用於感測化學品的方法

2023-10-20 14:22:12 1

專利名稱：用於感測化學品的方法
技術領域：
本發明涉及用於感測化學品的方法，尤其涉及利用包含壓電/熱電換能器的化學 感測設備進行免疫測定。
背景技術：
免疫測定是測量生物流體中被分析物存在與否，或者更通常地測量被分析物濃度 的測試。它通常涉及抗原對抗體的特異性結合。抗體可以是多株或者單株的，單株抗體具 有許多益處，包括生產可再現性以及對被分析物一個表位結合的抑制。為了提供被分析物 濃度的可量化測度，將應答與已知濃度的標準樣品相比較。抗體或抗原的濃度可由多種方 法確定，雖然最常用的一種方法是標記抗原或抗體並且檢測標記的存在。免疫測定可以是競爭性或者非競爭性的。在競爭性免疫測定中，未知樣品中的抗 原與被標記抗原(報告物)競爭以與存在的抗體相結合。隨後測量結合至抗體位點處的被 標記抗原的量。顯然應答將與未知樣品中抗體的濃度成反比。在非競爭性免疫測定(也被 稱為免疫分析測定)中，未知樣品中的抗原在存在過量的被標記抗體時與捕獲抗體結合， 由此形成「三明治」並且測量該「三明治」中被結合抗原的量。與競爭性方法不同，非競爭 性方法的結果將與抗原濃度直接成比例。在典型的競爭性免疫測定中，所關注抗原特異性的抗體固定至(即，附著)在聚合 物支持物上，諸如聚苯乙烯的薄片上。待測試一滴樣品(例如，細胞提取物或者血清或尿的 樣品)置於該薄片上。此外，已知量的報告物(即，被標記)抗原也被添加至該樣品。然 後，被標記和未被標記的抗原競爭以與固定聚合物支持物的抗體結合。在形成抗體-抗原 複合物之後清洗該聚合物支持物。確定結合至該薄片的報告物抗原的濃度。來自報告物抗 原的信號於是與樣品內的抗原數量成反比。這種測定以及這種類型測定的其他變化眾所周 知，參見例如"The Immunoassay Handbook, 2nd Ed. 」 David Wild, Ed. ，Nature Publishing Group,2001o這種免疫測定的一個變體是所謂的「置換免疫測定」。在此類測定中，報告物抗原 被預附至存在於聚合物支持物上的抗體。隨後將未知抗原添加至系統並且該抗原從所述支 持物表面置換所述報告物抗原。報告物抗原的損失被確定並且等於樣品中未知抗原的濃 度。然而，報告物抗原置換測量太不直接。例如，Giese等人(US 4, 801,726)描述了一種類似的操作。在一種所謂的「打了 就跑(hit-and-run) 」免疫測定中，預結合至一固定抗原體積的螢光標記抗體在一等分樣品 被添加到流經該體積的含水流時被置換。如果該等分樣品包含被分析物，那麼報告物抗體 的一小部分被置換並在下遊流出物中被螢光測得。這被設計為「重複」免疫測定，重複使用 同一體積多次。這一概念已針對連續篩查和極不穩定的爆炸檢測而有所發展。Ligler等人 (US 5，183，740)描述了一種極為類似的用於TNT的基於螢光檢測體積的系統。同一組人對 其進行了進一步的研究，至基於膜的系統(US 6, 750,031以及Rabbany等人Biosensors & Bioelectronics 1998，13,939-944)。在所有這些實例中，在體積或膜內發生免疫置換並且
4在下遊儀器內進行檢測。Herron等人(US 6，979，567)描述了在競爭性免疫測定中使用全內反射螢光檢測 器，包括檢測從浸透表面置換被分析物。V. I.Chegel等人Sensors Actuators B 1998,48, 456-460 和 P. T. Charles 等人 Anal. Chim. Acta 2004，525，199-204 描述了使用螢光 / 化學 發光方法檢測報告物種類的置換測定。然而，本領域仍然需要一種更為直接的檢測方法。

發明內容
因此，本發明提供一種用於檢測樣品中的被分析物的方法，包括以下步驟提供包含熱電或壓電元件和電極的換能器、固定在換能器上的第一試劑、以及可 釋放地結合第一試劑並且具有附至其上的標記的第二試劑，其中所述換能器能夠將能量變 化轉換成電信號，所述標記能夠吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的能量，並且其中第一試 劑或者第二試劑具有允許彼此結合併且能夠優先結合被分析物或被分析物衍生物的結合 位點；將換能器暴露於樣品，由此允許被分析物或被分析物衍生物與所述結合位點結合 並且置換所述第二試劑；用電磁輻射照射樣品；將所生成的能量轉換為電信號；以及檢測所述電信號。本發明還提供用於檢測樣品內被分析物的設備，包括具有熱電或壓電元件和電極並且能夠將能量變化轉換成電信號的換能器；固定在換能器上的第一試劑；可釋放地結合第一試劑並且具有附至其上的標記的第二試劑，其中所述標記能夠 吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的能量，並且其中第一試劑或者第二試劑具有允許彼此結 合併且能夠優先結合被分析物或被分析物衍生物的結合位點；電磁輻射源；以及用於檢測電信號的檢測器。本發明還提供具有熱電或壓電元件和電極的換能器的用途，用於監測置換免疫測 定中被標記的試劑。


現在將參考附圖描述本發明，其中圖1示出了根據W0 2004/090512的設備；圖2-4示出了本發明的方法的圖形表達；圖5示出了根據本發明的設備；以及圖6和圖7示出了使用本發明方法的針對兩種測定的計數相對時間的圖。
具體實施例方式本發明的方法提供用於檢測樣品中的被分析物。作為第一步驟，本發明包括提供具有熱電或壓電元件和電極的換能器，所述換能器能夠將能量變化轉換成電信號並將樣品 暴露於換能器。這類換能器是本領域內周知的，參見例如W0 90/13017和W0 2004/090512。 在此方面，圖1示出了適於在本發明中使用的化學感測設備1的原理。設備1依靠用電磁 輻射照射物質2時物質2中的發熱。設備1包括熱電或壓電換能器3，它具有電極塗層4、 5。優選情況下，換能器3是極化聚偏氟乙烯膜。電極塗層4、5優選地由厚度大約35nm的 氧化銦錫形成的，儘管從lnm的下限至lOOnm的上限中的任何厚度都是可接受的，但是低於 下限時電導率太低，而高於上限時透光率太低(應當不低於95% T)。使用任何適宜的技術 使物質2保持在換能器3上或者接近換能器3，此處示出為固定在上電極塗層4上。所述 試劑可以是任何適宜的形式，並且可以澱積多種試劑。優選情況下，物質2被吸附在上電極 上，例如經由分子間力(比如離子鍵、氫鍵結合或範德瓦爾斯力)的共價耦合或結合。這種 設備的關鍵特徵在於，在受到電磁輻射源6(比如光，優選情況下是可見光)的照射時物質 2發熱。光源可以是例如LED。光源6用適當波長(如補色)的光照亮物質2。儘管不奢 望成為理論上的結合，但是據信物質2吸收光以產生激發態，然後經歷非輻射衰減從而產 生能量，由圖1中的曲線所示。這種能量的主要形式為熱(即環境中的熱運動)，儘管也可 能產生其他形式的能量，如衝擊波。無論如何，此能量由換能器檢測並轉換為電信號。對本 發明的設備由測定的具體試劑標定，因此並不需要確定由非輻射衰減所產生能量的確切形 式。除非另外指明，否則本文所用的術語「熱」意味著由非輻射衰減所產生的能量。光源6 被定為以照亮物質2。優選情況下，光源6定位成與換能器3和電極4、5基本垂直，並透過 換能器3和電極4、5照亮物質2。光源可以是換能器內的內光源，其中光源是導波系統。波 導可以是換能器本身，也可以是固定在換能器上的附加層。優選地，使用525nm波長，雖然 可以連同描述的有利屬性(例如在W0 2007/107716中)使用其他合適的波長。物質2所產生的能量由換能器3檢測並轉換為電信號。電信號由檢測器7檢測。 光源6和檢測器7都在控制器8的控制下。在一個實施例中，光源6產生一系列光脈衝(除非說明特定波長，否則本文所用的 術語「光」意味著任何形式的電磁輻射)，術語為「斷續光(chopped light)」。在原理上， 單個閃光，即電磁輻射的一個脈衝，便足以從換能器3產生信號。不過，為了獲得可再現的 信號會使用多次閃光，因此實際上需要斷續光。施加電磁輻射脈衝的頻率可以變化。在下 限處，脈衝之間的時延必須足以確定每個脈衝和電信號生成之間的時延。在上限處，每個 脈衝之間的時延必須不會大到使得記錄所述數據所花時間變得不合情理地延長。優選情 況下，脈衝頻率從2至50Hz，更優選情況下，5至15Hz，最優選情況下，10Hz。這分別對應於 20-500mS、66-200mS和100ms的脈衝間時延。此外，所謂的「脈衝間隔」比，即通信號與斷信 號的比值，優選情況下是1，儘管可以使用其他比值而無有害後果。以不同調製頻率或不同 脈衝間隔比產生調製光的電磁輻射源是本領域內公知的。檢測器7確定光源6的每個光脈 衝與檢測器7檢測的來自換能器3的對應電信號之間的時延(或者說「相關延遲」)。申請 人已經發現，這種時延是距離d的函數。確定每個光脈衝與對應電信號之間的時延的任何方法只要提供可再現結果就都 可以使用。優選情況下，測量從每個光脈衝的起點到檢測器7檢測到與熱吸收對應的電信 號的最大值點間的時延。因此，物質2可以與換能器表面分離並仍然能夠檢測到信號。另外，不但所述信號經過能夠向換能器3傳送能量的中間介質可檢測，而且可以區分不同距離d(這已被稱為術 語「深度剖析」)，所收到信號的強度與相距換能器3表面具體距離d處物質2的濃度成比 例。圖2示出了在根據本發明的置換免疫測定中的圖1設備1。在此實施例中，第一試 劑是抗體而第二試劑是被標記的被分析物。圖2中示出了豎直排列的換能器3。如下將更 為詳細地討論這一排列的好處。換能器3塗有圖2所示的第一試劑，作為抗體9 (被固定的 捕獲抗體)。已產生抗被分析物10的抗體9 (參見圖2b)，並且所述抗體9在樣品被引入時 選擇性地結合至被分析物10。換能器還具有被標記的被分析物11 (對應於圖1中的物質 2)。被標記的被分析物11包括標記12，所述標記12則具有(可任選的經由連接體14)附 至其上的多個被分析物半分體13。用過量的被標記的被分析物11預培育抗體9。具有抗 體9層的換能器3隨後典型地由保存劑層(未示出)覆蓋並乾燥。在此狀態中，換能器可 被存儲延長的時間段。使用中，如圖2b所示，換能器被暴露於含有未知濃度的被分析物10的樣品。被分 析物10迅速擴散至換能器表面並且從抗體9置換被標記的被分析物11，參見圖2c。置換 通常會發生，這是因為被分析物具有比被標記的被分析物(第二試劑)更高的結合常數，即 被分析物具有相比於被標記的被分析物(第二試劑)的「附著(on)」反應速率更快的「附 著」速率，或者相比於被標記的被分析物的「脫落(off)，，反應速率更慢的「脫落」速率，或 者以上兩者。所述反應使用換能器3以參考圖1所述的方式實時監測。因為該測定可以在 除了在測定開始時存在於換能器表面上的試劑之外無需任何試劑的情況下執行，所以該測 定也被稱為術語「無試劑的」。優選地，第一試劑和第二試劑是單獨存在的試劑。圖2c中示 出的測定是樣品中存在高濃度被分析物時置換被標記被分析物的圖示。圖2d和2e分別示 出了被分析物濃度較低時的置換。這使得較少的被標記的被分析物11從換能器3的表面 釋放。從表面釋放的第二試劑自由擴散遠離所述表面。雖然從表面移除第二試劑是容易的 (例如，在重力/浮力的作用下)，但是優選地允許第二試劑僅通過擴散與表面分離。本發明的方法允許在無需分離和清洗步驟的情況下實時檢測被分析物10的結合 (儘管是間接通過檢測被標記的被分析物11的置換)。這是本領域內的一大進步。於是， 在優選實施例中，所述測定在測定期間的任何時刻都無需從換能器3中移除樣品的情況下 執行。此外，在將換能器暴露於樣品和照射樣品的步驟之間也不需要其他介入(例如，將結 合的與未結合的第二試劑分離)。圖3示出了其中第一試劑是被固定的被分析物而第二試劑是被標記的抗體的實 施例。圖3a中示出了豎直排列的換能器3。圖3a中的第一試劑是被固定的被分析物15。 第二試劑是被標記的抗體16 (報告物抗體)，對應於圖1中的物質2。被標記的抗體16包 括具有附至其上的多個抗體17的標記12。已產生抗被分析物10的抗體17，並且所述抗體 17在樣品被引入時選擇性地結合至被分析物10。使用中，如圖3b所示，換能器被暴露於含有未知濃度的被分析物10的樣品。被分 析物10快速擴散至換能器表面，這是因為被分析物10具有更高的結合常數或者相比於第 二試劑的「脫落」反應速率更高的「脫落」速率，以從抗體17置換被固定的被分析物15，參 見圖3c。所述反應使用換能器3以參考圖1所述的方式實時監測。已經參考圖2和圖3示出了在添加樣品之間，固定在換能器上的第一試劑和第二
7試劑可釋放地彼此結合。該結合將典型地通過非共價分子間力，例如抗體和抗原之間的結 合或者互補核酸之間的結合。結合是可釋放的，使得該結合可由被分析物或其衍生物打破 從而導致從第一試劑置換第二試劑。允許第一試劑與第二試劑結合的結合位點存在於第一 試劑、第二試劑或者這兩種試劑上，並且能夠優先結合被分析物或者被分析物衍生物。結合 具有優先性使得被分析物的存在導致第一試劑和第二試劑之間的結合被打破，並且具有針 對被分析物或其衍生物的結合位點的第二試劑和第一試劑變得與被分析物或其衍生物結
1=1 o雖然圖2和3中通過抗體，即被固定的捕獲抗體(圖2)或報告物抗體(圖3)，來 例示相關試劑，但是本發明不限於此。於是，雖然圖2中的第一試劑和圖3中的第二試劑優 選地是抗體，但是也可以使用諸如核酸之類的其他試劑。在一個優選實施例中，本發明提供 一種執行(置換)免疫測定以檢測樣品中的被分析物(半抗原)的方法，包括如下步驟提 供包含熱電或壓電元件和電極的換能器、固定在換能器上的捕獲抗體、以及結合捕獲抗體 並且具有附至其上的標記的被標記的被分析物，其中所述換能器能夠將能量變化轉換成電 信號，所述標記能夠吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的能量；將換能器暴露於樣品，由此允 許被分析物或被分析物衍生物與被固定的捕獲抗體結合併且從所述換能器置換所述被標 記的被分析物；用電磁輻射照射樣品；將所生成的能量轉換為電信號；以及檢測所述電信 號。替換地，包括如下步驟提供包含熱電或壓電元件和電極的換能器、固定在換能器上的 被分析物、以及結合被固定的被分析物並且具有附至其上的標記的被標記的抗體，其中所 述換能器能夠將能量變化轉換成電信號，所述標記能夠吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的 能量；將換能器暴露於樣品，由此允許被分析物或被分析物衍生物與被標記的抗體結合併 且從所述換能器置換所述被標記的抗體；用電磁輻射照射樣品；將所生成的能量轉換為電 信號；以及檢測所述電信號。圖2和圖3示出的第一試劑9、15附至換能器3的表面並且優選地被吸收至換 能器上。該表面還可由其他塗層(例如來自SurModics Inc，Eden Prairie, MN, USA的 Stab il coat)覆蓋以使得表面穩固。如上參考圖2和3討論的，標記12能夠吸收由輻射源生成的電磁輻射以生成非輻 射衰減的能量。於是，為了檢測換能器3附近標記12的存在，樣品由一系列電磁輻射脈衝 照射。換能器3將生成的能量轉換成電信號，並且電信號由檢測器7檢測。標記12可以是能夠與由輻射源生成的電磁輻射相互作用以生成非輻射衰減的能 量的任何材料。優選的，標記包括但不限於碳微粒、有色聚合物微粒(例如，有色橡膠)、 染料分子、酶、螢光分子、金屬(例如，金)微粒、血紅蛋白分子、磁性微粒、具有非傳導核心 材料以及至少一個金屬殼層的納米微粒、紅細胞、以及它們的組合。在磁性微粒的情況下，電磁輻射是射頻輻射。上述提及的所有其他標記利用包 括IR或UV輻射的光。金微粒市面有售，並且可以使用公知方法製備(參見例如G.Frens， Nature, 241, 20-22 (1973) ) 0對於納米微粒標記的更詳細解釋參見US 6，344，272和W0 2007/141581。在一個實施例(擴散受控)中，本發明使用具有20至l，000nm，優選地100至 500nm微粒尺寸的微粒。微粒尺寸是指微粒在其最寬點處的直徑。優選地，微粒具有 0. 5-3. Og/mL的密度，更優選地1. 5-2. Og/mL並且最優選地具有1. 8g/mL的密度。在一個尤其優選的實施例中，微粒是具有上述微粒尺寸和密度的碳微粒，雖然也可以使用諸如聚苯 乙烯或乳膠之類的其他材料。在另一實施例(重力輔助)中，本發明使用具有20至l，000nm，優選地100至 500nm微粒尺寸的微粒。優選地，微粒具有1. 5_23g/mL的密度，更優選地15_20g/mL並且 最優選地為19g/mL。在一個尤其優選的實施例中，微粒是具有上述微粒尺寸和密度的金微 粒，雖然也可以使用諸如鋨或銥之類的其他材料。標記12在結合事件已發生時接近換能器。也就是說，標記與換能器表面足夠接近 使得換能器能夠檢測在照射樣品時由標記生成的能量。儘管如此，標記和換能器表面的實 際距離將取決於多個變量，諸如標記的尺寸和特性、抗體及被分析物的尺寸和特性、樣品培 養基的特性、以及電磁輻射的特性和相應的檢測器設置。對於電磁輻射的特性，本發明的設 備可以包括適於生成一系列電磁輻射脈衝的輻射源以及適於確定來自輻射源的每個電磁 輻射脈衝與電信號生成之間的時延的檢測器，由此允許精確確定標記相對於圖1討論的換 能器的定位。雖然認為未知樣品包含被分析物，但是本發明的測定當然可用於確定被分析物的 存在與否。被分析物優選地是小分子，因此所述測定理想地使用這類分子，雖然本發明並不 限於此。本文使用的術語「小分子」是本領域內的術語並且用於與諸如蛋白質和核酸之類 的大分子相區別。小分子在免疫測定領域內通常被稱為「半抗原」，一種當附至大載體分子 (諸如蛋白質)時能夠引起免疫應答的小分子，並且包括諸如激素及合成藥物的分子。這類 小分子通常具有2，000或以下的分子量，經常具有1，000或以下甚至500或以下的分子量。 第一試劑可適於結合至被分析物本身，雖然被分析物在與第一試劑結合之前可以經歷化學 反應或者初始絡合事件。例如，被分析物可以在測定的PH條件下質子化/去質子化。於是， 與第一試劑結合的被分析物可以是被分析物本身或者被分析物的衍生物；這兩者都位於本 發明的範圍內。包含或者不包含所關注被分析物的樣品一般將會是流體樣品並且通常是生物樣 品，諸如像是血液、血漿、唾液、血清或尿的體液。樣品可以包含懸浮顆粒，甚至可以是全血。 本發明的方法的一個優點在於可以對包含懸浮顆粒的樣品執行測定而不會不恰當地影響 測定結果。樣本典型地具有微升量級(例如，1-100 iiL，優選地1-10 iiL)。為了保持流體樣 品，換能器優選地位於具有兩個側壁、一個上表面和一個下表面並且優選地是凹槽(well) 的樣品室內。在一個優選實施例中，換能器集成到室內，即，形成限定室的側壁、或者上或下 表面之一。試劑9和被標記的被分析物11顯然將位於室的內表面以允許與樣品接觸。樣 品可以簡單地由表面張力保持，例如在毛細管道內。在本發明的一個實施例中，重力可用於輔助從換能器的表面置換被標記的被分析 物11。也就是說，換能器形成室的上表面並且所述被標記的被分析物比所述樣品的介質更 為稠密，或者所述換能器形成樣品室的下表面並且所述標記比所述樣品的介質更不稠密。 當所述被標記的被分析物比所述樣品的液體介質更為稠密時，被標記的被分析物在重力的 影響下朝樣品室的下表面(基底)沉積。替換地，被標記的被分析物比所述樣品的液體介 質更不稠密，是的被標記的被分析物在浮力的作用下朝樣品室的上表面(蓋)浮起。換句 話說，通過重力/浮力下的沉積或浮起來幫助對被標記的被分析物的置換。這在參考圖4 詳細地示出。
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圖4a_4e示出了其中換能器形成樣品室的上表面的本發明的測定。在圖4a中，換 能器3包含被固定的抗體9的層和被標記的被分析物11的層。如圖4b所示，樣本被添加 並且被分析物10朝換能器擴散。被標記的被分析物11的置換如圖4c-4e分別針對低、中、 高被分析物濃度示出。被標記的被分析物具有比樣本介質更大的密度並因此趨向於在重力 影響下沉積。本發明還提供用於執行本文描述的測定的設備。在一個優選實施例中，設備實質 上由上述特徵組成。「實質上」意味著無需其他特徵就能執行該測定。該設備可以採用手持 便攜讀取器和包含換能器的一次性設備的形式。在實質上封閉的系統內收集樣品，與第二 試劑混合，並且置於讀取器內，後者會執行樣品照射並且檢測得到的電信號。本發明還提供 具有熱電或壓電元件和電極的換能器的用途，用於上述的監測置換免疫測定中被標記的試 劑。示例例 1活性壓電/熱膜生物傳感器的製備在如下示例中用作感測設備的塗覆氧化銦錫的極化聚偏二氟乙烯(PVDF)雙晶壓 電膜在低溼環境中在聚苯乙烯溶液(1%甲苯)中浸塗以在氧化銦錫之上提供聚苯乙烯層。 該雙晶壓電膜隨後在室溫下整夜培育以在聚抗生蛋白鏈菌素溶液(PBS中200y g/mL，其中 PBS 是包含 2. 7mmol/L KC1、137mmol/L NaCl 和 0. 05% 吐溫的 pH 7. 510mmol/L 磷酸鹽緩衝 液)中浸塗。聚抗生蛋白鏈菌素的製備由Tischer等人(US 5,061,640)描述。為了製備「捕獲」表面，聚抗生蛋白鏈菌素表面用生物素標記的抗睪酮培育以提 供塗覆抗體的表面(C1)，或者用生物素標記的睪酮培育以提供塗覆抗原的表面(C2)。對 於C1，在室溫下在PBS中整夜培育10ug/mL的生物素標記的抗睪酮(HyTest Ltd, Turku, Finland, Cat # 2T2_biotin, or Accurate Chemical Co, ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)並在隨後用過量PBS衝洗並在40°C下乾燥之前用Stabilcoat(SurModics Inc， Eden Prairie,MN, USA)塗覆。對於C2，在室溫下在PBS中整夜培育30nmol/L的7 a-C6_生 物素標記的睪酮(其製備如Luppa et al. Clin. Chem. 1997，43，2345中所述)並在隨後用 過量 PBS 衝洗並在 40°C下乾燥之前用 Stabilcoat(SurModics Inc, Eden Prairie,MN, USA) 塗覆。M 2碳標記的報告物結合物的製備碳標記的報告物結合物實質上按照Van Doom等人的描述製備(US 5，641，689)。 為了製備塗覆抗體的報告物結合物(R1)，室溫下用200i!g/mL聚抗生蛋白鏈菌素溶液在 5mmol/L磷酸鹽緩衝液pH 6. 2中搖動培育lmL的Special Black-4 RCC標稱150nm碳微粒 (Degussa, Essen, Germany)整夜，得到塗覆抗生蛋白鏈菌素的表面(A1)。得到的碳結合物 被清洗(通過離心、粒化和再懸浮)。隨後用1ml的這一塗覆抗生蛋白鏈菌素的碳微粒懸浮 液整夜搖動培育PBS中10ug/mL的生物素標記的抗睪酮(HyTest Ltd, Turku,Finland, Cat # 2T2-biotin，或者 Accurate Chemical Co,ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)。用 pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸鹽緩衝液清洗得到的碳結合物3次(通過離心、粒化和再懸浮) 並在4°C下暗處存儲。為了製備塗覆抗原的報告物(R2)，在5mmol/L磷酸鹽緩衝液pH 6.2中用30nmol/L的7 a -C6-生物素標記的睪酮(其製備如Luppa et al. Clin. Chem. 1997， 43，2345中所述)整夜搖動培育1ml的塗覆抗生蛋白鏈菌素的碳微粒(A1)。用上述pH 8. 5 的0. 05mol/L硼酸鹽緩衝液清洗得到的碳結合物3次並在4°C下暗處存儲在此緩衝液中。例 3金標記的報告物結合物的製備金標記的報告物結合物的製備實質上如Frens G. Nature 1973，241，20-22或者 Roth J所述。膠質金標誌物系統針對光和電子顯微鏡細胞化學領域。可參見Bullock GR， Petrusz P, eds. Techniques in immunocytochemistry, Vol 2. New York, NY, Academic Press，1983，216-284。為了製備塗覆抗體的報告物結合物(R3)，室溫下用200 y g/mL聚鏈 黴抗生物素蛋白溶液在5mmol/L磷酸鹽緩衝液pH 6. 2中搖動培育lmL單分散的標稱150nm 金微粒(BBI International,Cardiff,UK)整夜，得到塗覆鏈黴抗生物素蛋白的表面(A2)。 得到的金結合物被清洗(通過離心、粒化和再懸浮)。隨後用1ml的這一塗覆抗生蛋白鏈 菌素的金微粒懸浮液整夜搖動培育PBS中10ug/mL的生物素標記的抗睪酮(HyTest Ltd, Turku, Finland, Cat # 2T2_biotin,或者 Accurate Chemical Co, ffestbury, New York, USA, Cat # BHS113)。用pH 8. 5的0. 05mol/L硼酸鹽緩衝液清洗得到的金結合物3次(通 過離心、粒化和再懸浮)並在4°C下暗處存儲。為了製備塗覆抗原的報告物(R4)，在5mmol/ L磷酸鹽緩衝液pH 6. 2中用30nmol/L的7 a -C6-生物素標記的睪酮(其製備如Luppa et al. Clin. Chem. 1997，43，2345中所述)整夜搖動培育1ml的塗覆抗生蛋白鏈菌素的金微粒 (A2)。用上述pH 8.5的0.05!1101/1硼酸鹽緩衝液清洗得到的金結合物3次並在41下暗處 存儲在此緩衝液中。例 4塗覆試劑塗覆抗體膜的製備為了製備塗覆試劑塗覆抗體的壓電膜表面，在室溫下用塗覆抗原的碳(R2)或者 塗覆抗原的金試劑(R4)(如上所述)在PBS中整夜培育一片塗覆抗體的壓電膜(如上所述， C1)，隨後用過量PBS清洗該壓電膜並在40°C乾燥前用Stabilcoat(SurModics Inc，Eden Prairie, MN, USA)塗覆，以分別給出塗覆碳試劑(C3)或者塗覆金試劑(C4)的反應表面。M 5塗覆試劑塗覆抗原膜的製備為了製備塗覆試劑塗覆抗原的壓電膜表面，在室溫下用塗覆抗體的碳(R1)或者 塗覆抗體的金試劑(R3)(參見所述)在PBS中整夜培育一片塗覆抗原的壓電膜(如上所述， C2)，隨後用過量PBS清洗該壓電膜並在40°C乾燥前用Stabilcoat(SurModics Inc, Eden Prairie, MN, USA)塗覆，以分別給出塗覆碳試劑(C5)或者塗覆金試劑(C6)的反應表面。例 6測定塗覆試劑的壓電膜傳感器、碳標記、簡單「擴散」測定如圖5所述，製造傳感器1以執行測定。傳感器1由一片塗覆抗體的壓電膜3(如 上所述，C3或者C5)和一片透明聚碳酸酯蓋膜14製成。上述兩膜用間隔物18隔開約500 微米的距離，其中該間隔物18由一片塗覆粘合劑的壓敏聚酯膜製成並被衝切形成兩個尺 寸不等的室19、20 ；大小約為30 x 10 x 0.5mm的一個室用於測定反應而大小為10 x 10 x 0. 5mm的較小的第二室20用於控制反應。提供結構用以允許至壓電膜頂表面和底表面的電連接，由此檢測生成的電荷。通過用PBS中的睪酮標準品(通過填充孔21)填充較大的室19以給出 0. Ι-lOOnmol/L最終濃度範圍來執行測定。控制室20同時填充與測定室相同的反應混合 物，不同之處在於用PBS代替睪酮標準品。入口和出口被密封並將室組件連至測試儀器，使 得壓電膜垂直於室的側面定向。隨後順序用四個LED(波長625nm)以斷續LED光照射壓電 膜，其中三個LED照射測定室表面的不同區域，一個照射控制室的壓電膜表面。對於每個 LED脈衝，使用鎖定放大器和模數(ADC)轉換器測量跨壓電膜的電壓。ADC信號隨時間的標 繪以及ADC計數/min相對於睪酮濃度的關係在圖6中示出。數據已在反應起點被調零，因 此僅例示了信號的變化。例 7測定塗覆試劑的壓電膜傳感器、金標記、簡單「重力協助擴散」測定為了執行該測定，如例6所述製造樣品室(如上所述，C4或C6)。以與例6相同的 方式設置測定，不同之處在於壓電膜水平於室的上面定向。隨後順序用四個LED(帶有使用 檢測較大金標記的波長，標稱值為625nm，參見WO 2007/107716)以斷續LED光照射壓電膜， 其中三個LED照射測定室表面的不同區域，一個照射控制室的壓電膜表面。對於每個LED 脈衝，使用鎖定放大器和模數(ADC)轉換器測量跨壓電膜的電壓。ADC信號隨時間的標繪以 及ADC計數/min相對於睪酮濃度的關係在圖7中示出。數據已在反應起點被調零，因此僅 例示了信號的變化。
1權利要求
一種用於檢測樣品中的被分析物的方法，包括以下步驟，提供包含熱電或壓電元件和電極的換能器、固定在換能器上的第一試劑、以及可釋放地結合第一試劑並且具有附至其上的標記的第二試劑，其中所述換能器能夠將能量變化轉換成電信號，所述標記能夠吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的能量，並且其中第一或者第二試劑具有允許彼此結合併且能夠優先結合被分析物或被分析物衍生物的結合位點；將換能器暴露於樣品，由此允許被分析物或被分析物衍生物與所述結合位點結合併且置換所述第二試劑；用電磁輻射照射樣品；將所生成的能量轉換為電信號；以及檢測所述電信號。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述換能器位於具有兩個側壁、一個上表面和一個 下表面的樣品室內。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述換能器形成樣品室的一個側壁。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中所述換能器形成樣品室的上表面並且所述第二 試劑比所述樣品的介質更為稠密。
5.如權利要求1或2所述的方法，其中所述換能器形成樣品室的下表面並且所述第二 試劑比所述樣品的介質更不稠密。
6.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述第一試劑是被固定的抗體並且所述第二 試劑是被標記的被分析物。
7.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述第一試劑是被固定的被分析物並 且所述第二試劑是被標記的抗體。
8.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述換能器還包括塗覆在換能器、第一試劑 和第二試劑之上的保存塗層。
9.如在前任一權利要求所述的方法，其中標記選自碳微粒、有色聚合物微粒、染料分 子、酶、螢光分子、金屬(例如，金)微粒、血紅蛋白分子、磁性微粒、具有非傳導核材料以及 至少一個金屬殼層的納米微粒、紅細胞、以及它們的組合。
10.如在前任一權利要求所述的方法，其中所述第一試劑吸附在所述換能器上。
11.如在前任一權利要求所述的方法，其中所述樣品包括懸浮顆粒。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述樣品是全血。
13.如在前任一權利要求所述的方法，其中所述輻射源適於生成一系列電磁輻射脈衝， 以及所述檢測器適於確定來自輻射源的每個電磁輻射脈衝與電信號生成之間的時延。
14.如在前任一權利要求所述的方法，其中所述方法在將樣品暴露於換能器和照射樣 品的步驟之間無需從換能器移除樣品的情況下進行。
15.如前述任一權利要求所述的方法，其中所述第一和第二試劑是唯一存在的試劑。
16.用於檢測樣品中的被分析物的設備，包括具有熱電或壓電元件和電極並且能夠將能量變化轉換成電信號的換能器；固定在換能器上的第一試劑；可釋放地結合第一試劑並且具有附至其上的標記的第二試劑，其中所述標記能夠吸收 電磁輻射以生成非輻射衰減的能量，並且其中第一或第二試劑具有允許彼此結合併且能夠優先結合被分析物或被分析物衍生物的結合位點；電磁輻射源；以及用於檢測電信號的檢測器。
17.如權利要求16所述的設備，還包括具有兩個側壁、一個上表面和一個下表面的樣 品室並且其中所述換能器位於所述樣品室內。
18.如權利要求16或17所述的設備，其中所述換能器形成樣品室的一個側壁。
19.如權利要求16或17所述的設備，其中所述換能器形成樣品室的上表面並且所述第 二試劑比所述樣品的介質更為稠密。
20.如權利要求16或17所述的設備，其中所述換能器形成樣品室的下表面並且所述第 二試劑比所述樣品的介質更不稠密。
21.如權利要求16至20中任一項所述的設備，其中所述第一試劑是被固定的抗體並且 所述第二試劑是被標記的被分析物。
22.如權利要求16至21中任一項所述的設備，其中所述第一試劑是被固定的被分析物 並且所述第二試劑是被標記的抗體。
23.如權利要求16至22中任一項所述的設備，還包括塗覆在換能器、第一試劑和第二 試劑之上的保存塗層。
24.如權利要求16至23中任一項所述的設備，其中標記選自碳微粒、有色聚合物微 粒、染料分子、酶、螢光分子、金屬(例如，金)微粒、血紅蛋白分子、磁性微粒、具有非傳導核 材料以及至少一個金屬殼層的納米微粒、紅細胞、以及它們的組合。
25.如權利要求16至24中任一項所述的設備，其中所述第一試劑吸附在所述換能器上。
26.如權利要求16至25中任一項所述的設備，其中所述輻射源適於生成一系列電磁輻 射脈衝，以及所述檢測器適於確定來自輻射源的每個電磁輻射脈衝與電信號生成之間的時 延。
27.如權利要求16至26中任一項所述的設備，其中第一和第二試劑是所述設備中唯一 存在的試劑。
28.具有熱電或壓電元件和電極的換能器的用途，用於監測置換免疫測定中被標記的 試齊11°
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測樣品中的被分析物(10)的方法，包括以下步驟提供包含熱電或壓電元件和電極的換能器、固定在換能器上的第一試劑、以及可釋放地結合第一試劑並且具有附至其上的標記的第二試劑(11)，其中所述換能器能夠將能量變化轉換成電信號，所述標記能夠吸收電磁輻射以生成非輻射衰減的能量，並且其中第一或者第二試劑具有允許彼此結合併且能夠優先結合被分析物或被分析物衍生物的結合位點；將換能器暴露於樣品，由此允許被分析物或被分析物衍生物與所述結合位點結合併且置換所述第二試劑；用電磁輻射照射樣品；將所生成的能量轉換為電信號；以及檢測所述電信號。本發明還提供了用於執行所述方法的設備。
文檔編號G01N33/543GK101981448SQ200980111668
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月31日 優先權日2008年4月2日
發明者S·A·羅斯, T·J·N·卡特 申請人:維瓦克塔有限公司