一種重組葡激酶的製作方法

2023-10-20 12:42:37 2

專利名稱：一種重組葡激酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於溶解血栓的葡激酶突變株(121)的構建及其表達產物的分離純化方法，屬生物技術領域。
背景技術：
葡激酶(Staphylokinase，Sak)是來源於金黃色葡萄球菌分泌的一種蛋白質。1948年Lack C.H首先發現其具有溶解血栓的能力，由於天然Sak分泌水平較低及當時純化工藝的落後，制約了Sak發展。80年代隨著基因工程技術的發展，Sak的核苷酸序列被解析，並確認了它的溶栓機理。Sak象鏈激酶(SK)一樣，首先與纖溶酶原結合形成複合物，去催化纖溶酶原轉化為纖溶酶，然後對血纖維蛋白進行水解。Sak優先選擇與血栓上的纖溶酶原結合，水解其中的血纖維蛋白，當血漿中不存在血栓時，血纖維蛋白溶酶則被血漿中的α-AP中和，不降低凝血系統中的纖維蛋白原，不易引起全身性溶血。由於Sak具有很強的溶栓專一性，曾先後被國內外多家實驗室克隆，如中國專利94112105、95111222、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195和00112673均為成熟的Sak(136個胺基酸組成)。
本發明的目的就是提供一種表達水平和活性均比成熟葡激酶提高的工程菌株；為此，我們通過在N端缺失不同胺基酸的方法，通過PCR擴增，最後獲得了在成熟葡激酶N端缺失15個胺基酸殘基的表達水平和活性均提高的新型葡激酶。其具有專一性強、溶栓速度快等特點。

發明內容
本發明所述的重組葡激酶突變株與中國專利94112105、97105988、97103921、98102132、00111627、00111628、99804195、00112674、和00112673報導的均不相同，中國專利所報導的均為成熟的葡激酶由136個胺基酸組成，而本發明提供的Sak是由121個胺基酸組成的，表達水平和活性均提高的葡激酶突變株，是一種新型的葡激酶。
本發明構建的葡激酶工程菌CGMCC0871，具有45％以上的表達量，並以可溶性形式表達。表達產物經分離純化獲得高純度葡激酶製品，經臨床研究表明葡激酶與尿激酶(UK)、鏈激酶(SK)、組織纖溶酶原激活劑(t-PA)相比，具有分子量小、專一性強、溶栓速度快等特點，其可用於急性心肌梗塞，腦栓塞、肺栓塞等疾病的治療和預防。
本發明所要解決的技術問題是提供一種分子量小、專一性強、溶栓速度快的新型重組葡激酶(121)基因核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列；提供一種高效表達工程菌菌株的製備方法；提供該重組葡激酶與適當賦形劑的藥用組合物；同時提供該重組葡激酶與適當賦形劑的藥用組合物的用途。
本發明目的是通過以下技術方案來實現以本實驗室構建的成熟Sak(pSAK136)DNA為模板，採用引物I和引物II經PCR擴增，獲得含有約380bp的葡激酶基因DNA片段，該基因DNA片段和表達載體pBV220(pBV220質粒見《病毒學報》，1990，6(2)111-116。)質粒，分別以EcoRI和BamHI酶切；再將酶切後的上述質粒和葡激酶基因DNA片段用T4DNA連接酶連接，獲得含有Sak(121)基因的pDS03質粒DNA，再轉化入大腸桿菌DH5α宿主細胞中，構建成高表達的葡激酶(121)工程菌菌株CGMCC0871。
本發明提供的技術方案一為本發明質粒pDS03構建過程中所採用的引物為引物I為5′CACGAATTCATGAGTTATTTTGAACCAACA 3′；引物為5′CACGGATCCCTATTTCTTTTCAATAACAACCTT 3。
本發明PCR反應為dd.H2O 31μl
10xPCR緩衝液 5μldNTP(2.0mmol)4μlP-1(20pmol) 2μlP-2(20pmol) 2μl模板DNA(pSAK136) 5μlPfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl振蕩、稍加離心，92℃變性3分鐘。放入PCR擴增儀，按以下步驟進行反應94℃10秒55℃30秒72℃60秒共30個循環，然後72℃延伸10分鐘。
本發明重組葡激酶(121)表達質粒的構建為將PCR擴增Sak121基因片段以EcoRI-BamHI雙酶切後，以相同的限制性內切酶酶切的表達載體pBV220重組，轉化大腸桿菌DH5α，塗於LB(含Amp)平板上，37℃培養過夜。提取質粒(方法見《分子克隆操作指南》1986)，以EcoRI-BamHI雙酶切，走1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢查，似含Sak121基因特徵片斷者，為表達質粒pDS03。經自動序列分析儀測定了其核苷酸序列為AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA
本發明重組葡激酶(121)高效表達工程菌株的鑑定方法為將葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取單菌落分別接種在5ml的LB(Amp)液體培養基中30℃振蕩培養4h，42℃繼續培養3h，各取1ml培養液，4℃，10000rpm，離心1min，去上清，沉澱加入100μl的2xSDS-PAGE電泳緩衝液100℃煮沸5min，室溫12000rpm，離心5min。對照為pBV220/DH5α或誘導前培養液以同樣方法處理。取樣10μl，走SDS-PAGE電泳，電泳結束後，將SDS-PAGE電泳凝膠切開。一組用於考馬斯亮藍染色，可見誘導樣品在分子量14.0KD處有非常濃集的區帶，而對照樣品pBV220/DH5α和誘導前培養液無此區帶。經電泳凝膠成像掃描分析，Sak121蛋白約佔菌體總蛋白的45％以上。
另一組凝膠以Western Blot的方法，將SDS-PAGE凝膠用半乾膠轉移儀轉移在硝酸纖維素膜(NC)上，通過特異試劑(抗體)作為探針，對靶物質進行檢測。首先在下電極板上依次放上溼濾紙2張，NCl張，凝膠，溼濾紙2張，蓋上電極板，電壓60V，30分鐘。轉移結束後，取出NC用TTBS封閉1小時；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗體)的新鮮配置的TTBS(0.1ml/cm2膜面積)，室溫過夜；用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去過量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鮮配置的TTBS(0.1ml/cm2膜面積)，室溫孵育2小時，用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去未結合的二抗；以DAB(3，3』一二氨基聯苯胺鹽酸鹽)室溫顯色，在分子量約14.0KD處有一條非常濃集的區帶，而對照樣品pBV220/DH5α和誘導前培養液無此區帶。表明葡激酶突變株121具有高效表達能力。
本發明提供的技術方案二為重組葡激酶(121)產物的分離純化經發酵液、離心收集菌體、高壓溶漿離心收集細胞裂解上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下進行超濾，去掉約40％的雜蛋白。然後上Q-Sepharose F.F柱進行分離純化每升發酵液可獲得該純品500mg以上；經SDS-PAGE和HPLC分析， 純度均在98％以上。以人血纖維蛋白平板法，測定重組葡激酶(121)蛋白質的生物活性，其比活為6.0×105IU/mg。


圖1重組葡激酶pDS03表達質粒的構建圖譜圖2重組葡激酶(121)核苷酸序列分析圖譜具體實施方案本發明是以本實驗室克隆的成熟葡激酶基因(pSAK136)為模板，經PCR擴增，將擴增出的葡激酶(121)基因片段插入表達載體pBV220質粒，轉化大腸桿菌，構建成新的重組葡激酶工程菌菌株CGMCC0871。該表達產物具有免疫原性降低的與成熟葡激酶相同的藥用價值，可用於心肌梗塞、腦栓塞、肺栓塞等血栓性疾病的治療和預防。
下面結合實施例證詳細說明本發明的製備方法實施例一1、引物設計根據已知葡激酶核苷酸序列，設計一對引物，用該引物擴增出的葡激酶基因片段，為在成熟的葡激酶基因前缺失15個胺基酸殘基的葡激酶基因片段。
引物I5′CACGAATTCATGAAGGGCGATGACGCGAGT；引物II5′CACGGATCCTATTTCTTTTCAATAACAAC。
2.PCR反應dd.H2O 31μl10xPCR緩衝液 5μldNTP(2.0mmol)4μlP-1(20pmol) 2μlP-2(20pmol) 2μl模板DNA(Sak136DNA) 5μlPfu DNA聚合酶(2.0u/μl) 1μl振蕩、稍加離心，92℃變性3分鐘。放入PCR擴增儀，按以下步驟進行反應
94℃10秒55℃30秒72℃60秒共30個循環，然後72℃延伸10分鐘。取5μl PCR反應物，以1.2％瓊脂糖電泳檢查，可見380bp左右的DNA片斷。
3、重組葡激酶(121)表達質粒的構建將PCR擴增Sak121片段以EcoRI-BamHI雙酶切後，以相同的限制性內切酶酶酶切的表達載體pBV220重組，轉化大腸桿菌DH5α，塗於LB(含Amp)平板上，37℃培養過夜。提取質粒，以EcoRI-BamHI雙酶切，走1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢查，似含Sak121基因特徵片斷者，為表達質粒pDS03(如圖1所示)。經自動序列分析儀測定了其核苷酸序列(如圖2所示)。
4、重組葡激酶(121)高效表達工程菌株的鑑定將葡激酶121工程菌CGMCC0871挑取單菌落分別接種在5ml的LB(Amp)液體培養基30℃振蕩培養4h，42℃繼續培養3h，各取1ml培養液，4℃，10000rpm，離心1min，去上清，沉澱加入100μl的2xSDS-PAGE電泳緩衝液100℃煮沸5min，室溫12000rpm，離心5min。對照為pBV220/DH5α或誘導前培養液以同樣方法處理。取樣10μ1，走SDS-PAGE電泳，電泳結束後，將SDS-PAGE電泳凝膠切開。一組用於考馬斯亮藍染色，可見誘導樣品在分子量14.0KD處有非常濃集的區帶，而對照樣品pBV220/DH5α和誘導前培養液無此區帶。經電泳凝膠成像掃描分析，Sak121蛋白約佔菌體總蛋白的45％以上，比成熟葡激酶表達量提高約10％。
另一組凝膠以Western Blot的方法，將SDS-PAGE凝膠用半乾膠轉移儀轉移在硝酸纖維素膜(NC)上，通過特異試劑(抗體)作為探針，對靶物質進行檢測。首先在下電極板上依次放上溼濾紙2張，NCl張，凝膠，溼濾紙2張，蓋上電極板，電壓60V，30分鐘。轉移結束後，取出NC用TTBS封閉1小時；加入溶有一抗(兔抗葡激酶抗體)的新鮮配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面積)，室溫過夜；用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去過量的一抗；加入二抗(羊抗兔IgG，HRP)的新鮮配置的TTBS(0.1m1/cm2膜面積)，室溫孵育2小時，用TTBS漂洗3次，各10分鐘，以除去未結合的二抗；以DAB(3，3』一二氨基聯苯胺鹽酸鹽)室溫顯色，在分子量約14.0KD處有一條非常濃集的區帶，而對照樣品pBV220/DH5α和誘導前培養液無此區帶。表明葡激酶突變株121具有高效表達能力。
實施例二一種重組葡激酶(121)產物的分離純化1、收穫發酵液經4℃，10000rpm，離心10分鐘，收集菌體。以20mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)懸浮，洗菌體一次，以同樣條件離心，收集菌體。
2、高壓溶漿將離心收集菌體，以溼重菌體100g加入1000ml 20mM磷酸鹽(pH8.0)緩衝液懸浮，用高壓溶漿儀破碎細胞，4℃，15000rpm離心20分鐘，收集上清。用SDS-PAGE檢測上述細胞裂解液，可見在分子量14KD處有一很粗的區帶，經掃描分析含量約45％，由此可見，表達產物為可溶性。
3、超濾將高壓溶漿離心收集上清液，以截流量100KD膜包，在8℃以下進行超濾截留，可去掉約40％的雜蛋白，使粗酶液的純度達到80％以上。
4、Q-Sepharose F.F柱層析將以分子截流量100KD超濾濾出液(葡激酶粗蛋白)，上經20mM磷酸鹽(pH8.0)緩衝液平衡層析柱(Φ7.5×20cm)，並用此緩衝液充分洗滌至基線，再用含有0.25M NaCl的上述緩溶液洗脫目的峰。經蛋白質定量測定，每升發酵液經分離純化可得純品500mg以上；SDS-PAGE和HPLC分析，純度均在98％以上。
5、活性鑑定(人血纖維蛋白平板法)5.1纖維蛋白平板的製備稱取125mg瓊脂糖，加入23ml生理氯化鈉溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14μ1(100IU/ml)，纖溶酶原280μl(0.5mg/ml)，要邊加邊搖勻，加2.2ml人纖維蛋白原(6mg/ml)，不停地搖勻，混勻後立即到平板(直徑9cm)，水平放置充分凝固後4℃放置至少30分鐘待用。
5.2標準品和待見樣品的稀釋標準品用生理氯化鈉溶液稀釋成以下5個稀釋度(IU/ml)1000，250，62.5，15.6，3.9，待檢樣品根據標示量稀釋至大約100IU/ml，或1μg/ml的濃度，待用。
5.3打孔及點樣在形成的纖維蛋白平皿內打孔(直徑2mm)，每孔點樣10μl，每個待檢樣品和標準品各點2個孔，37℃溼盒(在飯盒內加少量水以保持一定的溼度)水平放置24小時。
5.4 結果計算縱橫兩次量取溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數(x)為橫坐標，以溶圈直徑的平均數(4次量取的數值)的對數為縱坐標(y)，按生物統計學方法分析結果，並求得y＝a+bx中的a和b及線性回歸係數r值，根據待檢樣品的溶圈直徑可求得待檢樣品的活性。
經測定，葡激酶121蛋白質的生物活性，其比活為6.0×105IU/mg，比成熟的葡激酶活性5.0x x105IU/mg高20％左右。
本發明構建的重組葡激酶的高效表達工程菌株為pDS03/DH5α。菌株已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行了保藏保藏地址北京市海澱區中關村北一條13號保藏日期2002年12月27日保藏編號No.0871分類命名大腸埃希氏菌
權利要求
1.一種重組葡激酶，其特徵在於其編碼的核苷酸序列為AGT TAT TTT GAA CCA ACA GGC CCG TAT TTG ATG GTAAAT GTG ACT GGA GTT GAT GGT AAG GGA AAT GAA TTGCTA TCC CCT CGT TAT GTC GAG TTT CCT ATT AAA CCTGGG ACT ACA CTT ACA AAA GAA AAA ATT GAG TAC TATGTC GAA TGG GCA TTA GAT GCG ACA GCA TAT AAA GAGTTT AGA GTA GTT GAA TTA GAT CCA AGC GCA AAG ATCGAA GTC ACT TAT TAT GAT AAG AAT AAG AAA AAA GAAGAA ACG AAG TCT TTC CCT ATA ACA GAA AAA GGT TTTGTT GTC CCA GAT TTA TCA GAG CAT ATT AAA AAC CCTGGA TTC AAC TTA ATT ACA AAG GTT GTT ATA GAA AAGAAA
2.根據權利要求1所述重組葡激酶，其特徵在於其編碼的胺基酸序列為Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met ValAsn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu LeuLeu Ser Pro Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys ProGly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr TyrVal Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys GluPhe Arg Val Val Glu Leu Asp Pro Ser Ala Lys IleGlu Val Thr Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys GluGlu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly PheVal Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile lys Asn ProGly Phe Asn Leu Ile Thr Lys Val Val Ile Glu LysLys
3.根據權利要求1所述重組葡激酶，其高效表達工程菌株為pDS03/E.coli(CGMCC0871)。
4.根據權利要求3所述的重組葡激酶，其構建該葡激酶衍生物的高效表達工程菌的方法為以本實驗室構建的成熟葡激酶(pSAK136)DNA為模板，將擴增出葡激酶(121)基因片段，與表達載體pBV220重組，轉化宿主菌大腸桿菌DH5α，獲得了高效表達工程菌菌種CGMCC0871。
5.權利要求1所述的重組葡激酶的製備方法。
6.權利要求1所述的重組葡激酶的適當賦形劑的藥用組合物。
7.根據權利要求6所述的藥用組合物在治療心腦血管疾病方面的用途。
全文摘要
本發明涉及一種重組葡激酶(Sak)基因的構建及其表達產物的製備方法，屬生物技術領域。本發明所述Sak為N端缺失15個胺基酸殘基的Sak衍生物，由121個胺基酸組成。改良後的Sak基因在大腸桿菌中高效表達，表達水平比成熟葡激酶表達量提高10％；比活比成熟葡激酶提高約20％；經分離純化獲得單一組份Sak製品，其表達產物具有分子量小、專一性高、溶栓速度快等特點，適宜工業化生產。可用於急性心肌梗塞和腦栓等血栓性急病的治療和預防。
文檔編號A61K38/43GK1511952SQ0215907
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月31日 優先權日2002年12月31日
發明者杜永峰, 左新文 申請人:北京永安世紀軟體技術開發有限公司