用於治療子宮感染的酪蛋白肽的製作方法

2023-10-27 12:13:52 1

專利名稱：用於治療子宮感染的酪蛋白肽的製作方法
用於治療子宮感染的酪蛋白肽本發明的領域本發明涉及酪蛋白肽並且涉及其治療用途。本發明的背景根據它們的電泳遷移率，酪蛋白包括三個部分，α、β和Y。酪蛋白水解物是酪蛋白的水解形式，其中包括酪蛋白衍生的活性多肽。已經確立的是，酪蛋白水解物在針對微生物和病毒性感染的免疫應答中起作用。例如，美國專利號3，764，670描述了酪蛋白片段(通過蛋白水解活性獲得)的抗細菌活性並且披露了具有針對微生物的抗微生物特性的蛋白水解酪蛋白消化物。美國專利號5，506, 209,5, 538，952 和 5，707, 968(都授予穆可伊(Muker ji )等人)、以及授予安德森(Andersson)等人的5,968,901描述了呈液體腸內配方的僅僅人β -酪蛋白、重組人酪蛋白、以及兩者的水解物的給藥，用於治療在嬰兒中的呼吸道合胞病毒感染、中耳炎、流感嗜血桿菌(H. influenza)和其他感染。美國專利號5，330，975描述了用於中和細菌內毒素(例如霍亂毒素)的結合唾液酸的K-酪蛋白和K-酪蛋白肽的用途。美國專利申請公開號2009/0305947描述了用於管理家畜和農場動物生殖周期的酪蛋白肽以及尤其是酪蛋白水解物的用途。美國專利申請公開號2009/0069218描述了酪蛋白肽以及尤其是酪蛋白水解物作為用於縮短泌乳家畜動物的幹乳期的長度、用於增加其產後產乳量和乳汁衛生、以及用於改善家畜福利的一種方法的用途。·本發明概述根據其第一個方面，本披露提供了一種用於治療雌性哺乳動物中的子宮感染的酪蛋白肽。這樣的治療尤其促進了哺乳動物的良好的產後管理。根據其第二個方面，本披露還提供了一種治療子宮感染的方法，該方法包括對需要治療子宮感染的雌性哺乳動物給予一定量的至少一種酪蛋白肽，該量對於治療哺乳動物中的子宮感染是有效的。根據其第三個方面，本披露還提供了至少一種酪蛋白肽用於製備用於治療需要治療子宮感染的雌性哺乳動物中的子宮感染的一種藥物組合物的用途。另外，根據一個另外的方面，本披露還提供了一種用於治療子宮感染的藥物組合物，該組合物包含作為一種活性組分的一定量的至少一種酪蛋白肽，該量對於治療雌性哺乳動物中的子宮感染是有效的。最後，根據一個另外的方面，本披露提供了一個藥盒，該藥盒包括至少一種酪蛋白肽以及使用該酪蛋白肽用於治療雌性哺乳動物中的子宮感染的說明書。本發明的詳細說明本發明是基於發現酪蛋白肽，並且尤其是酪蛋白肽水解物可以用於子宮感染的治療。特別發現的是，對產後奶牛給予酪蛋白水解物在臨床型子宮炎的治療中是有效的。哺乳動物(比如牛科動物)的子宮在產犢之前是無菌的。在懷孕期間，子宮頸提供了一個針對病原菌子宮內入侵的屏障。在產犢時，範圍廣泛的細菌通過此時開放的子宮頸進入子宮，引起(offset)以子宮感染、炎症、以及最終子宮清理而告終的級聯事件。然而，病原菌在一些奶牛中存留，通過防止生理性子宮復舊而引起子宮疾病，導致低生育力。由於繁殖性能對於可行的乳品生產以及哺乳動物的繁殖是至關重要的，產後期的子宮衛生需要廣泛的獸醫關注。分娩受孕間隔以及由此懷孕率是來自家 畜和農場管理的經濟觀點的關鍵因素。維持一個大約12至14個月的分娩-受孕間隔的最適宜周期的能力取決於許多因素，尤其是動物的子宮的臨床狀態，所述臨床狀態應當完全沒有任何產後相關性感染。子宮炎、子宮內膜炎和子宮積膿是常見的子宮炎性疾病，發生在家畜和農場動物的產後期期間，主要是產後期早期，並且主要與生殖道(即，子宮)的汙染有關。由於治療費用、回奶、繁殖性能降低以及過早淘汰(premature culling)，子宮感染、以及延遲的子宮與宮頸復舊會引起經濟損失。已經報導了各種各樣的子宮內膜炎的療法，包括以給予抗生素為主，通過前列腺素F2a (PGF2 a )或雌二醇的全身或局部給藥。本披露提供了一種用於子宮感染的替代治療。因此根據第一方面，本發明提供了一種用於治療雌性哺乳動物中的子宮感染的酪蛋白肽。正如所理解的，雖然在下面的詳細說明中關於用於治療雌性哺乳動物(如一種授乳動物)中的酪蛋白肽描述了本發明，應當理解的是在本披露之內還包括，對雌性哺乳動物給予酪蛋白肽以及包含作為一種活性組分的一定量的至少一種酪蛋白肽的藥物組合物的治療方法(該量對於治療子宮感染是有效的)、以及一種酪蛋白肽用於製備治療所述動物中的子宮感染的一種藥物組合物的用途。酪蛋白是非人類哺乳動物的乳汁中的主要蛋白，也發現於人類哺乳動物的乳汁中，已知包括亞型a SI、a S2、β和K。酪蛋白是根據各亞型a SI、a S2、β和κ的胺基酸序列而定義的(Farrell, Jr. H. Μ. , Jimenez-Flores R. , BleckG. Τ. , Brown Ε. Μ. , ButlerJ. Ε. , Creamer L. K. , Hicks C. L. , Hollar C. Μ. , Ng-Kwai-Hang K. F. , Swaisgood H. Ε.牛奶中的蛋白質的命名法_第六次修訂(Nomenclature of the Proteins of CowsiMilk-SixthRevision.)，《乳品科學期刊》(J. Dairy Sci. )，87:1641-1674(2004))。適合在本發明中使用的酪蛋白可以獲自多種來源中的任何一種，例如但不限於，包括人類和非人類動物的任何哺乳動物來源的奶的α SI、a S2和β -酪蛋白。在本披露的背景下，當提及酪蛋白時，應當理解為也包括酸性酪蛋白、酪蛋白鹽、含磷酪蛋白以及酶凝酪蛋白。此外，應當理解包含植物酪蛋白類似物。[例如，如描述在美國專利號3，930, 058中；Kumar, Surinder和Ramachandran, Kolar S.修飾的植物蛋白模擬酪蛋白]。術語「酪蛋白肽」在其廣泛的意義上是指獲自或相應於酪蛋白的一個或更多個部分的肽片段或擬肽物(peptido-mimetic product)。該肽可以包括但不限於一種酪蛋白分解產物(當酪蛋白被酶或重裂解為肽片段時出現該分解產物(在該領域中也被已知為術語「酪蛋白水解物」))、或可以是指一種合成產生的產物，其中該酪蛋白肽在治療子宮感染中展示出至少一種治療有益的效果。該酪蛋白肽可以是單個肽或獨立地天然存在的肽、半合成肽、合成肽、磷酸肽(pho sphor-p ep t i de )基因改造的酪蛋白肽、以及酪蛋白肽的擬肽物的不同肽的混合物。當最佳地比對兩個序列時，修飾的、合成的、半合成的酪蛋白肽、或天然存在的酪蛋白肽的其他類型的類似物的至少75%，有時85%、90%、95%並且甚至99% (在序列上)與天然發生的酪蛋白肽一致。此外，根據本發明，任何使用的非天然存在的酪蛋白肽應當保留天然存在的酪蛋白的至少一部分生物活性。根據本發明的一種酪蛋白肽的特徵為在大約100至10，000道爾頓之間(例如，在2至100個胺基酸之間)並且優選地在大約100至7，000道爾頓之間的分子量。 在本披露的背景下，一種酪蛋白肽還包括一種酪蛋白水解物。一種酪蛋白水解物被理解為酪蛋白(蛋白質)的水解形式，其中包括那些精通本領域的人員已知的活性β -酪蛋白衍生的肽。典型地在酶水解之後獲得天然存在的酪蛋白肽,該酶可以是任何哺乳動物肽酶,例如但不限於纖溶酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶、組織蛋白酶、以及植物肽酶(例如但不限於木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶)、以及微生物來源的酶。例如，一種天然存在的酪蛋白肽可以是對酪蛋白亞基β_酪蛋白、α Si-和as2-酪蛋白、K -酪蛋白的纖溶酶活性的結果。在一些實施方案中，通過用胰蛋白酶裂解酪蛋白而獲得一種酪蛋白水解物。該酪蛋白肽也可以是一個合成的或半合成的肽。可以通過肽合成領域已知的任何方法獲得一種合成肽，包括固相肽合成(R. B. Merrifield (1963))。「固相肽合成· I. 一種四肽的合成」。fn、.I- Am. Chem. Soc. 85 (14) : 美國化學學會期刊(J. Am. Chem. Soc.)85(14):2149 - 2154).可以通過酪蛋白的化學水解而獲得一種半合成的酪蛋白肽，例如通過在強酸(酸-HVP)或強鹼中延長的沸騰或使用一種化學試劑如溴化氰(CNBr)。還可以通過本領域已知的分子技術中的分子工程獲得酪蛋白肽，例如使用重組DNA。酪蛋白肽還可以包括一種天然存在的肽的化學修飾，例如在一個或多個胺基酸被缺失、置換或修飾的地方，例如通過一個側基的移除、一個側基的置換或一個化學基團的引入。化學修飾可以包括但不限於下列非排他性實例乙醯化、醯化、醯胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI錨點形成(GPI anchor formation)、脂質或脂質衍生物的共價連接、甲基化、十四烷基化、聚乙二醇化、異戊烯化、磷酸化、泛素化、或任何相似的過程。當提及一個胺基酸序列被另一個置換時，優選該置換是保守置換。例如，酪蛋白序列中的一個或多個胺基酸殘基被具有相似極性或電荷的另一個胺基酸置換。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺.帶正電荷的(鹼性的)胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性的)胺基酸包括天冬氨酸和穀氨酸。雖然如此，只要不顯著改變產生的酪蛋白肽類似物的所希望的(酪蛋白樣)生物活性，也可以發生非保守置換。酪蛋白肽也可以是一種擬肽類肽，如類肽或半類肽，它們是肽衍生物，具有例如修飾,例如但不限於環化、N末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾，包括但不限於CH2-NH、CH2-S, CH2-S-O, 0-C-NH、CH2-O, CH2-CH2, S_C_NH、CH-CH 或 CF-CH、主鏈修飾和殘基修飾(製備擬肽化合物的方法可以在定量藥物設計(Quantitative Drug Design)中找到，
C.A. RamsdenGd. , Chapter 17. 2, F. Choplin Pergamon 出版社(1992),猶如在此充分陳述一樣通過引用進行結合)。根據本發明的酪蛋白肽可以包含「L」以及「D」形式的殘基。
在一個實施方案中，該酪蛋白肽是單一的肽或磷酸肽混合物，S卩，含有單一含磷基團或是一種富含磷的肽。在一個實施方案中，該酪蛋白肽是富含任何磷酸絲氨酸、磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和/或磷酸組氨酸的酪蛋白肽(酪蛋白磷酸肽，CPP)和一價陽離子磷酸酪蛋白，如磷酸酪蛋白鈉、鉀、鈣或銨鹽。在一個實施方案中，富含磷基團的酪蛋白肽是一種酪蛋白水解物。在一個實施方案中，該酪蛋白肽包含一個由胺基酸序列Ser-Ser-Ser-Glu-Glu(序列ID NO: I)定義的基序，其中一個或更多的Ser殘基是任選地被磷酸化的。包含磷酸化基序的酪蛋白肽的一個非限制性基團由SEQ ID NOs:2-6提供。以下提供了 SEQ ID NO: 2-6,它們在酪蛋白多肽中的來源和定位(殘基數量)SEQ ID NO: 2-RELEELNVPGEIVES (p) LS (p) S (p) S (p) EESITR (在 β -酪蛋白中的1-25 位)SEQ ID N0:3-QMEAESIS(p)S(p)S(p)EEIVPDSVEQK(在αSl-酪蛋白中的59-79位)SEQ ID NO: 4-KNTMEHVS (p) S (p) S (p) EESIISNETYK (在 a S2-酪蛋白中的 1-21 位)SEQ ID NO:5-KVNELSKNIGS(p)ES(p)TEDQ(在 a SI-酪蛋白中的 36-52 位)SEQ ID NO:6-PTLNREQLS(p)TS(p)EENSKKTVD(在 a S2-酪蛋白中的 12-140 位)·雖然在SEQ ID NOs: 1-6中提出的肽序列的胺基酸殘基都是〃L〃異構形式，〃D〃異構形式中的殘基可以置換任何L胺基酸殘基，只要產生的肽類似物保留相應的「L」同分異構體的至少部分生物活性。設計包含至少一個D胺基酸的酪蛋白肽一個原因是增加肽對蛋白質降解的穩定性。如上面指出，酪蛋白肽用於治療子宮感染。術語〃子宮感染"在此是用來表示一種由病原體大量進入(influx)哺乳動物的子宮以及因此的子宮壁炎症引起的一種病理狀態。在一個實施方案中，子宮感染是一種病原體誘導的炎症，也稱為術語非無菌性炎症(non-sterile inflammation)。子宮炎，『產後型』或『臨床型』；子宮內膜炎，臨床型或亞臨床型；以及子宮積膿是常見的子宮炎症性感染性疾病，主要發生在家畜和農場動物的產後期期間(主要在產後期的早期)，並且主要與生殖道(即，子宮)的汙染相關。子宮炎是一種涉及子宮所有層(子宮內膜黏膜和黏膜下層、肌層、以及漿膜)的炎症反應。具有子宮炎(或子宮外膜炎)的動物有異常增大的子宮、可在陰道中檢測到的膿性子宮排出物(更為普遍地在產後21天之內)，通常沒有全身敗血症，具有明顯的疾病徵象(發熱、抑鬱、虛弱、食欲不振)。產後子宮炎(也稱為毒性產後子宮炎或毒性子宮炎)以異常增大的鬆弛的子宮和惡臭的水樣棕紅色陰道排出物為特徵，與全身性敗血症的急性疾病徵象(主要是產乳量降低、遲鈍或毒血症徵象)相關並且通常在產後10天發熱>39. 4° C。子宮內膜炎涉及子宮的臨床(急性)或亞臨床炎症。臨床型子宮內膜炎是僅僅子宮內膜的炎症，延伸不深於子宮海綿層，以膿性陰道排出物為特徵(典型地一直到產後42天)，沒有全身性疾病徵象。亞臨床型子宮內膜炎可以通過產後21-33天收集的子宮細胞學樣品中多於18%的多形核白細胞的存在和/或通過子宮腔內液體的超聲影像，或產後34-47天子宮細胞學樣品中多於10%的多形核白細胞的存在而被診斷[Sheldon IM, (2006) ibid.]。
子宮積膿是在持久黃體和宮頸閉合的情況下，在子宮腔中的大量液體的積聚。以上任何情況可以由許多種病原菌引起。在奶牛中，子宮炎和子宮內膜炎的致病生物最經常是單獨的化膿隱秘桿菌(放線菌)或與壞死梭桿菌或其他革蘭氏陰性厭氧生物聯合。在一些形式的子宮內膜炎中，致病因子是豬葡萄球菌或大腸桿菌。在其他動物中，如 母馬，子宮內膜炎最常見的的致病因子是獸疫鏈球菌，但是可以涉及幾種其他生物，包括大腸桿菌、綠膿假單胞菌和肺炎克雷伯桿菌。此外，術語「子宮感染」包含子宮頸和陰道感染，例如但不限於宮頸炎(一種子宮頸的炎症，可能由沙眼衣原體、細菌淋病奈瑟菌(也稱為淋球菌)引起)；或陰道炎(陰道炎症，可能由酵母白色念珠菌，加德納菌屬或寄生原生生物陰道毛滴蟲引起)；以及外陰炎(外陰的炎症，有時被稱為外陰陰道炎(因為在有陰道炎症時，外陰也經常發炎)。在一些奶牛群中，40%的產後動物被診斷為子宮感染，因此需要獸醫治療(LewisG. S.,子宮衛生和失調，《乳品科學期刊》(J. Dairy Sci. )，80:984-994(1997))。被診斷具有子宮感染，例如像，子宮炎或子宮內膜炎以及延遲性子宮與子宮頸復舊的奶牛，具有顯著降低的受孕率、延長的距離第一次受精的天數、以及增加的從產犢到育種的間隔，這已經通過降低的懷孕數量例證。例如，子宮感染可以增加產犢到產犢之間的周期，該周期最佳地應當不超過大約12至14個月的最適宜周期，即，每頭奶牛每年大約產犢一次。保持這樣一個最適宜周期的能力取決於許多因素，尤其是動物的子宮的臨床狀態，所述臨床狀態應當完全沒有任何產後相關性感染。因此，子宮感染引起經濟損失，例如獸群健康相關的成本增加，經常飼料消耗降低，引起很大的奶產量降低，並且迫使飼養員和奶供應商淘汰家畜動物(如奶牛)，否則這些家畜動物是多產的並留在獸群中。子宮內膜炎和子宮炎可以自愈，通常對於繁殖性能或任何其他生產力量度沒有很大的影響。應當理解的是，當子宮變得被感染時，它可能顯著影響奶產量。本發明可以適用於許多種雌性哺乳動物，可以在授乳期之前(例如小母牛)，也可以是授乳動物。在一些優選的實施方案中，該雌性哺乳動物是非人類的哺乳動物。在本發明的背景下，可能的非人類的哺乳動物可以選自下列非限制性組，該組由以下各項組成狗、綿羊、山羊、母豬、奶牛、瘤牛、斑馬、貓、驢子(donkey)、驢(ass)、水牛、牛(oxen)、母馬(包括小雌馬)、馴鹿、犛牛、駱駝、美洲駝(lama)、羊駝、大象、豬、野豬和疣豬。在一個實施方案中，本發明適用於授乳動物。在另一個實施方案中，本發明涉及家畜授乳動物，包括但不限於奶牛、水牛、山羊、綿羊、母馬、瘤牛、母豬和牛。一個特別感興趣的授乳動物是奶牛。該哺乳動物可以是任何未經產的、初產的或多產的授乳動物。「未經產的」(未生育者「nullipara」或「para」)應當被理解為是指一個從未完成一個妊娠周期的動物；「初產的」(初產者「primipara」或「primip」)應當被理解為是指一個已經生產了至少一個後代的動物(單次分娩)；以及「多產的」(「多產者」 「multip」)應當被理解為是指一個已經經歷了兩次或更多次分娩的動物。仍然在一個另外的實施方案中，該子宮感染是一種產後感染。在本發明的背景下，術語產後感染是指發生在分娩後任何時間的感染，例如在兩次連續分娩的時間間隔中，以及在一些實施方案中是在分娩之後直到發情期開始的時間。在一些實施方案中，產後期被看作是在分娩之後前7周期間。該酪蛋白肽被用來治療任何上述子宮感染。「治療」("treatment")或「治療」("treating)等術語在此用來是指對具有或傾向產生子宮感染(例如在產後期)的雌性哺乳動物獲得所希望的藥理和生理作用。這樣，在一個傾向於產生子宮感染的授乳動物中，在「預防」或部分預防感染、症狀或其病症方面，該作用可以是預防性的，和/或在部分或完全治癒已經存在的感染、病症、症狀或歸因於感染的副作用方面，該作用是是治療性的。因此，在此使用的術語「治療」覆蓋了任何以下內容(a)在可能易受感染的(例如產犢之前和之後)但是尚未被診斷為感染(例如感染的臨床症狀還沒有發展到一個可檢測水平)的雌性哺乳動物中預防感染發生；(b)抑制感染，即，阻止或減少感染的發生或其臨床症狀(如炎症和/或發熱)；或(C)減輕感染，即，引起感染和/或其症狀或病症的消退。在一些實施方案中，治療包括所述至少一種酪蛋白肽的腸胃外給藥(例如注射，輸注，等等)和/或局部給藥。給藥可以是子宮內的和/或陰道給藥。在一個實施方案中，給藥是經子宮頸子宮內給藥。取決於給藥途徑，該至少一種酪蛋白肽可以與一種適合的可接受的載體配製形成一種藥物組合物。一種可接受的載體是一種藥學上和生理學上可接受的載體，被理解為一種通常安全的、無毒性的以及在生物學上或其他領域都沒有所不希望的作用的載體或賦形劑。如在說明書和權利要求中所使用的藥學上可接受的載體包括一種或一種以上這樣的載體。載體可以是那些任何常規使用的載體，並僅僅受限於化學物理考慮因素(如溶解度以及與至少一種酪蛋白肽的反應性的缺乏)以及給藥途徑。如精通本領域的人員所理解的，治療也可以包括與其他藥物聯合給藥，例如抗生素。該藥物組合物也可以包括其他添加劑，以產生與該組合物相容的形式或增加穩定性、無菌性和等滲性或增強該酪蛋白肽的跨膜攝取。例如，添加劑可以包括一種PH調節劑，例如用來維持該組合物的pH在6至8的範圍內，或有時甚至在6. 7至6. 9的範圍內，這是發現用於酪蛋白肽的局部或腸胃外給藥的最適合pH。在一個實施方案中，實現有效治療子宮感染的至少一種酪蛋白肽的量是每次給藥劑量在10ng/ml至500mg/ml之間，有時，每次給藥劑量在10ng/ml至200mg/ml之間，甚至有時每次給藥劑量在10ng/ml至100mg/ml之間。在一些實施方案中，該酪蛋白肽是一種包含酪蛋白肽混合物的酪蛋白水解物，至少它的一部分用來治療子宮感染是治療有效的。有時，該酪蛋白肽可以以一種非溶液形式給予(例如乳膏)，在這種情況下，每次給藥劑量的量將在大約10ng/kg體重至200mg/kg體重之間，有時,每次給藥劑量在大約10ng/kg體重至100mg/kg體重之間。一個給藥劑量是指單次給藥事件，即，一個動物可以每天或在兩天或更多天期間接受單個給藥劑量或幾個給藥劑量。在一個實施方案中，該至少一種酪蛋白肽被給予一次(單次劑量給藥)。在另一些實施方案中，典型地以2個至6個之間的劑量執行所述至少一種酪蛋白肽的兩次或更多次給藥。當該至少一種酪蛋白肽以一次以上的劑量被給予時，典型地(即使不限於此)在兩次連續給藥之間使用從2小時至14天的時間間隔。雖然給藥的數量如此，根據一個實施方案，單次或首次給藥是在產犢之後，典型地一直到產犢後120天，更具體地，一直到產犢後70天，另外有時一直到產犢後30天，並且有時在產犢後即刻(B卩，產犢之後幾分鐘或幾小時)，以及一直到產犢後26天。如在此使用的，除非上下文中另有明確指示，形式「一個/ 一種」(〃a〃，〃an〃)和「該」("the")包括單數和複數指代。例如，術語「一種酪蛋白肽」包括一種或更多種這樣的肽，例如有效治療子宮感染的肽的混合物。此外，如在此使用的，術語「包含」旨在表示該組合物包含所述的一種或更種肽，即，該至少一種酪蛋白肽(可以單獨地涉及一種包含這些肽的混合物的製劑)，但是不排除
其他要素，如生理學可接受的載體和賦形劑以及其他活性劑。術語「主要由......組成」用
來定義包含所述要素但是排除可能對於治療子宮感染具有重要意義其他要素的組合物。因
此「由......組成」應當表示排除超過微量要素的其他要素。由每一個這些過渡術語定義
的實施方案在本發明的範圍之內。此外，所有數值(例如當提及構成包含至少一種酪蛋白肽作為一種活性成分的組合物的要素的量或範圍時)是近似值，為在規定值的20% (有時達到10%) (+)或㈠變化的近似值。應當理解的是，即使不總是明確地規定，所有數值標識的前面是術語「大約」。現在將在以下的根據本發明進行的實驗的描述中例證本發明。應當理解的是這些實例在性質上旨在是說明性的而不是限制性的。顯然，這些實例的許多修改和變化可能考慮到以上教導。因此，應當理解的是，在所附的權利要求書的範圍之內，本發明可以按照大量的可能的方式實施，而不是如在下文中特別說明的。提出以下實施例是為了更充分地說明本發明的優選實施方案。然而，它們絕不是以任何方式被解釋為限制本發明的廣泛範圍，因為其中的很多修改和改變對於本領域的技術人員將是顯而易見的。一些非限制性實例的說明材料碘化丙啶(螢光溶液，CAS 25535-16-4，西格瑪奧德裡奇目錄號70335，西格瑪奧德裡奇公司，3300南二街，聖路易斯，MO 63118)。重組人IL-8 (rhIL-8) (ProSpec-Tany TechnoGene 有限公司，雷霍沃特科技園，郵政信箱398，雷霍沃特76103，以色列)。等滲Percoll (基礎PcrcoI沖'西格瑪奧德裡奇目錄號P4937，西格瑪奧德裡奇公司，3300南二街，聖路易斯，MO 63118)。滅活的獸疫鏈球菌懸浮液(Omnisorbin, Calbiochem,巴德索登，德國)。脫水土黴素(Oxytetracyclinedehydrate) 200mg/mL( Aiiimycini1'·1, NorbrookLaboratory有限公司，英國)。灌洗水(治癒醫學(Cure Medical)，Teva醫學，以色列)。在下文，奶牛也是以色列的荷斯坦-弗裡生奶牛。十四醯佛波乙酸酯(PMA，西格瑪奧德裡奇目錄號P8139，西格瑪奧德裡奇公司，3300南二街，聖路易斯，MO 63118)。非螢光染料二氫羅丹明123 (DHR 123, Morbitec,哥廷根，德國)。實例I-酪蛋白水解物的製備
儲存液的製備25mMTris HCl ρΗ=8· O (20 升)和 25mM Tris HCl ρΗ=7· O (5 升)。稱量Tris鹼(Applichem GmBH，達姆施塔特，德國)(75. 687gr)溶解於包含24升灌洗水(WFI，治癒醫學，由Teva醫學製造，以色列)的裝備有磁性攪拌棒的玻璃瓶中，直至溶液完全澄清，最終PH約11.5。對於19升溶液，使用ION HCl(西格瑪奧德裡奇，以色列)調整pH至大約7. 5-8. 5(優選地大約為8)，並且通過加入WFI將體積定至20升。對於4. 75升溶液，調整pH至大約6. 75-7. 25之間，(優選地為7. O),並且通過加入WFI將體積定至5升。在室溫下儲存這些溶液直到進一步使用。酪蛋白衍生肽的製備根據以下內容，通過以色列生物工業公司(Biological Industries Israel)(Beit Haemek Ltd.,以色列)製備酪蛋白水解物:玻璃瓶中加入Tris HCl 25mM, pH=8. O (20升)，並且將溫度調整至大約40° C至48° C之間，優選45° C。總共4，OOOgr酪蛋白酸鈉(DMV國際菲仕蘭坎皮納總公司，阿默斯福特，荷蘭)加ATris HCl溶液中，獲得20%(w/v)的溶液。輕輕攪拌該混合物達到充分溶解。保持溶液的pH在大約8.0，溫度在大約45° C。溶液中加入4g豬胰蛋白酶粉末(西格瑪奧德裡奇，以色列)。在磁力攪拌器或反絮凝(優選)攪拌器上在大約45° C的輕微攪動下，輕輕攪拌該混合物。允許水解進行持續總共大約I小時。使用ION NaOH(JT Baker, AvantorPerformanceMaterials,菲利普斯堡，新澤西州，美國)調整pH至大約8. O,並且將溫度保持在大約45° C。通過將溫度升高至90 ° C-95 ° C持續一小時將粗製水解物中的胰蛋白酶滅活。通過使用冰在外部浴中將上清液冷卻至室溫。使用ION HCl調整pH至4. 7。在15-30分鐘之後，通過在2° C-8° C在4500rpm離心20分鐘去除不溶物。將上清液轉移至一個新的無菌玻璃瓶中，使用ION NaOH調整pH至7. O。通過加入pH 7. O的25mM Tris HCl溶液調整溶液體積至20升。最終體積按順序通過I. 2 μ m/0. 65 μ m預濾器以及通過兩個O. 45/0. 22 μ m無菌CA囊式膜過濾器而被過濾。在無菌工作檯中，通過無菌灌裝將過濾的溶液轉移至一個玻璃血清瓶(分別是IOOml和200ml)中。將樣品儲存在-20° C (冷凍)直至進一步使用。產品(原料)包含20%酪蛋白酸鈉、25mM Tris-HCl和O. 02%胰蛋白酶.實例2:臨床研究I -酪蛋白水解物在急性牛產後臨床型子宮炎中的作用的低劑量研究研究了牛酪蛋白水解物相比於抗生素藥物在患有急性產後子宮炎的奶牛中的作用(Sheldon 等人,ibid2006)。總的研究信息本研究納入的奶牛是授乳的荷斯坦弗裡生奶牛，位於以色列的大奶牛群中(經度34° 40』E-35° 30; E ;緯度30° 30』N_33° 01』N)。奶牛每天擠奶三次。所用的獸群在沒有畜欄的畜棚中，規模範圍從300至350頭產奶牛。在奶牛場中，由臨床研究組織(CRO)(Hachaklait-Israeli CattleBreedersAssociation,撒利亞工業園區，以色列)選擇並任命一個管理獸醫師，以便進行研究職能，確切地說該管理獸醫師負責治療管理、臨床評定、親自訓練奶牛群、適當儲存、針對不良事件進行必要的臨床觀察並填寫報表。以擦不掉的黑/藍墨水字跡清楚地填寫所有研究文件。將原始數據發送給主辦方。身體觀察所有奶牛在產後的前5至10天進行常規檢查，並且使用以下量度評定它們的身體狀況(i)通過經直腸觸診的子宮的情況；(ii)用於近似重量確定的胸圍測量值；(iii)根據Edmonson A. J.,等人，基於奶牛的身高和身體各個部分的脂肪組成，由獸醫師提供的身體狀況評分。[Edmonson A. J.，Lean I. J. , WeaverL.D. ,Farver T. , Webster G.,荷斯坦奶牛的身體狀況評分表，《乳品科學期刊》(J.DairySci.)，(1989);72:68 - 78]。奶牛被納入本研究，條件是它們的身體狀況符合以下入選標準患有臨床型產後子宮炎的奶牛，非雙胎分娩的奶牛，在過去的4周期間沒有子宮內或全身性生殖激素療法的奶牛。沒有診斷為患病的奶牛，這些疾病可能影響研究者對治療結果的判斷。在檢查用於本試驗的奶牛之前，獸群管理者同意不給予任何子宮內或生殖激素療法。另外，奶牛被納入本臨床研究的條件是它們沒有任何以下特徵(在此的「排除標準」):具有異常的內生殖器官(包括粘連)的奶牛納入時，在當前產犢後期間具有嚴重的陰道炎、跛行、乳腺炎-酮症、消化不良、或需要全身治療的任何其他臨床疾病的診斷和/或治療的奶牛，在產犢之後經鑑定被淘汰(將不授精)的奶牛在進入研究前的3周之內被給予免疫療法的奶牛，在進入研究前2周，全身性地或通過飼餵給予抗炎藥和/或合成代謝療法的奶牛。在當前產犢之時，疑似或診斷為胎膜滯留的奶牛。疑似或臨床確證為具有全身影響的急性產後子宮炎的奶牛。因當前位置的農場的任何原因將要剔除的奶牛。被診斷為確認的臨床型子宮炎的具有適合的身體狀況(如上文在入選標準和排除標準中所定義的)的奶牛被納入本臨床研究，正如通過以下臨床標準的任何之一所確定的I)奶牛必須是發熱的(B卩，早晨直腸溫度高於39. 4° C)和/或2)奶牛必須具有位於腹腔中的鬆弛的、非伸縮自如的子宮，子宮頸直徑>7. 5cm，以及水樣的、粘液膿性的、或惡臭的陰道排出物。研究細節在日期"O"(本研究的第一天)，由研究者使用預先準備的表格，將來自同一獸群並且處於相同哺乳期和年齡的乳用小母牛或初產的或多產的奶牛進行隨機分組，以便接受一種治療或其他治療。在每個表格之內，成對地將奶牛分配於治療，每組一頭奶牛。
治療病例研究組("組I")-以150ml的溶液給予450mg牛酪蛋白水解物(批號B100)，
直至完成該組的樣本大小。對照組(〃組2〃)- 25ml 脫水土黴素(總共 5，OOOmg, 200mg/ml) (NorbrookLaboratory ,英國)。對測試奶牛不提供其他的子宮內治療(包括但不限於子宮內抗微生物劑、內部或外部治療全身性抗微生物劑)。治療在日期"O"處開始，通過使用無菌子宮導管經子宮頸子宮內輸注而對奶牛給予治療。所有實驗是盲法病例(blind case)-對照研究，因為所有未辨別的有待給予的產品被標記在牛酪蛋白水解物小瓶上，並且總是以與治療相同的途徑向奶牛給予陰性對照，因此研究者或牧人(herdsperson)或獸醫師不能辨別出研究病例或對照。研究終點本研究的終點是安全和有效的，如以下詳細說明安全性確定與具有當前劑量的牛酪蛋白水解物很可能相關的任何毒性的最大嚴重度。確定與具有當前劑量的牛酪蛋白水解物很可能相關的任何毒性的最大嚴重度。安全性是通過監測在治療後0.3、1、2、3、7和14天的不良事件(在下面詳細介紹)或任何毒性徵象的出現而確定的。另外，根據表I的說明，對每頭奶牛的總的整體印象進行評定和分級。表I-奶牛整體印象分級
評分說明O正常I輕微抑鬱2抑鬱(獨處，頭傾斜向下)本項目的管理者/監督者/主辦者負責即時通知不良事件(AEs)的任何可能徵象。適當的行動可以涉及定位並打破盲法編碼，以便能夠給予適當的醫學治療，將不良事件記錄在本研究文件中，並向主辦者報告不良事件。根據獸醫標準，如果遇到不良事件(包括在第一次治療後隨訪的推移時間內)或在治療後7天觀察到臨床產後子宮炎的顯著體徵和症狀，對奶牛給予與在第O天提供的相同的治療。記錄所有嚴重的和/或意外的不良事件。療效通過以下兩個參數的平均減少來度量治療成功與在第O天期間測量的平均溫度相比，如果動物組在治療後14天具有平均直腸溫度降低，和/或
如果在治療後14天，該動物組具有排出物參數的平均降低。通過在治療之前、在治療後6-8小時而且在治療後第1、2、3、7和14天在早晨觀察和擠奶之後的初訪時測量直腸溫度、生殖系統形態和生殖器分泌物而評定療效。總之，在治療後總共14天之後評定治療成功。
基於提供在表2中的說明，管理獸醫師檢查所有奶牛並且負責對生殖器分泌物進行分級(從I至4)。表2-生殖系統分泌物的分級
權利要求
1.一種用於治療雌性哺乳動物中的子宮感染的酪蛋白肽。
2.如權利要求I所述的酪蛋白肽，包括酪蛋白、αSI-酪蛋白、a S2_酪蛋白、k_酪蛋白的一個或多個片段。
3.如權利要求I或權利要求2所述的酪蛋白肽，其中該酪蛋白肽是一種酪蛋白水解物。
4.如權利要求I至3中任一項所述的酪蛋白肽，是一種磷酸肽。
5.如權利要求4所述的酪蛋白肽包括選自下組的一種胺基酸序列，該組由以下各項組成SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ IDN0:5 和 SEQ ID NO:6。
6.如權利要求I所述的酪蛋白肽，用於治療選自下組的子宮感染，該組由以下各項組成產後毒血性子宮炎、臨床型子宮炎、子宮外膜炎、臨床型子宮內膜炎、亞臨床型子宮內膜炎、子宮積膿、宮頸炎、陰道炎和外陰炎。
7.如權利要求6所述的酪蛋白肽，用於治療選自下組的子宮感染，該組由以下各項組成產後毒血性子宮炎、臨床型子宮炎、臨床型子宮內膜炎和亞臨床型子宮內膜炎。
8.如權利要求I至7中任一項所述的酪蛋白肽，用於治療產後感染。
9.如權利要求I所述的酪蛋白肽，用於一種雌性哺乳類授乳動物的治療。
10.如權利要求9所述的酪蛋白肽，用於選自下組的雌性哺乳動物的治療，該組由以下各項組成未經產的、初產的或多產的授乳動物。
11.如權利要求I至10中任一項所述的酪蛋白肽，用於雌性哺乳動物為奶牛的治療。
12.如權利要求I至11中任一項所述的酪蛋白肽，用於與一種藥物載體結合而用於腸胃外給藥或用於局部給藥。
13.如權利要求12所述的酪蛋白肽，用於以子宮內給藥或陰道給藥的形式使用。
14.如權利要求13所述的酪蛋白肽，用於經子宮頸子宮內使用。
15.如權利要求12至14中任一項所述的酪蛋白肽，用於通過經由注射或輸注的腸胃外給藥使用。
16.如權利要求I至15中任一項所述的酪蛋白肽，用於在產犢之間的一個時期使用。
17.如權利要求16所述的酪蛋白肽，其中該時期包括一直到產犢之後120天。
18.如權利要求16所述的酪蛋白肽，其中該時期包括一直到產犢之後70天。
19.如權利要求16所述的酪蛋白肽，其中時期是從產犢日一直到產犢之後33天。
20.如權利要求I至19中任一項所述的酪蛋白肽，用於以單劑量給藥使用。
21.如權利要求I至20中任一項所述的酪蛋白肽，用於以兩次或更多次給藥使用，該兩次或更多次給藥包含從I小時到14天的一個時間間隔。
22.如權利要求21所述的酪蛋白肽，用於在包括酪蛋白肽的兩次至六次給藥的治療方案中使用。
23.如權利要求I至22中任一項所述的酪蛋白肽,用於以10ng/ml至500mg/ml之間的量使用。
24.一種用於治療子宮感染的方法，該方法包括對需要治療子宮感染的雌性哺乳動物給予一定量的至少一種酪蛋白肽，該量對於治療哺乳動物中的子宮感染是有效的。
25.如權利要求24所述的方法，其中該至少一種酪蛋白肽包括酪蛋白、αSI-酪蛋白、aS2_酪蛋白、K -酪蛋白的一個或多個肽片段。
26.如權利要求24或25所述的方法，其中該至少一種酪蛋白肽是一種酪蛋白水解物。
27.如權利要求24至26中任一項所述方法，其中是至少一種酪蛋白肽包含一種磷酸肽。
28.如權利要求24至27中任一項所述方法，其中該至少一種酪蛋白肽包含選自下組的一種胺基酸序列，該組由以下各項組成SEQ IDN0:2、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5 和 SEQ ID NO:6。
29.如權利要求24至28中任一項所述的方法，其中子宮感染選自下組，該組由以下各項組成產後毒血性子宮炎、臨床型子宮炎、子宮外膜炎、臨床型子宮內膜炎、亞臨床型子宮內膜炎、子宮積膿、宮頸炎、陰道炎和外陰炎。
30.如權利要求29的方法，其中子宮感染選自下組，該組由以下各項組成產後毒血性子宮炎、臨床型子宮炎、臨床型子宮內膜炎和亞臨床型子宮內膜炎。
31.如權利要求24至30中任一項所述的方法，其中子宮感染是一種產後感染。
32.如權利要求24至31中任一項所述的方法，其中該雌性哺乳動物是一種授乳動物。
33.如權利要求32所述的方法，其中該雌性哺乳動物選自下組，該組由以下各項組成未經產的、初產的或多產的授乳動物。
34.如權利要求24至33中任一項所述的方法，其中該雌性哺乳動物是奶牛。
35.如權利要求24至34中任一項所述的方法，其中該至少一種酪蛋白肽用於與一種藥物載體結合而用於腸胃外給藥或用於局部給藥。
36.如權利要求35所述的方法，其中給藥包括子宮內給藥或陰道給藥。
37.如權利要求36所述的方法，其中給藥是通過經子宮頸子宮內。
38.如權利要求35至37中任一項所述的方法，其中腸胃外給藥是通過注射或輸注。
39.如權利要求24至38中任一項所述的方法，其中該至少一種酪蛋白肽在產犢之間的一個時期被給予。
40.如權利要求39所述的方法，其中該時期包括一直到產犢之後120天。
41.如權利要求40所述的方法，其中該時期包括一直到產犢之後70天。
42.如權利要求40所述的方法，其中該時期是從產犢日一直到產犢之後33天。
43.如權利要求24至42中任一項所述的方法，其中給藥包括一種單劑量給藥。
44.如權利要求24至43中任一項所述的方法，其中給藥包括該至少一種酪蛋白肽的兩次或更多次給藥，該兩次或更多次給藥包括從I小時到14天的一個時間間隔。
45.如權利要求44所述的方法，其中給藥包括酪蛋白肽的兩次至六次給藥。
46.如權利要求24至45中任一項所述的方法，其中有效治療所述子宮感染的所述至少一種酪蛋白肽的量是在10ng/ml至500mg/ml之間。
47.如權利要求I至23中任一項所定義的至少一種酪蛋白肽用於一種藥物組合物的製備的用途，該藥物組合物用於治療需要治療子宮感染的雌性哺乳動物中的子宮感染。
48.一種用於治療子宮感染的藥物組合物，該組合物包含如權利要求I至23中任一項所定義的作為一種活性組分的一定量的至少一種酪蛋白肽，該量對於治療雌性哺乳動物中的子宮感染是有效的。
49.如權利要求48所述的藥物組合物,包含10ng/ml至500mg/ml之間的至少一種酪蛋白肽。
50.如權利要求48或49所述的藥物組合物，包含一種藥學上可接受的載體。
51.如權利要求48至50中任一項所述的藥物組合物，包含在溶液中的至少一種酪蛋白肽，該溶液包含大約7. 5至8. 5之間範圍內的pH。
52.如權利要求48至51中任一項所述的藥物組合物，該藥物組合物呈一種適合於腸胃外給藥或局部給藥的劑型。
53.如權利要求48至52中任一項所述 的藥物組合物，該藥物組合物呈適合於注射或輸注的劑型。
54.如權利要求48至50中任一項所述的藥物組合物,包含10ng/kg體重至200mg/kg體重之間的一定量的酪蛋白肽。
55.—種藥盒，包含如權利要求I至23中任一項所定義的至少一種酪蛋白肽以及使用酪蛋白肽治療需要治療子宮感染的雌性哺乳動物中的子宮感染的說明書。
56.如權利要求55所述的藥盒，其中該至少一種酪蛋白肽是在如權利要求48至55中任一項所定義的藥物組合物中。
全文摘要
本披露涉及用於治療雌性哺乳動物中的子宮感染的一種酪蛋白肽，涉及向雌性哺乳動物給予至少一種酪蛋白肽治療此類感染的方法，涉及酪蛋白肽用於製備治療子宮感染的藥物組合物的用途，並且涉及用於所述治療的藥盒。該酪蛋白肽優選地是一種酪蛋白水解物，例如通過酪蛋白的胰蛋白酶水解作用獲得。根據一些實施例，該雌性哺乳動物是一種授乳動物，該感染是一種產後感染。
文檔編號A61P43/00GK102933223SQ201180028083
公開日2013年2月13日 申請日期2011年4月17日 優先權日2010年4月21日
發明者喬斯·馬裡奧·伊斯柯維奇 申請人:米勒尤迪斯公司