具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株的製作方法

2023-10-11 00:55:19 1

專利名稱：具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術、微生物動物細胞系領域，具體涉及一種具有骨、肝、腎上腺轉 移高潛能的中國人肺腺癌細胞株及其用途。
背景技術：
肺癌是嚴重威脅人類生存和發展的惡性疾病之一，已成為腫瘤疾病中的頭號殺 手。2006年，美國確診肺癌新病例約174470人，約佔全部腫瘤的13% (男性)和12% (女 性)，發病率僅次於皮膚癌；死於肺癌者約162460人，約佔全部腫瘤的31 % (男性)和26% (女性)，死亡率位居第一[1 2]。日本每年肺癌新發病例超過50000人，死亡率近90% [3]。 據上海市近年的惡性腫瘤發病調查顯示，肺癌(21.56%)高居上海男性惡性腫瘤發病率 榜首，在女性中則僅次於乳腺癌[4]。肺癌死亡率長期居高不下的主要原因在於難以早期診 斷和它的高轉移性，許多患者首診時即發現有多器官轉移[3]。骨轉移佔肺癌病人的30 70%，僅次於乳腺癌和前列腺癌[5 7]。調查顯示，超過1/3的患者會發展成溶骨性病變，引 起疼痛、病理性骨折、脊髓壓迫和高鈣血症。使患者的生活質量嚴重下降，最後導致死亡，病 程一般不超過6個月[3』8]。由於肺癌骨轉移的生物學機制至今尚不明確，臨床缺乏有效的治 療方法，因此，研究肺癌骨轉移發病機制並探索有效的診療方法是國內外學者長期以來的 努力方向。儘管隨著分子生物學、信號傳導途徑、蛋白功能研究等基礎學科的發展，人類對 疾病發病機理的研究手段有了突飛猛進的發展，但由於種種客觀限制，該領域的研究仍未 有重要突破。有研究報導，雖然宿主微環境因素，包括破骨細胞以及一些具有生長因子功能的 基質蛋白等對腫瘤的轉移具有一定的作用[3』9 1(1]。腫瘤細胞自身生物學特性無疑是骨轉移 發生更為主要而直接的原因。由於肺癌骨轉移的發生大多見於晚期的手術禁忌患者，臨床標本取材受限，在很 大程度上遲滯了肺癌骨轉移診療研究的進展。因此，如能建立有效的人肺癌骨轉移細胞模 型，尤其是發現和建立親代人肺癌細胞的骨轉移模型，不僅能更接近人類本身的生物學特 性，而且所建的親代人肺腺癌細胞模型可以更有效地發現人肺腺癌骨轉移的腫瘤生物學特 性，，進而利用所建細胞模型研發相關的功能基因，直接進行幹預性治療研究，其優越性是 臨床標本及其他模型所難以企及的。腫瘤轉移動物模型的理論基礎在於腫瘤細胞體內自發轉移大多具有相對固定的 靶組織。經研究發現，這一特性是由腫瘤組織中少量亞群細胞所決定的。在一定的條件下， 該類細胞會按相對固定的模式在特定靶組織形成腫瘤轉移灶。因此，以腫瘤細胞株反覆多 代接種免疫缺陷動物篩選後，此類亞群細胞得到有效的富集，靶組織轉移率漸進升高。無論是肺癌的基礎研究，包括病理學、免疫學、遺傳學、藥物基因組學、肺癌功能基 因組學還是肺癌的臨床診療實踐，都要求研究者必須根據國情和國人肺癌發病特點，走自 己的研發之路。細胞是生命之源，腫瘤細胞是萬惡之首。建立我國自己的新型的高轉移的 肺癌細胞模型將具有顯著的科學意義和社會價值。與本發明相關的現有技術有(以引入上
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發明內容
本發明的目的是提供一種具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株 (簡稱CPA-Yang3)。本發明的進一步目的是提供該肺癌細胞株的醫用用途。本發明採用肺腺癌首診患者(55歲女性)的胸水作細胞原代培養，該人肺腺癌細 胞經動物實驗證實該親代細胞已具有僅限於骨轉移的生物學特性；第5代後的該親代細 胞經小鼠體內誘導後經裸鼠接種細胞懸液，三周後能檢出70%骨轉移；解剖發現有50% 肝轉移；20%肺和腎上腺轉移；骨轉移細胞擴增後，裸鼠核素骨顯像和X線拍片顯示，80% 的鼠在第二個循環後，核素骨顯像檢出骨轉移灶，第三個循環後小鼠骨轉移達90%以上。 本發明建立了具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、 Liver and Adrenal Gland Metastases， CPA-Yang3)。該細胞已於2009年7月2日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區大屯路甲3號，北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101，保藏編號CGMCC No.3137，分類命名人肺腺癌細胞株 CPA-Yang3(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、Liver and Adrenal Gland Metastases, CPA_Yang3)。本細胞株具有以下生物學特性1，貼壁生長，致瘤率高，自採集新鮮胸水做細胞培養的第三天已發現所有細胞培養瓶底都有部分細胞長 出；第七天，對三瓶長滿培養瓶底的細胞用胰酶消化，取細胞數約為4 X 106，用生理鹽水洗2 遍後製成細胞懸液，濃度為lX107/mL。分別接種在2隻免疫缺陷小鼠兩側皮下。接種60 天仍不長瘤。傳至第四代才致瘤並100%長瘤。一個月後長成3. 5X4mm2和4. 7X28mm2， 6. 5X5. 8mm2、7. 2X5. 7mm2。致瘤率 100%。2，繪製細胞生長曲線顯示，生長快速和代謝旺盛。3，ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL 和 AR 基因表達水平，採用RT-PCR法對本中國人肺腺癌細胞CPA-Yang3和SPC-A-I進行ESMl、VEGF_C、 IL-6、IL-8、SVIL、AR和FNl基因表達水平的比較，結果顯示，本中國人肺腺癌細胞的部分癌 基因ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL、AR禾口 Fm基因表達水平明顯高於SPC-A-1細胞。4，CPA-Yang3是以骨轉移為主的具有肝和腎上腺高轉移潛能的細胞株第5代後的親代細胞經小鼠體內誘導後給每隻裸鼠左心室分別接種 70X 105/0. ImL細胞懸液，三周後經自創微孔針孔活體成像方法能檢出70%骨轉移；解剖時 肉眼發現有50%肝轉移；20%肺和腎上腺轉移；取膝關節轉移灶培養骨轉移細胞成功擴增 後再給裸鼠左心室注射三周後行核素骨顯像和X線拍片，80%的鼠在第二個cycle後還是 能被核素骨顯像檢出骨轉移灶而不能被X線檢出。檢出的骨轉移灶主要集中在下頌骨、膝 關節、肱骨和脊柱。小鼠左心室接種70萬細胞，存活期3周。具有較強侵襲能力。第三個 循環後小鼠骨轉移達90%以上。5，骨轉移細胞生長速度快，細胞形態完整，具有典型的荷瘤CPA-Yang3骨轉移小 鼠病理圖。本發明建立了一個具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株。經實驗 證實，中國人肺腺癌細胞系CPA-Yang3是轉移能力很強的肺癌細胞。該細胞經左心室注射 僅70萬細胞2周後小鼠出現轉移且小鼠嚴重消瘦，以至於本發明在實驗過程中出現過整個 cycle的兩籠小鼠全軍覆沒的結果。本實驗結果顯示了其良好的均一性和重複性；骨轉移 細胞生長速度快，細胞形態完整。經3個in vivo-in vitro後骨轉移達到90%以上。是個 值得研究的國人肺癌細胞株。也是個良好的肺癌轉移細胞模型，為系統研究肺癌多發轉移 提供了技術平臺。本發明建立了高潛能轉移人肺腺癌親代細胞株，能對人肺腺癌骨轉移進行早期診 斷提供參考數據，還可進一步建立相關基因晶片技術，綜合運用基因晶片、實時定量PCR、蛋 白印跡(Western Blotting)等技術，評估探索各種藥物包括化學、生物、免疫、中醫藥、放射 性藥物等治療療效。為探索診療人體肺癌骨轉移提供技術平臺。同時，進一步分析肺癌轉移相關的功能基因組以及轉移的相關基因，可加深對肺 癌轉移分子機理的認識，為骨轉移的早期診斷、評估療效提供一種有效的分子檢測方法。


圖1是第二代CPA-Yang3細胞(AX 100)和(B X 200)的相差顯微鏡圖。圖2是第四代細胞皮下種植30天。圖3是CPA_Yang3細胞生長曲線。圖 4 是 RT-PCR 法比較 CPA_Yang3 與 SPC-A-l 部分基因 ESMl、VEGF-c、IL-6、IL_8、 SVIL、AR、FN1的表達水平。圖5是CPA-Yang3膝關節轉移細胞左心室接種後小鼠微孔針孔骨顯像示其中，A 左下頌骨、左肱骨、左膝關節和脊柱轉移，骨轉移灶做細胞培養一周後又 長出；B:右下頌骨、兩肱骨、頸椎、脊柱轉移。圖6是CPA-Yang3骨轉移細胞接種後小鼠骨轉移病理，其中，Α:膝關節 (HEX200) ；B 腰椎(HEX 100)。圖7是CPA-Yang3人肺腺癌骨轉移細胞X 100。
具體實施例方式實施例1取肺腺癌首診患者(55歲女性)的胸水作細胞原代培養，採集新鮮淺黃色胸水50 毫升，每細胞培養瓶吸8毫升胸水加2毫升不含牛血清的RPMI1640培養液和雙抗後稍搖 勻，放入培養溫度為37°C、C02濃度為5%的德國賀利氏BB16型二氧化碳孵養箱內培養。五 天后光鏡下觀察時發現細胞培養瓶底約有30%的面積已長滿細胞。細胞呈貼壁生長；貼壁 細胞大多呈多邊形。細胞體積較大。培養初期細胞生長緩慢；細胞形態穩定，傳至第10代， 細胞形態和生長速度稍變快。凍存復甦後性狀不變。在相差倒置顯微鏡下觀察CPA-Yang3 細胞生長情況貼壁細胞多為大小不等的多邊形，核大、核仁2-3個，可見分裂相，分裂後細 胞仍呈貼壁狀，細胞異質性明顯。胰酶消化後計數2X IO5細胞加入一細胞培養瓶按常規細 胞培養。在相差顯微鏡下，拍攝細胞生長圖片。該人肺腺癌細胞經動物實驗證實該親代細胞已具有僅限於骨轉移的生物學特性； 第5代後的該親代細胞經小鼠體內誘導後給每隻裸鼠左心室分別接種70X1070. ImL細胞 懸液，三周後經自創微孔針孔活體成像方法能檢出70%骨轉移；解剖時肉眼發現有50%肝 轉移；20%肺和腎上腺轉移；取膝關節轉移灶培養骨轉移細胞成功擴增後再給裸鼠左心室 注射三周後行核素骨顯像和X線拍片，80%的鼠在第二個cycle後還能被核素骨顯像檢出 骨轉移灶而不能被X線檢出。檢出的骨轉移灶主要集中在下頌骨、膝關節、肱骨和脊柱。小 鼠左心室接種70萬細胞，存活期3周。具有較強侵襲能力。第三個循環後小鼠骨轉移達90 % 以上。建立了具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株(The Chinese Human Lung Adenocarcinoma cell with Highly Bone、Liver and Adrenal Gland Metastases, CPA-Yang3)。實施例2上述人肺腺癌細胞(CPA-Yang3)70X 104，注入免疫缺陷小鼠血液系統，兩周後隔 天稱重，第三周起每周進行核素骨顯像檢測，結果證實，該親代細胞是高潛能骨轉移肺癌細 胞(圖8)。所述的培養基為含10%胎牛血清RPMI1640或DMEM培養基，pH = 7，培養溫度為37°C,5% C02。實施例3RT-PCR檢測顯示與現有技術已建立的SPC-A-I國人肺腺癌相比，部分癌基因 ESM1、VEGF-C、IL-6、IL_8、SVIL、AR和Fm基因表達水平明顯高於SPC-A-I細胞。
權利要求
一種具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株，其特徵是所述細胞為具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株CPA Yang3，保藏編號CGMCCNo.3137，分類命名中國人肺腺癌細胞系；具有以下生物學特性1)貼壁生長，致瘤率高至100％；2)生長快速和代謝旺盛；3)癌基因ESM1、VEGF C、IL 6、IL 8、SVIL和AR基因表達水平高於SPC A 1細胞；4)以骨轉移為主，具有肝和腎上腺高轉移潛能；5)骨轉移細胞生長速度快，細胞形態完整。
2.根據權利要求1所述的具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株，其 特徵是所述細胞傳至第四代免疫缺陷小鼠致瘤並100%長瘤，一個月後長成3.5X4mm2和 4. 7X28mm2,6. 5X5. 8mm2,7. 2X5. 7mm2，致瘤率 100%。
3.根據權利要求1所述的具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株，其特 徵是所述細胞的骨轉移灶為下頌骨、膝關節、肱骨和脊柱，三周後骨轉移70% ；50%肝轉 移；20%肺和腎上腺轉移；第三個循環後骨轉移達90%以上。
4.權利要求1的具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株在製備診斷人肺 腺癌相關基因晶片中的用途。
5.權利要求1的具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株在製備檢測治療 人肺腺癌相關藥物療效的分子檢測方法中的用途。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域。提供了一種具有骨、肝和腎上腺轉移潛能的中國人肺腺癌細胞株。本發明採用肺腺癌首診患者的胸水作細胞原代培養，該人肺腺癌細胞保藏編號CGMCC No.3137，分類命名人肺腺癌細胞系CPA-Yang3，具有貼壁生長，致瘤率高至100％；生長快速和代謝旺盛；癌基因ESM1、VEGF-C、IL-6、IL-8、SVIL和AR基因表達水平高於SPC-A-1細胞；以骨轉移為主，具有肝和腎上腺高轉移潛能和骨轉移細胞生長速度快，細胞形態完整生物學特性。本發明能對人肺腺癌骨轉移進行早期診斷提供參考數據，還可進一步建立相關基因晶片技術，綜合運用基因晶片、實時定量PCR、蛋白印跡等技術，評估探索各種藥物等治療療效。
文檔編號C12Q1/68GK101955911SQ200910054739
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者楊順芳 申請人:上海市胸科醫院