具有長循環作用的甘草次酸前體脂質體及其製備方法

2023-10-28 01:43:37

專利名稱：：具有長循環作用的甘草次酸前體脂質體及其製備方法
技術領域：
：本發明屬於藥物製劑的新
技術領域：
，具體涉及一種含難溶性藥物甘草次酸的前體脂質體製劑及其可工業化應用的製備方法。尤其涉及該製劑經注射給藥能達到長循環作用的目的，具有提高肝靶向作用。另固體前體脂質體可製備硬膠囊、片劑或顆粒劑，經口服給藥可顯著提高生物利用度35倍。
背景技術：
：甘草次酸(Glycyrrhetinicacid)又名甘草亭酸，是甘草中一類三萜皂苷甘草酸水解脫去糖酸鏈的產物。甘草次酸有抗肝炎、抗腫瘤、抗免疫、降血脂、抗潰瘍和抗破傷風毒素及抗HIV活性等作用[謝世榮，趙潔，劉琳等.甘草次酸的研究與展望.大連大學學報.2005,26(4):85-88]。藥理學研究還發現，甘草次酸有提高內耳聽力抗缺氧、抗乙醯膽鹼脂酶、抗心律失常的作用，並具有抗HIV活性。甘草次酸在抗肝臟疾病的應用研究中取得了突破性研究，通過提高對肝細胞的吸附能力達到保肝作用，並具有抑制肝癌的基本機理。NoseM.等人採用同分異構體中吸附性能更強的18a-甘草次酸，通過CCU誘導的肝細胞毒性實驗，證實肝細胞中抗肝毒性化合物的能力與其吸附能力平行。王吉耀等研究發現甘草次酸能抑制CCU與乙醇聯合誘導的慢性肝損傷大鼠肝臟內NF-KB結合活性增加。甘草次酸幾乎不溶於水，市售製劑一般為甘草酸鹽，由於口服給藥體內經過水解可能吸收，不同患者的生物利用度及藥動學數據差別很大。臨床上治療肝炎時需要長期口服甘草酸鹽，絕大部分甘草次酸衍生物在體內先經胃酸及腸道細菌水解為甘草次酸，然後經由小腸吸收入血液，甘草次酸經膽汁排至腸道被腸內細菌作用，以甘草次酸或3-表-甘草次酸吸收入血液，形成肝腸循環，甘草次酸為其鹽的代謝物以發揮藥效作用。中國專利主要通過將甘草次酸進行結構修飾或成鹽來降低其毒副作用和增大其在水中的溶解度，甘草次酸琥珀酸半酯二鈉鹽臨床上用於胃潰瘍的治療；甘草次酸鈉口服給藥有抗炎及免疫調節作用[朱任之.甘草次酸鈉口服給藥的抗炎及免疫調節作用.中國藥理學通報.1996，12(6):542-544.]，中國專利CN1948332公開了甘草次酸-30-醯胺類衍生物的合成方法及其製劑的用途，將ll位的酮還原，3位羥基改造和30位羧基改造，製備了注射劑、固體和液體的口服製劑，期望增強抗炎作用。CN1762967A公開了甘草次酸與鹼性胺基酸或有機鹼形成鹽的製備方法及用途，改變了甘草次酸的水溶性，製備其注射劑和凍乾粉針劑等劑型。以上中國專利公開的甘草次酸鹽雖然能提高藥物的水溶性，但由於甘草次酸結構修飾的合成反應步驟繁多，條件苛刻，且成本高，容易造成汙染環境，可能引入製劑生產中含雜質難以控制等問題，尤其是注射劑的原料質量標準需嚴格控制，否則可能導致較大的毒副作用。國內產品有甘草次酸普通注射劑，由於藥物不溶於水該處方中需添加大量的非水溶媒如乙醇、丙二醇等，靜脈注射途徑對患者的血管造成嚴重刺激性，由於藥物代謝半衰期短，進入血液消除快，體內維持時間短，嚴重影響製劑臨床安全性和療效。脂質體是具有磷脂雙分子層結構的定向藥物載體，磷脂作為內源性物質無毒副作用，該脂質體有天然磷脂雙分子層作為粒膜構成單位，具有原位振動性與流動性，有一定的柔性，可擠壓變形，不存在因工藝不慎或儲存中聚結形成少數大粒子、栓塞血管導致生命危險的可能性。含有PEG修飾材料的脂質體能夠增大脂質體粒子間的斥力，其表面的"構象雲"結構能夠產生空間位阻效應，親水性的PEG基團形成的水化膜，進一步降低屏蔽網狀內皮系統(RES)細胞的識別和攝取，修飾脂質體能夠更穩定地在血液中存在，延長了脂質體在體內循環的時間，增強了藥效作用，可提高臨床治療肝病的療效和安全性。目前，關於甘草次酸的研究報導，中國專利和文獻主要集中於結構修飾的發明專利，曰本對於甘草次酸的藥理作用報導較多，尚無前體脂質體，特別是未見具有PEG修飾的新型脂質體發明專利和文獻報導。嵌段共聚物作為一類新型的高分子化合物，具有良好的表面活性作用，mPEG-PLA可在脂質體表面修飾達到長循環的作用。通常使用的嵌段共聚物為使其形成膠束，需要使親脂端有一定的長度，一般至少與親水鏈等長。而合成的親脂鏈遠小於親水鏈的共聚物，在水中不能自發形成膠束，但其親脂鏈可以插入脂質體的磷脂雙分子層達到修飾脂質體的目的。本發明合成的兩親性嵌段共聚物具有以下優勢(1)合成的兩親性小分子量載體mPEG2000-PLA(8:2)，毒性低，生物相容性和安全性好，體內可生物降解；(2)脂質體的表面PEG化可以達到長循環作用。由於脂質體的表面組成經過PEG化修飾，可有效的避免被血漿中內源性物質破壞，緩慢而有效的富集於肝臟及其它病變部位，體內甘草次酸的吸收增加，可延長藥物作用時間，減小毒副作用。本發明採用脂質體包裹甘草次酸，能夠避免藥物本身結構修飾的複雜反應，克服成本高，汙染環境等問題，顯著降低甘草次酸的毒副作用。本發明的有益優勢為(1)在脂質體中加入PEG修飾材料，能夠有效地避免RES對脂質體的消除，增加體內循環時間，延長藥效。(2)將脂溶性的甘草次酸製成脂質體凍乾粉，革除了有機溶劑，臨用前用水合介質高度分散為靜脈滴注液，也可靜脈滴注給藥，有效控制及延長體內游離甘草次酸有效濃度，防止副作用的發生，提高臨床注射給藥的順應性。(3)緩控釋保肝治療作用。可製備甘草次酸前體脂質體固體劑型如片劑、膠囊劑等，增加了製劑貯藏的穩定性，甘草次酸前體脂質體通過口服給藥，由於親水載體修飾了甘草次酸脂質體，使其緩慢的進入肝臟釋放藥物以達到緩控釋作用，以減輕普通劑型引起的肝臟代謝過重問題，可提高口服藥物生物利用度35倍，增強病人用藥的順應性。
發明內容本發明目的是採用長循環脂質體新技術，製備一種具有長循環作用的甘草次酸前體脂質體，由於長循環脂質體表面覆蓋著一層PEG凝膠，可成功逃脫免疫系統的吞噬和破壞，改變藥物在體內的分布，從而延長其在血中的滯留時間，緩慢地濃集於肝臟，降低了藥物在其它各組織的毒副作用；且長循環脂質體的粒徑小於150nm。也可解決了甘草次酸口服溶解度、吸收差，延長了藥效，大大提高製劑口服的生物利用度，本發明的前體脂質體和PEG修飾脂質體，提供一種具有長循環作用、包封率高、且製劑儲存穩定性的脂質體處方，製備工藝簡單，重現性好，適用可工業化實施的製備方法。本發明的目的在於提供一種生物降解的兩親性二嵌段共聚物聚乙二醇單甲醚2000-聚乳酸(mPEG2000-PLA)合成的方法，聚合過程中需氮氣保護，無需抽真空，在保證產品性能的前提下可縮短反應時間、降低能耗。本發明所合成的兩親性聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸(mPEG-PLA，w/w80:20)二嵌段共聚物，其特點具有能生物降解的小分子量兩親性載體，本發明的兩親性載體能夠修飾甘草次酸脂質體，體內達到長循環作用，也可作為口服藥物緩控釋釋藥系統的新型載體。本發明的技術方案如下本發明的甘草次酸前體脂質體，含有以下各成分及重量百分比0.38%甘草次酸、590%磷脂、0.525%膽固醇、0.520%表面活性劑、0.525%PEG修飾材料、585%水溶性載體，緩衝鹽適量。其中磷脂採用天然磷脂、半合成磷脂或合成磷脂中的一種或幾種，磷脂醯膽鹼的含量在75%98%，包括大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、心磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂乙醇胺、二月桂醯磷脂醯膽鹼或二油醯磷脂醯膽鹼中的一種或幾種。本發明的表面活性劑包括甘氨膽酸鈉、去氧膽酸鈉、鵝去氧膽酸鈉、去氫膽酸鈉、膽酸鹽或牛磺膽酸鹽的一種或幾種。優選甘氨膽酸鈉和/或去氧膽酸鈉。本發明採用修飾脂質體的PEG修飾材料，包括聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸(mPEG-PLA)、聚乙二醇—聚乳酸、聚乙二醇一二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇一膽固醇、聚乙二醇一聚己內酯、聚乙二醇一聚十六烷基氰基丙烯酸酯、聚乙二醇一磷脂醯膽鹼、聚乙二醇一單羧酸3000—二棕櫚醯磷脂醯二乙醇胺、聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯或聚氧乙烯脂肪醇醚中的一種或幾種。優選聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸。本發明緩衝鹽溶液包括磷酸鹽緩衝液、氨-氯化銨緩衝液、硼砂-氯化鈣緩衝液、硼酸-氯化鉀緩衝液，且pH值範圍為68.0。上述水溶性載體包括甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、氯化鈉、環糊精、麥芽糖、微晶纖維素、右旋糖苷、蔗糖或果糖的一種或幾種。優選甘露醇、海藻糖或乳糖。研究發現，磷脂是甘草次酸被包裹在磷脂雙分子層內主要載體，採用乙醇注入法製備脂質體混懸液，處方組成以重量份數計(w/w)，甘草次酸:磷脂:膽固醇:表面活性劑，磷脂對脂質體粒徑及包封率的影響見表h表1磷脂用量對甘草次酸脂質體物理特性的影響處方組成(w/w)粒徑(nm)包封率(％)Zeta電位(mV)1:1:6:4415.636.5一20.21:10:6:4288.765.5一18.61:20:6:4145.587.9_23,31:30:6:472.998.2_30.11:40:6:481.497.7一32.1表1結果表明，甘草次酸:磷脂高於1:20時，脂質體的包封率提高，粒徑變小，綜合考慮生產成本，故磷脂的用量範圍為590%，優選2085%。膽固醇與甘草次酸有相似的結構，對甘草次酸脂質體的包封率有重要影響，處方組成以重量份數計(w/w)，甘草次酸:磷脂:膽固醇:表面活性劑，膽固醇對脂質體粒徑及包封率的影響見表2:表2膽固醇用量對甘草次酸脂質體物理特性的影響處方組成(w/w)粒徑(nm)包封率(％)Zeta電位(mV)1:30:0:4251.4卯.l一32.11:30:1:4137.592.9_34.81:30:4:468.998.2_36.01:30:7.5:496.396.9一31.31:30:10:4151.478.1一25.9結果表明，膽固醇可增加脂質膜的穩定性，但加入量太多可能阻礙甘草次酸嵌入磷脂雙分子層的親脂性結構作用，膽固醇用量大於10份會降低甘草次酸脂質體的包封率，故膽固醇的用量範圍為0.525%。表面活性劑可提高難溶性藥物載藥量，並適當減小脂質體的粒徑，處方組成以重量份數計(w/w)，甘草次酸:磷脂:膽固醇表面活性劑，表面活性劑對脂質體粒徑及包封率的影響見表3:表3表面活性劑對甘草次酸脂質體物理特性的影響處方組成(w/w)粒徑(nm)包封率(％)Zeta電位(mV)1:30:5:0—20.51:30:5:1128.482.5—23.61:30:5:264.998.2—30.41:30:5:578.495.5—31.8結果表明，甘草次酸與表面活性劑的用量比高於1:4時，脂質體的載藥量降低，粒徑變大。兩親性嵌段共聚物比例的選擇本發明選用mPEG2000-PLA(簡，P-P)作為脂質體表面修飾載體，研究了不同比例的嵌段共聚物對脂質體物理特性的影響，結果見表。表4mPEG2000-PLA對脂質體物理特性的影響修飾材料mPEG2000-PLA主藥(mg)磷脂(mg)膽固醇(mg)脫氧膽酸鈉(mg)P-P(mg)粒徑Cnm)包封率(%)80:2048.51250.0242.597.295.272.398.470:3050.11050.2236.0跳388.5450.272.1560:4050.51207.9243.199.792.7-沉澱050.41190.6239.698.693.4-沉澱本發明的甘草次酸前體脂質體的製備方法，步驟如下(1)將甘草次酸、磷脂、膽固醇、表面活性劑和PEG修飾材料溶於乙醇、叔丁醇或者它們中任選的混合液中，形成類脂質溶液，將水溶性載體加純淨水適量溶解，加入磷酸鹽緩衝液，將磷酸鹽緩衝液轉移至梨型瓶中，加熱至60'C以上，並放入攪拌器，將有機溶液用注射器緩緩注入至磷酸鹽緩衝液中，形成脂質溶液，將脂質溶液於旋轉蒸發除去有機溶劑，反覆過濾膜，除去熱原，冷凍乾燥，即得甘草次酸前體脂質體。或(2)將甘草次酸、磷脂、膽固醇、表面活性劑和PEG修飾材料溶於乙醇、乙醚或者它們中任選的混合液中，超聲溶解，在40'C旋轉蒸發除去有機溶劑，形成脂質膜。將水溶性載體加純淨水適量溶解，加入的磷酸鹽緩衝液，再將磷酸鹽緩衝液轉移至梨型瓶，與脂質膜水合，直至脂質膜完全脫落，形成粗脂質體混懸液，冷凍乾燥，得甘草次酸的前體脂質體。前體脂質體處方中加入的水溶性載體作為凍幹保護劑或賦性劑，以保證脂質的體固體狀態和穩定性，選擇甘露醇、乳糖和山梨醇為凍幹保護劑進行處方篩選，其處方組成以重量份數計(w/w)，甘草次酸:磷脂:膽固醇:去氧膽酸鈉:水溶性載體，考察前體脂質體經緩衝鹽溶液重建後脂質體物理特性，結果見表5:表5水溶性載體對脂質體物理特性影響tableseeoriginaldocumentpage9結果表明，水溶性載體對脂質體粒徑、包封率均有一定影響，特別是凍幹效果十分重要，水溶性載體用量需為甘草次酸5倍，故水溶性載體的用量為585%。採用兩種脂質體製備技術，注入超聲法、薄膜分散，脂質體按照處方組成以重量份數計(w/w)，甘草次酸:磷脂:膽固醇:表面活性劑為1:30:6:4，結果見表6。表6脂質體製備方法對脂質體物理特性影響tableseeoriginaldocumentpage9本發明所製備的脂質體粗混懸液可通過超聲、高壓勻質或者過膜一種或幾種方法來減/」粒徑，通過冷凍千燥法或噴霧乾燥法製備脂質體凍乾粉，包封率均大於85%，乙醇注入法製備的脂質體形成的多是小單室脂質體，粒徑小於150nm，載藥量偏低，包封率大於85%，薄膜分散法製備的脂質體形成的多是大多室脂質體，粒徑小於150300nm，載藥量較高，包封率大於90%，兩種製備方法簡單易行，適合於工業化大生產。將上述脂質體和修飾脂質體用5。/。葡萄糖或0.9%氯化鈉等滲溶液水合後，形成的脂質體混懸劑可用於靜脈注射，PEG親水基團表面修飾的脂質體，其立體位阻增強了脂質體的穩定性，並避免與血液中的調理素結合，降低與單核巨噬細胞的親和力，從而延長脂質體在血液中的循環時間，延長了藥效，增強了甘草次酸在肝的聚集，可降低藥物在其它各組織中的毒性。將上述前體脂質體按常規工藝可製備成固體劑型，例如膠囊劑，片劑和顆粒劑等，向前體脂質體添加微晶纖維素、乳糖、澱粉等填充劑，交聯羧甲基纖維素鈉、交聯聚維酮等崩解劑，可製備成顆粒劑；按照片劑常規製備方法可製備成片劑；將前體脂質體直接裝入硬膠囊，或將顆粒劑裝入硬膠囊中製備成膠囊劑；所製備的固體製劑能夠增加甘草次酸在體內的吸收，顯著提高其口服生物利用度，增強其抗肝炎療效和具有較好的保肝作用。圖1是本發明甘草次酸溶液、脂質體和修飾脂質體的體外釋放曲線(n=6)甘草次酸溶液劑(—一)，脂質體(一D—)，修飾脂質體(一A—)圖2是本發明大鼠靜脈注射甘草次酸脂質體、修飾脂質體和普通注射劑血藥濃度曲線(n=6)甘草次酸注射劑(一*一)，脂質體(一口一)'修飾脂質體(一A-)具體實施例方式實施例1(1)中間體丙交酯的合成將定量乳酸投入到三頸瓶中，通N2氣，機械攪拌下加入氧化鋅，加熱至120'C，蒸去乳酸中所含的水。然後升溫至14(TC左右，反應1小時減壓將反應中生成的水蒸去。反覆多次，直至無水蒸出。再升溫至18(TC,收集餾分，用乙酸乙酯重結晶兩次，得白色片狀結晶。formulaseeoriginaldocumentpage11(2)mPEG2000-PLA嵌段共聚物的合成一定比例的丙交酯和mPEG2000，加入到三頸瓶中，密封，N2流下除盡空氣，加熱套加熱至160。C，待內容物全部熔融，加入0.5wt。/。的辛酸亞錫，磁力攪拌條件下，反應8小時停止。產物用二氯甲烷溶解，用無水乙醚沉澱，反覆3次。產物真空乾燥24小時，計算得率(以PLA量計算)。formulaseeoriginaldocumentpage11反應得率(％)=生成的共聚物的量X0.8/投入丙交酯的量X100。/。反應得率為84.8±3.9%(n=3)(3)嵌段共聚物的結構表徵本發明通過開環聚合反合成mPEG2000-PLA嵌段共聚物，進行嵌段共聚物的純度檢查，鑑定表徵共聚物結構。通過DSC圖譜的研究，可以確認是否有未反應的丙交酯存在，考察嵌段共聚物理化性質，如熔點的改變，晶型的轉變等。在IR圖譜中。通過對共聚物特徵峰出現和消失，峰強度改變情況的研究，確定了共聚物的結構，通過NMR圖譜中特異氫的面積比可以推算出分子量。①DSC圖譜解析取mPEG2000-PLA嵌段共聚物、丙交酯與mPEG2000的物理混合物、丙交酯和mPEG2000單體適量裝入鋁製坩鍋內，以1(TC/min的速度程序升溫，20300'C的範圍內記錄DSC圖譜。從DSC圖譜得知，mPEG2000、丙交酯及嵌段共聚物mPEG2000-PLA(80:20)的熔點(rm)分別為50.4。C(mPEG2000)、123.7°C(Lactide)、47.0°C。mPEG和丙交酯的物理混合物均出現了各自的吸熱熔融峰，而嵌段共聚物只出現了mPEG2000的峰，並沒出現丙交酯的峰，這預示嵌段共聚物的生成，且共聚物中無殘留丙交酯。嵌段共聚物中mPEG的熔點與mPEG單體相比有所降低，可能的原因在於mPEG熔融與PLA相分離，並且PLA影響了mPEG的晶型，使得mPEG的結晶度降低。②IR圖譜取mPEG2000-PLA(80:20)嵌段共聚物、丙交酯與mPEG2000的物理混合物、丙交酯和mPEG2000單體適量，以1%溴化鉀壓片，掃描IR光譜。IR譜圖中丙交酯的特徵峰在波數1700cm-1處，是CK)雙鍵的伸縮振動，在1200cm"處也有C-O鍵的伸縮振動的峰，在3000cm"C-H鍵伸縮振動微弱，2920cm—1處是-CH3的吸收峰，在3500cm—i處出現了很強的-OH吸收峰。mPEG2000的有兩個特徵峰，波數2900cm—1處是C-H鍵的伸縮振動和1200cm-l處是C-0鍵的伸縮振動，無C=0雙鍵的伸縮振動峰；在各嵌段共聚物的IR圖譜上均有mPEG2000和丙交酯的特徵峰，預示著嵌段共聚物的生成。mPEG和丙交酯的物理混合物與合成的聚合物具有相似的IR圖譜。③!H-NMR圖譜取mPEG2000-PLA(80:20)嵌段共聚物、丙交酯與mPEG2000的物理混合物、丙交酯和mPEG2000單體適量，以D-氯仿為溶劑，記錄NMR圖譜。!H-NMR圖譜表明，mPEG中CHz的峰在5=3.5ppm;丙交酯中CH3和CH的峰分別在5=1.5ppm和S=5.1ppm處。嵌段共聚物出現了mPEG和丙交酯的峰，表明嵌段共聚物由mPEG和聚乳酸組成。通過圖譜可計算共聚物中mPEG/PLA的重量比。具體方法如下a處為PLA中CH的峰，b處為mPEG中CH2的峰，峰面積與氫的數目存在以下關係Areab/Areaa=4n/m，已知11=2000/44=45.5，則可求出m。結果表明，根據NMR算出來的共聚物中m=9.6，聚合物分子量約為2700。實施例2處方:甘草次酸氫化大豆磷脂膽固醇鵝去氧膽酸鈉百分比(％)2.5080.07.5010.0將甘草次酸、氫化大豆磷脂醯膽鹼、膽固醇和鵝去氧膽酸鈉用50mL無水乙醇超聲溶解；另取50mLpH7.4磷酸鹽緩衝液置梨型瓶中，6(TC加熱攪拌均勻。將乙醇溶液緩緩注入至磷酸鹽緩衝液中，超聲20min，形成脂質溶液，將脂質溶液於45"C下旋轉蒸發除去乙醇，反覆過0.22pm濾膜三次，除去熱原即得甘草次酸脂質體混懸液。將上述脂質體用5%葡萄糖水溶液水合重建，即得靜脈注射的甘草次酸脂質體混懸劑。採用光子相關光譜儀測定脂質體的粒徑為83.6nm，採用葡聚糖凝膠柱法HPLC測定藥物的包封率為96.5%。實施例3百分比(％)甘草次酸1.12蛋黃卵磷脂40.45膽固醇6.74甘氨氧膽酸鈉2.25mPEG2000-PLA4.49乳糖44.94將甘草次酸，磷脂，膽固醇，mPEG2000-PLA和甘氨氧膽酸鈉用50mL乙醇超聲溶解，45。C旋轉蒸發除去乙醇，形成膠狀液，將乳糖加純淨水適量溶解，加入pH7.4磷酸鹽緩衝液50mL,用此磷酸鹽緩衝液稀釋上述膠狀液，超聲20min，依次過0.8、0.45和0.22pm濾膜，反覆過濾膜三次，除去熱原，經冷凍乾燥法，得甘草次酸前體脂質體製品。將上述前體脂質體用0.9%氯化鈉水合重建即得靜脈注射的甘草次酸脂質體混懸劑。包封率為96.1%，粒徑為123.4nm。實施例4處方百分比(％)甘草次酸1.18蛋黃卵磷脂23.53膽固醇7.06甘氨氧膽酸鈉4.70聚乙二醇一膽固醇4.70甘露醇(無熱原)58.82將甘草次酸、磷脂、膽固醇、聚乙二醇一膽固醇和甘氨氧膽酸鈉用50mL乙醇超聲溶解;另取50mLpH7.4磷酸鹽緩衝液置入梨型瓶中，6(TC加熱攪拌均勻。將乙醇溶液用注射器緩緩注入至磷酸鹽緩衝液中，超聲20min，形成脂質溶液，將脂質溶液於45'C下旋轉蒸發除去乙醇，高壓勻質機處理兩次，反覆過0.22pm濾膜三次，除去熱原，冷凍乾燥，得甘草次酸修飾脂質體。將上述修飾脂質體用5%葡萄糖水合重建即得靜脈注射的甘草次酸前體脂質體。採用Zetamaster光子相關光譜儀測定前體脂質體的粒徑為73.6nm。採用葡聚糖凝膠柱法HPLC測定藥物的包封率為97.5%。實施例5百分比(％)處方甘草次酸1.14大豆磷脂45.45(含磷脂醯膽鹼卯％)膽固醇4.54去氧膽酸鈉I.I4mPEG2000-PLA6.82海藻糖40.91將甘草次酸，磷脂(含磷脂醯膽鹼90%)，膽固醇，mPEG2,-PLA和去氧膽酸鈉加入梨型瓶，用50mL甲醇超聲溶解，45'C旋轉蒸發除去甲醇，形成脂質膜待用；將海藻糖加純淨水適量溶解，加入pH7.48.0的磷酸鹽緩衝液50mL，將磷酸鹽緩衝液轉移至梨型瓶，與脂質膜水合，直至脂質膜完全脫落，形成粗脂質體混懸液，依次過0.8、0.45和0.22pm濾膜，冷凍乾燥，得甘草次酸前體脂質體。包封率為92.1%，粒徑為180.1nm。將上述10g前體脂質體與8g微晶纖維素、7g無水乳糖、0.2g硬脂酸鎂和0.05g二氧化矽混合均勻，用自動填充機直接裝入硬膠囊中，即成膠囊劑。實施例6處方:甘草次酸大豆磷脂(含磷脂醯膽鹼卯％)膽固醇甘氨膽酸鈉mPEG2000-PLA百分比(％)1.2344.449.882.477.41山梨醇34.57將甘草次酸、大豆磷脂(含磷脂醯膽鹼卯％)、膽固醇、mPEG2,-PLA和甘氨膽酸鈉用50mL叔丁醇超聲溶解，另取50mLpH7.4磷酸鹽緩衝液置入梨型瓶中，6(TC加熱攪拌均勻，將叔丁醇溶液緩緩注入至磷酸鹽緩衝液中，超聲20min，形成脂質溶液，將脂質溶液於45'C下旋轉蒸發除去叔丁醇，依次過0.8、0.45和0.22^m濾膜，即得甘草次酸脂質體混懸液，冷凍乾燥，得甘草次酸固體脂質體。稱取25g固體前體脂質體與6.75g微晶纖維素、3.5g可壓性澱粉和硬脂酸鎂0.35g，混合均勻，加入2%聚乙烯吡咯垸酮乙醇液適量制軟材，45i:千燥lh，過篩，整粒，採用異型壓片機壓片，每片750mg(每片含甘草次酸10.0mg)。測定固體水合後藥物的包封率為95.7%，粒徑為165.9nm。實施例7處方百分比(％)甘草次酸1.25大豆磷脂37.5(含磷脂醯膽鹼80%)膽固醇5.00去氧膽酸鈉5.00聚乙二醇一磷脂醯膽鹼6.25乳糖(120目)45.0將甘草次酸，大豆磷脂(含磷脂醯膽鹼80%)、膽固醇、聚乙二醇一磷脂醯膽鹼和去氧膽酸鈉加入梨型瓶，用50mL乙醇醇超聲溶解，45'C下旋轉蒸發除去乙醇，形成脂質膜待用；將乳糖加純淨水適量溶解，加入50mLpH7.4磷酸鹽緩衝液，將磷酸鹽緩衝液轉移至梨型瓶，與脂質膜水合，直至脂質膜完全脫落，形成粗脂質體混懸液，高壓勻質機處理兩次，經冷凍乾燥，得甘草次酸前體脂質體，將脂質體水合後測定包封率為88.7%，粒徑為151.1nm。將上述10g固體脂質體與4g微晶纖維素，3g可壓性澱粉和2g乳糖混合均勻，用2%聚維酮乙醇液制軟材，4(TC乾燥2h，過篩，整粒，即成顆粒劑。實施例8處方百分比(％)甘草次酸1.20氫化大豆磷脂38.55膽固醇9.64去氧膽酸鈉2.41聚乙二醇一二硬脂醯磷脂醯乙醇胺9.64山梨醇38.55將甘草次酸、氫化大豆磷脂、膽固醇和去氧膽酸鈉溶解於50mL乙醇，聚乙二醇一二硬脂醯磷脂醯乙醇胺用氯仿15mL超聲溶解，6CTC下旋轉蒸發除去有機溶劑，形成脂質膜；將山梨醇加純淨水適量溶解，加入50mLpH7.8磷酸鹽緩衝液，將磷酸鹽緩衝液轉移至梨型瓶，與脂質膜水合，直至脂質膜完全脫落，形成粗脂質體混懸液，高壓勻質機處理兩次，經冷凍乾燥，得甘草次酸前體脂質體。包封率為88.4%，粒徑為153.8nm。將上述前體脂質體用5%葡萄糖水合重建，即得靜脈注射的甘草次酸前體脂質體混懸劑。實施例9以甘草次酸溶液劑為對照，進行甘草次酸普通脂質體和修飾脂質體的體外釋放試驗，分別吸取甘草次酸溶液劑、甘草次酸普通脂質體和修飾脂質體混懸劑各2mL至透析袋(截留相對分子質量800010000)，將透析袋兩頭紮緊，放入200mLpH7.4磷酸鹽緩衝液釋放介質中，以200r/min速度磁力攪拌48h，分別在0.25，0.5,1，2，3，4,6，8，12，24和48h吸取釋放介質0.5mL，同時補液0.5mL，樣品用甲醇適量稀釋破膜，吸取20pL進樣分析，採用HPLC測定藥物含量。實施例10取SD大鼠18隻，體重200250g，隨機分為三組，每組6隻，雌雄各半，禁食12h。甘草次酸鈉注射劑為參比對照組，普通脂質體和修飾脂質體注射劑為受試製劑兩組，按lmg/kg劑量尾靜脈注射給藥，分別於0.08、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8禾Q10h經目艮眶靜脈叢取血0.5mL置肝素化離心管中，以4000r/min離心20min，吸取血漿lOOpL置離心管中，採用乙腈直接沉澱蛋白法沉澱蛋白，以10000r/min高速離心20min，吸取上清液20|xL進樣，分析，採用HPLC測定體內藥物含量，計算血藥濃度。經藥動學DAS2.0軟體數據處理，得藥動學參數見表7和表8。表7大鼠靜脈注射三種甘草次酸製劑的房室模型藥動學參數(n=6)tableseeoriginaldocumentpage16k12(l/h)k21(l/h)T1/2a(h)Ti鄰(h)CL(L/h/kg)AUC(。-t)(嗎/L-h)0.383±0.182*0.366±0.144*0.153±0.023*2.365±0.8660.715±0.082*1278.1±154.4*0,176±0.045"0.215±0.074**0.183±0.0193.939±2.0210.531±0.064"畫.6士95.1"0.608±0.147***0.407±0.0800.186±0.0352.140士0.4080.286±0.044***3449.2±487.2****P<0.05與脂質體比較；**屍<0.05與長循環脂質體比較；***屍<0.05與注射劑比較表8大鼠靜脈注射三種甘草次酸製劑的非房室模型藥動學參數(n=6)普通注射劑脂質體長循環脂質體C隨(ng/L)AUC(0-t)(ng/L'h)MRT(o-t)(h)2074.0±跳43*1302.8士151.35151.209±0.05*2788.1士220.2"3441.2±252.2***1697.1士87.1"3588.6±483.6***1.453±0.194**2.052±0.165****P<0.05與脂質體比較；**屍<0.05與長循環脂質體比較；***屍<0.05與注射劑比較實施例11取SD大鼠18隻，體重200250g，隨機分為三組，每組6隻，雌雄各半，禁食12h。以甘草次酸鈉注射劑為參比製劑，甘草次酸混懸劑(1%羥丙甲基纖維素)、甘草次酸普通前體脂質體和修飾前體脂質體三組製劑為受試製劑，按80mg/kg劑量分別灌胃給藥，分別於0.08、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24和36h經眼眶靜脈叢取血0.5mL置肝素化離心管中，將離心管置離心機以3500r/min離心20min,取血漿lOO^L置離心管中，採用乙腈直接沉澱蛋白法沉澱蛋白，吸取上清液2(VL進樣，分析，採用HPLC測定藥物含量，計算血藥濃度。經藥動學DAS2.0軟體數據處理，得藥動學參數見表9。表9大鼠口服給予三種甘草次酸製劑的藥動學參數(n=6)參數混懸劑脂質體長循環脂質體T隨(h)0.58±0.380.44±0.493,08±2.50CmaxOg/L)2.73±0.189.07±3.1013.52±4.11AUC(o-t)(pg/L-h)22.28±12.7154.66±26.8895.11±20.69MRT,(h)6.17±0.5213.69±4.2316.45±9.58T1/2(h)5.68±0.9713.85±4.2118.82±12.15F(%)136.2334.1581,權利要求1.一種具有長循環作用的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於各成分重量百分比為0.3～8％甘草次酸、5～90％磷脂、0.5～25％膽固醇、0.5～20％表面活性劑、0.5～25％PEG修飾材料、5～85％水溶性載體，緩衝鹽適量。2、根據權利要求1所述PEG修飾材料，兩親性修飾材料聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸(mPEG-PLA)，其特徵在於mPEG為小分子量，mPEG與PLA按照重量比(w/w)為80:20、70:30、60:40和50:50，優選80:20。3、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於所述磷脂包括大豆磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酸、天然或合成心磷脂、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯膽鹼、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂乙醇胺、二月桂醯磷脂醯膽鹼或二油醯磷脂醯膽鹼中的一種或幾種，且磷脂醯膽鹼的含量在60%99%。4、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於表面活性劑包括甘氨膽酸鈉、去氧膽酸鈉、鵝去氧膽酸鈉、去氫膽酸鈉、膽酸鹽或牛磺膽酸鹽的一種或幾種。優選甘氨膽酸鈉和/或去氧膽酸鈉。5、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於PEG修飾材料包括聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸、聚乙二醇一聚乳酸、聚乙二醇一二硬脂醯磷脂醯乙醇胺、聚乙二醇一膽固醇、聚乙二醇一聚己內酯、聚乙二醇—聚十六垸基氰基丙烯酸酯、聚乙二醇一磷脂醯膽鹼、聚乙二醇一單羧酸3000—二棕櫚醯磷脂醯二乙醇胺、聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯或聚氧乙烯脂肪醇醚中的一種或幾種，優選聚乙二醇單甲醚2000—聚乳酸。6、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於緩衝鹽溶液包括磷酸鹽緩衝液、氨一氯化銨緩衝液、硼砂—氯化鈣緩衝液、硼酸一氯化鉀緩衝液，且pH值範圍為6.58。7、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體，其特徵在於水溶性載體包括甘露醇、海藻糖、山梨醇、葡萄糖、乳糖、氯化鈉、環糊精、麥芽糖、微晶纖維素、右旋糖苷、蔗糖或果糖的一種或幾種。優選甘露醇、海藻糖或乳糖。8、根據權利要求1所述的甘草次酸前體脂質體的製備方法，其特徵在於-(1)將甘草次酸、磷脂、膽固醇、表面活性劑和PEG修飾材料溶於乙醇、叔丁醇或者他們中任選的混合液中，形成類脂質溶液，將水溶性載體加純淨水適量溶解，加入磷酸鹽緩衝液，將磷酸鹽緩衝液轉移到梨型瓶，6(TC加熱攪拌均勻，將有機相溶液緩緩注入磷酸鹽緩衝液中，形成脂質溶液。將脂質溶液於旋轉蒸發除去有機溶劑，高壓乳勻兩次，在用反覆過濾膜，除去熱原，經冷凍乾燥，即得甘草次酸前體脂質體。或(2)將甘草次酸、磷脂、膽固醇、表面活性劑和PEG修飾材料溶於乙醇、乙醚或者他們中任選的混合液中，45'C旋轉蒸發除去有機溶劑，形成脂質膜待用；將水溶性載體加純淨水適量溶解，加入的磷酸鹽緩衝液，再將磷酸鹽緩衝液轉移到梨型瓶，與脂質膜水合，直至脂質膜完全脫落，形成粗脂質體混懸液，經冷凍乾燥，即得甘草次酸前體脂質體。全文摘要本發明屬於藥物製劑的新
技術領域：
，具體涉及一種含甘草次酸前體脂質體及其製備方法。本發明的甘草次酸前體脂質體由甘草次酸、磷脂、膽固醇、表面活性劑和水溶性材料組成，採用乙醇注入法或薄膜分散法製備甘草次酸脂質體混懸液，經冷凍乾燥法或噴霧乾燥法製備固體脂質體粉末，該工藝簡單，重現性好，適合於工業化生產。前體脂質體經靜脈注射給藥具有長循環作用，可顯著降低藥物毒性，達到延長藥效作用；其脂質體固體製劑經口服給藥能增加吸收，提高生物利用度3～5倍。文檔編號A61K47/24GK101366698SQ20081015614公開日2009年2月18日申請日期2008年9月28日優先權日2008年9月28日發明者娟李,帥李,鐵李,王廣基,銘範,洋陸申請人:中國藥科大學