雙向側流測試片及方法

2023-10-11 00:47:54

專利名稱：雙向側流測試片及方法
技術領域：
本發明涉及側流測試片以及該側流測試片的操作方法。
對流體樣品，尤其是體液樣品中的細胞和分析物進行定量分析，通常會為醫生和病人提供關鍵的診斷和治療信息。例如，利用了抗原-抗體反應高特異性的免疫測試方法，就提供了一種測量分析物的方法(Kennedy，D.M.和S.J.Challacombe(編)，酶聯免疫吸附測定和其他固相免疫測定理論和實踐(ELISAand Other Solid Phase ImmunoassaysTheoretical and Practical Aspects)，John Wileyand Sons，Chichester(1988)。該文獻與本文提及的其他文獻都被引用作為參考，就如同它們被完全複製那樣。這些分析方法也可用於其他應用方面，例如獸醫、食品測試或農業應用方面。
可提供樣品中分析物的定量測量值的免疫測定方法，早已使用只有在實驗室環境下才有的昂貴分析儀而且所用的程序複雜且步驟多。
免疫色譜分析，例如在下列文獻中所描述的免疫色譜分析是較簡單的，但是不能提供分析物的定量測量值英國2,204,398A；美國專利No.5,096,837、5,238,652和5,266,497；Birnbaum，S.等人，分析生物化學(Analytical Biochem.)，206168-171(1992)；Roberts，M.A.和R.A.Durst，分析化學(Analytical Chem.)67482-491(1995)；和Klimov，A.D.等人，臨床化學(ClinicalChem.)411360(1995)。相反，這些免疫色譜分析檢測是否存在高於界定的測試截止水平(cutofflevel)的分析物。無法進行定量測定限制了這些分析方法的用途。
已經開發了各種一次性的診斷測試裝置。這些裝置的例子包括(但並不限於)Cathy等人的美國專利No.5,660,993；國際出版號WO92/12428；Eisinger等人的美國專利No.4,943,522；Campbell等人的美國專利No.4,703,017；Campbell等人的美國專利No.4,743,560；和Brooks的美國專利No.5,753,517。
提供了一種測試片，該測試片適於接受樣品並檢測其中的分析物。根據一個實例，測試片包括可加入樣品的加樣區；位於加樣區近端的吸收區；一個或多個位於加樣區遠端的測試區，其中至少一個測試區包含固定化的第一分析物結合劑，該結合劑能夠結合於待檢測的分析物；和位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試片的其他區域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區的樣品遠端擴散前沿從加樣區擴散至末端樣品流動區中的遠端擴散點，然後逆轉方向並擴散至相對於一個或多個測試區的近端。
在另一實例中，提供了一種測試片，該測試片包括可加入樣品的加樣區；位於加樣區近端的吸收區；一個或多個位於加樣區遠端的測試區，其中至少一個測試區包含固定化的第一分析物結合劑，該結合劑能夠結合於待檢測的分析物；位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試片的其他區域而言具有吸收能力，從而使得按預定體積範圍加至加樣區的樣品遠端擴散前沿，從加樣區擴散至末端樣品流動區中的遠端擴散點，然後擴散至相對於一個或多個測試區的近端；和可加入偶聯緩衝液的、位於末端樣品流動區遠端的偶聯緩衝液添加區。
根據上述測試片例子，偶聯緩衝液添加區的位置可與測試區相對，從而使得在將樣品加至加樣區的同時被加至偶聯緩衝液添加區的偶聯緩衝液，會在樣品遠端擴散前沿已擴散至遠端擴散點並已開始向近端方向擴散之後，才達到遠端擴散點。偶聯緩衝液添加區的位置也可以與測試區相對，從而使得在將樣品加至加樣區的同時被加至偶聯緩衝液添加區的偶聯緩衝液，會在樣品遠端擴散前沿相對於測試區向近端擴散之後，才達到測試區。偶聯緩衝液添加區可與測試區相對，從而使得偶聯緩衝液能夠在樣品之前被加至測試片，並仍能在樣品遠端擴散前沿已擴散至遠端擴散區、逆轉方向並已開始向近端方向擴散之後，才達到遠端擴散點。
根據上述任一測試片例子，測試片可含有1、2、3或更多的測試區，並且在測試區中固定有一種或多種對照結合劑。在一個例子中，測試片含有至少第一對照區，在第一對照區中固定有對照結合劑。任選地，測試區還可含有第二對照區，在第二對照區中固定有與第一對照區相同的對照結合劑，而第一對照區和第二對照區中對照結合劑的含量不同。
此外，根據任一上述測試片例子，測試片可以含有第二(種)分析物結合劑，該結合劑能夠與分析物結合併擴散至一個或多個測試區。或者，第二分析物結合劑可以通過偶聯緩衝液而輸送至測試片上。第二分析物結合劑可以與樣品中除了分析物之外的其他組份結合。或者，第二分析物結合劑也可以是不結合於樣品中其他組份而只結合於分析物的試劑。
為了便於檢測，第二分析物結合劑宜用可檢測的標記物標記。如本文所述，本領域已知的大量可檢測標記物都可使用。在一個優選例子中，第二分析物結合劑被附著於能夠擴散至一個或多個測試區的顆粒上。該顆粒可以作為可檢測標記物，也可以顆粒自身被可檢測標記物所標記。
還提供了一種檢測樣品中分析物的方法。在一個例子中，該方法包括將樣品輸送至測試片，使得樣品遠端擴散前沿(a)向遠端方向擴散至一個或多個測試區，其中至少一個測試區含有固定於其中的第一分析物結合劑，該第一分析物結合劑與樣品中的分析物結合，(b)擴散至位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，改變方向和(c)擴散至位於一個或多個測試區近端的位置；將偶聯緩衝液輸送至測試片上位於末端樣品流動區遠端的位置，輸送偶聯緩衝液導致第二分析物結合劑向近端擴散通過末端樣品流動區，並且在樣品遠端擴散前沿向一個或多個測試區的近端擴散之後擴散至一個或多個測試區，第二分析物結合劑與被固定於測試區的分析物結合；和檢測被固定於測試區的第二分析物結合劑。
根據本方法，可在將樣品加至測試片的同時、之前或之後，將偶聯緩衝液加至測試片。相對於偶聯緩衝液而言，樣品被加至測試片的時間取決於樣品達到末端樣品流動區所需的時間，這反過來又取決於測試片的流動設計。
根據本方法，第二分析物結合劑也可被包含在測試片上輸送偶聯緩衝液的區域，這樣，輸送偶聯緩衝液會導致第二分析物結合劑的擴散。或者，第二分析物結合劑可以被包含在測試片上並位於輸送偶聯緩衝液區域的近端，這樣，輸送偶聯緩衝液會導致第二分析物結合劑的擴散。將偶聯緩衝液輸送至測試片，還包括將包含在偶聯緩衝液中的第二分析物結合劑輸送至測試片。
根據上述方法，測試區可包含其中固定有對照結合劑的第一對照區，輸送偶聯緩衝液導致對照劑向近端擴散，通過末端樣品流動區而達到第一對照區，並且結合於其中所固定的對照結合劑。或者，測試區可包含第一和第二對照區並且各對照區含有不同數量的被固定的對照結合劑，輸送偶聯緩衝液導致對照劑向近端擴散，通過末端樣品流動區而達到第一和第二對照區，並且結合於其中所固定的對照結合劑。
根據上述方法，用可檢測標記物標記第二分析物結合劑會有助於檢測第二分析物結合劑，而檢測第二分析物結合劑包括檢測可檢測標記物。第二分析物結合劑可附著於顆粒。檢測第二分析物結合劑包括檢測顆粒。
根據上述任一例子，輸送至測試片上的樣品較佳地在一預定體積範圍內，該範圍是測試片的設計處理範圍。該預定體積範圍宜約為10-250微升，較佳地約為20-100微升，更佳地約為30-50微升，最佳地約為35-45微升。當樣品在預定體積範圍內被加至測試片上時，末端樣品流動區的從近端至遠端的距離可以被設計成具有短長度。例如，當樣品以約35-45微升範圍被加至測試片時，末端樣品流動區的從近端至遠端的長度可以約為1-25毫米，較佳地為2-15毫米，最佳地為3-10毫米。
根據上述任一例子，第一分析物結合劑宜不結合於樣品除了分析物之外的其他組份。能夠作為第一分析物結合劑的分子的種類包括(但並不限於)抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、含有異源的抗原(抗原具有分析物結合位點)混合物的裂解物、配體和受體。在一個具體例子中，第一分析物結合劑是抗體或其片段。


圖1是本發明一種側流測試片的俯視圖。
圖2A-2H顯示了本發明側流測試片的操作方法。
圖2A顯示了樣品正被加到測試片上。
圖2B顯示了樣品在測試片中流動。
圖2C顯示了當樣品在測試片中沿背離吸收區的方向流動了一段距離並達到末端樣品流動區時的測試片。
圖2D顯示了當樣品折返並流向吸收區時的測試片。
圖2E顯示了將緩衝液加至測試片上。
圖2F顯示了緩衝液在測試片中流向吸收區。
圖2G顯示了在測試片中緩衝液流過測試區。
圖2H顯示了在測試片中緩衝液流入吸收區。
圖3A-3H顯示了本發明側流測試片的操作方法。
圖3A顯示了樣品和緩衝液正被加到測試片上。
圖3B顯示了樣品和緩衝液在測試片中流動。
圖3C顯示了當樣品在測試片中沿背離吸收區的方向流動了一段距離並達到末端樣品流動區時的測試片。
圖3D顯示了當樣品折返並流向吸收區時的測試片。
圖3E顯示了緩衝液繼續流向樣品流。
圖3F顯示了緩衝液流過末端樣品流動區。
圖3G顯示了在測試片中緩衝液流過測試區。
圖3H顯示了在測試片中緩衝液流入吸收區。
圖4顯示了一種測試片設計，其中加樣區的位置鄰近洗滌緩衝液添加區。
圖5A-5C顯示了各種盒式設計，其中裝有本發明的測試片。
圖5A顯示了適用於圖2A-2H所示測試片的盒式設計。
圖5B顯示了適用於圖3A-3H所示測試片的盒式設計，其中加樣區的位置遠離洗滌緩衝液添加區，使得樣品和洗滌緩衝液能夠同時添加。
圖5C顯示了適用於圖4所示測試片的盒式設計，其中加樣區的位置鄰近洗滌緩衝液添加區，測試區遠離洗滌緩衝液添加區。
圖6A顯示了Abbott製造的FLEXPACKTMHP測試片的布局圖。
圖6B顯示了圖6A所示測試片的操作過程。
圖7顯示了圖1所示側流測試片的側視截面圖。
圖8顯示了實施例2中進行的II型皰疹的ReLIATM截流式測定的結果。
圖9顯示了實施例3中進行的II型皰疹的ReLIATM截流式測定的結果。
圖10顯示了實施例4中進行的Helicobacter pylori(幽門螺旋菌)的ReLIATM截流式測定的結果。
本發明涉及一種側流測試片，該測試片能夠使加至測試片的一部分樣品從樣品加樣區流過一個或多個測試區並進入末端樣品流動區，然後在無用戶任何幹擾的情況下改變方向，折返並流過一個或多個測試區而進入加樣區。固定於至少一個測試區中的是第一分析物結合劑，該第一分析物結合劑能夠與設計用測試片檢測的樣品中的分析物相結合。通過使一部分樣品流過一個或多個測試區然後獨立地返回並流向加樣區，可以省去在一個或多個測試區與第二分析物結合劑接觸之前洗滌一個或多個測試區的要求。還省去了確定何時讓第二分析物結合劑擴散至一個或多個測試區的要求。如本申請下面將詳細論述的那樣，本發明測試片的自洗滌和自定時特徵提供了多種優於以前測試片的明顯優點。
本發明測試片的自洗滌和自定時特徵，是通過將吸收區的位置與加樣區相對，從而使得當一定體積的樣品(在測試片的預定樣品體積範圍內)被加至測試片時，樣品擴散前沿延伸通過一個或多個測試區並流至末端樣品流動區。當樣品達到末端樣品流動區時，吸收區的吸收特性使得樣品被反向吸回，通過測試區而流向加樣區，並且最終被吸入吸收區。
圖1是本發明一種側流測試片100的頂視圖。如圖所示，測試片100分別具有近端102和遠端104，而且能夠被劃分成幾個不同區域。測試片含有加樣區106，在此可以將樣品加至測試片100。吸收區108位於加樣區106的近端。一個或多個測試區110、112、114位於加樣區106的遠端。測試片100還含有位於一個或多個測試區110、112、114遠端的末端樣品流動區116。每個上述區域在液體擴散方面是互相連通的。
如圖所示，測試片還含有偶聯緩衝液添加區118，它位於末端樣品流動區的遠端。偶聯緩衝液添加區118可以是偶聯緩衝液被加至測試片的區域。或者，偶聯緩衝液添加區118就是偶聯緩衝液從更遠處擴散而達到測試片的區域。
應注意，圖1所示測試片的布局在設計上是線性的。然而，非線性的布局，例如圖4所示的布局也可用於本發明的測試片。
圖2A-2H顯示了側流測試片(比如圖1所示的測試片)的操作方法。在用本發明測試片進行測試之前，先獲得據信含有待檢測分析物的液體樣品。樣品可包括能溼潤測試片並且其粘度足以讓樣品移動通過測試片的任何液體。在一個優選例中，樣品是水溶液(例如體液)。
圖2A顯示了樣品120正被加至測試片100的加樣區106。應注意，測試片被設計成用於體積在特定範圍內的樣品。更具體地，輸送預定範圍內的樣品可導致樣品向遠端擴散越過測試區並進入末端樣品流動區116，但是不超過末端樣品流動區116(如圖2D所示)。
如圖2B所示，樣品120在被加至測試片之後，開始在測試片上向近端和遠端兩個方向擴散。如圖2C所示，樣品120的遠端前沿124擴散通過一個或多個測試區110、112、114而進入末端樣品流動區116。如圖2D所示，樣品120的遠端前沿124最終延伸至末端樣品流動區116中的某個位點。
當加至測試片的樣品體積在測試片的設計的預定體積範圍內時，樣品120的遠端前沿124會到達遠端擴散點，該遠端擴散點對應於末端樣品流動區116中最遠的遠端流動點。在該點，如圖2E所示，吸收區108的毛細管作用將樣品吸向近端，朝向吸收區108。當樣品被吸入吸收區108時，樣品的遠端前沿124就向近端退回。
如圖2A-2D所示，本發明的一個特徵是控制樣品在測試片中如何流動以及在何處流動。加至測試片的樣品宜在測試片的設計處理的預定體積範圍內。預定的體積範圍宜約為10-250微升，較佳地約20-100微升，更佳地約30-50微升，最佳地約35-45微升。當加至測試片的樣品在該範圍內時，樣品流會停在末端樣品流動區中。
末端樣品流動區的從近端至遠端的距離可以被設計成具有短長度。例如，當樣品以約35-45微升範圍被加至測試片時，末端樣品流動區的從近端至遠端的長度可以約為1-25毫米，較佳地為2-15毫米，最佳地為3-10毫米。
第一分析物結合劑位於一個測試區(如測試區110)中，該第一分析物結合劑會結合於測試片設計檢測的樣品中的分析物。存在於流過測試區的樣品部分中的分析物，會被第一分析物結合劑固定在測試區110中。
圖2E顯示了樣品已到達末端樣品流動區之後，將偶聯緩衝液122加至測試片的偶聯緩衝液添加區118。偶聯緩衝液122可含有一種或多種不同的第二分析物結合劑，該第二分析物結合劑可結合於分析物並使固定於測試區的分析物被檢測出。應注意，偶聯緩衝液添加區118也可任選地含有一種或多種用於檢測被固定的分析物的第二分析物結合劑。在這種情況下，加入偶聯緩衝液122所起的作用是使一種或多種第二分析物結合劑開始擴散並通過測試區。
如圖2F和2G所示，偶聯緩衝液122流向測試片近端，並流向吸收區108，從而使一種或多種第二分析物結合劑移動通過測試區110、112、114，並且結合於被固定的分析物。
如圖2H所示，吸收區108的毛細管作用使樣品120擴散入吸收區108。同時，偶聯緩衝液122繼續向近端擴散，通過測試區110、112、114並進入吸收區108。任何沒有被固定於測試區110、112、114的一種或多種第二分析物結合劑，會隨偶聯緩衝液122被攜帶進入吸收區108。
對於圖2A-2H中所示的實例，應注意，應在樣品120已到達測試區110、112、114之後，較佳地在樣品已到達末端樣品流動區116並已開始折返並朝吸收區108擴散之後，將偶聯緩衝液122加至測試片。這使得流過測試區的樣品120部分，可在沒有偶聯緩衝液的情況下與測試區中的第一分析物結合劑接觸。
圖3A-3H顯示了本發明的另一種測試片設計和該測試片的操作方法。在這種實例中，樣品和偶聯緩衝液是同時加入的。為了使樣品和偶聯緩衝液能夠幾乎同時被加入，必須使偶聯緩衝液在樣品已經與測試區接觸之後才到達測試區210、212、214。較佳地，偶聯緩衝液到達測試區之前，樣品擴散已開始折返通過測試區朝吸收區208擴散。
與圖2A-2H所示的測試片設計相比，延遲偶聯緩衝液到達測試區的時間，在該實例中是通過使偶聯緩衝液添加區218和末端樣品流動區216之間的距離更長而實現的。或者，人們可以使用讓偶聯緩衝液擴散速度更慢的材料。
圖3A顯示了樣品220被加至測試片200的加樣區206。與此同時，偶聯緩衝液222被加到偶聯緩衝液添加區218，與將樣品加至測試片幾乎同時。
如圖3B所示，樣品220一旦被加至測試片，開始在測試片中朝近端和遠端擴散。與此同時，偶聯緩衝液22也在測試片中朝近端和遠端擴散。
如圖3C所示，樣品220的遠端前沿224擴散通過一個或多個測試區210、212、214，到達末端樣品流動區216。與此同時，偶聯緩衝液222繼續在測試片中向遠端，朝向測試區擴散。
如圖3D所示，樣品220的遠端前沿224最終延伸至末端樣品流動區216中的某點。當樣品在末端樣品流動區216時，偶聯緩衝液222還沒有到達該區域。
如圖3E所示，吸收區208的毛細管作用使樣品向近端擴散，流向吸收區208。當樣品被吸入吸收區208時，樣品的遠端前沿224向近端流動。第一分析物結合劑位於一個測試區(如測試區210)中，該第一分析物結合劑會結合於樣品中測試片設計檢測的分析物。存在於流過測試區的樣品部分中的分析物，會被第一分析物結合劑固定在測試區210中。
圖3F顯示了偶聯緩衝液222到達測試區。如圖所示，當緩衝液222到達測試區時，樣品的遠端前沿224早已向近端流動，流出末端樣品流動區216和測試區210、212、214。
如圖3G和3H所示，吸收區208的毛細管作用使樣品被吸入吸收區208。同時，偶聯緩衝液222繼續向近端擴散，通過測試區210、212、214並進入吸收區208。任何沒有被固定於測試區210、212、214的一種或多種第二分析物結合劑，會隨偶聯緩衝液222被攜帶進入吸收區208。
加至測試片的偶聯緩衝液222可含有一種或多種不同的第二分析物結合劑，該第二分析物結合劑可結合於分析物並使固定於測試區的分析物被檢測出。或者，測試片也可包含位於末端樣品流動區216遠端的、含有一種或多種第二分析物結合劑的偶聯物區。偶聯緩衝液添加區218也可作為偶聯物區。當一種或多種第二分析物結合劑被預載至測試片上時，偶聯緩衝液222所起的作用是使一種或多種第二分析物結合劑開始擴散，通過測試區流向吸收區。
如圖3A-3H所示，通過設計測試片的擴散路徑使得偶聯緩衝液不會在樣品已擴散離開測試區之前到達測試區，偶聯緩衝液就可在樣品到達測試區之前被加至測試片。應注意，偶聯緩衝液的擴散到達測試區的時間可以被大大延遲，這樣人們可以在將樣品加至測試片之前將偶聯緩衝液加至測試片。
圖4顯示了本發明側流測試片的另一種測試片設計。該測試片的操作與圖3A-3H所述的操作相似。在圖4中採用與圖3A-3H相同的參考編號。如圖4所示，加樣區206的位置與偶聯緩衝液添加區218相鄰。這可使測試片的設計更緊湊，同時還允許同時添加樣品和偶聯緩衝液。
圖4所示的測試片設計的一個特徵，是樣品和偶聯緩衝液可同時被加至測試片的相同末端。還應注意，測試區210、212、214位於加樣區206和偶聯緩衝液添加區218的另一端。這使得測試區可被置於樣品閱讀器中，而加樣區和偶聯緩衝液添加區在樣品閱讀器外部。這樣，又允許當測試片位於測試片閱讀器中時，將樣品和偶聯緩衝液加至測試片。
圖5A-5C顯示了各種盒式設計，其中裝有本發明的測試片。在每種盒式設計中，測試盒具有靠近測試片加樣區206的加樣孔240。測試盒還具有靠近測試片的偶聯緩衝液添加區218的偶聯緩衝液添加孔242。測試盒還具有靠近測試片測試區210、212、214的測試窗244。
圖5A顯示了適用於圖2A-2H所示測試片的盒式設計。圖5B顯示了適用於圖3A-3H所示測試片的盒式設計，其中加樣區的位置遠離偶聯緩衝液添加區，使得樣品和偶聯緩衝液能夠同時被添加至測試片。圖5C顯示了適用於圖4所示測試片的盒式設計，其中加樣區的位置鄰近偶聯緩衝液添加區，測試區遠離緩衝液添加區。
應注意，對於圖2-4而言，本發明測試片的特徵是測試片本身能夠使測試片上的測試區在一段時間內暴露於一部分樣品，然後在偶聯緩衝液到達測試區之前使樣品擴散離開測試區。這個特徵是通過將下列因素(1)與因素(2)、(3)相匹配而實現的(1)吸收區的位置與加樣區相對，(2)測試片在加樣區和末端樣品流動區之間的吸收能力，(3)加至測試片的樣品體積。如果加入過多樣品，樣品會擴散逸出末端樣品流動區。如果加入樣品過少，則樣品不能在測試片中擴散足夠距離到達測試區。
使測試區在限定時段內暴露於樣品，然後使樣品離開測試區這一測試片的能力，使得測試片不依賴於定時，這提高了測試片的精度且便於使用。例如，如實施例2詳細描述的那樣，測試結果與偶聯緩衝液何時加至樣品無關。因此該測試片不需要小心監測何時應加入偶聯緩衝液。在這方面，本發明消除了在加入樣品之後應將偶聯緩衝液加至測試片的時間之窗。
現在結合圖1，描述將一定體積的樣品加至測試片從而控制樣品如何在測試片中擴散的動力學。如前所述，圖1顯示的測試片分別具有近端102和遠端104，並且被分成數個獨立的區域。測試片含有加樣區106，在此可以將樣品加至測試片。吸收區108位於加樣區106的近端。測試區110位於加樣區106的遠端。末端樣品流動區116位於測試區110的遠端。偶聯緩衝液添加區118位於末端樣品流動區116的遠端。
為了便於闡述，假設測試區110含有第一分析物結合劑，而偶聯緩衝液添加區118含有用可檢測標記物標記的第二分析物結合劑。還假設測試片被設計成30微升的樣品會使樣品擴散但不會超過測試區110。同時，50微升的樣品體積會使樣品擴散至末端樣品流動區116的遠端。
如果加至測試片的樣品在30-50微升體積範圍內，則樣品的遠端前沿將擴散通過測試區110。樣品遠端的前進將停在末端樣品流動區116中。在到達測試區110的部分樣品中的分析物，會結合於第一抗體並被固定在測試區110中。樣品中的其他組份將不會結合於第一抗體，因為第一抗體對分析物有選擇性。然後，樣品折回，按近端方向通過測試區110流向吸收區108。當加入偶聯緩衝液時，偶聯緩衝液使第二分析物結合劑擴散通過測試區110，在此處第二分析物結合劑結合於被固定在測試區110中的分析物。因為在緩衝液到達測試區110之前樣品已擴散離開測試區110，因此不存在任何原本會結合於第二分析物結合劑的樣品成分。因此，為了結合於第二分析物結合劑，樣品中的待檢測分析物不必與樣品中的其他物質競爭。
如果加至測試片的樣品體積小於30微升(例如25微升)，樣品將不能擴散至測試區110。結果，樣品中的分析物不能到達測試區110並結合於第一抗體。當加入緩衝液時，第二分析物結合劑會隨偶聯緩衝液的擴散而被攜帶，並通過測試區110而不被固定，因為在測試區中不存在分析物。
如果加樣的樣品體積大於50微升(例如55微升)，樣品會擴散通過測試區110並通過末端樣品流動區116進入偶聯緩衝液添加區。一些分析物會結合於測試區110中的第一分析物結合劑並被固定。同時一些分析物會結合於偶聯緩衝液添加區118中的第二分析物結合劑，然後才折回並結合於測試區110中的第一分析物結合劑。因為空間位阻效應，結合了雙拷貝第二分析物結合劑的分析物不會結合於第一分析物結合劑。而且，在分析物已結合於第二分析物結合劑之後，就難以使分析物結合於第一分析物結合劑。結果，測試片的靈敏度會下降，如果分析物在結合於第一分析物結合劑之前就結合於第二分析物結合劑。到達偶聯緩衝液添加區118的部分樣品中的其他組份，也可能結合於第二分析物結合劑。這些其他組份會與分析物競爭與第二分析物結合劑的結合。
通過控制加樣的樣品體積，從而(1)使分析物暴露於第一分析物結合劑之後才讓固定化的分析物暴露於第二分析物結合劑，和(2)使第二分析物結合劑在暴露於樣品中的其他組份之前不暴露於分析物，可以減低非特異性結合。這樣大大提高了分析靈敏度和分析物檢測精度。
如上所述，本發明測試片的兩個優點是自洗滌和自定時特性。為了解釋這些特性的重要性，現在將與Abbott製造的FLEXPACKTMHP測試片進行比較(示於圖6A和6B)。
圖6A顯示了這種測試片的布局圖。如圖所示，該測試片含有兩個獨立區段310、312，它們通過鉸鏈314互相連接。右側的區段310包括測試片316，測試片316具有加樣區318、測試區319、限制線320和偶聯緩衝液轉移墊片322。左側的區段312包含吸收墊片324(它與加樣區318相對)、偶聯緩衝液添加墊片326(它與偶聯緩衝液轉移墊片322相對)、和測試窗328(它與測試區319相對)。吸收墊片324、偶聯緩衝液添加墊片326和測試窗328的位置並列，使得第一區段310和第二區段312相互接觸時，吸收墊片324會與加樣區318接觸而偶聯緩衝液添加墊片326會與偶聯緩衝液轉移墊片322接觸。此外，當第一區段310和第二區段312相互合攏時，可通過測試窗328觀察測試區319。
圖6B顯示了圖6A所示測試片的操作過程。如圖所示，偶聯緩衝液330被加至偶聯緩衝液添加墊片326。偶聯緩衝液添加墊片含有能夠結合於待檢測樣品中分析物的第二分析物結合劑(如抗體)。第二分析物結合劑用可檢測標記物標記，這使得第二分析物結合劑可以顯現。第二分析物結合劑並不是對分析物特異的，因此可以結合於樣品中的其他組份。
然後採集樣品322，並將其加至加樣區318。一旦加入，樣品在測試片316上擴散，從加樣區318擴散通過測試區319。測試區319含有被固定的第一分析物結合劑(如抗體)，它可選擇性地結合於樣品中測試片設計檢測的分析物。當樣品穿過測試區319時，樣品中的分析物會結合於第一分析物結合劑並被固定在測試區319中。
當樣品的擴散前沿到達限制線320時，用戶要將第一區段310和第二區段312合在一起。將第一區段310和第二區段312合在一起，使得吸收墊片324將樣品吸回加樣區318。同時，偶聯緩衝液被從偶聯緩衝液添加墊片326轉移至偶聯緩衝液轉移墊片322。偶聯緩衝液從偶聯緩衝液轉移墊片322擴散出來，通過測試區319。儲存在偶聯緩衝液添加區318中的第二分析物結合劑會與偶聯緩衝液一起擴散，並與測試區319中被固定的分析物接觸。第二分析物結合劑一旦被固定在測試區319，那麼通過觀察第二分析物結合劑上的可肉眼檢測的標記物就可以檢測分析物。
從對FLEXPACKTMHP測試片操作過程的上述描述可以看出，必須確定樣品何時到達限制線320，然後才讓偶聯緩衝液從偶聯緩衝液添加墊片326轉移至偶聯緩衝液轉移墊片322並流向測試區319。還必須有確定加樣區318和吸收墊片324接觸的步驟，以便樣品被吸離測試區319。本發明的測試片設計，例如在圖2-4所示的設計，消除了監視測試片已確定何時開始將樣品從測試區移去這一要求。此外，因為樣品會自動退回，因此在加入偶聯緩衝液時人們不必小心監視測試片。相反，如實施例2所示，用本發明測試片獲得的測試結果與在樣品擴散離開測試區後偶聯緩衝液何時到達測試區無關。
本發明的側流分析(或側流測定)可用於各種不同用途。例如，該分析可用於分析人類疾病，例如傳染性疾病、或任何其他涉及可識別表位的人類疾病(如癌症、自身免疫疾病、心血管病症和病理)。該分析還可用於獸醫、食品測試、農業和精細化學應用。本發明的側流分析可用各種不同方法進行，包括使用側流分析測試設備，例如1998年11月23日申請的專利申請No.09/199,255中所述的設備，該文獻在此引用作為參考。在一個優選例中，側流分析測試設備包括可從PraxSysBioSystems(San Ramon，CA)得到的ReLIATM測試設備。
1、製造本發明的測試片現在更詳細地描述用於製造本發明測試片的方法和材料。應注意，測試片的具體構造可以變化，這取決於意圖用測試片來進行的具體測試。在實施例之外製造測試片的變動方法，也落於本發明範圍之中。
圖7顯示了圖1所示側流測試片的側視截面圖。如圖7所示，測試片100可包括背襯片402，其長度與測試片相同。膜片404位於背襯片402之上，並作為測試片的擴散通路。吸收墊片408在吸收區108且位於膜片404之上，而吸收區位於測試片的近端。樣品墊片406位於膜片404之上且位於吸收墊片408的遠端。可用粘合劑409將樣品墊片406粘於膜片404。在膜片404上可形成位於樣品墊片406遠端的一個或多個測試區410、412、414。偶聯緩衝液添加墊片416在膜片404上方，位於測試區410、412、414的遠端且位於末端樣品流動區116的遠端。在測試區上方有一保護性蓋片418。為了讓夾帶入流體前沿的氣泡逸出，在測試區和偶聯物區之間留有一個沒有被保護性蓋片418覆蓋的空隙。保護性蓋片418可被更廣泛地置於膜片404上方，以便保護測試片的其他部分。
背襯片可以用任何穩定的、無孔的材料製成，其強度應足以支承材料和粘於其的測試片。因為許多測定用水作為擴散介質，因此背襯片較佳地是基本上不透水的。在一個優選例中，背襯片是用聚合物膜製成的，更佳地是用聚氯乙烯膜製成的。
膜片可以用任何材料製成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內部發生流體的毛細管作用。膜片應有足夠的孔隙度，從而允許塗有抗體或抗原的顆粒移動。膜片還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤溼(例如，對於水性液體具有親水性，對於有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利No.4,340,482或No.4,618,533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉變成親水表面)，可以改變膜的疏水性從而使膜具有親水性以便用於水性液體。可用於製造膜片的材料例子包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚碸(polyethersulfone)。在一個優選例中，膜片是用硝酸纖維素製成的。
吸收墊片可以用任何能吸收作為樣品和緩衝液的液體的材料製成。吸收墊片的吸收能力應足夠大，以便吸收添加至測試片的液體。適用於吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。
緩衝液添加墊片可用任何吸收性材料製成。可使用的材料例子包括纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚碸。
如前所述，偶聯緩衝液添加墊片可作為偶聯物墊片並含有被可檢測標記物標記的試劑，該試劑可結合於樣品中待檢測的分析物。或者，測試片可含有與緩衝液添加墊片分開的偶聯物墊片，在該偶聯物墊片中含有被可檢測標記物標記的、能結合於樣品中待檢測分析物的試劑。
保護性蓋片可用任何材料製成，只要該材料不透水而且較佳地是半透明或透明的。保護性蓋片可以是單層或多層。優選的用作保護性蓋片的材料包括透光材料，例如聚醯胺、聚酯、聚乙烯、丙烯酸類材料、玻璃或類似的材料。保護性蓋片可以是透明或不透明的，這取決於所用的檢測方法。在一個優選例中，保護性蓋片是透光透明的聚酯。
2、與本發明測試片一起使用的分析方法本發明測試片可用於大量不同的側流分析方法，而這些分析方法涉及使用兩種都能結合於待檢測分析物的分析物結合劑。至少一種結合劑可選擇性地結合於分析物。更具體地，一種結合劑應能結合於分析物而不結合於樣品中的其他組份。
如本文所用，術語「分析物」指待用分析測試片檢測以及可任選地被定量測定的、樣品中的任何組份(如分子、化合物、或其聚集體)。分析物的例子包括蛋白質，如激素或其他分泌蛋白質、酶和細胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物；毒素；病毒或病毒顆粒；細胞壁組份；或其他具有表位的化合物。
第一和第二分析物結合劑可以是任何能夠結合於待檢測分析物的物質。有各種不同類型的分子可用作分析物結合劑，其中包括例如抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結合位點)的異源混合物的裂解物。P.Holliger等人，Trends in Biotechnology 137-9(1995)；S.M.Chamow等人，Trends inBiotechnology 1452-60(1996)。如果待檢測分析物是配體，那麼可使用結合於該配體的受體，反之亦然。在一個具體例子中，第一和/或第二分析物結合劑是可結合於分析物免疫原性部分的抗體。
應注意，第一和第二分析物結合劑中應至少有一種能夠結合於分析物而不結合於待分析樣品中的其他組份，這種分析物結合劑在此被稱為分析物選擇性結合劑。在一個例子中，被固定在測試區中的第一分析物結合劑是分析物選擇性結合劑，而用可檢測標記物標記的第二分析物結合劑能夠非特異地結合於分析物。在另一例子中，被固定在測試區中的第一分析物結合劑能夠非特異地結合於分析物，而用可檢測標記物標記的第二分析物結合劑是分析物選擇性結合劑。在另一例子中，第一和第二分析物結合劑都是分析物選擇性結合劑。
分析物選擇性結合劑的例子包括抗體(單克隆抗體、多克隆抗體及其片段)，它們僅對特定類型的生物分子(如蛋白質或受體)有狹窄的結合親和力。
連於第二分析物結合劑的可檢測標記物包括大量不同物質，只要標記物能夠被檢測。可檢測標記物的例子包括(但並不限於)顆粒、發光標記物；比色標記物、螢光標記物；化學標記物；酶；放射性標記物；或射頻標記物；金屬膠體；和化學發光標記物。常用檢測方法的例子包括(但並不限於)光學方法，如測量光散射、單反射、光度計或光電倍增管；放射性(用蓋革計數器等進行測量)；導電性或電介質(電容)；電化學法檢測所釋放的電活性物質，如銦、鉍、鎵、碲離子[如用Hayes等人(Analytical Chem.661860-1865(1994)所述的方法]，或亞鐵氰化物[如用Roberts和Durst(Analytical Chem.67482-491(1995)所提出的方法。其中通過在檢測區滴加洗滌劑，使包裹在脂質體中的亞鐵氰化物被釋放出，然後用電化學法檢測釋放的亞鐵氰化物]。其他常規方法只要合適，也可使用。
可能會需要用同一測試片來分析兩種或多種不同的分析物。在這種情況下，在同一測試片上採用不同的可檢測標記物會是有利的，其中每種可檢測標記物檢測不同的分析物。例如，不同的可檢測標記物可連於不同的分析物選擇性結合劑。不同的可檢測標記物可以是在不同波長發出螢光的不同螢光劑。
當用同一測試片檢測兩種或多種不同的分析物時，可任選地在測試片上形成獨立的針對各種待檢測分析物的測試區。對所有分析物可以使用相同的可檢測標記物。或者，如上所述，可對不同的分析物使用不同的可檢測標記物，以防一個測試區與其他測試區相混淆。
在一個優選例中，可檢測標記物是顆粒。可使用的顆粒例子包括(但並不限於)膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；滷化銀顆粒；二氧化矽顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；塗有有機或無機層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質或肽分子；脂質體；或有機聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。
一類優選的顆粒是膠體金顆粒。膠體金顆粒可用任何常規方法製造，例如總結於G.Frens，1973 Nature Physical Science，24120(1973)中的方法。其他方法描述於美國專利No.5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775。
顆粒大小的選擇會影響一些因素，例如總溶膠試劑及其偶聯物物的穩定性、偶聯物墊片釋放顆粒的效率和充分性、反應的速度和充分性。此外，顆粒表面積會影響結合分子之間的空間位阻。顆粒大小還應根據膜片的孔隙度進行選擇。顆粒宜足夠小，從而能因偶聯緩衝液的毛細管作用而沿膜擴散。
顆粒可以被標記，以協助檢測。標記物的例子包括(但並不限於)發光標記物；比色標記物如染料；螢光標記物；或化學標記物，如電活性劑(electroactiveagents)(如亞鐵氰化物)；酶；放射性標記物；或射頻標記物。
存在於測試片上的顆粒數目可以改變，這取決於顆粒的大小和組成、測試片和膜片的構成成分、以及分析測試的靈敏度水平。顆粒數目的範圍通常約為1×109-1×1013個顆粒，儘管也可使用低於1×109個顆粒。在一個優選例中，顆粒數目約為1×1011個顆粒。
3、對照測試區如圖1所示，在測試片上可包含多個測試區110、112、114。每個測試區的位置使得自動的或半自動的分析儀器，或者觀察者，能夠測定側流分析的確定結果。
如前所述，固定在至少一個測試區中的是第一分析物結合劑，該第一分析物結合劑能夠結合於測試片設計檢測的樣品中的分析物。在某些例子中，讓某些其他測試區含有一個或多個對照區是有利的，對照區中固定有一種或多種對照結合劑。能夠結合於對照結合劑的對照劑可以位於測試片上的各種不同位置，或者可以在進行測試時被加至測試片上。對照劑較佳地被可檢測標記物(例如上述的可檢測標記物)所標記，以利於檢測對照劑與固定在對照區中的對照結合劑之間發生的結合。
對照劑和對照結合劑可以結合使用，以實現各種對照功能。例如，對照結合配對(pairs)可用於驗證樣品和偶聯緩衝液在測試片上的擴散是否正常。對照結合配對還可被用作內部標準，使得分析物測量結果能夠在不同測試片之間進行比較。這可用於修正測試片-測試片之間的差異。用基於例如對測試片統計採樣而得出的外部對照來進行這種修正是不切實際的。此外，通過使用對照結合配對，可以減小不同測試片在各個批次和各次使用之間的差異。此外，如下所述，還可減低非特異性結合的影響。在使用外部的非測試片對照時，所有這些修正都是難以實現的。
可用作對照結合配對成員的各種不同物質，是本領域中已知的。例如，對照結合配對的至少一個成員可以是天然存在的或工程改造的蛋白質。對照結合配對也可以是受體-配體的配對。此外，對照結合配對的至少一個成員可以是偶聯於對有關分析物非特異的蛋白質之上的抗原、其他有機分子、或半抗原。有關對照結合配對的其他合適成員的描述，可在美國專利No.5,096,837中找到，並且包括IgG、其他免疫球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、其他白蛋白、酪蛋白、和球蛋白。
對照劑-對照結合劑配對的有利特性包括(但並不限於)整體穩定性、對有關分析物的非特異性、測試的重現性和可預測性、分子大小、相互結合的親和力。
在一個優選例中，對照結合配對的成員並不與可能存在於測試片上的任何東西(例如來自樣品的東西)結合。在一個例子中，對照結合劑包括兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)抗體，而對照劑包括偶聯於BSA(牛血清白蛋白)的二硝基苯酚。
在一個優選例中，對照劑和沿測試片擴散的第二分析物結合劑兩者都被附著在一種顆粒上。附著可以是非特異性的吸附，也可以是常規的化學偶聯。或者，可以使用非共價的結合系統，例如生物素-親和素或甚至對第二分析物結合劑特異的抗體，使分析物結合劑附著於顆粒。雙官能或多官能試劑也可用於將第二分析物結合劑和對照劑連於顆粒。
連於各顆粒的第二分析物結合劑和對照劑的數目可以變化，這取決於對具體的測試是否合適。例如，可將雙份第二分析物結合劑和一份對照劑連於各顆粒。或者，將一份第二分析物結合劑和二份對照劑連於各顆粒。根據採用三者的具體測試情況，第二分析物結合劑對照劑顆粒之間的其他不同比例也可使用，這些不同的變化形式也在本發明範圍之內。
在一個優選例中，測試片包含一個以上的對照區，並且被用於產生一標準曲線，而大量不同的分析物測量結果就可與該標準曲線進行比較。該例子在1998年11月23日提交的專利申請No.09/198,118中有更詳細的描述，該文獻在此引用作為參考。讓測試片具有一個以上對照區，使得側流分析能夠比常規側流分析具有更廣的動態量程。在優選例中，如下所述，將具有2個、3個或更多對照區的測試片與相對比例法結合使用，從而可以將檢測到的對照結合配對的數量映射到同一標尺，並根據該標尺得出被檢測分析物的數量。
在一個優選例中，測試片有至少一個高對照區和至少一個低對照區。兩個區之間的差異通常為一種濃度。在高對照區中的對照劑濃度大於在低對照區中的對照劑濃度。因此，在高對照區中的對照結合配對的數量高於低對照區。在給定對照區中的對照結合配對物的數量能夠被映射到同一測量標尺上(並可根據該標尺得出分析物的數量)的例子中，可以通過高和低對照區中結合配對物的數值而繪製標準曲線。
在其他例子中，可存在2個以上對照區。這樣所產生的曲線能更好地反映測試中在檢測的分析物數量和被映射數量的測量值之間的非線性現象(如下所述)。儘管這些非線性現象原本會影響假定較為線性關係的測試，但是通過使用多個對照區可以對其進行校正。可以使用2個、3個或更多的對照區。
在另一實施例中，一個單個對照區可含有一種以上的對照劑。這在有一組以上偶聯於檢測劑的分析物非特異性試劑和分析物結合劑情況下是有用的。例如，當需要在同一測試片上分析兩種或多種感興趣的分析物時，可以製備兩組偶聯於檢測劑的分析物非特異性試劑和分析物結合劑。對於每組可使用不同的檢測劑，從而可以區分感興趣的兩種不同分析物的測量結果。在這種情況下，可能需要使用包含不同對照劑或對照結合配對的對照區。
對照區可位於一組測試區中的各種位置。應注意，測試區可位於測試片的各種位置，這取決於本發明測試片的流動設計。
可按圖2A-2H和3A-3H所述的相同方式，用包含一個或多個對照區作為測試區域一部分的測試片進行測試。應注意，測試片或偶聯緩衝液中的一者，應包含可結合於被固定的對照結合劑的對照劑，例如在圖2A-2H中的測試區112和114以及圖3A-3H中的測試區212和214。當加入偶聯緩衝液時，對照劑會隨偶聯緩衝液一起擴散並結合於被固定在對照區中的對照結合劑。
在檢測固定於測試區中的第二分析物結合劑數量的同時，被固定在對照區中的對照劑的數量也被檢測。如上所述，較佳地用可檢測標記物對對照劑和第二分析物結合劑進行標記，以便於檢測。在各測試區中的可檢測標記物的數量，可以輕易地用本領域已知的各種技術加以確定，其中所用的技術取決於所用的可檢測標記物類型。常見的檢測技術例子包括光學方法(光散射、單反射、光度計或光電倍增管)；放射性；導電性；電介質電容；電化學法檢測所釋放的電活性物質等，這在上面已有描述。
一旦在各測試區中已檢測出可檢測標記物的數量，那麼這些測量值就可用於檢測並且更佳地可用於定量所存在的分析物數量，較佳地還通過對照區中的可檢測標記物數量校正測試片。例如，當採用高和低對照區時，被固定在高和低對照區中的對照劑數量，可用於確定相對於高和低對照區而言的第二分析物結合劑的數量。接著，這些相對強度測量值可用於更精確地確定存在於測量體積中的分析物拷貝數。
使用多個對照區的一個特徵是能夠產生用於測量分析物的相對標尺。一旦可檢測標記物的數量被定量，那麼這些數量接著就可被映射到另一測量標尺上。例如，儘管測量分析物所得出結果可基於分析物的絕對測量值進行測量，但是以其他單位所表示的測量結果可能更有意義，例如相對於對照區的相對強度(在本文被稱為相對強度或RI)。結果還可表示為測量體積中存在的分析物拷貝數。將檢測的分析物數量映射到其他測量標尺上是一種報告本發明測試結果的優選例子。
例如，測試結果可被映射到相對標尺上。對於內部對照，使用相對標尺(例如相對強度(RI))，可以將測得的分析物絕對值轉化為RI值。在一個優選例中，低對照的RI值被定為1而高對照的RI值被定為3，儘管這些對照的絕對值之比並不如此。在一個優選例中，絕對值之比至少約為5∶1，而RI之比約為3∶1。通過這樣做法，在各測試片中影響測量絕對值的變化因素，會導致標準曲線在Y軸上下波動，但是對於沿X軸繪製的RI值的影響卻較小。這會全面地減小報告數據的可變幅度，即會表現為「負增益」。
例如，如果在分析物的測量數量和分析物的報告數量之間存在負增益，那麼在分析物測量數量上的大變化會轉化為分析物報告數量上的較小變化。儘管分析物測量數量的內在差異沒有改變，但這種方法在某些情況下是有用的。負增益效應減小了某些測試差異度，並且與簡單地報告測量絕對值相比，可用於提高測試報告結果的重複性。
除了在連續標尺上報告測試結果(或者直接地報告所檢測分析物的數量，或者將檢測的分析物數量映射到標尺再間接地報告測量標度)之外，本發明測試方法還可用於「截止」式分析。如果可檢測標記物在分析物結合區被檢測，那麼可將測得的可檢測標記物數量與截止值相比較。截止值是高於該數值時測試就被認為陽性的數值；即，感興趣分析物在液體樣品中的存在達到了某種統計置信度。低於截止值時，測試通常被認為非陽性--或者感興趣分析物並不存在，或者本發明側流分析不能檢測到它的存在。儘管可根據直接測量值(如測得的分析物數量)來建立截止關係，但是如果數據以間接或相對標度來表示的話，那將更有意義。
陰性值和陽性值之間的區別越大，截止式側流分析越有利。陰性值是當有關分析物在統計意義上不存在時在連續標尺上的報告值。與之相反，陽性值是當有關分析物在統計意義上存在時在連續標尺上的報告值。當這些數值收斂時，能夠在統計上區分陽性和陰性的可能性就下降。
在截止處的準確度上升的截止式側流也是有利的。當在選定的截止處的變異度較小時，陽性被準確地定為陽性以及陰性被準確地定為陰性的可能性就增加。
測試結果可以被變換成上述的「相對」標度或「絕對」標度。絕對標度是以實際物理單位測量的，例如分析物的拷貝數/每毫升液體。用絕對標度表示的測量值，在測試某些疾病或病症是有優選的，例如測試癌症指標時。在這些優選例中，結果可用例如ng/ml之類的單位表示。因此，對照區具有指定濃度值的對照劑。作為相對測量概念的延伸，可以測量一系列已知分析物濃度的標準物的反射強度(density of reflectance，DR)，並如上所述計算相對於對照的強度(相對強度值)。然後，可將RI值對分析物濃度進行作圖，以建立標準曲線，在該曲線中各RI值對應於有關分析物的某個濃度值。然後，樣品的RI可在這一數值對應的標準曲線上解讀，得到用所需單位表示的結果。
如果可能，採用一種既作為分析物結合劑又作為對照劑的單一試劑是有好處的。與分析物結合劑和對照劑是不同試劑的測試方法相比，採用單一試劑的測試方法可使陰性和陽性樣品組的測量值分得更開，並且截止準確度也更高。
許多環境因素會影響側流分析的絕對反應性，其中包括(但並不限於)製造方面的變數、操作者所引入的變數、環境所引入的變數和樣品效應。使用常規的側流分析時，任何這些因素會抑制或可能提高一個測試片相對另一測試片的反應性，從而導致假陰性或假陽性結果。對於這些或其他變數沒有對照，會導致很不準確、無重複性、缺乏敏感度和缺乏測試特異性。
側流分析還會受到多種幹擾，它們會影響分析物結合劑或對照劑與測試區之間結合的絕對量。影響因素包括(1)從偶聯物墊片上釋放第二分析物結合劑或對照劑方面的差異，(2)裝置和裝置之間在分析物結合群與測試片的非特異結合方面的差異，(3)在測試過程中，因測試片或膜片材料的孔徑或分析物結合劑的非特異聚集而導致的分析物結合群通過或沿測試片移動方面的差異。因此，由這些或其他因素而導致的結合絕對測量值的差異，會在常規側流分析中高得無法接受。
通過使用一種包含了第二分析物結合劑和對照劑的單一試劑，可以減小這些類型的變數。與常規雙群式(two-population)分析相比，已暴露於對照劑的側流分析基質的任何部分，也更可能暴露於第二分析物結合劑。與常規雙群式分析相比，任何阻礙或防止對照劑沿著或通過側流基質運動的機制，也更可能阻礙或防止第二分析物結合劑的運動。第三，可以選擇對照劑以減少第二分析物結合劑的非特異結合量。
還可通過修飾分析物檢測基質的疏水性/親水性來降低非特異性結合。分析物檢測基質顆粒的聚集「自締合」現象(這會阻礙基質在測試片上的運動)，也可通過選擇性質合適的對照劑而加以減少。最終的好處在於，因為只需製備更少的試劑，所以可降低製造成本。
如本文所述，在側流分析的實踐中多個對照區可提供許多潛在好處。額外的對照區可用於擴展分析標準曲線的動態量程，而不論曲線是線性還是非線性的。多個對照區還可用於確定在給定測試中是否存在前帶或高劑量彎曲效應(hookeffect)。如果存在這種效應，那麼可建議用戶稀釋樣品以便準確地測定有關分析物的濃度。
實施例1.測試片的構造在該實施例中，描述了具有圖1和7所示設計的測試片的構造。對微孔SRHF背襯硝酸纖維素片(4.8釐米×20釐米)(膜片404)進行塗覆，即用Bio Dot XYZ3000分配平臺並且生物噴口(Biojet)的工作頻率為120Hz的情況下，以20.83nl/滴和0.5μl/cm將一個抗原條帶(測試區410)和兩個對照條帶(測試區412、414)按縱向塗於硝酸纖維素404上。然後，硝酸纖維素片404在強風溫箱中於37℃乾燥1小時，在含10mg/ml BSA、1％(w/v)PEG 8000、3％(w/v)甘露醇、0.3％(w/v)明膠、0.01％(w/v)疊氮化鈉和0.05％(w/v)十二烷基硫酸鈉的PBS溶液中封閉15分鐘。接著在強風溫箱中於37℃再乾燥1小時。塗覆的硝酸纖維素片404以乾燥形式在室溫下貯藏於箔袋中。
Gelman 8980玻璃纖維墊片被用作偶聯緩衝液墊片416，通過將其浸入PBS溶液(含10mg/ml BSA、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)而預封閉，然後在強風溫箱中乾燥2小時。用Bio Dot XYZ3000分配平臺並且單生物噴口的工作頻率為120Hz的情況下，以104.17nl/滴和2.5μl/cm將PBS(含10mg/ml BSA、1％(w/v)Triton X-100、2.5％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)中的偶聯物溶液，按縱向塗於預封閉過的偶聯緩衝液墊片416上。在偶聯緩衝液墊片416上塗覆偶聯物的圖案是每釐米2-6線，並且在每個3釐米×10釐米的墊片上塗覆3個圖案。塗覆後的偶聯緩衝液墊片416在2託和室溫下真空乾燥2小時，然後切割成1釐米×20釐米的小塊，每塊含一個圖案。
測試片是這樣製備的將一片4.8釐米×20釐米的背襯硝酸纖維素片404、一塊1釐米×20釐米的塗覆過的偶聯緩衝液墊片416和一片1.2釐米×20釐米Gelman Cytosep 1662片406固定在一片塗有粘合劑且厚0.010″的6釐米×20釐米乙烯背襯片402上(GL Precision Die Cutting)。用雙面膠409將0.5釐米寬的加樣墊片406固定在硝酸纖維素404上。用GL Precision Die Cutting的鼓式切片機，從組裝好的片材上切下0.5釐米寬的測試片。為了將測試片裝入測試盒(如圖5A所示)，將測試片置於容器的下半部分，再將0.6釐米×1.5釐米的吸收墊片408置於測試片的上方，然後將容器上半部分的插腳對準下半部分的插孔，將容器壓緊合二為一。
2.分析測試片對緩衝液添加時間和體積的依賴性用於該實施例的測試片是如實施例1中所述進行製備的。測試片在高對照條帶(測試區414)塗有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低對照條帶(測試區412)塗有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，並且在測試區410塗有II型皰疹gG2抗原(在280納米處的光密度約為0.115)。這些條帶在測試片上的次序是抗原條帶最接近偶聯緩衝液墊片，低對照區位於抗原條帶和高對照區之間，而高對照區離偶聯緩衝液墊片最遠且離吸收墊片最近。
用A蛋白-OMNITM偶聯物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，來塗覆預封閉的偶聯緩衝液墊片416，其中塗覆液的制各是通過將3份體積的偶聯物原液(OD520約為63)與1份體積的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份體積的20×PBS混合而成的。如實施例1所述，將混合物塗在預封閉的偶聯緩衝液墊片上。
測試是這樣進行的將測試盒置於實驗室長臺上，然後將體積為32.5微升、35微升、40微升、45微升或50微升的II型皰疹的中度陽性樣品705145，通過測試盒的加樣孔而加至樣品墊片406。然後，在樣品達到末端樣品流動區116後0分鐘、5分鐘或15分鐘時，將125微升偶聯緩衝液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)加至偶聯緩衝液添加區416。接著，將包含了測試片的測試盒置於的ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測抗II型皰疹抗體的ReLIATM分析並讀取數據。測試片溫度被設為40℃，並在10分鐘後對測試片進行讀數。
如圖8所示，對於35-45微升的樣品體積和高達15分鐘(測量的最長延遲時間)的孵育時間而言，II型皰疹的ReLIATM截流式測定結果與加入的樣品體積和逆流開始之前的孵育時間都無關。在該體積和孵育時間範圍內，測試結果的變差係數(CV)為12.5％。
3.II型皰疹的測試用於該實施例的測試片在高對照條帶塗有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低對照條帶塗有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，並且在抗原條帶塗有II型皰疹gG2抗原(在280納米處的光密度約為0.115)。這些條帶在測試片上的次序是，抗原條帶最接近偶聯緩衝液墊片，低對照區位於抗原條帶和高對照區之間，而高對照區離偶聯緩衝液墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例1所述，對硝酸纖維素片進行塗覆並製備測試片。
用A蛋白-OMNITM偶聯物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，來塗覆預封閉的偶聯緩衝液墊片，其中塗覆液的製備是通過將3份體積的偶聯物原液(OD520約為63)與1份體積的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份體積的20×PBS混合而成的。如實施例1所述，將混合物塗在預封閉的偶聯緩衝液墊片上。
測試是這樣進行的將測試盒置於實驗室長臺上，然後將40微升圖9所示的II型皰疹陽性或陰性樣品，通過樣本盒的加樣孔而加至樣品墊片。當樣品液體前沿達到末端樣品流動區時，將包含了測試片的測試盒置於的ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測抗II型皰疹抗體的ReLIATM分析並讀取數據。之後，將125微升偶聯緩衝液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)加至測試盒的偶聯緩衝液添加孔。測試片溫度被設為40℃，並在10分鐘後對測試片進行讀數。樣品的相對強度(RI)是根據一算法而計算出的，在該算法中將低對照反應(反射強度)的RI定為1，而將高對照反應(反射強度)的RI定為3，而零反應的RI定為0。
如圖9所示，所有的II型皰疹陽性樣品的相對強度值(RI)為0.58或更高，而所有的II型皰疹陰性樣品的RI為0.01或更低。這表明在該測試中陽性和陰性群體可很好地被區分開。
4.幽門螺旋菌(Helicobacter pylori)的測試用於該實施例的測試片在高對照條帶塗有800微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，在低對照條帶塗有200微克/毫升的兔抗-二硝基苯酚(抗-DNP)，並且在抗原條帶塗有Helicobacter pylori抗原(在280納米處的光密度約為1.157)。這些條帶在測試片上的次序是，抗原條帶最接近偶聯緩衝液墊片，低對照區位於抗原條帶和高對照區之間，而高對照區離偶聯緩衝液墊片最遠且離吸收墊片最近。如實施例1所述，對硝酸纖維素片進行塗覆並製備測試片。
用A蛋白-OMNITM偶聯物[A蛋白/BSA-DNP(2×/0.5×)]-8.5nm金，來塗覆預封閉的偶聯緩衝液墊片，其中塗覆液的製備是通過將3份體積的偶聯物原液(OD520約為63)與1份體積的PBS(含40毫克/毫升BSA、4％(w/v)Triton X-100，10％(w/v)蔗糖和1.2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K-30)和0.15份體積的20×PBS混合而成的。如實施例1所述，將混合物塗在預封閉的偶聯緩衝液墊片上。
測試是這樣進行的將測試盒置於實驗室長臺上，然後將40微升圖10所示的Helicobacter pylori陽性或陰性樣品，通過樣本盒的加樣孔而加至樣品墊片。當樣品液體前沿達到末端樣品流動區時，將包含了測試片的測試盒置於的ReLIATM儀上，該儀器已被設置好可運行檢測抗Helicobacter pylori抗體的ReLIATM分析並讀取數據。之後，將125微升偶聯緩衝液(PBS，10mg/ml BSA、0.1％疊氮化鈉和2mM EDTA)加至測試盒的偶聯緩衝液添加孔。測試片溫度被設為40℃，並在10分鐘後對測試片進行讀數。樣品的相對強度(RI)是根據一算法而計算出的，在該算法中將低對照反應(反射強度)的RI定為1，而將高對照反應(反射強度)的RI定為3，而零反應的RI定為0。
如圖10所示，所有的Helicobacter pylori陽性樣品的相對強度值(RI)為1.64或更高，而所有的Helicobacter pylori陰性樣品的RI為1.14或更低。這表明在該測試中陽性和陰性群體可很好地被區分開。
對於本領域的技術人員而言，很明顯可以在不背離本發明精神和範圍的情況下，對本發明的裝置和方法作各種改動和修改。因此，本發明覆蓋了本發明的這些改動形式，只要它們在所附權利要求或等價形式的範圍內。此外，下列實施例是為了闡明提出要求保護的本發明，而不是用於限制要求保護的本發明的範圍。
權利要求
1.一種測試片，它適於接受樣品並檢測其中的分析物，其特徵在於，該測試片包括可加入樣品的加樣區；位於加樣區近端的吸收區；一個或多個位於加樣區遠端的測試區，其中至少一個測試區包含固定化的第一分析物結合劑，該結合劑能夠結合於待檢測的分析物；和位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試片的其他區域而言具有吸收能力，從而使得加至加樣區的樣品遠端擴散前沿從加樣區擴散至末端樣品流動區中的遠端擴散點，然後逆轉方向並擴散至相對於一個或多個測試區的近端。
2.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為10-250微升的樣品。
3.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為20-100微升的樣品。
4.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為30-50微升的樣品。
5.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，末端樣品流動區從近端至遠端的長度約為3-10毫米。
6.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，第一分析物結合劑除了結合於分析物之外，並不結合於樣品中的其他組份。
7.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，第一分析物結合劑選自下組抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物結合位點的抗原的異源混合物的裂解物、配體和受體。
8.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，測試區還含有至少一個對照區，在對照區中固定有對照結合劑。
9.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，測試區還含有第一對照區，在第一對照區中固定有對照結合劑，和第二對照區，在第二對照區中固定有與第一對照區相同的對照結合劑，而第一對照區和第二對照區中對照結合劑的含量不同。
10.如權利要求1所述的測試片，其特徵在於，測試片還包括位於末端樣品流動區遠端的、含有第二分析物結合劑的區域，該第二分析物結合劑能夠結合於分析物並能擴散至一個或多個測試區。
11.如權利要求10所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑能夠結合於樣品中除分析物之外的組份。
12.如權利要求10所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑並不與樣品中除分析物之外的組份結合。
13.如權利要求10所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑被可檢測標記物所標記。
14.如權利要求10所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑被附著於能夠擴散至一個或多個測試區的顆粒上。
15.一種測試片，它適於接受預定體積範圍的樣品並檢測其中的分析物，其特徵在於，該測試片包括可加入樣品的加樣區；位於加樣區近端的吸收區；一個或多個位於加樣區遠端的測試區，其中至少一個測試區包含固定化的第一分析物結合劑，該結合劑能夠結合於待檢測的分析物；位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，吸收區的位置與加樣區相對而且吸收區相對測試片的其他區域而言具有吸收能力，從而使得按預定體積範圍加至加樣區的樣品的遠端擴散前沿，從加樣區擴散至末端樣品流動區中的遠端擴散點，然後擴散至相對於一個或多個測試區的近端；和可加入偶聯緩衝液的、位於末端樣品流動區遠端的偶聯緩衝液添加區。
16.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為10-250微升的樣品。
17.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為20-100微升的樣品。
18.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，該測試片適於接受預定體積範圍約為30-50微升的樣品。
19.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，末端樣品流動區從近端至遠端的長度約為3-10毫米。
20.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，第一分析物結合劑除了結合於分析物之外，並不結合於樣品中的其他組份。
21.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，第一分析物結合劑選自下組抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物結合位點的抗原的異源混合物的裂解物、配體和受體。
22.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，測試區還含有至少一個對照區，在對照區中固定有對照結合劑。
23.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，測試區還含有第一對照區，在第一對照區中固定有對照結合劑，和第二對照區，在第二對照區中固定有與第一對照區相同的對照結合劑，而第一對照區和第二對照區中對照結合劑的含量不同。
24.如權利要求15所述的測試片，其特徵在於，測試片還包括位於末端樣品流動區遠端的、含有第二分析物結合劑的區域，該第二分析物結合劑能夠結合於分析物並能擴散至一個或多個測試區。
25.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑能夠結合於樣品中除分析物之外的組份。
26.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑並不與樣品中除分析物之外的組份結合。
27.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑被可檢測標記物所標記。
28.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，第二分析物結合劑被附著於能夠擴散至一個或多個測試區的顆粒上。
29.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，含有第二分析物結合劑的區域位於偶聯緩衝液添加區的近端。
30.如權利要求24所述的測試片，其特徵在於，含有第二分析物結合劑的區域是偶聯緩衝液添加區。
31.權利要求15所述的測試片，其特徵在於，偶聯緩衝液添加區的位置與測試區相對，從而使得在將樣品加至加樣區的同時被加至偶聯緩衝液添加區的偶聯緩衝液，會在樣品遠端擴散前沿已擴散至遠端擴散點並已開始向近端方向擴散之後，才達到遠端擴散點。
32.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，偶聯緩衝液添加區的位置與測試區相對，從而使得在將樣品加至加樣區的同時被加至偶聯緩衝液添加區的偶聯緩衝液，會在樣品遠端擴散前沿相對於測試區向近端擴散之後，才達到測試區。
33.一種檢測樣品中分析物的方法，其特徵在於，它包括將樣品輸送至測試片，使得樣品遠端擴散前沿(a)向遠端方向擴散至一個或多個測試區，其中至少一個測試區含有固定於其中的第一分析物結合劑，該第一分析物結合劑與樣品中的分析物結合，(b)擴散至位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區，和(c)擴散至位於一個或多個測試區近端的位置；將偶聯緩衝液輸送至測試片上位於末端樣品流動區遠端的位置，輸送偶聯緩衝液導致第二分析物結合劑向近端擴散通過末端樣品流動區，並且在樣品遠端擴散前沿向一個或多個測試區的近端擴散之後擴散至一個或多個測試區，第二分析物結合劑與被固定於測試區的分析物結合；和檢測被固定於測試區的第二分析物結合劑。
34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，偶聯緩衝液是在將樣品加至測試片的同時被加至測試片上的。
35.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，偶聯緩衝液是在將樣品加至測試片之前被加至測試片上的。
36.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，偶聯緩衝液是在將樣品加至測試片之後被加至測試片上的。
37.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第一分析物結合劑除了與分析物結合之外，並不結合於樣品的其他組份。
38.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第一分析物結合劑選自下組抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、含具有分析物結合位點的抗原的異源混合物的裂解物、配體和受體。
39.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑被包含在測試片上輸送偶聯緩衝液的區域，而輸送偶聯緩衝液會導致第二分析物結合劑的擴散。
40.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑被包含在測試片上並位於輸送偶聯緩衝液區域的近端，而且輸送偶聯緩衝液會導致第二分析物結合劑的擴散。
41.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，將偶聯緩衝液輸送至測試片包括將包含在偶聯緩衝液中的第二分析物結合劑輸送至測試片。
42.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，測試區可包含其中固定有對照結合劑的第一對照區，輸送偶聯緩衝液導致對照劑向近端擴散通過末端樣品流動區而達到第一對照區，並且結合於其中所固定的對照結合劑。
43.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，測試區包含第一和第二對照區並且各對照區含有不同數量的被固定的對照結合劑，輸送偶聯緩衝液導致對照劑向近端擴散通過末端樣品流動區而達到第一和第二對照區，並且結合於其中所固定的對照結合劑。
44.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑能結合於樣品中除分析物之外的組份。
45.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑不結合於樣品中除分析物之外的組份。
46.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑被可檢測標記物所標記，而檢測第二分析物結合劑包括檢測可檢測標記物。
47.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，第二分析物結合劑被附著於顆粒，檢測第二分析物結合劑包括檢測該顆粒。
全文摘要
提供了一種適於接受樣品並檢測其中分析物的測試片。該測試片包括:加入樣品的加樣區;位於加樣區近端的吸收區;一個或多個位於加樣區遠端的測試區,其中至少一個測試區包含固定化的、能夠結合於待檢測的分析物的第一分析物結合劑;和位於一個或多個測試區遠端的末端樣品流動區,吸收區的位置與加樣區相對且相對測試片的其他區域而言具有吸收能力,從而使得加至加樣區的樣品遠端擴散前沿從加樣區擴散至末端樣品流動區中的遠端擴散點,再逆轉方向並擴散至一個或多個測試區的近端。
文檔編號G01N33/543GK1277357SQ9912614
公開日2000年12月20日 申請日期1999年12月10日 優先權日1999年6月14日
發明者R·M·塞耶, A·J·波利託, R·K·德尼羅, G·H·謝拉, H·J·威克 申請人:普萊克斯生物系統股份有限公司