基於綠色螢光蛋白檢測細胞凋亡的方法

2023-10-11 06:35:59 2

專利名稱：基於綠色螢光蛋白檢測細胞凋亡的方法
技術領域：
本發明涉及用於檢測細胞凋亡或檢測細胞程序性死亡的組合物和方法。
背景技術：
在本發明公開的內容中，不同的文獻通過第一作者和日期，在括號內的，專利號或文獻號被引用。完整的文獻引用被提供在本申請的末尾用於參考。這些文獻的內容通過引用被合併到本申請中用來更全面的描述本申請的相關技術。
細胞凋亡，也稱為細胞程序死亡(「PCD」)，是在維持生物體的正常生理功能中起重要作用的非常重要的細胞過程[1，2]。例如，當DNA在細胞中被損傷且不能被修復時，細胞將進入細胞凋亡來避免在組織中形成畸形變態。此外，細胞凋亡過程被用於胸腺中來去除自我反應的T細胞從而來避免自身免疫。細胞凋亡必需被精確地調控來維持我們機體的正常功能。例如激活細胞凋亡的失敗可引起癌症或自身免疫病[3]。另一方面，細胞凋亡的激活過度可導致有機體的巨大的損傷；其可導致很多的神經變性疾病例如亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease)和阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease)[4，5]。
由於很多重要的疾病，包括癌症，AIDS，自身免疫疾病以及神經變性疾病與細胞凋亡的不足或過度有關，能夠啟動或阻止細胞凋亡的藥物在治療很多的疾病中均是非常有用的。因此，在分子基礎上研究細胞凋亡的過程是非常有意義的。指示細胞凋亡過程的信號途徑是非常複雜的[6-8]。很多外部信號可以引發細胞凋亡的開始，包括UV照射，「死亡區域」通過TNF(腫瘤壞死因子)受體的激活，激素(例如，腎上腺皮質激素)治療或化學療法藥物(例如，喜樹鹼)[6-9]。同樣作為內部信號，已知細胞凋亡是細胞內事件程序性級聯的結果，其主要激活一類稱為半胱天冬酶(caspases)的半胱氨酸蛋白酶[7，10]。半胱天冬酶是死亡蛋白酶且彼此之間是異體同型的。它們在進化中是高度保守的且被發現可存在於從人到昆蟲，線蟲和水螅中[23-25]。在人體超過一打的半胱天冬酶已被鑑定，其中的三分之二被確信在細胞凋亡中行使功能[25，26]。
所有已知的半胱天冬酶具有一個活性位點半胱氨酸且在Asp-Xxx鍵處裂解底物。每一種半胱天冬酶的顯著的特性通過裂解位點的4個殘基氨基末端被檢測[27]。半胱天冬酶被依據底物特異性，序列同源性以及結構相似性的程度被分成亞族。綜述細胞凋亡的生物化學和半胱天冬酶的作用參見Hengartner，M.(2000)自然(Nature)407770-776。
目前，存在很多技術可以檢測細胞凋亡在不同階段的作用。例如，細胞凋亡的終止階段可通過細胞的形態學變化被測定(例如存在凋亡體(apoptotic bodies))。在此之前，細胞凋亡可通過利用凝膠分析或TUNEL技術的DNA斷裂來被檢測[11]。細胞凋亡的早期階段可通過Annexin V-FITC標記的蛋白[12]檢測PS(磷脂醯絲氨酸)在膜中的轉移來測定，或通過檢測半胱天冬酶-3利用螢光染料連接到底物肽上的激活來測定[13]。然而所有的這些技術具有特定的局限性，例如凝膠分析僅被用於細胞的提取物，而不能用於單個細胞或完整的細胞。TUNEL方法僅僅可被應用於固定化細胞，而不是活的細胞。Annexin V僅僅檢測外細胞表面而不是細胞內的情況。利用連接螢光染料肽的半胱天冬酶探針也具有其自己的局限性。首先，此探針不能穿透細胞膜，典型的其用於測定細胞提取物。其不能夠進行體內測定。其次，半胱天冬酶裂解產生的螢光變化主要包括染料發射譜的遷移而不是螢光的全部破壞。其敏感性是有限的。因此，需要一種有效和精確的組合物和方法來檢測程序性細胞死亡。本發明滿足了這種需求並同時提供了相關的優點。
本發明也提供了實現可更好理解細胞凋亡的調控機制的研究以及有助於發現和改進新藥來克服很多重要疾病的工具。

發明內容
目前，人們強烈地需要改進有效的方法來檢測活細胞中的細胞凋亡過程的激活。本發明的檢測方法基於的事實是程序性細胞死亡涉及一系列胞內稱為「半胱天冬酶」的細胞內蛋白酶，這些半胱天冬酶的底物通常共享稱為「底物序列」的共有序列識別和裂解胺基酸序列。通過遺傳工程技術，分子探針被製備來通過插入編碼底物序列的基因到連接兩種不同顏色的螢光蛋白分子且顯示螢光共振能量轉移(FRET)特性的連接頭上測定半胱天冬酶活性。當此改造的基因在細胞中表達時，其基因產物(例如探針的蛋白)是特異性半胱天冬酶的底物且在激活的基礎上被半胱天冬酶裂解。在細胞裂解之後，探針的FRET特性被破壞。因此，半胱天冬酶的激活通過調控螢光探針的螢光特性的變化被檢測。
與傳統的檢測細胞凋亡的技術不同，本發明提供了一種高度敏感性但簡單的早期檢測細胞凋亡的方法。本發明分子探針的改進利用三種不同的技術，其中的一些僅最近才被利用。其為(1)GFP技術的改進，(2)半胱天冬酶家族的已知底物序列，以及(3)FRET(螢光共振能量轉移)方法。
本發明提供了一種用於檢測蛋白酶和半胱天冬酶激活的細胞凋亡的螢光蛋白構建體。構建體含有一個供體螢光蛋白，一個受體螢光蛋白，和一個在受體和供體之間的連接肽。連接肽含有半胱天冬酶的底物序列。本發明也提供了編碼螢光蛋白構建體的核酸，含有核酸的表達載體以及含有這些核酸的基因傳遞載體。
這些組合物在檢測半胱天冬酶和蛋白酶激活的細胞凋亡地方法中是有用的，通過在適於刺激供體螢光蛋白的條件下培養含有上述核酸和/或蛋白的宿主細胞樣本並檢測樣本中的螢光特性，其中存在細胞凋亡的樣本細胞在供體蛋白和受體蛋白之間產生螢光共振能量轉移的程度的變化。


圖1顯示了inter-GFP(「GFP」)探針設計的原理。此探針通過一個含有半胱天冬酶的底物序列的短肽(在此稱為「傳感蛋白」)連接一個藍綠色的綠色螢光蛋白分子(CFP)與黃色GFP分子(YFP)來構建。當這兩種GFP分子被連接在一起時，螢光共振能量轉移現象就發生了。當細胞進入細胞凋亡時，激活的半胱天冬酶裂解了連接兩個GFP分子的底物肽(例如「傳感蛋白」)。當兩種GFP分離時，就沒有FRET發生了。
圖2顯示了純化的重組FRET探針的SDS-PAGE分析。多組氨酸標記FRET融合蛋白在細菌中表達並通過Ni-NTA柱純化。每一含有大約5.2μg蛋白的樣本被通過12％SDS-PAGE凝膠電泳分析，然後用考馬斯藍染色。
圖3A和圖3B顯示半胱天冬酶-3裂解的Western印跡分析。純化的FRET探針與半胱天冬酶-3一起在反應緩衝液中於37℃溫育1-2小時。反應混合物用SDS-PAGE分離並轉到硝化纖維膜上。蛋白條帶然後用抗-GFP抗體(Clontech)探針檢測。CHO(AC-DEVD-CHO)，是半胱天冬酶-3特異性抑制劑。
圖4A～圖4C顯示了半胱天冬酶-3處理改變了傳感蛋白A和B的發射譜。通過分光螢光計(SPEX 1681)掃描譜分析測定每一探針的螢光發射譜。用於激發探針中CFP的波長為433nm。-cpp32在反應中沒有半胱天冬酶-3。+cpp32半胱天冬酶-3被加到反應中。
圖5顯示了劑量依賴性的半胱天冬酶-3裂解試驗。相同量的純化的傳感蛋白A和傳感蛋白B蛋白與從0.3125ng到1.28μg範圍的不同量的半胱天冬酶-3溫育1小時。在反應的終止處通過分光螢光計測定每一樣本的YFP和CFP的發射譜。每一樣本的發射比率(YFP/CFP)依據沒有半胱天冬酶-3的空白對照的比率被標準化。
圖6顯示了UV處理的HeLa細胞的傳感蛋白A的圖像分析。表達傳感蛋白A和CFP-YFP融和蛋白的HeLa細胞被通過UV照射5分鐘誘導細胞凋亡。當探針在440nm激活時，相同細胞的在UV處理前(A，C)和處理後(B，D)的CFP(480±15nm)和YFP(535±12.5nm)的螢光強度通過冷卻的CCD成像系統記錄。YFP/CFP的代表性的比率的圖像顯示在此。顯著的FRET減少僅在表達傳感蛋白A的兩個細胞的B區觀察到，而沒出現在表達對照融和蛋白的細胞的D區中。
圖7是在細胞凋亡的過程中FRET變化的統計分析。圖像被記錄在圖6中。YFP和CFP的螢光強度被從每一個圖像測定。來自13個表達傳感蛋白A的細胞和9個表達CFP-YFP融和蛋白的細胞的UV照射前和照射後的YFP/CFP的平均值被圖示在此。在表達傳感蛋白A的apoptotic細胞中通過FRET探針檢測發現有4倍的減少而在表達CFP-YFP融和基因的對照細胞中沒有發現。
圖8是Western印跡的結果，其表明純化的傳感蛋白C8和C8A蛋白(210nM)能夠被兩種不同的濃度(86nM和216nM)的半胱天冬酶-8裂解。YFP的位置和多組氨酸標記的CFP用箭頭表示。
圖9是劑量依賴性半胱天冬酶-8裂解實驗。固定量的純化傳感蛋白C8和C8A蛋白(22.45nM)與不同量的半胱天冬酶-8一起溫育1小時。每一樣本的發射譜在反應終止時用分光螢光計測定(激發波長433nm)。發射比率(YFP526nm/CFP480nm)依據沒用半胱天冬酶-8處理的對照樣本的值進行標準化。
具體實施例方式
本發明的實施，除非另有說明，利用常規的分子生物學(包括重組技術)，微生物學，細胞生物學，生物化學和免疫學的技術，其是本領域技術人員所公知的。這些技術具體的被闡述在文獻中。這些方法被描述在下列文獻中。參見，例如，Sambrook等，分子克隆(MOLECULAR CLONING)實驗室手冊，第二版(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等eds.(1987))；叢書METHODS IN ENZYMOLOGY(學院出版社，Inc.)；PCRA PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson等，IRL Press at Oxford University Press(1991))；PCR 2APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))；ANITBODIES，實驗室手冊(Harlow和Lane eds.(1988))；和ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney ed.(1987))。
定義在此處所用的特定的術語具有下面所定義的含義。
在本說明書中，單數形式″a″，″an″和″the″包括複數含義除非上下文清楚地顯示其它的含義。例如，術語「一種細胞」包括多種細胞，包括其混合物。
此處所用的術語「包含」是指組合物和方法包含所列舉的基本要素，而不包括其它的。當「基本上含有」被用於定義組合物和方法時，將排除組合的任意基本含義的其它要素。因此，在此定義的一種組合物基本上含有要素將不排除來自分離和純化方法的痕量汙染物以及藥理上可接受的載體，例如磷酸鹽緩衝液，防腐劑等等。「含有」意味排除多種其它成分的痕量元素以及用於實施本發明組合物的基本的方法。通過這些術語限定的實施方案在本發明的範圍之內。
術語「多核苷酸」和「核酸」可選擇的指任意長度核苷酸的聚合的形式。聚核苷酸可包含脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，和/或其類似物。核苷酸可具有任意三維結構，以及可執行任意已知或未知的功能。術語「多核苷酸」包括，例如，單，雙鏈和三螺旋分子，基因或基因片段，外顯子，內含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重組多核苷酸，分支多核苷酸，質粒，載體，分離的任意序列的DNA，分離的任意序列的RNA，核酸探針，以及引物。核酸分子也可包括修飾的核酸分子。
被用於其用作廣泛的含義的術語「肽」是指兩或更多亞單位胺基酸，胺基酸類似物，或擬肽(peptidomimetics)的複合物。亞單位可被肽鍵連接。在另一個實施方案中，亞單位可被其它的鍵連接，例如，酯，醚等。此處所用的術語「胺基酸」是指天然和/或非天然或合成的胺基酸，包括，甘氨酸和D或L光學異構體二者，和胺基酸類似物和擬肽(peptidomimetics)。三或更多胺基酸的肽如果肽鏈很短通常被稱為寡肽。如果肽鏈是長的，肽通常被稱為多肽或蛋白。
術語「遺傳修飾」是指含有和/或表達一個外源基因或核酸序列其依次修飾細胞或其子代的基因型或表現型。換句話說，其指細胞內源核苷酸的任意增加，刪除或破壞。
此處所用的「表達」是指多核苷酸被轉錄成mRNA並被翻譯為肽，多肽，或蛋白質的過程。如果多核苷酸來自基因組DNA，表達可包括mRNA的剪接，如果適當的真核宿主被選擇。表達所需的調控元件包括啟動子序列來結合RNA聚合酶以及轉錄啟動序列來用於核糖體結合。例如，一個細菌表達載體包括一個啟動子例如lac啟動子來用於轉錄啟動Shine-Dalgarno序列以及啟動密碼子AUG(Sambrook等(1989)見上文)。類似的，一個真核表達載體包括RNA聚合酶II的異源或同源啟動子，一個下遊的多腺苷酸信號，啟動密碼子AUG和分離核糖體的終止密碼子。此種載體可通過商業途徑獲得或通過本領域公知的序列來合成，例如，下面所述的常規的用於構建載體的方法。
「啟動子」是DNA分子上的一個RNA聚合酶結合和啟動轉錄的區域。啟動子的核苷酸序列決定結合於其上的酶的特性和RNA合成的速率。在本發明中，術語「啟動子」是指多核苷酸其不僅包括RNA聚合酶接合位點而且包括所有其它鄰近的與調控轉錄啟動例如阻遏或誘導轉錄的因子相互作用的序列元件。因此，此處所定義的「啟動子」，是一個多核苷酸其包含所有的以相同於染色體中的天然元件的方式調控基因表達所需要的序列信息。
「在轉錄調控下」是本領域共知的術語，其表明多核苷酸序列通常為DNA序列的轉錄，依賴於其被可操作的連接於有助於啟動的元件或啟動子轉錄。「可操作地連接於」是指元件中的排列為允許其行使功能的方式。
術語「表達構建」是指一個含有啟動子元件的多核苷酸可操作地連接於一個基因。表達構建可通過多種方式，例如子基因傳遞載體中或被插入到細胞的染色體中。此術語也指通過任意方法包括但不限於重組DNA技術，同源重組，基因或啟動子元件的靶插入或基因或啟動子元件的隨機插入產生的啟動子-基因融合。
「基因傳遞載體」被定義為可以攜帶被插入的多核苷酸到宿主中的任意分子。基因傳遞載體的例子為脂質體，生物相容的聚合物，包括天然的聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人工的病毒外殼；金屬粒子；和細菌，病毒，例如杆狀病毒，腺病毒和逆轉錄病毒，噬菌體，質粒，真菌載體和其它的本領域所用的典型的重組載體，其已被描述用於在各種真核和原核宿主中的表達，以及可被用於基因治療和簡單蛋白表達。
「基因傳遞」，「基因轉移」等類似術語是指外源多核苷酸(有時是指「轉基因」)到宿主細胞中的導入，其與所用的導入方法無關。此方法包括各種已知的技術例如載體介導的基因轉移(通過例如，病毒感染/轉染，或各種其它的基於蛋白或基於脂類的基因傳遞的複合方法)以及促進「裸」多核苷酸傳遞的技術(例如，電穿孔，「基因槍」傳遞和不同的其它用於多核苷酸導入的技術)。導入的多核苷酸可以穩定的或短暫的維持在宿主細胞內。穩定的維持典型地要求導入的多核苷酸含有一個複製區域其與宿主細胞相容或被整合到宿主細胞的複製子中例如非染色體複製子(例如，質粒)或核的或線粒體染色體。如本領域和此處所述的，已知大量的載體能夠介導基因傳遞到哺乳動物細胞中。
「病毒載體」被定義為重組產生的含有通過體內，來自體內(ex vivo)或體外被傳遞到宿主細胞中的多核苷酸的病毒或病毒粒子。病毒載體的例子包括逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體及其類似物。其中的基因轉移被介導通過逆轉錄病毒載體，含有逆轉錄基因組或其部分的多核苷酸的載體構建體，和一個轉基因。此處的「逆轉錄病毒介導的基因轉移」或「逆轉錄病毒轉導」具有相同的含義其是指通過利用病毒進入細胞並整合其染色體組到宿主染色體組的能力將基因或核酸序列穩定的轉移到宿主細胞中的過程。病毒進入宿主細胞通過其正常的感染機制或被修飾結合不同的細胞受體或配體來進入細胞。此處所用的逆轉錄病毒是指能夠通過病毒或類病毒侵入機制導入外源核酸到細胞中的病毒粒子。
逆轉錄病毒以RNA的形式攜帶其遺傳信息，RNA被逆轉錄成為DNA的形式整合到被感染細胞的基因組DNA中。被整合的DNA形式被稱為原病毒。
一方面，其中的基因轉移被DNA病毒載體，例如腺病毒(Ad)或腺伴隨病毒(AAV)，載體構建體，是指含有病毒基因組或其部分的多核苷酸，和轉基因介質。腺病毒(Ads)是具有相關的特徵，同源性的病毒組，包括超過50個血清型。參見，WO 95/27071。Ads較容易的生長且不需要整合到宿主細胞基因組中。重組體來源於Ad的載體，尤其是這些減少重組可能性和野生型病毒的產生的載體已被構建。參見WO 95/00655和WO 95/11984。野生型AAV具有高度的整合到宿主細胞基因組中的感染性和特異性。參見Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Nati.Acad.Sci.USA 816466-6470以及Lebkowski等(1988)分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)83988-3996。
含有一個啟動子和一個被可操作地連接於多核苷酸的克隆位點的載體是本領域公知的。此載體能夠在體外或體內轉錄RNA，且可從例如Stratagene(La Jolla，CA)和Promega Biotech(Madison，WI)購買到。為了優化表達和/或體外轉錄，其可能有必要去除、增加或改變5′和/或3′的克隆的未翻譯部分來除去額外的、可能的不適當的可選擇的啟動密碼子或其它的在轉錄或翻譯水平作用於或減少表達的序列。可選擇的，共有核糖體結合位點可被插入在起始密碼子的5』末端來增強表達。
基因傳遞載體也包括一些非病毒載體，包括DNA/脂質體複合體，以及靶向病毒蛋白-DNA複合物。含有靶向抗體或其片段的脂質體可被用於本發明的方法中。為了增強傳遞到細胞，本發明的核酸或蛋白可被結合於抗體或結合細胞表面抗原的抗體結合片段，例如，TCR，CD3或CD4。
此處所用的「報導基因」是一個編碼被可被檢測和測數的細胞所表達的蛋白的多核苷酸。因此，測定的報導分子的表達水平是使報導基因的表達的啟動子元件的激活水平的指標。
「雜交」是指一個反應，其中的一或多個多核苷酸反應來形成複合體其通過核苷酸殘基之間的氫鍵被穩定化。氫鍵可通過Watson-Crick鹼基配對，Hoogotein結合，或以任意的其它序列特異性方式來產生。複合體可包括兩條鏈形成的雙螺旋結構，三或更多鏈形成的複合鏈結構，一個單鏈自我雜交鏈，或這些的任意組合。雜交反應可在更廣的方法中構成為一個步驟，例如，PCR反應的啟動，或多核苷酸被核酶的酶解。
嚴格雜交條件的例子包括大約25℃到37℃的溫育溫度；大約6×SSC到大約10×SSC的雜交緩衝液濃度。大約0％到25％的甲醯胺濃度；以及大約6×SSC的洗滌液。溫和的雜交條件包括大約40℃到50℃的溫育溫度；大約9×SSC到2×SSC的緩衝液濃度；大約30％到50％的甲醯胺濃度；以及5×SSC到大約2×SSC的洗滌濃度。高度嚴格的雜交條件包括大約55℃到68℃的溫育溫度；大約1×SSC到0.1×SSC的緩衝液濃度；大約55％到75％的甲醯胺濃度；以及1×SSC到大約0.1×SSC的洗滌濃度，或去離子水。通常雜交時間為5分鐘到24小時，用一個、兩個或更多的洗滌步驟，以及溫育時間為大約1，2，或15分鐘。SSC是0.15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩衝液。可以理解，使用其它緩衝體系的SSC的等價物可被使用。
多核苷酸或多核苷酸區域(或多肽或多肽區域)與另一個序列具有特定(例如，80％，85％，90％，或95％)的「序列同一性」是指，當比對時，比較的兩個序列的相同鹼基(胺基酸)的百分比。此比對和百分比同源性或序列同一性可通過本領域已知的軟體來測定，例如這些描述在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等，eds.，1987)增刊30，7.7.18部分，表7.7.1。優選的用於多核苷酸和多肽序列比對來測定百分比同源性的程序是CLUSTALW，使用預設的參數。此程序可獲自全球資訊網的很多站點例如位於聖路易斯(Saint Louis)的華盛頓大學的生物計算學院的網站，MO(www.ibc.wustl.edu/msa/clustal.html)，德克薩斯州休斯敦醫學Baylor學院的人類基因組測序中心(Human GenomeSequencing Center)，(dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及法國巴黎的巴斯德研究院(bioweb.pasteur.fr/seqanal/Interfaces/clustalw-simple.html)。
多核苷酸的「生物學等價物」被通過序列比對程序在預設參數下測定的具有至少75％，或至少80％，或至少90％，或至少95％序列同一性，糾正序列數據的二義性以及在不改變功能的核苷酸序列中改變被表徵的。「生物學等價物」多核苷酸也可通過在溫和或嚴格條件下雜交被分離。除了序列相似性或與參照的多核苷酸雜交之外，生物學等價物多核苷酸與參照的多核苷酸具有相同或相似的生物學功能。
各種軟體程序是本領域可獲得的，其用來鑑定生物學等價物多核苷酸而不需要大量的試驗。這些程序的非限制性的例子為BLAST家族程序包括BLASTN，BLASTP，BLASTX，TBLASTN，以及TBLASTX(BLAST可獲自全球資訊網http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，FastA，Compare，DotPlot，BestFit，GAP，FrameAlign，ClustalW，以及PileUp。這些程序可以是從市場上獲得的綜合的序列分析程序軟體包例如GCG Inc.的Wisconsin軟體包。其它的類似分析和比對程序可從不同的供應商購買例如DNA Star′s MegAlign，或GeneJockey比對程序。可選擇的，序列分析和比對程序可通過全球資訊網來使用，例如在www.sdsc.edu/ResTools/cmshp.html的CMSMolecular Biology Resource。任意的含有與基因或其片段相應的DNA或蛋白序列的序列資料庫可以被使用來用於序列分析。通常使用的資料庫包括但不限於GenBank，EMBL，DDBJ，PDB，SWISS-PROT，EST，STS，GSS，和HTGS。序列相似性可以通過比對靶序列和DNA序列資料庫來辨別。可選擇的，靶序列可被轉換為六個閱讀框；所有可能的閱讀框的預知肽序列然後被與儲存在蛋白資料庫中的各個序列比較例如利用BLASIX程序。
用於檢測同源性程度的上述比對程序的一或多個參數在本領域是確定的。其包括但不限於p值，百分比序列同一性和百分比序列相似性。p值是比對偶然產生的概率。對一個單一的比對來說，p值可通過Karlin等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872246被計算。對於多重比對來說，p值可通過利用啟發式方法例如BLAST中的一個程序被計算。百分序列同一性通過在查詢的序列和已知序列最佳比對時的核苷酸或胺基酸匹配的數目的比被定義。百分序列相似性通過與百分同一性相同的方式來計算除了一種計分的胺基酸，當計算百分相似性時其是不同的但是相似的。
「體內」基因傳遞，基因轉移，基因治療等術語是指含有外源多核苷酸的載體直接導入到生物體體內，例如人類或非人哺乳動物，由此外源多核苷酸被體內導入到此生物體的細胞中。
術語「分離的」是指分離自組分，細胞以及其它的方式，其中的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段，通常是天然產生的。例如，對於多核苷酸而言，分離的多核苷酸是分離自與染色體正常相連的5′和3′序列。對本領域技術人員是顯而易見的是，非天然產生的多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段，不需要「分離」來區別其與天然產生的相應物。此外，「濃縮的」，「單獨的」，「稀釋的」多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段被區別於天然產生的對應物，其每體積分子的濃度或數量與其天然產生的對應物相比大於「濃縮的」或小於「單獨的」。多核苷酸，肽，多肽，蛋白，抗體，或其片段其在基本序列上區別於天然產生的對應物，或通過其糖基化形式，不需要其是存在於分離的形式由於其通過基本序列或可選擇的，通過另外的特徵例如糖基化形式被區別於其天然產生的對應物。儘管沒有詳述本發明在此公開的每一內容，可以理解所有用於描述下文公開的組合物和適當條件的上述實施方案，被本發明所提供。因此，非天然產生的多核苷酸被提供作為來自分離的天然產生的多核苷酸的單獨的實施方案。在細菌細胞中產生的蛋白被提供作為來自分離自真核細胞的天然產生的蛋白的獨立的實施方案，其中的細胞是自然產生的。
「宿主細胞」，或「基因修飾細胞」趨向於包括任意單獨的細胞或細胞培養物，其可是載體或是載體的受體或包含外源核酸分子，多核苷酸和/或蛋白。其也包括單細胞的子代，且子代由於自然，偶然的，或定向的突變可能不是與起始的親代細胞完全相同(在形態學或基因組或總DNA補體上)。細胞可以是原核的或真核的，且包括但不限於細菌細胞，酵母細胞，動物細胞，以及哺乳動物細胞，例如鼠科動物，鼠，猿或人類的。
「受試者」是脊椎動物，優選哺乳動物，更優選為人類。哺乳動物包括，但不限於，鼠科動物，猿，人類，農田動物，戶外動物，和寵物。
「對照」是在實驗中用於比較的目的的可選擇的受試者或樣本。對照可以為「陽性的」或「陰性的」。例如，當實驗的目的是檢測基因的改變的表達水平與癌症的特定表型的關係時，通常優選使用一個陽性對照(攜帶此種變化並顯示該疾病的綜合症狀的特性的受試者或來自受試者的樣本)，和一個陰性對照(缺少改變的表達和該病的臨床症狀的受試者或來自受試者的樣本)。
術語「培養」是指細胞或生物體在不同類型培養基上或其中的體外繁殖。可以理解在培養基上生長的細胞子代可能與親代細胞不完全相同(形態學，遺傳學，或表型)。「放大」是指細胞的任意增殖或分裂。
「組合物」是指活性因子和其它化合物或組合物，惰性(例如，可檢測的試劑或標記)或活性劑，例如助劑的組合。
「藥物組合物」是指包括活性劑與載體，惰性劑或活性劑的組合產生適於體體，外內或來自體內的診斷或治療用途的組合物。
此處所用的術語「藥學上可接受的載體」包含任意的標準的藥物載體，例如磷酸緩衝鹽溶液，水，和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各種類型的潤溼劑。此組合物也可包含穩定劑和防腐劑。例如，載體，穩定劑和助劑，參見Martin REMINGTON′S PHARM.SCI，15th Ed.(Mack Pubi.Co.，Easton(1975))。
「有效量」是指產生有益作用的或所期望的結果的充分的量。有效的量可以一或多種給藥方式應用方法或劑量被給藥。
綠色螢光蛋白(GFP)是一種非常有用的蛋白，其在過去幾年的細胞和分子生物學的研究中有非常大的應用。GFP最初由Shimomura等人在1962年發現在水母Aequorea victoria中[14]且其基因被Prasher等人在1992年克隆和測序[15]。GFP分子含有通過設計三種胺基酸的氧依賴性環化反應產生的螢光團[16]。最近，人們發現GFP基因可在大量的細胞中表達來產生內源的螢光蛋白，而不需要外源的底物或輔酶[16-18]。利用這種內源螢光特性，GFP已成為用於研究基因表達的調控的強有力的工具。其也被用作融合標記來監視蛋白定位和在活細胞中的運動[16-18]。
本發明提供了基於GFP的分子探針，其對蛋白酶是更具體的，不同點的半胱天冬酶是敏感的。每種半胱天冬酶具有獨特的識別和裂解的胺基酸序列(例如，「底物序列」)[19]。例如，半胱天冬酶-3的底物序列是DEVD(Asp-Glu-Val-Asp)。表1列舉了幾種半胱天冬酶及其底物序列。
表1蛋白酶別名 識別/裂解序列蛋白質底物半胱天冬酶-1 ICE Try-Val-Ala-Aap(YVAD)Pro-IL-1β半胱天冬酶-2 ICH-1/Nedd2 Asp-Glu-His-Asp(DEHD)PARP半胱天冬酶-3 CPP32/Yama/apopainAsp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，DNA-PK，SREBP1，2，rho-G半胱天冬酶-4 TX/ICH-2./ICEre1-II Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-5 TY/ICEre1-III Trp/Leu-Glu-His-Asp(W/LEHD)半胱天冬酶-6 Mch2 Val-Glu-His-Asp(VEHD)Lamin A半胱天冬酶-7 Mch3/ICE-LAP3/CMH-1 Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP，pro-半胱天冬酶6，SREBP1，2半胱天冬酶-8 MACH/FLICE/Mch5 Leu-Glu-Thr-Asp(LETD)PARP半胱天冬酶-9 ICE-LAP6/Mch6 Leu-Glu-His-Asp(LEHD)PARP半胱天冬酶-10 FLICE2/Mch4半胱天冬酶-11 ICH-3半胱天冬酶-12 DRONC半胱天冬酶-13 ERICE半胱天冬酶-14 MICE Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)PARP聚(ADP-核糖)聚合酶參考Cryns V.和Yuan J.Genes Dev11，1551-1570，1998。Cohen G.M.Biochem J.326(Ptl)，1-16，1997.Negata S.Cell88，355-365，1997。Thomberry NA.等J.Biol Chem272，17907-17911，1997.
為了開發有實用用途的探針來檢測半胱天冬酶在活細胞中的活性一些技術問題被解決和克服，例如(1)作為供體和受體的GFP的最匹配對的篩選；(2)優化連接頭的設計使得FRET的影響在連接頭被半胱天冬酶裂解之前最大化；和(3)優化連接頭設計使得底物序列在連接頭處較容易地被半胱天冬酶作用。
本發明的一個方面是螢光蛋白構建體用來檢測蛋白酶或半胱天冬酶激活細胞凋亡或細胞程序死亡，其中的構建體含有1)一個供體螢光蛋白；2)一個受體螢光蛋白；以及3)一個含有蛋白酶或半胱天冬酶底物序列的肽連接頭。該連接頭位於連接供體螢光蛋白和受體螢光蛋白之間。此處的術語「半胱天冬酶激活的細胞程序死亡或細胞凋亡」是指細胞凋亡和細胞程序死亡由一系列的在凋亡(apoptotic)細胞中被特異性激活的半胱氨酸蛋白酶所引起。構建體特定的適於檢測蛋白酶或鑑定在表1中的細胞凋亡激活的半胱天冬酶，上面的或選自含有半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12組的半胱天冬酶。酶的底物序列是本領域公知的，參見例如上文表1。
在另一方面，至少一個供體或受體是分離自生物體。在另一個方面，至少一個供體螢光蛋白或受體螢光蛋白是Aequorea-相關的螢光蛋白或其突變體或變體。可選擇的，供體螢光蛋白或受體螢光蛋白二者均是Aequorea-相關的螢光蛋白或其突變體或變體。Aequorea-相關蛋白和其功能性變體是本領域的技術人員所公知的且是商業可獲得的。參見，例如美國專利第5,981,200號以及其中引用的參考文獻。儘管始終沒有清楚的闡述，至少供體和/或螢光蛋白可為野生型，突變體或其生物學等價物是人們趨於理解的。生物學等價物可通過基於同源比較的測序或通過在前面所述的溫和或嚴格條件下雜交來被檢測。
兩種GFP分子可具有不同的「顏色」(螢光特性)使得第一GFP(供體)的發射譜與第二GFP(受體)的吸收譜重疊。由於這兩種GFP分子被連接在一起，「螢光共振能量」(FRET)現象就發生了[20]。也就是說，當供體分子被適當波長的光激發時，能量被轉移到受體分子且其將發射螢光。在一方面，FRET現象對於檢測半胱天冬酶的激活是有用的且當細胞進入細胞凋亡時，半胱天冬酶被激活。當兩個GFP分子分離時，沒有FRET發生。因此，當供體分子被激發時沒有從受體的光的發射。這種螢光特性的改變可通過不同的光學裝置被檢測(例如，螢光顯微鏡或分光螢光計)。申請人測定到下面的GFP顏色對特別適於本發明BFP-GFP(藍色-綠色)；CFP-GFP(青色-綠色)；BFP-YFP(藍色-黃色)；以及YFP-CFP(黃色-青色)。
特定設計的探針含有兩個GFP分子連接在一起通過含有半胱天冬酶的底物或裂解序列的短肽(參見圖1)。肽連接頭優選在4到30個胺基酸之間，或在6到30之間，或8到30之間，或8到20之間，或16到30之間，或16到20之間。在一個情況下連接頭是16個胺基酸或更長。在另一個方面，連接頭側接於一個兩個甘氨酸對，例如，GXXXXG或GGXXXXGG。在一個選擇性的實施方案中，肽連接頭超過50％的含有一或多的選自包括甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸的組的胺基酸。
本發明也提供了一個編碼螢光蛋白構建體的核酸和含有一或多個這些核酸的表達構建體。這些可進一步包含在基因傳遞載體中。蛋白構建體，核酸，表達構建體和本發明基因傳遞載體可在載體例如藥學可接受的載體中，或在宿主細胞中以分離的形式提供。宿主細胞，依次的，可以分離的形式提供，或可選擇的，與載體例如藥學上可接受的載體結合的形式提供。
本發明的核酸分子可通過聚合酶鏈式反應(「PCR」)(Perkin-Elmer)被分離或複製。例如，序列可通過PCR(Perkin-Elmer)化學合成，其與寡核苷酸的合成結合，使得DNA序列容易的複製。PCR技術是美國專利第4,683,195號，第4,800,159號，第4,754,065號和第4,683,202號的主旨且描述於PCRTHE POLVMERASECHAIN REATION Mullis等eds，Birkhauser出版社，波士頓(1994)在此引用作為參考。可選擇的，本領域的技術人員可使用此處所提供的序列和商業可獲得的DNA合成儀來複製DNA。相應的，本發明也提供了獲得本發明多核苷酸的方法通過提供多核苷酸，核苷酸，適當的引物分子，化學物質例如酶的線性序列和用於其複製和化學複製或在正確方向連接核苷酸來獲得多核苷酸的操作規程。在一個獨立的實施方案中，這些多核苷酸被進一步的分離。進一步的，本領域的技術人員可插入核酸到合適的複製載體中並插入載體到合適的宿主細胞中用於複製和擴增。如此擴增的DNA可通過本領域公知的方法自細胞分離。獲得核酸分子的方法以及所獲的核酸分子也被提供。
RNA可通過利用分離的DNA並可操作地連接其到適於宿主細胞的調控區並將其插入到宿主細胞中獲得。DNA可通過任意合適的方法被插入，例如通過利用適宜的插入載體或通過電穿孔。當細胞複製物和DNA被轉錄為RNA時；RNA也可通過本領域公知的方法被分離，例如，上文的Sambrook等人所描述的(1989)。
本發明進一步提供了可操作地連接於RNA轉錄的啟動子的核酸分子，以及其它的用於複製和/或DNA或RNA的短暫或穩定表達的調控序列。在特定的實施方案中，細胞特異性啟動子被用於插入的核酸分子的細胞特異性表達。含有一個啟動子或一個啟動子/增強子，帶有終止密碼子和選擇性標記，以及可操作的連接於啟動子的DNA片段可被插入的克隆位點的載體是本領域公知的和商業可獲得的。常規的方法學和克隆策略，參見GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY，Goeddel ed.，Academic press，Inc.(1991)引用在此作為參考以及VECTORSESSENTIAL DATA Series，Gacesa和Ramji，eds.，John Wiley Sons，N.Y.(1994)，其包含圖，功能特性，商品供應商以及不同合適的載體的GenEMBL註冊號。優選的，這些載體能夠在體外或體內轉錄RNA。
如上所述，本發明的核酸分子可操作地連接於RNA轉錄的誘導型或非誘導型的啟動子。這些核酸分子對於螢光蛋白和多肽的重組製備或作為診斷用途的載體是有用的。相應的，本發明也提供了一種被插入上述核酸分子的載體(插入，複製或表達載體)，例如病毒載體，例如噬菌體，棒狀病毒，逆轉錄病毒，或粘粒，或質粒，YACS，酵母和其它重組的載體。核酸分子通過本領域公知的方法被插入到載體基因組中。例如，插入子和在載體DNA可均被暴露於限制性酶來在兩個分子上產生互補末端然後通過連接酶被結合在一起。可選擇的，合成的核酸連接頭可被結合於對應載體DNA限制性位點的插入DNA，其然後用識別特定核苷酸序列的限制性酶降解。此外，含有終止密碼子和合適的限制性位點的寡核苷酸可被結合用於插入到含有例如一些或所有的下列元件的載體中一個選擇性標記基因，例如新黴素基因用於哺乳動物中的穩定性或短暫轉染子篩選；來自人巨細胞病毒(CMV)的立即早期基因的用於轉錄的高水平表達的增強子/啟動子序列；用於mRNA穩定性的SV40的轉錄終止和RNA加工信號；SV40多型瘤複製起點和用於正確的游離基因複製的ColE1；多向複合的克隆位點；以及用於正義和反義RNA體外轉錄T7和SP6 RNA啟動子。
本發明的載體構建體的另一個實施例是包括啟動子例如lac啟動子且用於轉錄啟動，Shine-Dalgarno序列和起始密碼子AUG的細菌表達載體(Sambrook等(1998)見上文)。類似的，一個真核表達載體是含有異源或同源用於RNA聚合酶II的啟動子，一個下遊的多腺苷化信號，起始密碼子AUG，和一個用於分離核糖體的終止信號。此載體可通過商業獲得或通過此處所述的序列來合成。當一個核酸被插入到合適的宿主細胞中時，例如，原核或真核細胞以及宿主細胞複製物，蛋白可被重組製備。合適的宿主細胞將依賴於載體且可包括哺乳動物細胞，動物細胞，人細胞，猿細胞，昆蟲細胞，酵母細胞，以及通過公知方法構建的細菌細胞。參見Sambrook等(1989)，見上文。除了利用病毒載體插入外源核酸到細胞中，核酸可通過本領域公知的方法被插入到宿主細胞中，所述方法例如細菌細胞的轉化；利用磷酸鈣沉澱轉染哺乳動物細胞；或DEAE-葡萄聚糖；電穿孔；或微注射。此方法參見Sambrook等(1989)，見上文。因此，本發明也提供一種含有編碼螢光構建體的核酸分子的宿主細胞，例如，一種哺乳動物細胞，動物細胞(鼠或小鼠)，人細胞，或細菌細胞。
本發明也提供了一種方法來檢測半胱天冬酶激活的細胞程序性死亡，通過在激發供體螢光蛋白的條件下培養含有本發明宿主細胞的樣本並檢測樣本中的螢光特性，其中半胱天冬酶激活的細胞程序性死亡在樣本細胞中存在的情況下產生在供體蛋白和受體蛋白之間的螢光共振能量轉移的程度變化。檢測的方法可被用於定量測定螢光能量轉移程度的變化。
在另一方面，人們可以利用下述方法來檢測是否試劑修飾了樣本中細胞程序性死亡激活的半胱天冬酶，通過用試劑接觸樣本然後在適於供體螢光蛋白激發的條件下培養並檢測樣本的螢光特性，其中試劑的活性通過螢光特性在試劑的存在和不存在的情況下的程度的變化被檢測。此處的術語「試劑」包括但不限於小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，以及反義核酸分子。試劑可擴大細胞凋亡或下調控細胞凋亡。兩種下調控半胱天冬酶激活的細胞凋亡的試劑的例子是(AC-DEVD-CHO)。方法可進一步被修改通過提供含有本發明宿主細胞的第二樣本，在適於激發供體螢光蛋白的條件下培養細胞並比較兩個樣本中螢光共振能量轉移的程度。
本發明也提供了用於實施上述方法的試劑盒，其中試劑盒含有核酸及其使用的說明。
試驗實施例1儘管特定的實施例描述了半胱天冬酶-特異性探針的構建，對於本領域的技術人員來說很顯然任意的蛋白酶及其底物可在所提供方法中被取代。相應的，下面的實施例旨在闡述，而不是限制本發明。
FRET探針的構建含有CFP-YFP融合基因的哺乳動物構建體通過下述來產生首先，EYFP從pEYFP-C1通過PCR擴增，其利用含有EcoRI位點的5`引物KL-3(5`-CCG GAA TTC ATG GTG AGC AAG GGC GAGG)，以及帶有BamHI位點的3`引物KL-5(5`-CCG GAA TTC TATGGT GAG CAA GGG CGA GG)。其次，PCR產物從載體pECFP-C1(Clontech)的EcoRI和BamHI位點之間的CFP基因下遊克隆。連接CFP和YFP的連接頭的胺基酸序列是SGLRSRAQASNS。
第一FRET探針(傳感蛋白A)通過用含有半胱天冬酶-3識別基序的GGDEVDGG替換CFP-YFP融合基因連接頭區域的胺基酸RAQA。編碼此多肽的雙鏈DNA利用寡KL-6(5′-GGA AGA TCTGGA GGC GAC GAG GTG GAT GGA GGC TCG AAT TCT CGG-3′)作為模板和寡KL-8(5′-CCG AGA ATT-3′)作為引物進行引物延伸來被合成。然後DNA被克隆到BglII和EcoRI位點之間的CFP-YFP探針的連接頭區。CFP和YFP之間的傳感蛋白A的連接區由16個胺基酸組成且其序列是SGLRSGGDEVDGGSNS。
第二FRET探針(傳感蛋白B)通過用GGSGGDEVDGGSGG替換CFP-YFP探針的連接頭中的胺基酸RAQA來製備。插入的雙鏈DNA通過利用寡KL-7(5′-GGA AGA TCT GGA GGC AGC GGA GGCGAC GAG GTG GAT GGA GGC AGC GGA GGC TCG AAT TCTCGG-3′)作為模板並用寡KL-8作為引物來產生。因此，傳感蛋白B在兩種GFP之間具有較長的連接頭(22個胺基酸)並且其胺基酸序列為SGLRSGGSGGDEVDGGSGGSNS。
細菌版的FRET探針通過克隆來自哺乳動物構建體的CFP-YFP融合基因到載體pRSET-B(Invitrogen)的NcoI和鈍末端HindIII位點之間。所有的融合蛋白在其N末端含有聚組氨酸標記。
構建的FRET探針可被半胱天冬酶-3裂解為了檢測是否這些FRET探針對半胱天冬酶-3裂解敏感，純化的蛋白與半胱天冬酶-3一起被溫育然後進行Western印跡分析。抗體購自Clontech。圖3A顯示了半胱天冬酶-3可以裂解幾乎所有的傳感蛋白A和傳感蛋白B蛋白，而在相同的條件下CFP-YFP融合蛋白沒有被觀察到裂解。在半胱天冬酶-3抑制劑(AC-DEVD-CHO)存在的條件下，沒有FRET探針(傳感蛋白A)被裂解，此表明裂解是半胱天冬酶-3特異性的(圖3B)。
光學測定證明了FRET作用結果的變化對應於半胱天冬酶-3活性
FRET探針中螢光能量從CYP到YFP的轉移通過分光螢光計被測量。當每一探針中的CFP被激發時，激發的波長為433nm，來自FRET探針的非常弱的發射光在已知的CFP的發射波長處(480nm)檢測。相反，顯著量的發射的螢光在峰值在526nm的YFP的發射波長處被檢測到(圖4A～圖4C)。此結果表明有效的能量轉移發生在CFP的供體分子和YFP的受體分子之間。其然後被測定是否FRET作用是對半胱天冬酶裂解敏感的。FRET探針被用半胱天冬酶-3測定並用分光螢光計分析。發現半胱天冬酶-3處理完全改變了傳感蛋白A和B的發射波長，產生了YFP的發射峰的較大的減少以及CFP發射峰的顯著的增加(圖4A～圖4C)。作為對照，從缺少底物序列的CFP-YFP融合蛋白的發射譜沒有發現變化(圖4A)。相似於圖4A～圖4C的圖譜，測定半胱天冬酶處理前和處理後所有三種FRET探針的YFP(526nm)/CFP(480nm)的發射比率。此YFP/CFP比率被用於定量測定FRET的作用效果。我們發現，在用半胱天冬酶-3溫育傳感蛋白A或傳感蛋白B後，YFP/CFP的發射比率減少4-5倍，傳感蛋白A從3.02減少到0.59且傳感蛋白B從2.76減少到0.59。
比較傳感蛋白A和傳感蛋白B的靈敏度為了比較傳感蛋白A和傳感蛋白B對半胱天冬酶-3活性的靈敏度，劑量依賴性的半胱天冬酶-3裂解方法被實施。在此試驗中，1.28μg量的純化傳感蛋白A或傳感蛋白B被與從0.3125ng到1.28μg範圍的不同量的半胱天冬酶-3溫育1小時。每一樣本的YFP和CFP的發射譜在反應終止時用分光螢光計進行測定。每一半胱天冬酶反應的發射比率(YFP/CFP)用在反應中沒有半胱天冬酶-3的空白對照的發射比率進行標準化。結果顯示於圖5中。人們發現兩種FRET探針均對半胱天冬酶-3高度敏感，儘管傳感蛋白A看上去比傳感蛋白B稍微地更敏感。
使用FET探針來檢測細胞凋亡期間的活細胞中的半胱天冬酶-3活性為了檢測是否此FRET探針可被用於檢測活細胞中的半胱天冬酶活性，傳感蛋白A於HeLa細胞中表達並通過冷卻的CCD成像系統測定探針在單細胞中的FRET作用。獲自CFP和YFP的發射波長的細胞在UV處理前和處理後的螢光影像被記錄。計算機軟體(Metamorph，Universal Imaging)被用於產生每一細胞在不同處理中的YFP/CFP的比率圖像。圖6中A顯示了在UV照射前表達傳感蛋白A的兩種HeLa細胞。在UV處理3小時後，這些細胞進入細胞凋亡。這些細胞的YFP/CFP比率圖像的敏感性被發現突然降低(圖6中B)。類似的試驗在表達缺乏DEVD序列的CFP/YFP探針的HeLa細胞中進行，在UV處理的前後沒有觀察到比率圖像的顯著的變化(圖6中C和D)。計算13個表達傳感蛋白A的細胞凋亡細胞的平均YFP/CFP發射比率的變化，發現在UV處理後幾乎4倍的減少(圖7)。在另一方面，在9個表達CFP/YFP構建體的對照細胞中沒有發射比率的顯著的減少(圖7)。
這些結果表明FRET探針是一種靈敏的工具，其可檢測內源半胱天冬酶-3在細胞凋亡過程中的活細胞中的激活。最近，傳感蛋白A被用於研究UV誘導的細胞凋亡過程中的活HeLa細胞的半胱天冬酶-3激活的動力學。我們發現，利用此種FRET探針，半胱天冬酶-3激活在任意的可視的細胞形態變化之前被清楚地檢測到。此結果證明了FRET是用於細胞凋亡過程的早期檢測的強有力的工具。
可以理解當本發明利用上述的實施方案來協助描述時，前面的說明和下面的實施例旨在闡述而並非限定本發明的範圍。本發明範圍內的其它方面，優點和修改對於本發明的技術人員而言是顯而易見的。
試驗實施例2半胱天冬酶-8特異性探針的製備1.半胱天冬酶-探針的結構和化學特徵除了上述的半胱天冬酶-3特異性探針，傳感蛋白A和傳感蛋白B以外，我們改進了其它的FRET探針用於檢測細胞凋亡過程中的半胱天冬酶-8活性。這些探針與傳感蛋白A有類似的設計，其通過含有半胱天冬酶-8特異性裂解序列IETD(Ile-Glu-Thr-Asp)的肽連接頭融合YFP基因與CFP基因。為了檢測IETD位點增加探針對半胱天冬酶-8的裂解效率的可能性，我們導入單和雙IETD位點到傳感蛋白中。也即，傳感蛋白C8具有一個IETD位點，而傳感蛋白C8A具有兩個IETD位點，如下所示傳感蛋白C8His(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-S-N-S-YFP傳感蛋白C8AHis(6x)-CFP-S-G-L-R-S-G-G-I-E-T-D-G-G-I-E-T-D-S-N-S-YFP多組氨酸標記的傳感蛋白C8蛋白被在細胞中表達並利用Ni-NTA親和柱純化。純化的傳感蛋白C8蛋白與半胱天冬酶-8酶一起溫育並進行SDS-PAGE和通過抗組氨酸抗體進行Western印跡分析。結果被顯示於圖8中。在應用半胱天冬酶-8之前。傳感蛋白C8和傳感蛋白C8A為單鏈，其帶有大約63kDa的分子量，其接近所期望的CFP和YFP融合蛋白的分子量(見圖8的條帶1和2)。在半胱天冬酶-8被加入到反應中之後，兩個傳感蛋白被裂解為兩個與抗-GFP作用的帶。上面的條帶具有His-CFP的大約33kDa的期望的分子量且顯示出有與抗-組氨酸抗體的反應。這些結果表明傳感蛋白C8和C8A能夠被半胱天冬酶-8裂解來釋放CFP和YFP分子。
為了比較兩個C8探針之間的裂解的效率，相同量的傳感蛋白C8蛋白(120nM)被與不同量的半胱天冬酶-8酶一起溫育，反應混合物通過Western印跡試驗分析。顯示在圖8中的結果表明與傳感蛋白C8相比，傳感蛋白C8A蛋白被半胱天冬酶-8裂解為較大的片段(參見圖8，條帶3-6)。條帶5和6中的蛋白的強度分析表明95％的傳感蛋白C8A蛋白在用半胱天冬酶-8(216nM)溫育一小時後被裂解(條帶6)。而僅有58％的傳感蛋白C8蛋白在相同條件下被裂解(條帶5)。此結果表明傳感蛋白C8A中雙IETD的存在通過半胱天冬酶-8顯著的增加其裂解的敏感性。
2.光學檢測表明傳感蛋白C8A是一種用於檢測半胱天冬酶-8活性的更敏感的探針為了檢測傳感蛋白C8A中的CFP和YFP之間是否具有能量轉移，我們利用分光螢光計檢測了純化的傳感蛋白蛋白的發射譜。當傳感蛋白C8蛋白在CFP的發射波長處(433nm)被激發時，在YFP的發射波長(526nm)處比在CFP的發射波長(480nm)處檢測到更多的螢光，此清楚的表明具有FRET作用。能量轉移的效率通過兩種半胱天冬酶-8傳感蛋白的YFP(526nm)/CFP(480nm)的發射比率被計算。測定傳感蛋白C8和C8A的FRET比率分別為2.82和2.54。
為了比較不同傳感蛋白對半胱天冬酶-8的敏感性，我們進行了一系列的劑量依賴性的半胱天冬酶裂解試驗，相同量(22.45nM)的傳感蛋白C8和C8A蛋白與不同量的半胱天冬酶-8酶溫育一個小時。然後，我們用CFP的激發波長(433nm)的光來激發反應產物，並通過光學螢光計測定其發射譜。結果顯示在圖9中，其中YFP(526nm)/CFP(480nm)的發射比率以相對於半胱天冬酶的濃度被繪製。發射比率(YFP/CFP)被標準化來區別於未裂解傳感蛋白蛋白的發射比率。我們觀察到需要大約0.71nM的半胱天冬酶-8來減少傳感蛋白C8A的50％的FRET作用，而需要5倍的更多的半胱天冬酶-8(3.4nM)來產生傳感蛋白C8的相同FRET減少量。這些結果表明含有雙IETD位點的傳感蛋白C8A比僅含有單個IETD位點的傳感蛋白C8對半胱天冬酶-8裂解更敏感。
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權利要求
1.一種用於檢測在細胞凋亡中半胱天冬酶或蛋白酶激活的螢光蛋白構建體，含有a.一個供體螢光蛋白；b.一個受體螢光蛋白；以及c.一個含有半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列的連接供體螢光蛋白和受體螢光蛋白的肽連接頭。
2.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中至少一個供體螢光蛋白或受體螢光蛋白含有Aequorea-相關的螢光蛋白。
3.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中供體螢光蛋白和受體螢光蛋白均是Aequorea-相關的螢光蛋白。
4.如權利要求3所述的螢光蛋白構建體，其中供體螢光蛋白和受體螢光蛋白均是綠色螢光蛋白。
5.如權利要求4所述的螢光蛋白構建體，其中供體螢光蛋白和受體螢光蛋白選自含有BFP-GFP；CFP-GFP；BFP-YFP和YFP-CFP的供體和受體螢光蛋白對。
6.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中至少一個供體螢光蛋白或受體螢光蛋白含有分離自生物有機體的螢光蛋白。
7.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中的肽連接頭含有一個選自半胱天冬酶-3，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-8，半胱天冬酶-9和半胱天冬酶-12的半胱天冬酶的裂解位點的裂解識別位點。
8.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中的肽連接頭實質上含有具有4至30個胺基酸的多肽。
9.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中的肽連接頭側接於甘氨酸胺基酸。
10.如權利要求1所述的螢光蛋白構建體，其中連接供體螢光蛋白和受體螢光蛋白的肽連接頭含有兩個或更多的半胱天冬酶或蛋白酶的底物序列。
11.編碼如權利要求1-10中任一項所述蛋白構建體的核酸。
12.含有如權利要求11所述核酸的表達構建體。
13.含有如權利要求1-10中任一項所述蛋白構建體的分離的宿主細胞。
14.含有如權利要求11所述核酸的分離的宿主細胞。
15.含有如權利要求12所述表達構建體的分離的宿主細胞。
16.含有如權利要求11所述核酸的基因傳遞載體。
17.一種用於檢測在細胞凋亡中半胱天冬酶激活的方法，包括在適於供體螢光蛋白激發的條件下培養含有如權利要求1所述的蛋白構建體或編碼如權利要求1所述的蛋白構建體的核酸的宿主細胞並檢測樣本中的螢光特性，其中半胱天冬酶激活的細胞凋亡或細胞程序性死亡在樣本細胞中的存在導致供體蛋白和受體蛋白之間的螢光共振能量轉移的程度的變化。
18.如權利要求17所述的方法，進一步包括對螢光能量轉移程度變化的定量測定。
19.一種檢測在細胞凋亡中某種試劑是否改變了宿主中半胱天冬酶或蛋白酶激活的方法，包括用試劑接觸含有如權利要求1所述的蛋白構建體或編碼蛋白構建體的核酸的宿主細胞，並在適於供體螢光蛋白激發的條件下培養該細胞，及檢測樣本螢光特性，其中試劑的活性通過在試劑的存在或不存在時的螢光特性的變化而檢測。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述試劑選自小分子化合物，蛋白，核酸，核酶，反義核酸以及來自傳統中藥的分離的化合物及其化學衍生物。
21.如權利要求19所述的方法，進一步包括提供宿主細胞的第二樣本並在適於供體螢光蛋白激發的條件下培養第二樣本，並比較兩個樣本中螢光共振能量轉移的程度。
全文摘要
本發明涉及一種基於綠色螢光蛋白檢測細胞凋亡的方法。提供一種螢光蛋白構建體來用於檢測在細胞凋亡中蛋白酶或半胱天冬酶的激活。該構建體含有一個供體螢光蛋白；一個受體螢光蛋白；以及一個連接頭肽，其中的連接頭肽含有半胱天冬酶的底物序列。連接頭肽位於供體和受體蛋白之間。本發明還提供了該編碼螢光蛋白構建物的核酸，含有該核酸的表達構建體以及含有這些核酸的基因傳遞載體。所述方法通過在適於供體螢光蛋白激發的條件下培養含有上述核酸和/或蛋白的宿主細胞的樣本並檢測樣本中的螢光特性，其中細胞程序性死亡在樣本細胞中的存在導致供體蛋白和受體蛋白之間的螢光共振能量轉移的程度的變化。
文檔編號C12Q1/37GK1396265SQ0212042
公開日2003年2月12日 申請日期2002年5月24日 優先權日2001年5月24日
發明者張東才, 羅茜 申請人:香港科技大學