一種從單克隆抗體中製備N-連接糖肽的方法及N-連接糖肽與流程

2023-10-20 05:36:22 2

本發明涉及從單克隆抗體中分離製備N-連接糖肽組分的提取分離製備，具體的說是從單克隆抗體中酶解分離製備得到有9個胺基酸肽段的N-連接糖肽組分，該組分中的聚糖為5－15個甘露糖、半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、巖藻糖或唾液酸組成，分子量在2000－4000。

背景技術：

蛋白質糖基化是一種重要的蛋白質翻譯後修飾，在真核生物，尤其是哺乳動物中約有一半以上的蛋白質是被糖基化的，膜蛋白則幾乎100％是以糖基化的形式而存在(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化對蛋白質的結構和功能有著重要影響，如蛋白質的摺疊、運輸以及定位等。糖蛋白的糖鏈在細胞間的識別、黏附、通信聯絡以及免疫應答等方面均起著重要作用，除此之外，蛋白質糖基化的異常與腫瘤、發育、免疫異常以及感染等疾病的發生發展和診斷治療也有密切關係。目前，已知腫瘤、類風溼等疾病會引起糖鏈結構的異常改變，因此，糖鏈被認為是一種潛在的疾病標誌物和新疫苗的靶點(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867；Kim EH,Misek DE,Glycoproteomics based identification of cancer biomarkers.International journal of Proteomics,2011,2011,1-10)。由於糖肽僅佔所有酶解後肽段的小部分(2-5％)，其質譜響應很容易被高豐度非糖肽抑制。同時，由於糖鏈的微觀不均一性，一個糖基化位點上的糖鏈類型可能多達幾十種，進一步降低了糖鏈的相對量而使得它們很難被檢測到，這些使得糖蛋白糖肽的分離製備變得異常艱難。儘管糖鏈不容易得到，但是去除了蛋白質中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影響，在高純度糖肽基礎上，研究糖鏈的結構信息，發現一些潛在的診斷標誌物和治療靶點將會變得更加簡便、直接，更容易獲得準確的結果，因此對於糖肽的分離製備，迫切需求一種高效、高通量的分離製備方法。為了得到結構單一的糖肽標準品，將糖肽混合物從酶解液中富集分離出來是首要步驟。

二維液相色譜技術是一門新興技術，是用兩根性質相同或不同的色譜柱對複雜樣品進行分離。作為一種分析複雜樣品的理想工具，它已被廣泛應用於醫藥衛生、食品科學、環境和農業科學等各個領域。 近年來，隨著二維液相色譜理論及應用的發展，二維製備液相色譜也逐漸發展起來。與單維製備液相色譜相比，二維製備液相色譜不但具有更高的峰容量，而且兩維具有不同的選擇性。

酶法釋放糖蛋白糖鏈因方法簡單、條件溫和、能夠提供有關糖鏈殘基組成、排列順序和糖苷鍵的構型等信息，目前應用較廣，其中胰蛋白酶(Trypsin)應用更為廣泛。到目前為止，雖然對血清中免疫球蛋白、單克隆抗體的Trypsin酶解糖鏈釋放、結構表徵的研究很多，但大多數研究仍集中在用質譜方法檢測酶解液中的糖肽。同時，隨著對糖肽結構的不斷認識，對其功能的研究越來越引起人們的興趣，這使得對於糖肽樣品的獲取迫在眉睫。然而，到目前為止，從單克隆抗體酶解液中將糖肽富集分離出來，並通過二維液相色譜分離製備得到純度較高的糖肽組分，還未見報導。

技術實現要素：

為了深入研究糖蛋白、糖肽的結構及功能，糖肽樣品的獲取是最基礎也是最重要的。但是，從蛋白質中去除佔有量為95％－98％的非糖肽，從而獲得糖肽樣品是非常困難的。到目前為止，未見採用色譜方法從單克隆抗體酶解液中將糖肽富集分離出來的報導。本發明提供了一種利用二維色譜分離技術，從單克隆抗體中製備N-連接糖肽組分的高效分離製備方法。

為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：

1)蛋白變性：單克隆抗體樣品中加入尿素的緩衝溶液進行反應，反應產物中加入二硫蘇糖醇進行反應，產物中加入碘代乙酸，避光反應得到變性蛋白溶液；

2)酶解：向步驟(1)得到的變性蛋白溶液中加入酶，進行酶解反應得到酶解反應產物；

3)對步驟(2)得到的酶解反應產物進行二維液相色譜分離製備，收集的組分乾燥後即為N-連接糖肽組分。

步驟(1)中單克隆抗體樣品在尿素的緩衝溶液中進行反應的條件為20－30℃溫育，緩衝溶液pH值為7－9，反應時間為1－5小時；加入二硫蘇糖醇後反應條件為35－40℃溫育，反應時間為1－5小時；加入碘代乙酸後的反應條件為避光20－30℃溫育，反應時間為10－60分鐘。

步驟(1)緩衝溶液中尿素的濃度為4－10M；所使用的緩衝溶液為碳酸氫銨緩衝溶液，濃度為30－80mM；緩衝溶液中加入的單克隆抗體與尿素的質量比為1:1－1:40。

所述二硫蘇糖醇，加入後其在體系中的終濃度為30－100mM，初始單克隆抗體質量與二硫蘇糖醇的質量比為14:1－140:1；

所述碘代乙酸，加入後其在體系中的終濃度為30－100mM，初 始單克隆抗體質量與碘代乙酸的質量比為18:1－180:1。

步驟(2)酶解反應之前，變性蛋白溶液用碳酸氫銨緩衝溶液稀釋5－10倍後再加入酶，上述碳酸氫銨緩衝溶液，濃度為30－80mM；酶解反應pH值為7－9，溫度為35－40℃，反應時間為10－24小時；酶解後得到的酶解液在沸水中煮5－10分鐘使酶失活得到酶解反應產物。

在步驟(2)中所述酶是胰蛋白酶；酶和初始單克隆抗體的質量比為1:10－1:50。

步驟(3)以矽膠為基質的鍵合材料為色譜柱填料，Unitary C18或XAqua(華譜新創有限公司)為一維反相填料，XAmide或XIon(華譜新創有限公司)為二維親水填料。

步驟(3)所述的二維液相色譜分離製備中一維製備採用的矽膠基質鍵合材料的粒度為2－20微米，一維液相色譜製備採用的流動相為甲醇或乙腈中的一種或二種與水混合，其中甲醇或乙腈為有機相，不含或含有0.1v％甲酸，水相中不含或含有0.1v％甲酸；洗脫條件按照有機相體積分數5－30％等度或5－50分鐘有機相體積分數由5％提高到40％梯度進行；柱溫為25－40℃，洗脫液總流速為0.2－1.0mL/min，收集保留時間為10－30min的組分；二維製備採用的矽膠基質鍵合材料的粒度為2－20微米，採用的流動相為乙腈作為有機相與水作為水相混合，洗脫條件按水相體積分數10－50％等度或經5－30分鐘水相體積分數由10－15％提高到30－60％梯度進行，柱溫為25－40℃，洗脫液總流速為0.2－1.0mL/min，收集保留時間為10－30的組分。

所述一維製備，最佳流動相為含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈與含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，採用等度方式，乙腈體積比例為8％－15％；二維製備最佳流動相為含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈與含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，採用梯度條件，含有或不含有0.1v％甲酸的水體積濃度為15％，保持5分鐘，再經15－20分鐘增加到35％－45％。

按照上述方法製備的N-連接糖肽其主要成分是9個胺基酸肽段的N-連接糖肽組分，其肽段序列為EEQYNSTYRN，N-連接聚糖是以兩個N-乙醯葡萄糖胺和3個甘露糖組成的五糖核心基礎上，再連接總數為0－10個的甘露糖、半乳糖、N-乙醯葡萄糖胺、巖藻糖或唾液酸中的一種或二種以上，N-連接糖肽分子量為2000－4000。

本發明的優點

1.採用二維液相色譜分離技術，通過選用合適的色譜柱和色譜分離製備條件，去除了雜質蛋白、多肽、非糖肽，從單克隆抗體中得到了N-連接糖肽組分。

2.得到的N-連接糖肽組分純度高，可以達到80％以上。

3.本發明所涉及的從單克隆抗體中製備高純度N-連接糖肽的方法，儀器自動化程度高，操作方便、簡單，常溫常壓下就可進行，適合大規模製備的需要。

具體實施方式

下面結合實例，對本發明做進一步說明。實例僅限於說明本發明，而非對本發明的限定。

實施例1：

稱取單克隆抗體蛋白(Sigma-Aldrich,貨號527858)1mg，加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氫銨緩衝溶液中，20℃溫育1小時，緩衝溶液的pH為7。變性後的單克隆抗體蛋白加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液，35℃溫育1小時，還原變性後單克隆抗體蛋白的二硫鍵，然後加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下30℃溫育10分鐘，將還原後的二硫鍵進行烷基化。

將變性後的單克隆抗體蛋白加入960μL濃度為0.1M的碳酸氫銨緩衝溶液；加入0.1mg的Trypsin，酶解緩衝溶液的pH值為7，酶解反應溫度為35℃，酶解時間為10小時，酶解之後，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮3倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。用粒徑2微米的Unitary(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑3mm，柱長250mm，流動相選擇乙腈為有機相，水為水相，採用5％有機相等度洗脫，柱溫25℃，流動相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集20－30分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑2微米的XAmide(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑3mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動相採用乙腈(含0.1v％甲酸)為有機相，水(含0.1％v甲酸)為水相，採用10％水相等度洗脫，柱溫35℃，流動相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集20－30分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至幹，即為含9個胺基酸的N-連接糖肽組分，經質譜分析鑑定，糖肽個數為6條，純度85％。實施例2：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)10mg，加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩衝溶液中，30℃溫育5小時，緩衝溶液的pH為9。變性後的單克隆抗體加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液，40℃溫育5小時，還原變性後單克隆抗體的二硫鍵，然後加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下20℃溫育60分鐘，將還原後的二硫鍵進行烷基化。

將變性後的單克隆抗體加入1210μL的碳酸氫銨緩衝溶液，濃度為0.5M，加入0.2mg的Trypsin，酶解緩衝溶液的pH值為9，酶解 反應溫度為40℃，酶解時間為24小時，酶解之後，酶解液在沸水中煮10分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮5倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑20微米的XAqua(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長150mm，流動相選擇甲醇(含0.1％v甲酸)為有機相，水(含0.1％v甲酸)為水相，採用梯度洗脫方式：有機相體積濃度由5％經50分鐘提高到40％，柱溫40℃，流動相流速為1.0mL/min，280nm紫外檢測，收集15-20分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑20微米的XAmide(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機相，水(含0.1％v甲酸)為水相，採用50％有機相等度洗脫，柱溫40℃，流動相流速為0.7mL/min，280nm紫外檢測，收集10-15分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至幹，即為含9個胺基酸的N-連接糖肽組分，經質譜分析鑑定，糖肽個數為6條，純度70％。

實施例3：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)30mg，加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氫銨緩衝溶液中，25℃溫育2小時，緩衝溶液的pH為7。變性後的單克隆抗體加入10μL的100mM二硫蘇糖醇水溶液，37℃溫育5小時，還原變性後單克隆抗體的二硫鍵，然後加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下30℃溫育20分鐘，將還原後的二硫鍵進行烷基化。

將變性後的單克隆抗體加入1500μL的碳酸氫銨緩衝溶液，濃度為5M，加入1mg的Trypsin，酶解緩衝溶液的pH值為8，酶解反應溫度為37℃，酶解時間為24小時，酶解之後，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮7倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑5微米的XAqua(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長250mm，流動相選擇乙腈為有機相，水為水相，採用30％有機相等度洗脫，柱溫25℃，流動相流速為0.8mL/min，280nm紫外檢測，收集10-15分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑5微米的XIon(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長250mm作為二維分離色譜柱，流動相選擇乙腈為有機相，水為水相，採用梯度洗脫方式：水相濃度由10％經30分鐘提高到60％，柱溫30℃，流動相流速為1.0mL/min，280nm紫外檢測，收集15-20分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至幹，即含9個胺基酸的N-連接糖肽組分，經質譜分析鑑定，糖肽個數為10條，純度90％。

實施例4：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)10mg，加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩衝溶液中，25℃溫育2小時，緩衝溶液的pH為8。變性後的單克隆抗體加入40μL的400mM二硫蘇糖醇50mM碳酸氫銨緩衝溶液，35℃溫育1小時，還原變性後單克隆抗體的二硫鍵，然後加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氫銨緩衝溶液，避光條件下25℃溫浴10分鐘，將還原後的二硫鍵進行烷基化。

將變性後的單克隆抗體加入9000μL的碳酸氫銨緩衝溶液，濃度為0.05M，加入0.25mg的Trypsin，酶解緩衝溶液的pH值為8，酶解反應溫度為37℃，酶解時間為20小時，酶解之後，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮10倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑5微米的Unitary(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑3.0mm，柱長150mm，流動相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機相，水(含0.1％v甲酸)為水相，採用10％有機相等度洗脫，柱溫30℃，流動相流速為0.4mL/min，280nm紫外檢測，收集12-15分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑3微米的Xion(華譜新創有限公司)填料裝柱，柱徑2.1mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機相，水(含0.1％v甲酸)為水相，採用梯度洗脫方式：水相濃度由15％經30分鐘提高到40％，柱溫30℃，流動相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集17-24分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至幹，即含9個胺基酸的N-連接糖肽組分，經質譜分析鑑定，糖肽個數為8條，純度95％。