMP9消除骨形成的潛在風險。BMP9丙氨酸掃描誘變產生24個BMP9丙氨酸變體(H326A、D342A、S343A、W344A、I346A、K349A、F362A、D366A、K372A、I375A、L379A、H381A、L382A、K383A、K390A、S402A、L404A、K406A、D408A、V411A、T413A、L414A、Y416A和Y418A)，並在HMEC-1細胞中測試ID1基因誘導和在C2C12細胞中測試鹼性磷酸酶活性。該研究的結果總結在圖5中，其中可以看出，證實13個BMP9變體(H326A、S343A、K349A、F362A、D366A、I375A、L379A、L382A、K390A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)能維持內皮特異性信號傳導的有益效果，並且能大大降低成骨細胞信號傳導(通過當與野生型BMP9相比時，至少0.75倍ID1誘導和小於0.5倍ALP活性證實)。此外，圖5所示的結果證明，鑑定了8種BMP9變體(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)能維持內皮特異性信號傳導但缺乏成骨信號傳導(通過當與野生型BMP9相比時，至少0.75倍ID1誘導和可忽略的(小於0.1倍)ALP活性證實)。此外，圖5中顯示的結果證明兩種BMP9變體(D366A或D408A)增加內皮特異性信號傳導但缺乏成骨信號傳導(通過當與野生型BMP9相比時，大於1倍的ID1誘導和可忽略的(小於0.1倍)ALP活性證實)。原代內皮細胞中BMP9變體的驗證在原代內皮細胞中進一步驗證了上文鑑定為維持內皮特異性信號傳導但缺乏成骨信號傳導的8種BMP9變體(F362A、D366A、I375A、L379A、S402A、D408A、Y416A和Y418A)。這些突變體都被發現在人肺動脈內皮細胞中誘導BMPR2基因表達(hPAEC，圖6)。至少一種變體D408A已顯示能夠挽救由腫瘤壞死因子ɑ(TNFɑ)和放線菌酮(CHX)誘導的PAEC早期凋亡(圖7)。在內皮中BMP10信號轉導BMP10對於心臟發育是不可缺少的(Neuhaus等人(1999)Mech.Dev.80(2):181-184)。由於嚴重受損的心臟發育，BMP10缺失的小鼠是胚胎致死的(ChenH等人(2004)Development131(9):2219-2231)。BMP10通過轉錄因子Tbx20調節心室壁發育(Zhang等人(2011)J.Biol.Chem.286(42):36820-36829)並且BMP10在心肌中的過表達幹擾了出生後心臟肥大生長(Chen等人(2004)Development131(9):2219-2231)。在成人中，BMP10僅在右心房中表達(Chen等人(2004)，同上)。已經顯示循環的BMP10介導流動依賴性動脈靜止(Laux等人(2013)Development140(16):3403-3412)。BMP10的循環水平是有爭議的。雖然已經使用蛋白質組學方法在人血清中檢測到BMP10蛋白(Souza等人(2008)Mol.Endocrinol.22(12):2689-2702)，並且可以通過ELISA測量(Ricard等人(2012)Blood119(25):6162-6171)，使用活性測定的其它研究不能檢測循環的BMP10(Bidart等人(2012)，以及Herrera和Inman(2009)，同上)。然而，最近的報告已經證明了BMP10在循環中的活性(Chen等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(29):11887-11892)。這種爭議可能是由於循環BMP10處於活性/無活性狀態、不完全加工、血清因子抑制或在公開的報導中所用的不同活性測定。BMP10的前結構域可以在其中起作用。例如，與其它BMP不同，已經報導了BMP10的前結構域可以在C2C12細胞中抑制BMP10誘導的基因表達(Sengle等人(2011)J.Biol.Chem.286(7):5087-5099)。此外，Biacore測量顯示BMP10對ALK1/BMPR-II比BMP9具有更高的親和力(Townson等人(2012)J.Biol.Chem.287(33):27313-27325)，以及在PAH的發生時，BMPR-II蛋白的喪失將明顯地對BMP10信號傳導有影響。重要的是，在體外和體內研究中，BMP10缺乏成骨活性。因此，在治療PAH中，天然BMP10代表比天然BMP9更理想的激動劑。BMP9和BMP10活性的比較人類微血管內皮細胞(HMEC-1)中的濃度-應答信號測定顯示BMP10在誘導ID1、ID2和BMPR-II基因表達方面與BMP9一樣有效(圖3A至3C)。重要的是，BMP10在保護hPAEC免受TNFα-CHX誘導的細胞凋亡方面表現出與BMP9相同的抗凋亡活性(圖3D)。據報導，BMP9通過抑制內皮細胞增殖來維持血管系統的穩定性(David等人(2008)，同上)。BMP9和BMP10都在hPAEC中將DNA合成抑制至類似的程度(作為3H-胸腺嘧啶攝取測量)(圖3E)。鹼性磷酸酶(ALP)是成骨通路中的關鍵酶，並且可以在C2C12細胞中以5ng/mlBMP9檢測BMP9誘導的ALP活性。然而，在相同條件下，BMP10在測試的最高濃度(20ng/ml，圖3F)下不誘導任何ALP活性，這與先前使用C2C12細胞中的腺病毒表達的BMP的研究一致(Kang等人(2004)，同上)。給藥BMP10和前結構域結合的BMP10在治療PAH和其它心血管疾病中的潛能BMP作為前原蛋白合成，並且在分泌後裂解前結構域(圖4A)。以前的報告顯示BMP10的前結構域可以抑制BMP10活性，並且BMP10可能以無活性形式循環。本發明人已產生大量的前結構域結合的BMP10(pro.BMP10)。與以前的報告相反，當從哺乳動物細胞產生BMP10時，發現前結構域保持與BMP10結合，並且pro.BMP10複合物是非常穩定的(圖4B和4C)。這表明pro.BMP10可能是循環形式。此外，發明人已經在HMEC-1細胞(圖4D和4E)和hPAEC中證明pro.BMP10具有與從商業來源(R&DSystems公司)購買的BMP9和BMP10相當的活性。由於前結構域保護BMP10的疏水表面並因此穩定BMP10的循環形式，pro.BMP10可能是用於治療PAH和其它心血管疾病的體內給藥的優選形式。BMP9和BMP10抑制膠原凝膠中的血液過度生長內皮細胞(BOEC)管形成血液過度生長內皮細胞可以從大多數個體的外周血中分離，並且代表高度增殖的細胞類型，其是人內皮細胞的高度代表。已經表明，像內皮細胞一樣，BOEC在3維膠原:纖連蛋白基質中形成空泡化的毛細管樣結構。該分析的結果示於圖8中，其不僅證明了BMP9和BMP10的抗血管生成作用，而且還顯示BMP9以及對於內皮細胞是抗增殖的，保護內皮細胞免於凋亡，並保護內皮細胞對抗增加的滲透性。即使在低濃度下，BMP9的抑制也是明顯的。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp