一種具有高效解磷作用的黑麴黴菌株及其應用的製作方法
2023-10-18 07:12:14 1
一種具有高效解磷作用的黑麴黴菌株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種高效的解磷菌黑麴黴(Aspergillusniger)。本發明所述枯草芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8240。本發明涉及的黑麴黴(Aspergillusniger)具有較高的解磷作用，不汙染環境，生態安全。該高效黑麴黴(Aspergillusniger)單獨使用或與其它植物生長所需要的有機、無機營養成分一起使用，製備成生物複合肥料具有提高產量和改良品質的作用。
【專利說明】一種具有高效解磷作用的黑麴黴菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物和生物肥料領域，特別是涉及黑麴黴，具體而言，本發明涉及一種高效解磷作用的黑麴黴及其應用。
【背景技術】
[0002]磷肥能夠促進植物花芽分化，提早開花結果，促進幼苗根系生長和改善果實品質。施磷能夠促進各種代謝正常進行，植物生長發育良好，同時提高植物的抗寒性和抗旱性。由於磷與糖類、蛋白質和脂肪的代謝和三者相互轉變都有關係，多以不論栽培糧食作物、豆類作物和油類作物都需要磷肥。缺磷時，蛋白質合成受阻，新的細胞質和細胞核形成較少，影響細胞分裂，生長緩慢，也少，分枝或分櫱減少，植株矮小，葉片暗綠，可能是細胞生長慢，葉綠素含量相對提高。某些植物葉子有時呈紅色或紫色。因為缺磷阻礙了糖分運輸，也自己累了大量的糖分，有利於黃色素苷的形成。缺磷時，開花期和成熟期都延遲，產量降低，抗性減弱。但我國有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用，此外，大量使用化肥明顯造成土壤板結、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化嚴重等不良後果。因此，提高磷的利用率一直是農學、土壤學、生態環境和微生物學研究者關注的執佔。
[0003]人們在20世紀初開始注意到微生物與土壤磷之間的關係。Sackett (1908年)發現一些難溶性的複合物施入土壤中，可以被作為磷源而應用，他們從土壤中篩選出50株細菌，其中36株在平板上形成了肉眼可見的溶磷圈。1948年Gerretsen發現植物施入不溶性的磷肥，經接種土壤微生物後，促進了植株的生長，增加磷的吸收。他分離出了這些微生物，發現這些微生物可幫助磷礦粉的溶解。從此，許多科學家致力於解磷菌的研究，相繼報導了許多微生物具有解磷作用。`
[0004]本申請發明人經過多年悉心研究，從植物根際土壤中分離到一株新的黑麴黴菌株，該菌株具有較強的解磷作用，能把無效的磷有效的轉變成可用磷。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種新的黑麴黴菌株，所述菌株具有較好的解磷作用。
[0006]本發明所述的黑麴黴(Aspergillus niger)已經於2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.8240.進一步地，本發明提供上述黑麴黴在解磷方面的用途。
[0007]進一步地，本發明的黑麴黴可以製成微生物菌劑，即將所述菌株在H)培養液中(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000 mL)培養，培養溫度為27 °C，培養天數為5天，轉速為200 rpm，培養液過濾後，將菌液細胞數調節為IO8個/mL，即製得本發明的黑麴黴微生物菌劑。
[0008]本發明所提供的黑麴黴是從植物根際土壤中分離得到的，其實驗室命名為菌株Fdpal0
[0009]菌株Fdpal在PDA固體培養基在PDA培養基上培養，肉眼觀察菌落生長特徵、測量菌落生長速度，光學顯微鏡下觀察菌絲形狀及孢子大小、形狀、類型等。通過觀察發現，自中伸出，直徑15~20pm，長約I~3mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5~4.0 μ m。分生孢子頭球狀，直徑700~800 μ m，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，後變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。根據《真菌鑑定手冊》等方法初步鑑定菌株Fdpal為黑麴黴屬，利用分子生物學技術對其ITS序列鑑定後該菌為黑麴黴Aspergillus niger。
[0010]本發明的效果
在平板法中，即將解磷菌在含有難溶性磷酸鹽或有機磷的固體培養基上培養，菌落周圍產生較大的溶磷圈，本發明的黑麴黴經磷鑰藍分光光度法測得其解磷效果為537.142mg/L,說明本發明菌株具有較強的解磷作用。
【具體實施方式】
[0011]本發明公開了一種高效解磷菌黑麴黴，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數來實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，這些都被視為包括在被發明內。本發明所述的黑麴黴已經通過較規範的實施例進行了描述，相關人員明顯能在不擺脫本
【發明內容】
、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動和適當的變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0012]下面結合實施例，進一步闡述本發明。
[0013]實施例1微生物從土樣中的分離
從河北衡水湖附近採回的黃頂菊根際土壤，稱取IOg 土壤用90mL無菌水進行混勻，然後在從中取ImL樣用9mL無菌水進行稀釋`，以此進行6次，稀釋成10_6、10_7、10_8 3個梯度，移取最後三個梯度的菌懸液100微升，塗布於蒙金娜無機磷培養基(葡萄糖10 g，(NH4)2SCM
0.5 g, NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeS047H20 0.03 g，MnS044H20 0.03 g，MgS047H20 0.3 g,磷礦粉10 g，酵母膏0.4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 ml, pH 7.0~7.5)平板上，以最後一次的稀釋液作為對照，於28°C下培養，並每24h觀察一次。選擇對照中無菌落，而此前的稀釋液中長出菌落的菌株，根據菌落形態、顏色等特徵跳取單菌落於液體蒙金娜無機磷培養基中培養，並純化編號。
[0014]實施例2解磷菌株的篩選
在無菌環境下，將所有菌株接種到蒙金娜培養基上，30°C培養7天。觀察平板中菌落生長情況，根據產生解磷圈大小篩選出高效解磷菌。
[0015]實施例3菌株的ITS序列測定和分析及生理生化試驗鑑定
ITS鑑定:將篩選菌株的孢子液接入ro液體培養基中，28°C搖床培養48 h，過濾獲得菌絲，提取真菌基因組DNA。以提取的真菌DNA作為模板，以ITS5和ITS8引物對進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μ 1，反應體系為:基因組DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L，NSl 弓丨物 I μ L, NS8 弓丨物 I μ L, dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反應條件為:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循環 30 次；72°C 10 min。PCR 擴增產物送上海生工生物技術有限公司測序後，將獲得的DNA序列，輸入NCBI，用Blast程序與資料庫中的所有序列進行比較分析。
[0016]同源比較結果如下:
將該PCR擴增產物在GenBank中進行blast比對結果表明，本發明的菌株Fdpal與其高度同源的50個菌種均是黑麴黴屬，其同源性均在99%以上。經過序列分析顯示，本發明所分離的菌株屬於黑麴黴。
[0017]實施例4本發明所述黑麴黴微生物菌劑的製備
將保藏編號為CGMCC N0.8240的黑麴黴在H)培養液中培養，培養液溫度為27 V,天數為5天,轉速為200rpm, pH值為8。發酵培養後，加入5%的鹿糖,然後過濾並調節菌液細胞數為IO8個/mL，即製得本發明的黑麴黴微生物菌劑。
[0018]實施例5鑰銻鈧比色法測定微生物解磷能力
在含磷的溶液中，加入鑰酸銨，在一定酸度條件下，溶液中的磷酸與鑰酸絡合形成黃色的磷鑰雜合酸一磷鑰黃，然後用抗壞血酸加酒石酸銻鉀作還原劑，可以使磷鑰雜多酸轉化成穩定的藍色溶液(鑰藍)，其顏色深淺與磷含量成正比關係，由此可進行比色定量.用分光光度計在波長700 nm處測定鑰藍的吸光值，以定量分析磷含量。
[0019]磷標準曲線的繪製
依次吸取0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 5 mg/L磷酸標準溶液入試管，各加入2 mL鋁鋪抗顯色劑，以蒸懼水定容至20 mL,搖勻靜置15-20 min後,700 nm下測定吸光度「以吸光度為縱坐標，以磷濃度為橫坐標，繪製磷標準曲線」，此時各管中磷濃度分別為:0.00,0.20、
0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L。
[0020]培養液中可溶性磷含量的測定
取I mL在難溶性無機磷液體培養基(葡萄糖10 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl0.3 g，MgSO4.7Η20 0.3 g，FeSO4.7H20 0.03 g，MnSO4.H2O 0.03 g, Ca3 (PO4)2 5.0 g，定容至1000 mL, pH 7.0~7.5)中培養4d後的菌體發酵液以10000 g離心10 min，上清液經適當稀釋後加吸取200 PL入比色板，再加入鋁銻抗顯色劑2 mL,蒸餾水定容至20 mL,靜置15-20 min後，700 nm下測定可溶性磷含量為537.142 mg/L。
[0021]本發明的一種高效解磷菌黑麴黴及其應用已經通過具體的實例進行了描述，本領域技術人員可借鑑本
【發明內容】
，適當改變原料、工藝條件等環節來實現相應的其它目的，其相關改變都沒有脫離本發明的內容，所有類似的替換和改動對於本領域技術人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發明的範圍之內。
【權利要求】
1.一種黑麴黴(Aspergillus niger)，其特徵在於，保藏編號為CGMCC N0.8240，其於2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。
2.根據權利要求1所述的黑麴黴在土壤解磷方面的應用。
3.—種微生物菌劑，其特徵在於，將權利要求1所述的枯草芽孢桿菌在H)培養液中培養，培養液溫度為27 °C，天數為5天，轉速為200 rpm，然後過濾並調節菌液細胞數為IO8個/mL，即製得微生物菌劑。
【文檔編號】B09C1/10GK103805518SQ201310474986
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】時翠平, 趙斌, 霍靜倩, 董金皋, 張金林, 齊萌 申請人:河北農業大學