A型肝炎病毒疫苗的製作方法

2023-10-18 07:11:24

專利名稱：A型肝炎病毒疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高純化A型肝炎病毒疫苗的生產。
1973年Feinstone等人(Science 182，p1026)已經使用免疫電子顯微鏡發現傳染性肝炎病原體，就是後來所說的A型肝炎病毒。
Provost等人(P.S.E.B.M.160，p2113，1979)首先報導按照一種方法在活體外培養A型肝炎病毒(HAV)，該方法將被HAV感染的狨肝用作肝外植體培養物和胎兒恆河猴腎(FRhK6)細胞培養物(US-4164566)的接種物。在一個後來的發明中，直接接種HAV，這種不預先經過一種非人靈長類而進行的方法已成功地開始用於在活體外繁殖HAV(Provost等人，P.S.E.B.M.167，p201(1981);US-5021348)。
從該工作已證實，通過在活體外培養使HAV減毒。此外已證實，在活體外重複的繼代移種中，因為病毒變得適應被培養的細胞，HAV的培養物成為多產，並加速複製速度。進一步的研究證明在非人靈長類中活的減毒病毒(Provost等人，J.Med Voil.20，p165(1986))和福馬林失活的HAV(US-4164566，US-5021348，Provost et.al.，in Viral Hepatitis and Liver Disease，p83-86，1988-Alan R.Liss，Inc.)兩者的防護效能。從上述工作，可清楚看出，或者失活的致免疫HAV或者減毒的致免疫HAV是可接受的疫苗候選者。但是，如果一種用於人的安全的HAV疫苗在市場上是可以買到的，那末就需要一種可再現的工業規模生產高純度抗原的方法。
已經公開了用於部分純化整個HAV病毒粒子的各種方法，該方法是為了研究和描述起始病毒粒子性能。例如參見Hornbeck，C.L.等人，Intervirology 6，309-314(1975);Locarnini，S.A.等人，Intervirology 10，300-308(1978);Siegl，G.等人，J.Virol.26，40-47(1978);Siegl，G.等人，J.Gen.Virol.57，331-341(1981);Siegl.G.等人，Interrirology 22，218(1984);Hughes，J.V.等人，J.Virol.52，465(1984)和 Wheeler，C.M.等人，J.Virol.58，307(1986)。
所有這些方法是難以操作、不實用的，並使用極昂貴的步驟，例如蔗糖梯度離心或CsCl-密度梯度離心。此外，這些方法適合於較小的生產規模，而儘管一些著作已報導其製品是高純化的，但製品的精確分析已證實，檢測出不足以支持關於純度的任何最高水平要求的參數。因此，Lewis等人(歐洲專利申請0302692，1989年2月8日公布)揭示一種方法，它包括(a)分裂、萃取和濃縮HAV感染的細胞;(b)液流以高鹽濃度經過陰離子交換色譜分離除去核酸汙染物;(c)凝膠過濾色譜分離。在後來的著作中，Lewis等人(歐洲專利申請0468702，1989年7月8日公布)通過包括去除汙染的碳水化合物的離子交換吸附/解吸步驟來改進這種方法。在發表的這兩篇著作中，生該HAV的規模是較小的，並且，不會遇到大規模以至工業規模的本發明提出的問題。此外，通過凝膠電泳製品的考馬斯(coomassie)或銀染色法評定製品的純度。這種鑑定方法是一種測量蛋白質純度的方法，但它不是定量的，而且它不能提供關於其他汙染物，例如類脂、碳水化合物、核酸或低分子量有機物存在或不存在的信息。
在兩篇EP 0468702A2和EP 0302692A2公開說明書中曾指出，已有方法為了獲得和純化HAV使用一個或多個步驟，這些步驟由於使用去汙劑和外源酶可能不被食品醫藥管理局批准。在本發明中，雖然去汙劑和外源酶都使用，但本發明揭示了用於去除這些有效試劑的方法，並且證實，該製品含有低於這些添加物的檢驗極限值，同時是純的或比在上述公開文獻中報導的HAV製品更純的製品。
此外，Lewis，Moritsugu等人(歐洲專利申請0339668，1989年11月2日公布)描述一種方法，它包括(a)加溶、萃取、濃縮、DNase/RNase及蛋白酶處理;
(b)蔗糖密度分離(它分離含有和缺少衣殼的RNA);以及(c)凝膠過濾色譜分離。
再者，這種方法在生產規模上，尤其是在蔗糖密度分離步驟上受到限制。此外，難以確定製品的純度，並且在這些公開文獻中在任何絕對意義上沒有報導產品的純度。
Lino等人(Vaccine，vol＃10，p5-10(1992))報導了關於Moritsugu方法的改進。用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳和密度測定法檢測該方法的製品，結果表明，在其純化的HAV中殘留外源蛋白質低於1.9%。還可以斷定，在其0.5μg的純化HAV中，存在低於5pg的殘留宿主細胞核酸。然而，由於其生產過程的局限性，大規模生產HAV是不現實的，並且沒有通過大量參數報導絕對純度。
在另一報告中，Kusov等人(Vaccine，9，540(1991))在類似活體內的細胞中培養HAV，並且通過有機萃取、DNase處理和在多孔矽膠顆粒上進行色譜分離來純化病毒。此外，未指出製品的絕對純度，而只有可測量性的某種指示。
儘管在這些公開文獻中關於HAV疫苗純度的不可靠性，但對於疫苗製品來說，根據表明其生產者報導的不同製品中的相當數量HAV的相對抗原性，與本發明相比較還是可能的。
本發明的製品是一種免疫原，它具有在這種表示HAV純度水平和在此之前只有熱切期望的生產規模的揭示中所描述的絕對純度特性。本發明使所報導的離小規模很遠的用於生產HAV疫苗的中間試驗過程，使工業生產一種能再現高質量、高純化、安全的HAV疫苗第一次成為現實。
一種提供能再現的，以工業規模方式生產具有HAV蛋白質純度大於95%的穩定的HAV疫苗製品的方法，該方法包括在一個大尺度的靜態表面生物反應器中培養HAV、去汙劑收穫病毒、核酸酶處理、濃縮、有機溶劑萃取、離子交換色譜分離和凝膠過濾色譜分離。DNA、碳水化合物、RNA和類脂的含量表徵疫苗的特性。


圖1是用於臨床試驗用A型肝炎病毒疫苗生產的主要過程的組合流程圖。左分路代表用於階段Ⅰ/Ⅱ臨床試驗的已有技術方法，該臨床試驗應用一種輥式瓶生產過程。用於門羅(Monroe)效能研究(New England J.of Med.，327;453-457 1992)的新方法是在右分路，並且在中部代表本發明的生產過程。
圖2是在過程內分析中使用以磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)洗脫的HPSEC TSK PW 4000柱的分析測量結果。這種分析已相對於高分子量標準物進行校準，並呈現一種具有A型肝炎病毒稀釋物的線性面積應答。這種分析在以後的純化步驟中是特別有用的。在圖中出現四個來自生產過程的最後四個步驟的色層分離譜。分別利用二種紫外光(UV)在214nm(上跟蹤)和260nm(下跟蹤)監測色譜分離。在PEG小片再懸浮後，利用這種分析首次看到對應於A型肝炎病毒的峰值(圖幅A)。氯仿萃取步驟去除大量的高分子量的紫外光(UV)吸收物質(圖幅B)。陰離子交換色譜分離用於濃縮病毒(圖幅C)，而色譜分離提供高純化病毒製備(圖幅D)。純化的A型肝炎病毒在260或280nm範圍顯示差的吸收率，這樣僅有214nm跟蹤出現。在這種分析條件下，HAV製品是一個單一的對稱峰值，並因而這種分析提供一種測量HAV純度的方法，與使用SDS PAGE的分析無關。
圖3表示MRC-5細胞在玻璃、聚苯乙烯和316不鏽鈉上生長。以時間函數繪製出細胞表面濃度。以大約10000/cm2密度將細胞接種在各種材料試片上，並且試片每天為細胞計數服務。玻璃條狀蓋板和316不鏽鋼試片上的細胞在含90ml培養基(0.6ml/cm2)的150cm2陪替氏培養皿中培養;用7.5ml培養基(0.3ml/cm2)培養生長在25cm2T-燒瓶中的細胞。
圖4表示MRC-5細胞生長和在316不鏽鋼試片上生長細胞的殘留葡萄糖濃度。對於在25cm2不鏽鋼試片上生長的細胞，以時間函數繪製出細胞表面濃度(細胞/cm2)和葡萄糖濃度(mg/cm2)。
圖5是在不鏽鋼網上MRC-5細胞生長的光學顯微照片。以5000-10000細胞/cm2接種細胞並培養超過兩周。放大倍數40X。
圖6是生長在316不鏽鋼網上的MRC-5細胞的能生存和不能生存的染色。細胞用螢光素二乙酸酯(FDA)和溴化乙錠(EB)，按照在實施例14的材料和方法部分中所描述的方案進行染色，然後用掃描雷射共焦顯微鏡觀察;材料以57μm處加強的方式被掃描。圖6A對應於來自螢光素的螢光，並表示能生存的細胞。圖6B是由於溴化乙錠染色DNA而造成的螢光，表示細胞接近完整的生存能力。對溴化乙錠的正控制示於圖7。
圖7表示溴化乙錠染色的不能生存的MRC-5細胞。生長在316不鏽鋼網上的細胞通過用甲醇處理成為無生存力的。在用PBS充分漂洗和使之乾燥後，用FDA/EB染色細胞至對FDA起負控制作用及對溴化乙錠起正控制作用(用圖表示)。對於負控制沒有觀察到由於螢光素產生的螢光。
圖8表示對在一個網狀靜態混合反應器中的每個單元繪製出種植功效，使用重力沉積或培養基再循環方案。單元編號為1-5，1是頂部單元，4或5是底部單元(單元4用於重力沉積試驗，單元5用於再循環試驗)。這裡所表示的種植功效是全部被種值的百分數;全部種植功效約為90%。再循環數據是3個試驗的平均值，而重力沉積的數據是取自單個試驗。再循環速度大約是6cm/h。
圖9表示對於包括固體鈦和網狀316不鏽鋼單元的反應器，作為時間函數的葡萄糖攝入率(GUR)。示於圖9A中的GUR是根據時間(d)以每cm2為基準(μg/cm2-d)，而以每個反應器容積為基準的GUR繪製在圖9B中。圖9A中的數據取決於單元的預測的表面積，而圖9B由於兩個反應器是相同容積沒有具體預測。
圖10表示對於實心和網狀靜態混合器，在連續溶胞產生中觀察到的總蛋白質百分數。對於溶胞產物1-4的記錄在下文中描述。通過顯微鏡觀察，固體單元沒有細胞碎片，而網狀單元在第四次溶解後含有大量細胞碎片。
圖11表示對於316不鏽鋼靜態混合反應器，作為時間函數的葡萄糖攝入率。該反應器在第7天時用MOI1進行感染，並在第28天收穫。
圖12表示對於在圖11中所示的網狀靜態混合反應器，在連續溶胞產物中的總蛋白質和HAVAg的百分數。對於溶胞產物1-4的記錄在下文中描述。由於用低效的PBS洗滌，溶胞產物1的總蛋白質是人為的高。
圖13表示MOI對細胞生長和葡萄糖消耗的影響。細胞用含HAV CR326F P28的MOI 0.1和10感染。對於該系統直到感染後第8天未觀察到細胞密度(13A)和殘留葡萄糖(13B)的差別。在8天時進行全部培養基的再供入。
圖14示出根據BSA標準測定的細胞蛋白質與細胞數的關係曲線。用等式Y(104)＝-0.09+0.42X，r＝0.99描述最適合的線。該圖證明，一單個曲線提供通過總蛋白質測量MRC-5細胞數目的方法，而與細胞「狀態」無關。
圖15是圖14的重畫曲線，指出每個數據點的時間。
圖16表示總蛋白質轉換成細胞數接近使用Coulter計數器得到的細胞密度，可以認為，這種偏差是由於在收穫T-25s(為了一致性使用2×0.08ml/cm2)中使用少量體積的溶解緩衝液造成的。
圖17表示經過溶劑萃取步驟純化，HPSEC處形圖(一致性批量生產)。
圖18表示經過溶劑萃取步驟純化，HPSEC外形圖(中間規模批量)。
圖19表示混合時間對Hep A/雜質比例的影響。
圖20表示混合時間對Hep A和雜質面積的影響(振動器，50ml瓶，6分鐘)。
圖21表示混合時間對Hep A和雜質面積的影響(振動器，500ml容器，2分鐘)。
圖22表示混合時間和試管體積對Hep A和雜質面積的影響(振動器)。
圖23表示溶劑/含水比例對Hep A/雜質比例的影響。
圖24表示溶劑/含水比例對Hep A和雜質面積的影響(振動器)。
圖25表示混合時間和型式對Hep A/雜質比例的影響。
圖26表示用HPSEC確定的A型肝炎病毒樣的穩定性。
圖27表示鹽對A型肝炎病毒溶解度的影響(以4次方)。
圖28表示鹽對A型肝炎病毒溶解度的影響(以4次方)。
圖29表示分子量校準曲線，PW4000xl。
圖30表示對數A型肝炎病毒峰值面積V.對數Hep A濃度。
圖31表示A型肝炎病毒校準曲線。
圖32表示過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物樣品的對比，紫外光214nm。
圖33表示過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物樣品的對比，紫外光260nm。
圖34表示PEG小片再懸浮樣品。紫外光在214nm。
圖35表示氯仿萃取的含水相樣品，該樣品來自Rx2011008。
圖36表示陰離子交換產物樣品，該樣品出自Rx2009854。紫外光214nm。
圖37表示大小排阻色譜法產物。紫外光214nm。
圖38表示出自Rx2011008的SEC產物樣品。紫外光214nm。在約49分鐘可看到殘留峰值。
圖39表示11組樣品的EIA和HPSEC結果的相關性。
圖40表示13個A型肝炎病毒組中的4個樣品的面積百分值。
本發明的工業上適用的純化過程包括純化任何A型肝炎病毒(HAV)，不管是由減毒的或強毒的HAV衍生的，還是在任何細胞株、細胞系，對HAV感染敏感的培養物中產生的。此外，所有HAV衣殼，不管空的(沒有病毒核酸)還是完整的(包含病毒核酸)都包括在本發明的方法中。
傳代28的HAV(P28CR326F′;涉及由CR326產生的變種的分類學，例如CR326F和CR326F′，以及這種術語與絕對傳代水平的相互關係，參見Provost等人，J.Med.Virol.，20165-175，1986)在本發明中僅為所述目的用於感染MRC-5細胞，並且用P29.P28CR326F′培養產生的物質是一種減毒的HAV系。其他被本發明包括的HAV系包括可以用普通技術減毒的HAV系。對HAV繁殖合適的其他細胞系包括Vero、FL、WI-38、BSCI和FRhK6細胞。在細胞培養物中用於HAV繁殖的這些和其他體系在下述文獻中已描述Gerety，R.J.「Active Immunization Against Hepatitis A」，Gerety，R.J.(ed.)Hepatitis A Academic Press 1984，pp.263-276，及Ticehurst，J.R.，Seminars in Liver Disease6，46-55(1986)。原則上任何細胞系，例如任何人的二倍體成纖維細胞系，只要是對HAV感染敏感，都可以用作HAV的宿主細胞。用於疫苗生產的優選細胞系是MRC-5。
本發明的工業規模方法包括下述步驟
(a)在合適的培養容器和培養基中培養大量A型肝炎病毒(HAV)達到此目的優選方式包括，但不限於，使用適合在人二倍體肺細胞中生長的HAV，該肺細胞適合於疫苗生產。W138細胞或MRC-5是合格的。這些細胞已生長在微型載體上或作為在燒瓶或者輥式瓶中的細胞片生長。本發明的方法使用大表面積、多層生物反應器，如NUNC CELL FACTORY、COSTAR CUBE靜態表面反應器(SSR)，或者靜態混合器反應器，例如在US-4296204和4415670中所述的反應器，或者如本文中在不鏽鋼、網、靜態表面混合器中描述的另一種反應器，這取決所要求的生產規模。因此，在本發明的一種優選的實施方案中，MRC-5細胞生長在85000cm2COSTAR CUBE SSR中的細胞片中，或者甚至更大表面積的網狀SSR中的細胞片中，以足以達到使有效的細胞培養物感染的大量HAV的感染物(MOI)進行感染。約0.01-10的MOI是滿意的。通過使用來自培養約28天的SSR上清液部分的HAV可方便產生原種。
在一種優選的具體方案中，HAV在生長在不鏽鋼網上的MRC-5細胞上培養(見實施例14)。按照這種實施方案，使用一種生物反應器，在該反應器中使用由任何合適的無毒材料(細胞能在其上生長)製成的網狀單元。上述單元可由不鏽鋼、鈦、塑料或類似材料制，它們可以提供規則三維排列。最好是使用購自Sulzer Biote chSystems(尤其是SMV，SMX，E-PACK EX、DX、BX、CY)的316不鏽鋼網狀單元。每個單元由一個細胞在其上能生長的均勻排列的網層組成。規則網子的每個單元在無菌反應器系統中相互以0-90°角取向排列。結構形狀可以是直線圓柱或任何其他適合容納網狀單元並且能形成良好使用容積的幾何形狀。然後接種細胞，並使之固定在網提供的大表面積上。一旦細胞在培養物中很好定居，就可以足以保持養分交換和消除廢產物的灌注速率餵養細胞。在合適的細胞密度下，如下面進一步所述用HAV感染細胞。
網狀單元的優點是，纖維床使每單位容積有更大的表面積。幾何形狀準確的網允許成纖維細胞穿過表面生長至已知和恆定深度，並能控制養分供給。網的均勻性也在纖維之間提供預測的接觸點，使細胞迅速遷移以覆蓋纖維網。靜態混合器的形狀控制生長面相互接近，以便防止自然生物生長和反應器「變髒」。這是在任選的填充床反應器中碰到的一個重要問題，在這種反應器中，填充的不均勻性使細胞在局部範圍生長，以後這會引起養分減少並接著發生細胞餓死。
應當理解的是，除了HAV的CR326F品系的傳代18、p18、p28、p29、p72外，本發明的範圍包括任何其他HAV變體或品系，不管減毒的還是強毒的。可以通過細胞、動物中的系列傳代，或者其他方法分離減毒的變體或品系。例如參見Provost，P.J.等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.170，8(1982);Provost，P.J.等人，J.Med.Virol.20，165(1986)，US-4164566和US-5021348關於減毒的說明。，本發明的純化方法是容易的，並且易於適合減毒或強毒HAV品系。
HAV允許在SSR中複製至產生病毒峰值。對於減毒來說，細胞的培養適合HAV品系，例如CR326FP28，細胞培養進行7-35天，這取決於最初的MOI和細胞密度，在這個時間內營養素培養基通過供氣體交換的環路連續循環。細胞培養基可以是任何維持MRC-5細胞活性生長和HAV複製的培養基。最好，細胞培養基以約0.010-0.3ml/cm2/天之間的速率補充和去除。因為細胞群的產生速率是完全暴露在培養基之中，這種比率是可變通的。
因此，在本發明的一個優選實施方案中，MRC-5細胞在一個340000cm2SSR(例如使用4個85000cm2的單元)或者甚至更大表面積的網狀SSR中的細胞片上生長，以約0.1-1.0HAV的感染物(MOI)的多種性感染細胞，並且HAV允許複製至產生病毒抗原的峰值。這進行大約28天，在這個期間內營養素培養基通過培養容器和提供氣體交換的環路補充和循環。培養基可以是任何支持生長或維持MRC-5細胞和HAV複製的培養基。我們已發現，含一種基本培養基，例如威廉培養基E(William′s Medium E)，並添加合適的生長因子的培養基是優先選用的。作為生長因子源，我們已發現，優先選用添加鐵的小牛血清。
(b)收穫培養的HAV應當指出，收穫培養的HAV的方法在某種程度上藉助培養容器的幾何形狀。一般，在用補充營養培養約28天後，取出培養基並收穫HAV。在過去，對於小規模生產病毒來說，這是通過刮削，接著凍融和任選的聲處理至最佳釋放受細胞約束的病毒來完成的。在本發明方法中，受細胞約束的HAV釋放到最小體積的收穫溶液中。最好收穫溶液含有使細胞可向HAV滲透起作用的組分。這樣的組分在現有技術中是已知的。最好，將一種去汙劑，如TritonX-100、NP-40或一種等效物以最低有效的允許濃度供給，以便以後容易去除。已經發現，供給約0.05-0.5%，而最好是0.1%TritonX-100就足以達到有效地從細胞中萃取HAV，所述細胞是在NUNC細胞製造、COSTAR立方體或者任何其他細胞片培養物中培養的。使用去汙劑萃取，尤其是從SSR，如COSTAR CUBE萃取的優點是，這樣一種培養容器的幾何形狀不允許用機械方法收穫，除了在能被取出的培養物上清液中發現HAV和HAV被濃縮和回收的情況之外。但是，存在培養上清液中的HAV份數一般僅是從細胞回收的整個HAV的一小部分。從培養的細胞中去汙劑收穫HAV是高效的。
(c)處理收穫的HAV一旦HAV從培養基上清液、從細胞，或者從兩者以基本上無細胞的形式被收穫時，最好是將HAV濃縮至便於下遊加工和純化。在已有技術的純化HAV的方法中，HAV用機械方法收穫並且只有少量物質被純化，用有機試劑，例如二氯甲烷或二氯甲烷∶異戊醇(24∶1，v/v)萃取HAV，接著通過加入水溶性合成聚合物，如聚乙二醇濃縮含水相。現在已經發現，去汙劑和外源酶可以用於工業規模分離全部HAV的方法以製備完整的疫苗，並同時將添加物質去除至在純化製品中不可覺察的微量。
在本發明的一種實施方案中，一種在收穫HAV中使用的去汙劑，例如Triton X-100，通過濃縮/全過濾來去除，接著例如用AMBERLITE非離子聚合吸附劑，例如XAD去除殘留的去汙劑。用於所述的去除Triton X-100的有效方法，將其降到約10μg/ml，Hurni，W.M.，和Miller W.J.(Journal of Chromatography，559，337-343(1991))已有報導。通過這種分析，在本發明的這種實施方案的製品中未發現在收穫HAV中使用的去汙劑。此外，去除許多其他汙染物，形成特別純化的HAV製品。
在本發明的另一個實施方案中，在獲得去汙劑後，與其進行濃縮/全過濾，不如接著進行XAD處理，在核酸酶處理後接著為了濃縮使用一種陰離子交換俘獲步驟。
在這種實施方案中，最好使用一種非特性的、高比活度和高度均勻的核酸酶。非特性保證劈開DNA和RNA，而酶的均勻性保證只有一種酶被加入，而不加入其他蛋白質的汙染物。而且更好的是，在本發明方法中，由於是抗去汙劑的核酸酶，因此它可以直接加入去汙劑收穫的HAV。許多核酸酶的任一種都可以滿足這上結要求。但是，按照Nycomed Pharma A/S(丹麥)製備的BENZONASE作為一種重組蛋白已顯示對此目的是特別優先選用的。已經發現，加入0.1μg-100μg/L之間的，最好是約10μg/L的收穫的HAV，對於去除汙染的游離核酸是合適的。
添加最低量的酶對於在下遊處理步驟中促進隨後去除酶是重要的，以產出具有不可覺察的殘留酶水平(低於約10pg/ml)的製品。
因為核酸酶處理發生在較稀的溶液中，所以我們業已發現，通過在一種稀的(90-150mmol)鹽溶液中進行陰離子交換色譜分離，並隨後通過一個添加約1.5柱容積的較高離子強度(≥約0.3mol)溶液的步驟進行洗脫HAV，對於俘獲HAV是合適的。通過這種俘獲步驟濃縮HAV，而且此外，大量去汙劑、BENZONASE和許多其他汙染物流過這個柱。因此，自俘獲柱洗脫出的HAV是部分純化的。在已有技術中已知的許多離子交換樹脂中的任一種都可以用於這個步驟，包括那些列舉在EP-0468702A2中的。我們已發現，一種為此目的特別優選的樹脂是使用DEAETOYOPEARL 650M(Tosohaas)。
(d)HAV濃縮在HAV收穫和濃縮/全過濾/XAD或核酸酶處理/俘獲後，用一種對濃縮蛋白質有效的水溶性合成聚合物濃縮HAV。分子量在約2000道爾頓和12000道爾頓之間的聚乙二醇(PEG)對此目的是有效的。典型的是，將NaCl加入部分純化的HAV中至最終濃縮在約150mmol和500mmol之間。然後加入PEG，至最終濃縮在約2%(v/v)和10%(v/v)之間，最好是約4%。離心分離所產生的4%PEG沉澱的部分純化的HAV，排出上清液並為進一步處理而再懸浮該小片。我們已發現，在該步驟排出的上清液中的主要汙染物被去除。去除蛋白酶以提高經過提純殘餘物的HAV製品的產量、穩定性和純度。再懸浮的PEG小片任選地進行聲處理，以促進在如下所述的有機萃取之前溶解。
(e)有機萃取來自上述的再懸浮PEG小片通過加入含1-6個碳原子的滷代低級烷烴，例如二氯甲烷、氯仿、四氯乙烷、或其他同類的東西等，以及消泡劑，例如異戊醇進行萃取。滷代低級烷烴與消泡劑的體積之比在約15∶1和50∶1之間，最好是在約20∶1和30∶1之間。申請人已發現，有機萃取顯著提高最終HAV製品的純度。對於該步驟的有機萃取來說，氯仿勝過二氯甲烷。
這樣的萃取去除了其他汙染物中的類脂和類似脂類的物質。因此，再懸浮的PEG小片用各種緩衝液中的任一種進行稀釋，該緩衝液包括磷酸鹽緩衝鹽水、TRIS、碳酸鹽、碳酸氫鹽或乙酸鹽緩衝液。因為HAV衣殼在弱酸性條件下是穩定的，所以緩衝液在微酸性pH範圍是允許的。一種優先選用的緩衝液是TNE(10mmol TRIS-HCl，pH7.5，150mmol NaCl，1mmol EDTA)。磷酸鹽可以用來TRIS-HCl。
最好，再懸浮的PEG小球通過加入氯仿/異戊醇(24∶1，v/v)並且有機物與水的比在約0.5∶1和3∶1之間，用強渦流進行有機萃取。然後萃取液通過在20、4000g離心分離10分鐘進行澄清。保留水相，用某一體積的TNE或相當於約0.3和0.6之間的有機樣品體積的緩衝液再萃取界面和有機相，並合併兩個水相，產生萃取的PEG小片。
溶劑萃取步驟在A型肝炎病毒純化過程中起關鍵作用，這種純化過程是通過在界面上沉澱蛋白質雜質以及將類脂萃取到溶解相中來進行的。在一致性的批量生產期間，通過這種萃取達到的相當大的純化可以從圖17中的HPSEC色譜分離得知，在該圖中在23分的雜質峰值是研究通過這種步驟去除雜質的一個有用標誌。相反，當在較小規模的中間批量時，這個峰值的大部分保留在萃取出的製品中(圖18)。為了了解和控制在按比例擴大時的這一步驟，研究了一些可變因數即在不同尺寸的管和瓶中研究溶劑與水的體積比、振動類型、混合時間和混合強度(參見實施例15)。
(f)離子交換色譜分離上面所述的萃取液在樹脂、凝膠或基體上經受陰離子交換色譜分離。典型的陰離子交換基體包括(但不限於)DEAE纖維素，DEAE瓊脂糖，DEAE凝膠過濾劑，DEAE葡聚糖，DEAE交聯葡聚糖凝膠，
DEAE瓊脂糖凝膠，氨己基瓊脂糖凝膠，Ecteola纖維素，TEAE纖維素，QAE纖維素，單Q，或苯甲醯化二乙氨乙基纖維素。
一種優選的陰離子交換基體是DEAE TOYOPEARL 650M(Tosohaas)。關於離子交換色譜分離的一般基本知識報導例如可以在E.A.Peterson，「Cellulosic Ion Exchangers」，在Work，T.S.等人，Laboratoy Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 2，Part Ⅱ，Pages 223 et seq.North-Holland 1970中找到。
稀釋有機萃取的再懸浮PEG小片，如果需要，使用10mmol TRIS，1mmol EDTA，pH7.5，或等效的緩衝液，如果需要去除汙染的游離核酸，添加形成NaCl濃度約為0.3mol和0.35mol之間的NaCl。在這些條件下，HAV以過濾方式通過柱。但是，如果HAV的製劑預先用核酸酶進行處理，則在下個步驟的預處理中，用0.1mol和0.15mmol之間的NaCl，優先選用0.12mol NaCl進行有機萃取。
在上述NaCl摩爾濃度下，HAV衣殼粘附於陰離子交換基體，而中心保留的汙染物，例如碳水化合物通過基體。用幾個柱體積的0.12mol NaCl洗滌柱，以進一步去除保留的汙染物。然後用約1柱體積加0.35mol NaCl的有機樣品體積洗脫來自陰離子交換柱的HAV衣殼。任意地並且最好是藉助梯度洗脫將HAV洗脫達約1mol NaCl或等效鹽，並且HAV在約0.3mol NaCl洗脫。
(g)凝膠過濾在陰離子交換色譜分離後跟著進行凝膠過濾色譜分離的最後步驟。典型的是使用瓊脂糖凝膠CL-4B(Pharmacia)，但是許多其他種類的凝膠過濾基體可以代用。例如參見Fischer，L.，「Gel Filtration Chromatography」，in Work，T.S.等人，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Elsevier(1980)。我們已發現，在該步驟中為了純化HAV使用一種特別優選的方法，大小排阻色譜法。這包括在TOYOPEARL HW555和HW655串聯柱上洗脫儘可能小的陰離子交換純化的HAV樣品體積。
雖然在陰離子交換色譜分離步驟的特有順序之後再加上凝膠過濾是在本發明中用於純化HAV衣殼的典型記錄，但應當理解這個順序是可以改變的。例如凝膠過濾可以在陰離子交換步驟之前。我們已發現，前面的順序是優先選用的。
(h)HAV沉澱在大規模生產HAV過程中的一個完全意想不到的發現涉及作為按照本發明生產的大量HAV的結果而存在的病毒的溶解度。我們已發現，在0.25-0.3mol鹽濃度下(以此濃度由離子交換柱洗脫HAV)，如果HAV濃度在約10-20μg/ml以上，就出現病毒沉澱。這是通過代表性樣品的HPSEC分析發現的，這種代表性樣品表明，氯仿萃取的水相(AQX)和大小排阻產物(SEC)在4℃儲藏是極穩定的，但是陰離子交換產物(IEX)卻顯示在4℃儲藏時顯著損失A型肝炎病毒。
為了證實這個發現，用第二組樣品進行穩定性研究。AQX、IEX產物和SEC產物一產生就馬上用HPSEC分別進行分析(重複三次)。然後通過所產生的峰的面積與SECA型肝炎病毒校準標準物進行對照測定A型肝炎病毒濃度。此外，IEX產物的一個等分部分用磷酸鹽緩衝鹽水(0.12mol NaCl，6mmol磷酸鈉，pH7.2)稀釋到1∶5，並且立即進行測定。用HPSEC在整個幾天內監測這4種樣品在4℃的穩定性。
下面給出最初A型肝炎病毒濃度和4-5天後所得數值，這些數值是關於幾個A型肝炎病毒純化流程樣品的。
樣品 最初Hep A 4天Hep A濃度(μg/ml) 濃度(μg/ml)AQX 23 21IEX產物 59 50IEX產物稀釋成1:5 12 10SEC產物 12 12全部結果包括各中間時間點示於(圖)26中。
正如所看到的第一組情況那樣，IEX產物顯示顯著的A型肝炎病毒損失，儲藏過夜發生約25%的損失(A型肝炎病毒濃度從59μg/ml降至45μg/ml)。
稀釋的IEX產物和AQX顯示更大的穩定性，經過第一個100小時儲藏，A型肝炎病毒僅損失約10%。SEC產物顯示設有A型肝炎病毒損失，基本上得到與第一組相同的結果。
這兩組之間的一個差別是第二組形成明顯的沉澱物。沉澱物的出現以在SEC步驟之前離心分離全部IEX產物為條件。這種離心分離導致沉澱的A型肝炎病毒大量損失;在離心分離後濃度是29μg/ml。下面示出由HPSEC數據計算出的數據表。
樣品 Hep A總mg 步驟產率 取樣後HepA,mgAQX產物 12.9 11.7IEX產物 12.3(最初量) 105% 8.7離心分離的IEX產物 4.2 48% 4.2SEC產物 2.0 49% 1.4意想不到的低SEC產率暗示，聚集或沉澱可以發生在SEC柱上。實際上某些聚集物通過HPSEC可觀察到。在較小一組的串聯SEC柱上色譜分離(在完成預備的IEX之後立即進行)的IEX產物的7ml樣品顯示於71%的A型肝炎病毒回收率，這對於該步驟是比較典型的。因為這個樣品在離心分離時不遭受A型肝炎病毒損失(因為它還沒有沉澱)，71%的產率是以現有的從IEX到SEC產物的生產規模所得到的產率的約3倍。較小規模的串聯SEC造成大得多的稀釋因素，這可導致較高的產率。
意外地發現，在純化與病毒損失相符的這些組的期間通過HPSEC得到的沉澱物可溶於低離子強度的水溶液(例如6mmol磷酸鈉)，使得這種沉澱是可逆的。通過添加6mmol磷酸鈉沉澱物重新溶解，沉澱物發生迅速溶解。與此相反，沉澱物在120mmol氯化鈉和6mmol磷酸鈉中或較高離子強度溶液中的再懸浮幾乎沒有變化。根據HPSEC的保留時間，溶解在6mmol磷酸鈉中的沉澱物作為單體A型肝炎病毒是相同大小的，而具有銀染色斑點的SDC-Page表示溶解的沉澱物在最終SEC產物中具有可見的相同蛋白頻帶。根據這個數據A型肝炎病毒的純化已改進到包括稀釋離子交換產物，以防止沉澱物損失(見實施例16)，使得1∶1的稀釋造成鹽濃度達到約0.15mol或更低。更且最好是達到低於20μg/ml的HAV濃度。
(i)HPSEC一致性測定高效大小排阻色譜法(HPSEC)測定已擴大到測量取自A型肝炎病毒純化進程的樣品中的A型肝炎病毒濃度和雜質含量。
已經分析了按照本發明製備的整個14組的A型肝炎病毒處理過的樣品，所得的基本數據已用於表徵每個純化步驟的A型肝炎病毒含量和汙染物的圖形。HPSEC與EIA數據相比，有效數據證實這種檢定的精確性和正確性，HPSEC檢測條件和取自10組HPSEC的分析結果示於實施例17和圖29-46。
(j)疫苗失活和配製為了疫苗應用，傳統的和眾所周知特性的附加處理步驟對於製備純化的HAV衣殼是需要的或可能是需要的。例如，用福馬林處理、無菌過濾和吸附至載體或輔助劑上是製備福馬林失活疫苗的典型基本步驟。例如，參見Provost，P.J.等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.160，213(1979);Provost，P.J.等人，J.Med Virol.19，23(1986)。HAV可以通過加熱、改變pH、照射、用有機溶劑，例如福馬林或仲甲醛處理而失活。典型的是，以1/4000比例的福馬林進行HAV失活。我們已發現，在四倍標準濃度下福馬林失活進行得更快和有效，而1/1000的福馬林失活進行得更快和有效，而1/1000的福馬林濃度在設有相反作用的免疫原性下失活時間減少四倍。然後吸附失活的HAV或用提供輔助劑和載體作用的氫氧化鋁共沉澱失活的HAV。
因為為了這種製品的免疫功效所需的劑量是極少的，所以易於配合純化的HAV或命名其吸附到載體上。已經發現，氫氧化鋁對於形成含HAV的牢固配合物及防止容器壁上的病毒損失的目的是非常滿意的。
因此，本發明揭示一種工業規模製備大於95%HAV蛋白質純度的A型肝炎病毒的方法，該方法包括下列步驟a)在大表面積的靜態表面反應器中的細胞片上培養大量A型肝炎病毒，b)在基本上不去除、溶解或破壞細胞片培養物的情況下，通過去汙劑滲透細胞片，以使A型肝炎病毒從細胞培養物釋出，使A型肝炎病毒從細胞片放出，c)或者通過核酸處理或者通過離子交換吸附核酸，任選地在該步驟中從收穫的HAV中去除非A型肝炎病毒特性核酸，d)使用薄膜和全過濾，或者通過離子交換俘獲濃縮由細胞培養物分離出的A型肝炎病毒，e)通過有機萃取、PEG沉澱、離子交換、接著是作為最終精加工步驟的凝膠滲透色譜分離的結合，去除來自步驟d)的濃縮A型肝炎病毒的殘留的非A型肝炎病毒特性的蛋白質，如果在步驟c)中未預先完成的話，上述離子交換包括去除汙染的核酸，以及f)回收來自步驟e)的純化A型肝炎病毒。
在本發明的一種優選的實施方案中，用於工業規模生產失活的A型肝炎病毒菌苗的方法包括下列步驟(a)在NUNC CELL FACTORIES、COSTAR CUBES，或甚至更大表面積的靜態表面生物反應器中大量培養A型肝炎病毒(HAV)，在該生物反應器中MRC-5細胞的細胞片已固定在規則排列的實體不鏽鋼、鈦上或鈦不鏽鋼網上，
(b)通過去除培養基和添加含有約0.05-0.5%、最好是0.1%的Triton X-100的收穫溶液來收穫已培養的HAV，(c)用核酸酶處理收穫的HAV，以消化汙染的細胞核酸。
(d)通過在離子交換柱上俘獲，用約0.35mol NaCl洗脫俘獲的HAV和接著用聚乙二醇沉澱來濃縮核酸酶處理過的HAV，(e)在伴隨強烈攪拌下，用氯仿/異戊醇(24∶1，v/v)萃取濃縮的HAV，並進行分離和保留水相，(f)在離子交換基體上，以約0.12mol NaCl色譜分離來自有機萃取的水相，並用達較高NaCl濃度(1mol是合適的)梯度洗脫HAV，並且立即稀釋洗脫的HAV的匯集物，使鹽深度約為0.15mol或更低，最好HAV濃度約為20μg/ml或更低，(g)在大小排阻色譜分離樹脂上、最好是在串聯排列的TOYOPEARL HW55S和HW65S上色譜分離來自離子交換的HAV，在該色譜分離中HAV進入基體所包含的體積，(h)通過用1/1000的福馬林處理，使凝膠過濾的HAV失活，接著無菌過濾，與氫氧化鋁共沉澱，並配製成相當於每劑量約25ng-100ng失活純化HAV的單位劑量。
在本發明中所得到的HAV是高純化的，而且是高抗原的。該製品是純化的A型肝炎病毒製劑，根據SDS PAGE和銀染色法分析，在該病毒中大於95%的蛋白質是A型肝炎病毒特性物，而低於0.1%製劑物質是非HAV核酸，低於4%的是類脂。在制品的水解樣品中作為葡萄糖可覺察的碳水化合物是所存在蛋白質物質的約0%和200%，而非葡萄糖碳水化合物是以低於蛋白質物質的15%存在。在優選的實施方案中，葡萄糖和非葡萄糖碳水化合物，例如核糖，以低於約蛋白質物質的20%存在。當製劑是福馬林失活時，這種製劑保持其免疫原性。
少量失活病毒足以引出保護性免疫應答。最好是在幾個月期間內一次、兩次或三次按25-100ng的劑量給藥，這對於增加抗HAV免疫應答的高滴定度是需要的。
純化的A型肝炎病毒製劑具有下述性質，同時根據以每μg蛋白質為基準報導各種性質，圓括號內的方法用於測定各特性a)類脂含量(氣相色譜法)＜0.1μgb)由葡萄糖確定的碳水化合物(TFA水解，Dionex) ＜0.1μg-2.5μgc)非葡萄糖碳水化合物 ＜0.2μg(TFA水解，Dionex)d)A型肝炎病毒特性蛋白質 ＞0.95μg(胺基酸分析和西方印跡)e)甲型病毒特性RNA 0.1-0.2μgf)汙染的DNA＜0.0004μg在制品中存在的含有原葡萄糖的碳水化合物，從失活的配料疫苗的耐受性、免疫原性和保護性功效來看，認為是無意義的。但是，在制品中非葡萄糖碳水化合物含量(多半是來自HAV特性RNA降解的核糖)是很低的，這卻是有意義的。而且值得注意的是，由於生產大量足夠允許進行相應檢定的製品的方法的發展，解釋本文可報導的性質僅僅成為是可能的。
在本發明的一個特定的配製劑中，A型肝炎病毒疫苗具有下述額定組分(每25-100單位/0.1-1ml劑量)
已經發現，本發明的純化失活A型肝炎病毒，當給藥25ng(相當於上述配製劑之一的25單位劑量)的樣品時，根據EIA分析與特點在於胺基酸分析的參考標準比較，對預防感染是有效的。在認為是與疫苗相關的健康成年人、青年人或兒童中未觀察到一系列不利的體驗，從6至50單位範圍的劑量已給藥與成年人、青年人和兒童。由於提高給藥劑量，更快、更高的血清轉化率已在成年人中觀察到。這種現象在兒童中不明顯。
一個單獨的25單位劑量給藥後一個月，83%的成年人(≥18歲)和97%的兒童及青年人(2-17歲)血清轉化。25單位的兩個劑量給藥兩周間隔時，在達93%的成年中提高了血清轉化率。在第二或第三個25單位劑量給藥後七個月的血清轉化導致兩個年齡組中大於99%的血清轉化。在兩個年齡組中，血清陽性的持久性是約100%達到直到12個月和36個月。因此，顯然一個單獨的25單位劑量，在免疫接種的一個月內就足以在任何接種人群的至少80%中達到血清轉化。用更大劑量進行免疫接種，在更高的接種者百分數中誘發血清轉化。
按照25ng的劑量，一個單獨COSTAR CRBE可按照本發明的方法收穫，產生約5000和10000個之間或更多個的劑量。該方法也適合於同時收穫和操作幾個COSTAR CUBES。具有或不具有增加表面積網的單獨SSR使得在每個生產運轉期產生極大量的劑量。
下述實施例供舉例說明本發明的特定實施方案，但是這些實施例不應解釋為實施本發明各步驟的唯一模式。
實施例1A型肝炎病毒母種的生產生產病毒種的大規模方法包括在6000cm2的NUNC CELL FACTORIES中感染MRC-5細胞單細胞層。MRC-5細胞在生產裝置中生長至會合的單細胞層，然後以約0.1的MOI病毒感染。在感染後細胞用每周更換一次的含10%(v/v)的胎小牛血清的培養基培養28天。已經發現，2-10%(v/v)的高濃度血清比用低含量的0.5-2%(v/v)能產生更多的病毒。在這個周期結束時，上清液流體含有大量有傳染性的病毒，在本實施例中每毫升有107.3TCID50，它是直接從NCF收穫的，沒有細胞溶胞，用作病毒母種源。以這種方式，為生產所必須的大量有傳染性的病毒由比輥式瓶或燒瓶或用機械收穫細胞更可再現和更容易的大規模方法得到。
實施例2疫苗生產的按比例擴大為了支持階段Ⅲ(PhaseⅢ)的臨床研究，實驗室過程的按比例擴大成為A型肝炎病毒疫苗生產需要考慮的重要問題。為了便於按比例擴大生產過程，需要改進以前已知的HAV繁殖和純化過程。兩種主要的細胞繁殖方法是使用NUNC CELL FACTORISE和靜態表面反應器，例如COSTAR CUBE。本實施例敘述NUNC CELL FACTORY方法。實施例3敘述COSTAR CUBE SSR方法。
Nunc細胞裝置用於Monroe功效研究已研究一種修改的生產過程，它使比以前已知方法更大量生產減毒A型肝炎病毒的改進的按比例擴大的方法成為可能。這最初是用NUNC CELL FACTORIES(NCF)代表標準輥式瓶完成的。NUNC CELL FACTORY(NCF)的基本單元是培養面積為600cm2的淺盤。構成NCF的淺盤是由聚苯乙烯製成的，為了最佳的細胞附著和擴展進行了處理(Maroudas，1976，J.Cell Physiol.Vol.90，pp.511-520)。本文所述的10個淺盤單元具有10個相同的培養單元(淺盤)，其總表面積是6000cm2。在兩角有專門設計的形成垂直管的開孔，該管將淺盤連接在多層中。這些垂直管結尾於兩個接收空氣過濾器的轉接器和一個專門設計的聚四氟乙烯(Teflon)連接器。所有單元經照射消毒並隨時可以供生產使用。
在NCF中的MRC-5細胞環境十分類似於在滾動瓶中存在的環境。這些細胞在靜培養物中生長，這種靜態培養物具有細胞附著在被液體培養基覆蓋的固態基質上，並且向細胞供給營養素和氧氣是藉助擴散。儘管與在滾動瓶生產中的條件極為相似，但NCFs提高操作再現性。但是，如下面進一步所述那樣，收穫和下遊處理方法是不同的。
實施例3COSTAR CUBE靜態表面反應器用於工業規模生產方法在整個生物反應器具有良好環境控制之後，進一步按比例擴大的任務是每個反應器儘可能達到更大的表面積。NUNC CELL FACTORIES向該任務提供一種不完全溶液。較好的溶液由COSTAR CUBE和STATICMIXER靜態表面反應器(SSRs)供給。前者由在一個滅菌塑料管(COSTAR CS2000)中的緻密填充聚苯乙烯塑料片構成。在單個管中可達到總量為85000cm2的有用生長表面(與10個淺盤NUNC CELL FACTORY的6000cm2相比)。在US-4296204和4415670所述的後來的反應器中，金屬、陶瓷、玻璃或塑料的靜態混合單元形成緻密填充的生長表面;這些單元可以製成和布置成比在用於大生產過程中的單個反應器中的COSTAR CUBE提供更大的表面積。已經成功地在兩種類型的反應器中培養HAV。SSR有一個循環迴路，它允許培養基循環，並通過一個為了調節培養基中的pH和溶解的氣體含量的充氣器補充營養素，以滿足培養物對氧氣的需求，並使培養基充滿。這種最佳化在輥式瓶或在NCF中是不可能的。此外，為了改進大量主要原材料的利用率可以改變培養基。添加鐵的小牛血清(Cat.A-2151，Hycolone Laboratories，Inc.，Logan，UT or equivalent)已經成功地用於代替胎牛血清。
實施例4利用Triton溶胞從NUNC CELL FACTORIES或靜態表面反應器收穫A型肝炎病毒NUNC CELL FACTORY和靜態表面反應器都不適合於機械刮削分離MRC-5感染的細胞片。使用Triton細胞溶解有效地回收聯結細胞的A型肝炎病毒，並且用新方法進行純化。用Triton溶胞方法得到的溶液比從滾動瓶的機械刮削得到的製備液更稀。通過全過濾濃縮Triton收穫物，接著用吸附劑XAD進行處理，以去除殘留的Triton。使用毛細區帶電泳在過程中的檢定已證實Triton消除至低於10μg/ml。然後用聚乙二醇(PEG)沉澱HAV，用氯仿異戊醇萃取。使用DNA過濾柱，接著利用陰離子交換和大小排阻色譜分離去除汙染的DNA。包括NCF繁殖和Triton溶解兩者的方法都不會有害地影響純化的福馬林失活的A型肝炎病毒疫苗的免疫原性。
實施例5核酸酶處理和俘獲色譜分離該方法的可測量性、生產能力和一致性通過用核酸內切酶處理Triton收穫物，接著通過陰離子交換的俘獲色譜分離使病毒濃縮來提高(見圖1)。這種改進避免了對濃縮全過濾步驟、XAD處理和DNA過濾柱的需求。
選擇一種有效地既抗RNA又抗DNA的非特性核酸內切酶。這種核酸內切酶，即BENZONASE是從萎謝沙雷菌(Serratia marcescens)離析出的，並在大腸埃希桿菌(Escherichia coli.)中克隆。它是以極高純度生產的，按照Nycomed Pharma A/S(丹麥)很好表徵了重組蛋白質。選擇這種特殊核酸內切酶，部份地是因為它有很高的特殊活性並可以很小的量(10mcg BENZONASE/L收穫物)直接加入未加工的Triton收穫物中。已經開發出使用用於BENZONASE特性蛋白質的西方印跡和用於酶活性動態測定的試驗方法，以測量通過純化過程去除的酶。對於在洗滌中和在陰離子交換色譜分離俘獲步驟的流過部分中添加的核酸內切酶活性的大部份(＞90%)可以計算(下面敘述)。BENZONASE含量比在俘獲柱產物中減少到小於1%。
實施例6附加的工藝步驟a)俘獲步驟來自核酸酶處理的Triton收穫物中的A型肝炎病毒，在以低離子強度填充的陰離子交換柱上濃縮，用0.3～0.5mol氯化鈉溶於磷酸鹽緩衝液中的溶液來分級洗脫。A型肝炎病毒由該俘獲步驟濃縮30倍，而Triton降至不可檢測的含量，這由處理過程中的CIE測定來測定。
b)PEG沉澱和氯仿萃取由濃縮/全過濾/XAD或從俘獲柱洗脫得到的A型肝炎病毒用聚乙二醇(PEG)沉澱。在適當的條件下，該步驟是高選擇性的，並且主要的汙染物(它用另外的方法與病毒共純化)保持可溶性，並在上清液部分中被去除。將含有病毒的PEG沉澱物再懸浮，然後用氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取，以去除被氯仿變性的可溶性類脂和蛋白，它們存留在水相和有機相之間的界面處。
c)陰離子交換色譜法和大小排阻色譜法將氯仿萃取步驟的含水萃取物加到低鹽的陰離子交換柱上，隨後用梯度至1.1mol鹽的NaCl洗脫。最終大小排阻色譜法步驟產出高純化的病毒製品(見圖2)。
d)失活為了抗原濃度接近劑量含量，已經預先用93μg甲醛/毫升(1∶4000的甲醛水)，在37℃下進行A型肝炎病毒的甲醛失活。在這些條件下，病毒的失活遵循一級衰變動力學，具有約2小時的半存活期，這相應於每天喪失約3.5log10TCID50(50%組織培養基感染劑量)。在兩天後可達到病毒感染性降低7logs，但失活時間延長到20天，以保證病毒已完全失活的大安全極限。
小規模的實驗表明，增加甲醛的濃度提高失活率，按照ICID50損失來測量失活率。失活率與甲醛的濃度按比例地變化，如對失活的偽一級動力學所預料的那樣。對二百劑量當量的組織培養試驗證明，在37℃用370μg/ml甲醛(1∶1000甲醛水)培育病毒5天，則完全失活。因此，這些修改的失活條件像以前使用的那些條件一樣提供安全限度。這一點已經由在相同條件下產生三種大的實驗性規模(pilot-scale)的失活，隨後用氫氧化鋁吸附以產生用於臨床試驗的疫苗而得到證明。該失活率約是先前以較低濃度甲醛觀測到的失活率的4倍，這與小規模研究符合的非常好。將這兩次氫氧化鋁吸附的疫苗樣品在小鼠中作免疫原性試驗，對每個小鼠ED50類似於以前的疫苗(小於2ng)。
e)氫氧化鋁吸附通過將甲醛水失活的病毒與氫氧化鋁共沉澱而將其吸附到氫氧化鋁之上。用於臨床製備的所有方法基本相同，而僅有的改變是在甲醛水失活的本體溶液中病毒的濃度。將失活的病毒直接沉澱到氫氧化鋁上是通過首先把硫酸鋁鉀加入甲醛水失活的本體溶液中而進行的。最後，加入氫氧化鈉形成沉澱。通過去除浮在懸浮液上面的液體層而除掉甲醛和殘餘的鹽，並且用生理鹽水來代替。
實施例7HAV製品的純化在純化過程監測中使用分析大小排阻色譜法(HPSEC)、EIA和蛋白以及SDS-PAGE，以保證始終產出高純度疫苗。HPSEC提供了在核酸酶處理過程中監測核酸損失以及在該過程後來的步驟中對純度評定的手段。圖2中的色譜表明，在PEG沉澱物中相應於A型肝炎病毒的峰是明顯的。在溶劑萃取步驟中A型肝炎病毒富集，並然後在離子交換步驟中濃縮。最後的凝膠過濾形成高純化的(＞95%，通過SDS-PAGE和銀著色得出)A型肝炎病毒的製備。當獨立的測量純度時，HAV製品在HPSEC分析中是一個單獨包括的對稱峰(見圖2、37和38)。
Ⅱ.雜質的清除處理過程中試樣的CZE分析表明，Triton通過Monroe方法中的濃縮完全過濾步驟和製備過程中的俘獲柱而被去除。在陰離子交換製品中存在的BENZONASE量低於可探測的量(＜18fg BENZONASE活性並小於13pg BENZONASE質量/25單位劑量A型肝炎病毒;在該檢測中的探測極限是12.5pg)。
實施例8通過Triton溶解Monroe試驗純化由NUNC CELL FACTORIES或靜表面生物反應器得到的A型肝炎病毒基本上如實施例2中所述，用NCFs繁殖HAV。於37℃，MRC-5細胞在一組60個的6000cm2NCF's中，用含有10(v/v)胎牛血清和新黴素硫酸鹽補充的William's培養基E的培養基生長7天。在第7天，用含有足量病毒的新鮮培養基餵養該細胞，以0.1MOI來感染該培養物，並將其轉移到32℃環境。於32℃，每周餵養一次進一步培養該培養物21天。通過用含0.1%TritonX-100、10mmol TRIS、1mmol MgCl2的pH7.5的溶解緩衝液處理細胞片來收穫HAV。將由NCF's得到的溶胞產物匯集，並在進一步加工之前冷凍。
將通過用TRITON X-100處理而由NUNC CELL FACTORY培養物得到的4升冷凍的A型肝炎病毒於20-30℃水浴中解凍4小時，然後過濾。在Pellicon裝置上用300，000分子量的切斷膜將過濾的溶胞產物濃縮10倍。隨後將約400ml濃縮的溶胞產物逆著含150mmol NaCl和1mmol EDTA的10mmol Tris-HCl緩衝液(pH7.5)完全過濾。通過以每毫升溶胞產物使用30毫克AMBERLITE XAD-4(Rohm和Hass公司產)聚合樹脂的批量處理將Triton去除。在過濾去除XAD-4後，將溶胞產物調整到510mmol NaCl，然後通過加入聚乙二醇(PEG8000，Sigma)而沉澱為5%(v/v)最終濃度。將混合物用力搖動，於4℃培養1小時，然後在4℃，以1000xg離心分離10分鐘。離心分離後將上清液去除並廢棄。
然後將沉澱物溶於含120mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸鈉緩衝液(pH7.2)中。然後用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)混合物萃取再懸浮的片狀物。將混合物用力搖動，然後在20℃，以3000xg離心分離10分鐘。使用30%初始體積的相同有機溶劑混合物反萃取含不溶物的界面。在離心分離後，合併兩種水相。然後將氯仿萃取物調整到350mmol NaCl，在DEAE-Sepharese(瓊脂糖凝膠)CL6B(Pharmacia)上以過濾方式進行色譜分離，以吸附DNA。收集含HAV的柱的流過級分，並用6.2mmol磷酸鈉緩衝液(pH7.5)洗脫3次，並在TOYOPEARL DEAE 650mmol(Toso Haas)上色譜分離，用梯度洗脫至1mmol NaCl。以15-30%的1mol緩衝液洗脫的A型肝炎病毒相當於10-30mS。由該區域匯集的級分隨後在Sepharose CL4B(Pharmacia)上，以具有120mmol NaCl的6.2mmol磷酸鈉緩衝液進行色譜分離。對該柱的裝填設計為大於1%，但小於5%的柱體積。洗脫得到為產物在46%和64%總柱體積之間。
將最終純體物進行0.22微米的無菌過濾，並在37℃用1∶4000甲醛水試劑(甲醛水是37-40%重量的甲醛)失活20天。這些條件呈現具有2小時半存活期和約3.5log10 TCID50/24小時損失的一級衰變動力學。該失活期延長至20天，以保證大的安全限度。將硫酸鋁鉀加到失活A型肝炎病毒中，然後該溶液通過加入氫氧化鈉至pH6.6-6.8而沉澱。通過離心分離去除甲醛和殘餘鹽，在離心分離中去除上清液並用生理鹽水代替。
實施例9A型肝炎病毒的純化，用Triton X-100從COSTAR CUBES收穫，用核酸酶處理和俘獲色譜法生產規模的工藝過程使用用於病毒繁殖的SSR方法來製備生產規模的物質。在該方法中，COSTAR CUBE用作細胞生長面;將CUBE用外部環路和驅動培養基流動的泵與COSTAR CS2000曝氣器連接，如實施例3所示。將MRC-5細胞接種到COSTAR CUBE SSR中，並於37℃生長7天。在細胞引種兩天後開始灌注。用補充有10%(v/v)加鐵的小牛血清和新黴素硫酸鹽的William's培養基E連續灌注反應器。反應器的pH控制在6.9和7.6之間，反應器中溶解的氧在培養基中空氣飽和度的15%和100%之間變化。允許細胞生長7天整，以約0.1MOI將病毒引種到反應器中，使用按照實施例1方法製得的病毒毋種。將SSR溫度降至32℃，並連續餵養21天。然後使SSR排出培養基，再注入0.1%(w/v)TRITON 、10mmol TRIS 、pH7.5緩衝液，以釋放HAV。在COSTAR CUBE系統中用這種方法製備的4組病毒如在實施例10中所示，根據表面積，HAVAg製品平均2.8倍於在NCF反應器中用Monroe繁殖方法而得到的以往平均值。增加SSR生產率可以容易地將繁殖過程按比例地擴大為生產規模。
用BENZONASE處理該原溶胞產物，以從核酸加合物中稀放出病毒，隨後用陰離子交換色譜法俘獲病毒。該BENZONASE處理省去了所需的濃縮/完全過濾步驟、XAD-4處理及DNA過濾柱(見實施例8)。
在有1mmol MgCl2存在下，用每升溶胞產物5-25μg BENZONASE處理25升COSTAR CUBE Triton X-100收穫物，然後通過0.22微米過濾器過濾。於25℃將該混合物培養18小時。將酶處理的溶胞產物加到TOYOPEARL DEAE 650M陰離子交換柱上，該柱用含90mmol NaCl的4.7mmol磷酸鈉緩衝液(pH7.2)平衡。用含0.35mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸鈉緩衝液洗脫A型肝炎病毒(約800ml)。將利用酶活性動力學檢定的試驗方法發展成在該方法中監測酶的去除。結果表明，在俘獲柱洗滌和流過的級分中大於90%的核酸內切酶活性可以計算出。另外，在俘獲柱產物中總核酸酶活性，包括加入的BENONASE，與開始存在於溶胞產物中的量相比降低＞1/100。
將由俘獲柱得到的A型肝炎病毒產物的NaCl濃度調至420mmol，該病毒用最終4.5%濃度的聚乙二醇(PEG8000，Sigma)進行沉澱。將混合物用力攪拌，然後在4℃培養1小時。培育之後，在4℃，通過以1000xg離心分離10分鐘收集沉澱物。去除上清液並廢棄。將PEG沉澱懸浮在含120mmol NaCl和1mmol EDTA的6.2mmol磷酸鈉緩衝液(pH7.2)中。通過加入1.5體積的氯仿∶異戊醇(24∶1，v/v)完成懸浮的PEG沉澱物的有機萃取。於20℃，以3000xg離心分離10分鐘增強相分離，並保留上部的水相。用30%原體積的有機混合物反萃取該界面，離心分離，並將第二次水相與第一次水相合併。
將水提物在TOYOPEARL DEAE 650M(Toso Hass)陰離子交換基體上進行色譜分離並用梯度洗脫至1mol NaCl。以15-30%的1mol梯度洗脫的A型肝炎病毒相當於15-30mS。匯集由該區得到的級分並進行大小排阻色譜分離。該大小排阻步驟一前一後使用兩個柱TOYOPEARL HW 55S和HW65S。在這種條件下，A型肝炎病毒在兩個基體所包括的體積中，前後柱排列是用於溶解A型肝炎病毒中高和低分子量的兩種雜質。該柱用含120mmol NaCl的6.2mmol磷酸鈉緩衝液(pH7.2)平衡。將以對稱峰洗脫的A型肝炎病毒和產物部分匯集。
將由大小排阻色譜分離得到的經0.22微米無菌過濾的產物於37℃，用30μg/ml(1∶1000稀釋的甲醛水，它是37-40%(重量)的甲醛)、以約500單位/ml(一個單位相當於約1ng病毒蛋白)失活5天。將失活的A型肝炎病毒經0.22微米無菌過濾。通過首先加入硫酸鋁鉀然後再用氫氧化鈉滴定至pH6.6～6.8而進行與氫氧化鈉共沉澱。通過沉清/潷析方法去除殘留的鹽和甲醛，在該方法中將上清液去除並用生理鹽水代替。
實施例10對由上述方法製得的產物進行下列分析用胺基酸分析進行蛋白質分析(氣相水解，隨後作PTTC標記和反相高性能液相色譜法);用HAV抗原固相酶免疫測定進行HAV抗原分析(使用人體多克隆抗體製品進行抗原，隨後用小鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠(goat-anti-mouse)抗體/過氧化物酶共軛物檢測);用高pH陰離子交換色譜法和脈衝電流測定(HPAEC-PAD，用2N TFA的酸性水解，隨後進行HPLC分析)進行碳水化合物分析(包括葡糖和非葡糖碳水化合物測定，非葡糖碳水化合物在產物中以每μg產物蛋白質小於約0.1μg的含量存在);用DNA雜交進行宿主細胞DNA分析(使用Alu DNA片段作為雜交探針的斑點印跡(dot-blot)方法);用氣相色譜法進行脂肪酸分析(脂肪酸的甲基脂化，隨後進行毛細管氣相色譜法);用核苷酸的水解和反相HPLC分析進行RNA分析。
除了按照上述方法得到的下面出現的數據之外，SDS-PAGE分析及通過銀色斑或通過用抗HAV抗體的Western印跡的蛋白檢測表明，當加載50-300ng蛋白質時，僅存在HAV特定蛋白質。另外，通過HAV特定RNA分析、蔗糖密度梯度分析和反相HPLC分析證明存在全HAV衣殼，其中的HAV特定RNA分析通過與HAV特定DNA探針雜交進行的。發現HAV特定RNA在產物中以每μg蛋白質約0.1-0.2μg的量存在。HAV特定RNA的這一含量是恆定的，具有約1/3全HAV衣殼與約2/3空HAV衣殼的比例。最後，根據示於圖2的檢定，使用HPLC分析，提供HAV純度的獨立測量，它表明單個HAV產物峰值。
蛋白質、碳水化合物、類脂和DNA的絕對濃度示於下面A節。通過蛋白質的微克標準化將A節數據變換在下面的B節中，而在C節中按照蛋白質的重量百分數表示(指碳水化合物存在的質量，例如，和蛋白質存在的質量比，乘以100)。
按照本發明的工業規模方法製得的8種HAV製品的這些分析結果示於下面。
A.組成分析組號 蛋白質 RNA 總碳水化合物 DNA* 脂肪酸(mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml) (mcg/ml)1 14.7 2.4 3.4 0.0045 0.32 8.0 1.1 3.7 0.0003 0.33 18.9 2.1 0.9 0.0003 0.34 17.0 1.5 2.5 0.0003 0.35 16.6 2.5 2.2 0.0003 0.36 8.4 1.5 1.1 0.0003 0.37 14.5 1.4 1.5 0.0003 0.38 14.6 1.8 1.2 0.0003 0.3
蛋白質的重量%組號 RNA 碳水化合物 DNA 脂肪酸1 16 23 0.036 2.02 14 46 0.004 3.83 11 5 0.002 1.64 9 15 0.002 1.85 15 13 0.002 1.86 18 13 0.004 3.67 10 10 0.002 2.18 12 8 0.002 2.
＊對於第一個試樣的檢測極限(LOD)是0.0045μg/ml。
對於後續的試樣，靈敏度提高，因而LOD是0.003μ/ml。
上述數據表示本發明產物特性，在失活和氫氧化鋁共沉澱之前，作為HAV製品具有下述特性，根據每微克蛋白質(通過SDS PAGE和銀染色分析，蛋白質大於95%純HAV蛋白)葡萄糖組成的碳水化合物 0.1-2.5μg非葡萄糖碳水化合物 ＜0.2μgDNA ＜0.004μg類脂 ＜0.1μgHAV RNA 0.1-0.2μg最好，當HAV製品為非常濃縮時，在失活和配製之前，這些分析以本發明的純化的HAV製品進行。然而，提供足夠量的失活的或最終配製的疫苗，這些分析可預示得到基本類似的結果。在一個特別優選的實施方案中，本發明的疫苗具有下面的公稱組分，每25單位/0.5ml劑量
＊由純化病毒體分析而外推的。
＃來自實驗批量樣品的分析。
根據活性檢定。
實施例11不同HAV製品的比較本發明的純化HAV製品與由其製造者所描述的其他HAV製品的說明進行比較。比較結果示於表1。
表1失活A型肝炎病毒疫苗的比較疫苗 總蛋白質 病毒蛋白質 蛋白質純度(ng/劑量) (ng/劑量)本發明 25b-100 25c-100 95e,fSmithkline 2000b300-500d≤25fBeechamJapana---- 1000d95ea.由Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute、Chiba Serum Institute和Denka Bio-Research Institute共同研製。
b.根據胺基酸分析(AAA)數據。
c.由HAV抗原酶免疫測定法確定;校準標準是純化病毒，由SDS-PEG/銀色斑分析純度＞90%，蛋白質由AAA確定。
d.由HAV抗原酶免疫測定法確定，校準標準未定。
e.由SDS-PAGE分析而確定。
f.由HAV抗原與總蛋白質的比率確定。
由這些數據和上述實施例10中所提供的數據可明顯地看出，本發明的製品比以前所報導的可獲得分析數據的任何製品更純(根據HAV抗原與總蛋白質的比率和胺基酸分析)、更完全特徵化、以及含有最低量的影響達到血清轉化和保護的病毒蛋白質。
實施例12菌苗效能-Monroe研究通過用CR326F HAV感染在NUNC CEU FACTORISE中培養的MRC-5細胞片而製得疫苗。將培養物通過常規餵養保持幾周。在合適的時間，通過去汙劑處理收穫感染的MRC-5單層細胞，並用示於圖1的用於NCF's的本發明方法純化HAV。將水相中的病毒吸附到氫氧化鋁上並於2-8℃貯存。每一0.6ml劑量含有25單位A型肝炎病毒抗原(根據對純化病毒參照標準的放射免疫測定)和300μg氫氧化鋁。安慰劑，含300μg氫氧化鋁和以1∶20，000稀釋的乙基汞硫代水楊酸鈉。有益健康的是，以感染HAV傳染高危險性的血清陰性疫苗接受者要麼接受單個0.6ml劑量的安慰劑要麼接受疫苗。在接種的那天和一個月後採集血樣。注意在50天等候期之後幾乎100%的疫苗接受者無HAV感染，以此單獨篩選出在接種之前已感染HAV傳染的接受者。另一方面，在50天篩選期之後，大量的安慰劑接受者感染了HAV傳染。這種研究的人數是足夠多的，因此疫菌苗接受者的保護作用是統計意義的。
實施例13在靜混合器反應器中病毒的生產在包括由外環路和泵系統而連接到曝氣器上的靜混合器柱的SSR中繁殖A型肝炎病毒(Charles River Biologcal Systems CRBS 5300)。該靜混合器反應器由鈦金屬元件構成，總計約260000cm2表面積，柱的直徑為8英時，長40英時。將MRC-5細胞引入反應器中並於37℃在William's培養基E中生長7天，該培養基E補充有10%(v/v)胎牛血清和新黴素硫酸鹽。可允許細胞繼續生長7天，而培養基部分每周換三次，以使餵養速率等同於NCF Monroe方法。以約0.1MOI將病毒引入反應器中。將SSR溫度降至32℃，並如上所述連續餵養22天。然後從SSR中排出培養基，並充入0.1%(w/v)Triton 緩衝液，以釋放出HAV。根據表面積，該反應器所產生的HAVAg比T形燒瓶約多50%，該燒瓶使用相同的試劑控制接種，並且以相似方式進行餵養、繁殖和收穫。該反應器的HAV製品也比實施例2的Nunc細胞裝置良好。
實施例14在不鏽鋼絲網靜混合物中HAV的生產14.1原料和方法細胞培養在所有研究中使用MRC-5細胞，以PDL≤40。於37℃在含有10%富鐵的小牛血清、2mmol穀氨醯胺和50mg/L新黴素硫酸鹽的William's E培養基中培養細胞。在研究中使用噴射攪拌罐反應器將0.1%Pluronic F-68加入到培養基中。10000細胞/cm2的細胞密度用於接種新培養物表面。用Coulter計數器和/或具有臺盼藍染色的血球計數計進行細胞計數，以試驗生存力。
在金屬取樣管上培養細胞將實心或絲網金屬取樣管(約5cm×5cm)置於玻璃的150cm2的培替氏培養皿中並無菌處理。在冷卻後，將90ml培養基置於該培養皿中，然後加入細胞接種物。培養基的量達到完全覆蓋該金屬表面。於37℃一天後，用無菌鑷子取走金屬片，並放在新的無菌培替氏培養皿中(以降低細胞在玻璃表面的生長)，該培養皿含有90ml培養基。通過用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌兩次，並向金屬片加2ml胰蛋白酶使該實心片受胰蛋白酶作用。在觀察到細胞釋放出後，在表面將胰蛋白酶溫和地吸取幾次，以保證完全被去除。
病毒母種和傳染在所有研究中使用具有滴度為108TCID50/ml的A型肝炎病毒母種。在此所報告的MOI是以TCID50/細胞，而不是以PFU/細胞計算的。通過加入病毒母種到新鮮培養基中並將其加入到培養物中而傳染培養物。傳染之後，於32℃培養該培養物。
在絲網取樣管上進行生存力染色法用螢光素二乙酸酯(FDA)和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EB)染色法來監測細胞生存力。在可生存細胞中，FDA被胞質中的酯酶裂開，產生發綠螢光的游離螢光素。EB快速插入不能生存細胞的核DNA中並發紅螢光。同時用這兩種染料標記細胞。染色溶液含有於50ml PBS中的100μl FDA原料(在丙酮中5mg/ml)和200μl EB原料(在PBS中10mg/ml)。然後將絲網件在5ml這種溶液中培養5-6分鐘。標記之後，將基底在PBS(每次衝洗20ml)中衝洗兩次，並裝在載片和條狀蓋板之間。然後用BioRad MRC-600共焦顯微鏡觀察試樣。
靜混合器反應器從Koch Engineering(Wichita，KS)購得絲網(通稱「E-部件」)和實心片316不鏽鋼靜混合器元件(SMV構型)。所有元件均由316型不鏽鋼或鈦製成，尺寸約為2×2英寸。實心元件的表面積估計為1300cm2，而絲網元件的表面積估計為2300cm2。這些後一種元件的表面積與液體體積的比約為26cm2/ml(根據總反應器體積計算約為24cm2/ml)。5個元件放入帶有PTFE端部配件的刻紋的5cm×26.5cm玻璃柱中。在連續元件中元件以與混合方向垂直排列放置。帶有這種元件的柱包含用於細胞生長的反應器。連接到電子控制儀上的攪拌罐輔助容器用於控制培養基的pH為7.2-7.3和DO為80-90%。用蠕動泵將培養基從攪拌罐循環到反應器中。
通過提供使細胞附著的低循環速率而完成反應器種植。將接種物放入體系中，並典型地以100ml/分鐘循環5分鐘，以便細胞和培養基混合。在這種快速循環期間內產生非常少的細胞附著。然後將流速降至約2ml/分鐘，這就達到通過反應器的表面速度大約等於細胞的沉積速度。已發現在靠近細胞沉積速率的速度對於細胞附著速率以及甚至細胞通過反應器的分配是最佳的。
細胞溶解步驟將細胞溶解在含有0.1%Triton X-100、10mmol TRIS和1mmol MgCl2的Triton溶解緩衝液中。用0.3ml/cm2PBS衝洗T-燒瓶兩次，並用0.1ml/cm2溶解緩衝液溶解兩次，持續1小時。關於溶解反應器的方案在本文中有描述。
分析方法用kodak Ektachem DT60分析儀測量細胞代謝物。根據酶免疫測定法，使用單克隆抗體測定A型肝炎病毒抗原(HAVAg)。對照牛血清清蛋白標準，使用Coomassie Blue Bio-Rad蛋白測定(Cat.＃500-0001)確定細胞溶胞產物中的總蛋白質量。
結果和討論MRC-5細胞在實心金屬取樣管上的生長在該研究之前，在鈦元件上進行靜混合工作。最好是研究細胞在不同合金表面上的生長，除這些合金比鈦便宜之外，並提供便於靜混合器產生更大的延展性。研究了兩個級別的各種不鏽鋼和哈斯特洛伊耐蝕鎳基合金(Hastelloy)316和316L不鏽鋼，HastelloyB和C。用約10，000細胞/cm2接種金屬取樣管。4天之後，使細胞受胰蛋白酶作用，並記錄最終細胞密度材料細胞/cm2鈦 1.4×105316不鏽鋼 1.6×105316L不鏽鋼 1.2×105Hastelloy B 2.2×103Hastelloy C 1.3×104在兩個級別不鏽鋼上的生長類似於鈦;細胞在Hastelloy B上不生長而在Hastelloy C上生長不良。不鏽鋼和鈦所記錄的細胞密度的差異不應看作某一個是優良的證據，這種差異是合理的，因為是測定細胞的生存力。
對於細胞在塑料基底上(例如聚苯乙烯組織培養燒瓶)生長來說，已獲得有關A型肝炎病毒生產的大量數據。為了比較，將MRC-5細胞在聚苯乙烯、玻璃和316不鏽鋼上的生長曲線示於圖3。細胞在所有這些表面上不相上下地生長。最大的比生長速率是相似的(塑料為0.034h-1，玻璃為0.032h-1，316不鏽鋼為0.039h-1)。對於塑料得到較低的最終細胞密度是合理的，因為營養受到限制。在塑料上生長是在T形燒瓶中進行的，而在玻璃和不鏽鋼上生長是在培替氏培養皿上進行的。由於在每一個體系中每平方釐米所用培養基的體積不同，因而所得到的營養也會不同。對於不鏽鋼取樣管，細胞的生長和葡萄糖的消耗示於圖4。
MRC-5細胞在絲網金屬取樣管上的生長為了獲得每單位體積最大的表面積，研究用於MRC-5細胞生長的培替氏培養皿中的金屬絲網材料。對於絲直徑和間隔的某種組合，具有與實心取樣管相同設計面積的一塊絲網可提供用於細胞生長的更大總面積。於是可以每單位反應器體積得到最大表面積的這種方式將絲網片組裝在或裝配在反應器中。為試驗細胞在絲網表面的生長，用材料和方法一節中所述方法來進行MRC-5培養。
說明了MRC-5細胞在或者由316型不鏽鋼或者由鈦製成的絲網上的生長。研究了具有絲直徑範圍為100μm～400μm、每英寸編成14×100、120×110、40×200和107×59絲的絲網取樣管。細胞在所有試樣上較大或較小程度上均生長。在早期階段，細胞在絲表面生長。之後很短時間，細胞開始跨越間隔，尤其是在角落。隨時間推移，細胞完全充滿間隔並形成多層。通過目檢，該絲網承載著非常高的細胞密度，這比按表面積計算的要多。直接的細胞表面濃度沒有得到，因為在絲網上的多層生長不適於受胰蛋白酶作用。初步的數據表明，間隔的尺寸是一個重要的考慮問題，因為細胞不能跨越大的間隔，而具有小間隔的絲網在極限情況下降低至與平板相同的表面。構造的材質不影響細胞生長，並斷定任何能編織成絲網片的生物適應的材料均適於使用。如下所述，使用金屬絲網具有的優點是易於清洗並可重複用於細胞生長的許多周期中。
從這一點，僅例舉具有每英寸編成107×59絲、絲直徑為160μm的316不鏽鋼絲網(由此得到絲的間隔為77μm×270μm)。下面討論的絲網靜混合器元件由這種材料製成。除了提供增加的表面積之外，該絲網允許細胞以多層生長。在該絲網上多層細胞生長的顯微照片示於圖5。所關心的是，確定整個層中的細胞是否全存活，或者是細胞在多層中心的是否壞死。如在材料和方法一節中所述，螢光素二乙酸酯和溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓用於這種目的。通過用雷射共焦顯微鏡掃描絲網截面，根據溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓沒有插入核DNA和螢光素二乙酸酯分解產生游離的螢光素的事實，證明絕大多數細胞是存活的。圖6A示出一系列穿過細胞層的橫截面的螢光素信號。圖6B示出同一截面的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓信號。在這些實驗中，用甲醇處理使細胞不存活的個別取樣管作為溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的正調節和螢光素二乙酸的負調節。這種調節示於圖7。
在絲網靜混合器元件上種植細胞對於進行最佳培養以及對於保持低的、均勻的生物學生產中的細胞倍增水平來說，均勻種植是重要的。得到由上述研究的相同材料制的絲網靜混合器元件。圓柱形反應器的取向是其中心線為垂直的。儘管早期研究已用水平中心線的促進細胞沉降到生長表面上的反應器進行，但已發現附著到垂直表面是高效的，並且是優選的操作方式。在整個這種操作中，以約10，000cm2種植細胞。細胞被種植在多個元件的反應器中，其中各個元件的混合軸線是彼此平行或90°之間的任一角度。為了液態混合和最佳反應器操作的目的，優選垂直構形。
在早期研究中，不使用可產生5cm/分鐘表面速度的循環速率來種植細胞。通過填充反應器和使細胞通過重力沉降2小時種植可增加種植效率。這常常提供大於90%的種植效率(種植效率＝種植的細胞數/接種細胞總數×100%)，但這種種植是不均勻的。如圖8所示，底部元件含有大多數細胞，而頂部元件含的很少。由這些數據，MRC-5細胞生產中的平均沉降速度計算為6cm/h。在另一個實驗中使用4個元件，用於種植的培養基以約等於該沉降速度的速率循環。在這種條件下可重複地獲得種植效率大於90%的均勻的種植(圖8)。上述結果表明，通過反應器的培養基的表面速度影響反應器中的附著率和細胞最終分布的兩者比例。
細胞在實心片和在絲網靜混合器元件上生長的比較裝配兩個反應器並同時運轉，以說明實心片和絲網元件之間的差異。該實心元件是由鈦製成的，而絲網元件是由不鏽鋼製成的。估計表面積是實心元件為1300cm2，而絲網元件為2300cm2，結果絲網與實心元件的表面積比為1.8。實心片元件同絲網元件一起操作，以對所有實驗提供對比。將約10，000～20，000個細胞/cm2種植到反應器中。反應器以間歇方式運轉直至葡萄糖濃度降至低於120mg/dl，在此時開始灌注培養基。兩個反應器用相同收穫期的MRC-5細胞接種，並餵給來自公共儲藏器中的培養基，以清除這些易變因素的任何差別。
每個反應器的葡萄糖吸收率(GUR)示於圖9。圖9A以cm2比較這兩個反應器，使用上面指出的面積，這些表面積認為是近似的。圖9B以反應器培養基容積為基來比較這兩個體系，因為每個反應器都是相同尺寸，即5個2×2英寸元件，和1個1L的輔助培養基容器。圖9B不包括任何與表面積有關的近似值。葡萄糖吸收率被用作測量細胞生長並用於估計固定階段的開始。圖9中最後的點表示通過triton溶解反應器收穫的時間。用肉眼觀察，細胞匯合在實心基體上，在絲網元件上網格的間隔幾乎被填滿，這就可以假定更多的生長是可能的。在這一點，以0.19L/h的速率向實心反應器灌注培養基，而此時培養基中的葡萄糖濃度為1.16g/L。對於絲網反應器的灌注速率為0.26L/h，面培養基中的葡萄糖濃度為0.69g/L。這些結果表明，對於細胞生長階段，絲網反應器比實心反應器可達到更優越的代謝活性。
將反應器排乾，並用去汙劑緩衝液溶解細胞，以萃取細胞蛋白質，測量反應器中的細胞質量。對於這些實驗，從每個反應器中收穫細胞締合的蛋白質的溶解步驟是相同的將2L室溫PBS以100ml/分鐘循環通過反應器5分鐘，然後排出。為去除培養基中蛋白質的這種洗滌重複兩次。緊接著，將原料和方法一節中所述的1L溶解緩衝液在37℃、以400-500ml/分鐘、循環通過反應器1小時。這樣再重複一次(溶胞產物1和2)，而後來的溶胞產物循環更長的時間一對於溶胞產物3為2小時，對於溶胞產物4為4小時。在每個溶胞產物中所去除的蛋白質的百分數示於圖10。當用附錄1所給出的對應關係將總蛋白質計算值換算成細胞密度時，該實心靜混合器元件含3×105細胞/cm2，而絲網元件含6×105細胞/cm2。對於實心片反應器來說，前一個數值認為是有代表性的，因為所有的細胞在溶解過程都被去除了，這已由用拭子擦拭元件並在顯微鏡下觀察該拭子所證明。然而，當用顯微鏡觀察時，並非所有的細胞碎片都已從絲網元件上去除，因而可以斷定這後一個數據是低的。根據一個反應器，絲網元件承載的細胞濃度大於3倍的實心元件。假如表面積的計算是準確的，總蛋白質數量上的這種差別超過了表面積的比率，並且是多層細胞生長的證據。
在絲網靜混合器元件上的HAVAg的製備以使用絲網靜混合器元件的反應順說明HAVAg的製備。本實驗的目的是確定是否病毒的繁殖發生在支承多層生長的不鏽鋼絲狀元件上，這不是HAVAg製備的最佳化體系。對於該實驗，使用整個培養基的替代物而不是培養基灌注。本實驗的GUR曲線示於圖11;該圖的GUR的計算基於在培養基重新餵給之後那天所得到的葡萄糖值。用約1的MOI傳染細胞7天。對於MOI的細胞密度的計算是根據傳染時葡萄糖的消耗率確定的。如用如實施例9的方法觀察到的那樣，在傳染後葡萄糖吸收率平穩的時期很短，隨後即下降，與細胞傳染相一致。在圖10中所觀察到的下降比用實施例9中方法所觀察到的更陡峭，這是可能的，因為有更均勻的傳染度(實施例9用0.1的MOI)。在傳染21天後，通過Triton去汙劑溶解來收得病毒抗原。溶解細胞的方案下面敘述。
溶胞產物1於37℃將溶解緩衝液循環通過靜混合器1小時。
溶胞產物2於37℃將溶解緩衝液循環通過靜混合器1小時。
溶胞產物3在含0.7L溶解緩衝液的Branson近程聲波定位浴器中聲處理1小時。
溶胞產物4將元件在1L溶解緩衝液中冷凍12小時，解凍、並聲處理1小時。
在這些洗滌物中釋放出的總蛋白質和HAVAg的百分數示於圖12中。前2種溶胞產物所用的循環對於從細胞中去除HAVAg是非常有效的。這個實驗在溶解之前僅用2次PBS洗滌，而且並不是非常有效的，因此溶胞產物1的總蛋白質百分數是人為的高，而溶胞產物2、3和4的總蛋白質百分數是低的。在冷凍之前，對單個收集的樣品用EIA測定了HAVAg。根據後來確定的每個溶胞產物的百分數，這與每單位表面積的抗原產量兩倍於實施例9有關。這個實驗的目的是認識到，病毒的繁殖如所述可通過產生HAVAg而發生。這個實驗說明絲網靜混合反應器在HAV生產中的應用。
儘管該反應器根據GUR曲線可能收穫較晚，但是抗原產量是較高的，這表明了多細胞層對傳染的敏感性。這個數據也表明了MOI在HAV生產中的重要性;以MOI為1進行傳染，好像該過程的持續時間應減少一個多星期，並在20天收穫。根據數據的變化，傳染的時間和MOI對生產過程是重要的變量;這些參數在降低培養物長度方面是重要的。細胞生長實驗表明，傳染的細胞以類似於未傳染細胞的生長速率而連續生長，甚至對用CR326F P28以高MOI傳染的培養物也是一樣(圖13)。這是不管傳染和溫度至32℃，對這種病毒株來說，生長溫度是隨意的。由這些曲線計算的最大比生長速率是0.015h-1，約是未傳染細胞於37℃時生長速率的一半。事實上在反應器生產中，在HAV傳染的第一周內細胞具有相似的表現是重要的，因為人們可能注意到最高的細胞濃度而可能忽視傳染時間和MOI。這個實驗表明，細胞生長持續時間、傳染時間和MOI的最佳化是相互制約的。
靜混合器元件的清洗希望有用於生物生產的可重複使用的生長表面，以避免廢物處理，並能使反應器過程自動化，以及增加培養物的重現性。通常，用蒸餾水衝洗絲網元件，以去除培養基鹽類(以500ml/分鐘，衝洗1小時)，置於1L5%(w/v)NaOH溶液中，並高壓滅菌45分鐘。冷卻後，再用蒸餾水衝洗元件直到不存在NaOH(用衝洗後的pH來確定)。通過顯微鏡觀察，對於去除細胞碎片是非常有效的。可以推測出，不太苛刻的處理也產生相同的清洗，而且更適合於原位清洗生產中的反應器。經這種方法處理的絲網元件至少可以重複使用10個循環而不改變細胞生長性能。上述病毒生長研究中所用的元件以這種方式製成，說明所使用的清洗過的元件對HAV繁殖的應用。
結論這些研究已表明，由不鏽鋼絲網構成的靜混合器元件能夠承載MRC-5細胞的多層生長。證明多細胞層是能存活的，而沒有發現壞死。傳染研究表明這些多細胞層對A型肝炎病毒傳染是敏感的，並且在非最佳體系中產生超過目前使用如實施例9的實心承載物所獲得的抗原。用微載體進行培養，細胞叢將產生不定的多層，絲網靜混合器提供清晰的多層，這是因為它的精巧製作的幾何結構，因此養分限制和廢物積聚將不成為問題。細胞在網格的間隔中生長將阻塞間隔，並產生類似於填滿塞子的型式的實心片元件。因此，該體系得到靜混合器技術的混合益處，並將可預測的和均勻的養分供給細胞。這是與其它填充床反應器類型，例如纖維任意填充床、玻璃珠填充床，空心絲反應器，或陶瓷整體反應器相反的。在這些類型反應器中，細胞生長造成培養基流動方式變壞並產生營養不良的細胞囊。總之，包含不鏽鋼絲網靜混合器元件的可重複使用的反應器，用於MRC-5細胞培養和A型肝炎病毒抗原製備巨大潛力。
實施例14-附錄1總結對MRC-5細胞溶胞產物中的總蛋白質定量並直接與細胞計數(用血球計數器和Coulter計數器)相比較。在早期指數、後期指數和平穩生長階段中的健康細胞以及在傳染1、2和3周後的細胞證明，由每個培養物溶胞產物中測量的總蛋白質數通過用單個曲線可直接對應於細胞密度。這種簡單的對應關係提供了估計反應器中細胞密度的手段，這不適合於直接計數技術。
討論蛋白質測定及樣品製備Bio-Rad蛋白質測定法(Cat.＃500-0001)是一種快速、靈敏的用於定量總蛋白質的方法。早期實驗表明，目前的溶解緩衝液(0.1%Triton X-100、10mmol Tris-HCl、0.1mmol MgCl2)不影響Coomassie Blue基本測定。為了稠度，全部稀釋，包括那些標準蛋白質(牛血清清蛋白)在Triton緩衝液中進行。Triton細胞溶胞產物實際上經常是絮凝的這樣一個事實表明，在進行測定之前樣品需要進一步處理。大量的絮凝物導致高的蛋白質滴度。然而，在兩個快速冷凍(在-70℃乙醇中)和解凍循環之後，絮凝物尺寸降至能獲得均勻懸浮液的程度。另外，通過測定幾個單個樣品的稀釋液，可容易地確定可能由製備不好的樣品所產生的無關點。也將樣品離心分離，並使用澄清的上清液;這種處理提供相似的結果，但認為是不必要的。這裡所給出的數據是指在測定之前細胞溶胞產物最少冷凍兩次並被充分渦流。
細胞密度函數的蛋白質濃度對於允許總蛋白質轉換成比細胞數的單個標準曲線，整個方法中的細胞必須包括大約等量的蛋白質。為試驗這一點，用等數目的細胞接種T形燒瓶。在本方法中以特定的間隔，將兩個燒瓶破碎。一個燒瓶受胰蛋白酶作用並用血球計數器和Coulter計數器對細胞計數，而另一個燒瓶則用去汙劑溶解，即用0.3m/cm2PBS衝洗兩次，用0.08ml/cm2溶解緩衝液溶解兩次。這適合於在早期指數生長階段、後期指數生長階段和平穩階段中的培養物，以及在傳染後第1、2和3周的培養物。這些實驗的累積數據示於圖14。最吻合線由等式y(104)＝-0.09+0.42x表示。該圖證明，單個曲線提供了通過總蛋白質測量結果來估計細胞數的手段，而不考慮細胞的「狀態」。
本實驗中的細胞用HAV CR326FP28、以MOI為1進行傳染。在傳染後3周，證明胰蛋白酶作用對收穫的細胞無效。然而，因為由傳染後1和2周得到的細胞密度大致相同，並且在3周可見的細胞溶解看來好像不存在，因而對3周所用的細胞密度根據在2周時所得到的數據。將圖14重新繪製，以表明每個特定數據點的時刻。由於不考慮傳染後3周的數據，曲線的斜率和截距沒有大的影響(見圖15)。
利用上面的對應關係，如在實施例9中製備的幾個培養物的溶胞產物的總蛋白質數據得出平均490μg/ml蛋白質。這換算成約3.3×105細胞/cm2，並且大體上與在對比T形燒瓶上用血球計數器所測定的細胞密度相一致。總之，相信Triton細胞溶胞產物的總蛋白質量提供了病毒收穫時的有用的細胞密度近似值。
實施例15溶劑萃取步驟的混合研究概要在A型肝炎病毒純化過程中，在去除直至在PEG片狀物階段還存在的雜質中，溶劑萃取步驟是關鍵的。為了全面理解和控制這一步驟，進行一系列實驗以確定溶劑萃取的重要參數。兩個關鍵變量被確定為混合持續時間和攪動強度，以所用瓶子的尺寸來確定。溶劑與水相的體積比在整個研究範圍內不是主要的因素，不論是使用與手搖動不同的機械搖動器或者是使用渦流。
材料和方法將懸浮的PEG沉澱樣品與從0.5∶1至3∶1(溶劑與水相的比率)的不同比例的氯仿和異戊醇溶液(24∶1CHCl3∶IAA)混合。通過用力手搖、渦流(對於15ml試管)或者在3D機械搖動器上(Glas-Col.Terre Haute，Ind)以馬達速度100(對於15ml和50ml試管，對試管在水平方向輕敲)進行混合。混合時間範圍從20秒至1小時。
混合後，將樣品離心分離至各相分離。對於50ml試管和500ml瓶，使用帶有JS4.2擺動葉片旋轉器的Beckman J6-MI，以3800rpm離心分離10分鐘。對於小試管，開始使用DynacⅡ離心機，以1000rpm離心分離5分鐘，然後為了後續實驗，將樣品轉到50ml試管中，如上進行離心分離。
用玻璃吸移管將水相去除並用大小HPLC在下述條件下進行分析依次用兩個TSK P4000×1的柱(Toso Hass)，流動相以0.32ml/分鐘的RCM8(也稱作CM563，它是在6.2mmol磷酸鹽緩衝液中溶入150mmol NaCl，pH7.2)，在214和260nm處監測(80分鐘運轉時間)。結果以峰面積或基於214nm uv吸光度的峰面積比率來表示。對於在15ml試管中的初始實驗，使用單個的TSK柱(40分鐘運轉時間)。隨後，建立兩個柱，以在A型肝炎病毒和雜質峰之間獲得較好的分辨。
在15ml試管中於2-6ml刻度上進行初始實驗，用手搖或渦流進行混合樣品。當得到最初少量幾組的分散的結果時，在機械搖動器上用較大體積(於50ml試管中，裝入量最大至24ml)來進行混合。在批量生產過程中，樣品也可取自500ml瓶中。該瓶短時搖動(例如20秒)。通過放置約1分鐘將該相分離並從上部的相中取走600μl樣品。該瓶再經另外的短時搖動，然後再次取樣。這些樣品後來在微離心機中以最大速度向下旋轉2分鐘。
結果1.混合時間由在15ml試管中初始的小規模實驗可看出混合時間是重要的變量，隨著混合時間的延長導致較好的雜質的去除。由圖6可清楚地看出，經過較長的混合時間，A型肝炎病毒與雜質的比率增加。另外，在圖20中，可以看出雜質峰的面積隨著混合時間的增加而顯著降低。
對於50ml試管來說，混合時間的確是重要的，在這種樣品中需3分鐘的混合時間來最高程度地去除雜質(圖20)。在這種情況下，為了較好的分辨用串聯柱進行分析，並且僅觀察到A型肝炎病毒峰面積稍微減小。
也研究了在用於製備過程的500ml瓶中的混合時間的作用。在2分鐘總混合時間的過程中每20秒取一次樣品。該實驗以兩種不同的溶劑比2∶1和3∶1來進行，這也相應於瓶中的兩種不同的水相體積(約60ml和90ml，溶劑體積保持恆定在180ml)。圖21表明雜質含量隨混合時間延長而降低，在1分40秒後被完全去除。用於製備過程中的時間是2分鐘，這保證了基本上去除雜質。為了更完全去除，可延長至3分鐘。體積和溶劑比率的差別在整個所用範圍內看來似乎具有很小的作用。
在50ml和15ml兩個試管中將該實驗延長至更長的混合時間。圖22表明在所有使用的試管中基本上可達到相同的純化程度，但在較小試管中需要6-8分鐘，而在500ml離心瓶中需要時間小於2分鐘。這些差別將在第3節中進一步討論。為了確定病毒是否受到延長搖動的影響，將50ml試管用機械搖動器混合1小時。HPSEC結果表明，A型肝炎病毒峰面積沒有進一步減小，並且EIA結果(表1)表明，1小時如同2分鐘混合一樣，抗原性是相同的。同組的生產過程的液流的結果表現出相似的EIA值。因此，為了保證在生產過程中完全去除雜質，如在圖上看到的最短混合時間可以延長而不降低病毒的產量。
表1 通過HPSEC和EIA說明延長搖動對A型肝炎病毒的影響(50ml試管)
2.體積比對於比較組，用於簡單萃取的溶劑與水相的體積比為1.5(在單個瓶中用磁攪拌棒攪拌)，而對實驗組的上述體積比為2-3(在500ml瓶中攪拌)。因此測定在0.5和3之間體積比對純度的影響。用4個不同生產批次的原始PEG沉澱物進行最初的小規模實驗(在15ml試管中，混合1分鐘)。圖23表明，溶劑與水相體積比和雜質去除之間沒有明顯的對應關係。數據分散可能是由於原料變化和搖動的不一致造成的。將樣品的體積按比例擴大至50ml試管，並用機械搖動器與水平安置的試管一起搖動2分鐘。結果示於圖24。儘管數據仍然分散，還沒有基於溶劑與水相體積比的明顯變化趨勢。這一點可以由在具有2∶1和3∶1溶劑比的500ml瓶中進行的表明在雜質去除方面很小差別的混合時間實驗(圖21)所證明。因此，似乎溶劑比不是重要的變量，而且增加溶劑比並不有助於改進所觀察的同組的純度。
3.混合的類型和容器的尺寸在小試管(15ml)中，看不出手搖動與渦流之間的影響趨勢，因為對於不同生產批次的實驗結果是分散的(圖23)。圖19中簡單的數據點也表明手搖動和渦流之間好的吻合。在較大試管中，對手搖動和機械搖動進行比較。在圖25中，對於相同尺寸和裝入量的試管，可以看出手搖動的結果僅稍微不同於搖動器。表2示出了在500ml瓶中的實驗結果。這些結果來自一批6個瓶的實驗，一個用手搖混合，而其他用機械搖動。對每一類型的混合均取樣，HPLC分析表明它們的實驗結果非常近似，都得到高純度，證明了搖動類型不是關鍵的，但所用瓶的尺寸是很重要的，對於在搖動器上相同的混合時間，500ml的瓶優於50ml試管。這也由圖22中的數據所說明。
表2 不同類型的混合對A型肝炎病毒/雜質之比的影響(2分鐘 )
也要考慮到試管的裝入量。50ml試管裝入10.5ml(溶劑+水)的量可得到很近似於典型裝入21ml所得到的結果。類似地，500ml瓶裝入240或275ml出現相同量的雜質被去除(圖21)。在所有的混合實驗中，15ml試管裝入其滿容量的或者0.13或者0.4。對於50ml試管，大多是裝入其滿容量的0.53(一個實驗是0.26)，而500ml瓶裝其滿容量的0.48和0.57之間。因為對於三種類型的試管使用相似的量並且所得結果與裝入量無關，所以這在整個該範圍內不可能有強的影響。然而，如果試管被完全裝滿，不存在上部空間，並且很難將其混合，則是很可的。結果這會降低雜質去除的效率。
另一個變化的並是重要的因素是試管的寬度與高度比對15ml試管為0.13，對50ml試管為0.26，而對500ml瓶為0.58。較大的寬度與高度比有助於較好的混合是可能的，因為所形成的搖動模式會產生較大的界面面積。
也檢驗了來自先前的比較組的數據，在這些比較組中存在於PEG片中的雜質相同。4組樣品在裝有磁攪拌棒或旋轉器的單個燒瓶中用溶劑萃取1分鐘。然後將該溶液分配到離心瓶中，以通過離心分離進行相分離。溶劑與水相的比為1.5。所得的A型肝炎病毒與雜質的比在0.48-2.7範圍。附加的比較組在250ml錐形離心瓶中(溶劑與水相之比為1)搖動1分鐘。所得純度比(A型肝炎病毒/雜質)是0.87。這些結果都可比得上在相似條件下在15或50ml試管中所得結果，但比在全規模實驗組中所得的典型範圍為4-21的結果(對於8批樣品)低的多。這與在生產規模中為混合使用更長的混合時間和更大的瓶是一致的。
結論由這些數據我們可以得出結論，全規模實驗組和先前的比較組之間的純度的差別是因為在較大(500ml)瓶中進行搖動更長時間(2分鐘與1分鐘相比)。由於在這些瓶中搖動時產生較大的界面面積，體積的影響是可能的。500ml一般裝入量小於300ml，就形成大的上部空間面積，在混合過程中該空間被充滿，則產生擴大的溶劑/水相/空氣之間的界面面積。減小的界面面積很可能引起在小試管中得到的溶劑萃取產物純度較低。然而，由於混合時間也是重要的變量，因此在50ml試管中的純度最終達到了與在500ml瓶中相同的水平。
研究的其他變量，即溶劑與水相的比和搖動類型，在整個研究範圍內發現不是重要的。
實施例16A型肝炎病毒的溶解度如前面所述，根據來自生產組的生產過程的液流的HPSEC分析，觀察到了A型肝炎病毒的顯著損失。在純化過程中，用HPSEC定量方法來估計其損失量，在純化過程的離子交換和大小排阻色譜步驟之間病毒-夜損失大於50%。這與通過離心分離去除的沉澱物所表現出的損失相吻合。
假定沉澱物是A型肝炎病毒，並且沉澱是由用於洗脫來自離子交換柱上的病毒的緩衝液的高離子強度所引起。試圖用氯化鈉和磷酸鈉的水溶液來溶解該沉澱物。基於病毒損失，用HPSEC測定沉澱物(實際上是沉澱物漿)的濃度測定為幾mg/ml。將沉澱物漿的等分樣品或者與6mmol磷酸鈉、0.15N氯化鈉在6mmol磷酸鈉中形成的溶液、0.3N氯化鈉在6mM磷酸鈉中形成的溶液、0.5N氯化鈉在6mM磷酸鈉中形成的溶液，或者與1N氯化鈉在6mol磷酸鈉中形成的溶液混合。
甚至當與很少量的6mmol磷酸鈉混合時，該沉澱物也在幾秒鐘之內溶解。然而，當與含氯化鈉的溶液混合時，沒有觀察到外表上的明顯區別(除非顯著的稀釋)。通過用5.65ml的6mmol磷酸鈉溶液溶解0.35ml料漿而製備A型肝炎病毒儲液。應注意的是，在加入僅約0.5ml磷酸鈉溶液後，就發生可見的顆粒完全溶解。將該儲液的樣品與不同量的1N氯化鈉在6mmol磷酸鈉中形成的溶液混合，以達到0.15N、0.3N或0.5N氯化鈉的目標濃度(表Ⅰ)。
表16-I
然後這些溶液的濃度用HPSEC定量，兩周之後再用HPSEC定量。這些數據示於表Ⅱ並繪製在圖27和28中。
圖27表示在加入鹽之後約1天在溶液中測量的A型肝炎病毒的初始濃度。用HPSEC測定該儲液具有約100mcg/ml的濃度。這相當於沉澱物漿中的約2mg/ml。(該漿中的A型肝炎病毒的量大致相應於在生產過程觀測到的損失量。因為該沉澱物在僅加入少量磷酸鈉後就觀察到溶解，因此估計在含少量鹽水的溶液中的溶解度大於或等於約1mg/ml。)在含氯化鈉溶液中抗原的濃度比用鹽水稀釋的儲液稀釋液的計算濃度低的多。另外，含鹽水的溶液的HPSEC分析表明，在這些含鹽水的溶液中存在大比例的聚集體物質(表Ⅱ)。
表16-Ⅱ鹽水溶液中A型肝炎病毒的HPSEC結果(第1天)氯化鈉濃度 抗原(單體形式) 聚集體:單體(面積比)0(儲液) 106mcg/ml 00.15N 64 0.050.30 11 0.520.50 6.6 0.52這表明了A型肝炎病毒甚至當在鹽水中濃度低於50mcg/ml時也聚集然後由溶液中沉澱。圖27還示出了由離子交換柱上洗脫的產物的近似組成(由點IEP代表)。它顯然高於能保持在溶液中甚至1天的抗原含量，並因而在它由離子交換柱上洗脫後需要立即稀釋產物的純化過程中沒有顯著的改變。為了使稀釋最小，並使然後填充到製備大小排阻柱上的體積最小，應當用6mM的磷酸鈉進行稀釋，以保持額定的pH控制值同時減小離子強度和抗原濃度。1對1的稀釋估計將抗原濃度降低到一個點，使得它在磷酸鹽中氯化鈉為約25mcg/ml和150mM時低於圖27中IEP＊所代表的曲線。在這些數據的基礎上，實現了將該稀釋加進到純化過程中。
圖28示出了在第1天和第14天在上述溶液中測量的濃度。顯然抗原的濃度在第1天和第14天之間的全部時間內下降，並且1對1的稀釋不將抗原稀釋到溶解度曲線之下，但僅使病毒溶液穩定，並減慢聚集和沉澱的開始進行。可能的是，對稀釋進一步優化將導致產物產量的進一步提高。
最後，為檢驗該儲液含A型肝炎病毒而不含會在HPSEC上共同洗脫的某些其它物質，對該儲液進行SDC-PAGE和銀染色法。當與SEC產物比較時，同樣的蛋白質頻帶是明顯的。
實施例17用於監測A型肝炎病毒純化試樣的高效大小排阻色譜法引言已經研究了一種在A型肝炎病毒純化過程中表徵和監測過程效能的方法。使用UV在214nm和260nm進行檢測的分析用高效大小排阻色譜法(HPSEC)使得能夠分析過程樣品中A型肝炎病毒和關鍵雜質(聚集體、核酸-A型肝炎病毒加合物、以及660kDa雜質)的相對量。此外，HPSEC被用於測定由最後三個純化階段(萃取、離子交換和製備SEC)所取樣品中A型肝炎病毒的濃度值。這種測定方法用於監測BENZONASE的消化效能，並提供每一操作階段A型肝炎病毒雜質外形的獨特標記，以用於後步試驗作參考。
取自10個生產組的A型肝炎病毒過程樣品通過HPSEC分析以提供所有各純化階段的過程效能數據。這些分析所得的數據和另外的穩定性及摻料研究一起，使得能確認該HPSEC試驗，並清楚的指明A型肝炎過程的一致性。
本實施例既說明了HPSEC測定確認的數據，又說明了10個生產組分析的結果。本報告被編制進下列章節第Ⅰ節 儀器和色譜法條件敘述HPSEC柱和HPLC的儀器和操作條件。
第Ⅱ節 測定和校準步驟敘述校準標準物的製備和測定步驟。
第Ⅲ節 線性度、精確度，以及再現性統計計算。
第Ⅳ節 結果分析示出取自1個組的一組色譜，同時敘述每個過程樣品所得數據的類型，以及推薦的報警極限第Ⅴ節 樣品的貯存條件對每種過程試樣進行貯存研究，以確定4-6℃下的穩定性。
第Ⅵ節 對EIA和HPSER結果進行比較第Ⅶ節 過程效能的一致性附錄A 對取自10個組的過程樣品進行HPSEC的結果。
第Ⅰ節 儀器和色譜法條件物料和試劑含有6mM磷酸鈉，120mM氯化鈉的CM80(MMD)磷酸鹽緩衝鹽水，pH7.2儀器(除使用柱以外可作等功能的替代)
HPLC系統配有10ml鹽洗滌頭的RAININ Rabbit泵自動取樣器配有循環冷卻器的RAININ AI-1，以保持試樣架溫度為2-6℃檢測器RAININ UV-M雙通道UV檢測器數據採集系統Dynamax HPLC法管理系統，輸到Apple Macintosh SE上的Verson1.1柱TosoHaas TSK PW 4000xl，7.8x300mmLHPLC微型瓶-玻璃或聚丙烯。
色譜法條件柱Tosohaas TSK PW 4000xl，7.8x300mmL流動相CM80(6mM磷酸鈉，120mM氯化鈉，pH7.2)流量0.32ml/分檢測UV214nm和260nm@1V檢測器輸出注射體積50μl注射之間的運轉時間55分鐘TSK PW 400xl柱所用的柱是TSK PW 4000xl，它包括一個甲基丙烯酸酯基的5μm載體。以下示出了由聚環氧乙烷(PEO)標準物繪製的校準曲線。虛線表示所關心的3種溶質，即A型肝炎病毒聚集體、A型肝炎病毒和660kDa汙染物的保留時間。還用虛線表明了2種低分子量疏水化合物，即維生素B12和丙酮的保留時間。兩種化合物均位於校準曲線的右邊;這些化合物的保留表明該聚合物載體的疏水性質。在幾個過程試樣中觀察到保留的峰(見圖29)。它們通常在鹽的峰值附近洗脫，並假定是低分子量的化合物。
第Ⅱ節 測定和校準步驟製備校準用標準物使用6條水平的校準曲線測量A型肝炎病毒的值。通過稀釋純化的A型肝炎病毒產物製備校準標準物。濃度為12μg/ml的SEC產物已被用作標準物。復蓋濃度範圍0.75-12μg/ml的6種校準標準物通過用CM80稀釋SEC產物而製備，如下表所示。
校準用標準物 A型肝炎病毒濃度 μlA型肝炎病毒 μlCM80(μg/ml)1 12 250μl9854SEC產物 02 9 180μl9854SEC產物 603 6 250μl9854SEC產物 2504 3 250μl校準標準物3 2505 1.5 250μl校準標準物4 2506 0.75 250μl校準標準物5 250通過將A型肝炎病毒溶液和CM80直接加入HPLC微型瓶製備標準物。A型肝炎病毒的校準曲線經繪製A型肝炎病毒峰值面積的常用對數值對濃度的常用對數值的圖而製備。典型的校準曲線示於圖30。
進行校準曲線數據的10g-10g轉換，以減小校準曲線對高濃度校準標準物的依賴性。對於生物的微小分子的色譜法而言，數據的差別隨濃度的增大而趨於增大。因而對於HPLC校準曲線，回歸線的斜率應由也是最易變化的最高濃度的標準物首先確定。
繪有13條A型肝炎病毒校準曲線的圖(如上所述在整2個月期間製得)示於圖31。左面是13條曲線的線性圖，右面是同樣13條曲線的10g-10g轉換圖。該線性圖由共用的坐標原點起各曲線呈現出明顯的「嗽叭形」，清楚地證明A型肝炎病毒的峰值面積隨著濃度的增大其差別增大。其結果是曲線間斜率值變化。
這些校準曲線的10g-10g轉換使得在整個濃度範圍內差別(RSD)恆定。結果是如圖31B所示減小了曲線間的斜率變化。
試樣的製備步驟A.A型肝炎病毒的過程試樣測定取自下列各階段的過程試樣1.過濾的溶胞產物2.核酸酶處理的過濾的溶胞產物3.PEG沉澱物再懸浮液4.氯仿萃取的水相5.陰離子交換產物6.大小排阻產物過濾的溶胞產物，核酸酶處理的過濾的溶胞產物，以及大小排阻產物的各個試樣在注入前不應稀釋。PEG沉澱再懸浮的試樣應離心(10000xg5分鐘)除去殘留的顆粒然後注入。PEG沉澱物再懸浮的試樣在注入前用CM80按1∶4(v/v)稀釋。氯仿萃取的水相和陰離子交換產物分為未稀釋測定和在注入前用CM80按1∶1(v/v)稀釋測定，以使濃度落在校準曲線的範圍內。對全部試樣均重複測定三次並將三個測定結果平均。各試樣於2-6℃貯存在自動取樣器中同時等待注入。
少量的Triton殘留在TSK PW 4000xl柱上，需要附加洗脫液將其去除。因而含有Triton的各試樣(過濾的溶胞產物，以及核酸酶處理的過濾的溶胞產物)應接著注入CM80空白劑以保證在注入另外試樣之前去除。各試樣可以用SEC產物開始以相反的次序進行，以避免後期的洗脫影響峰值。
測定步驟1.將6種校準標準物各注入50μl。A型肝炎病毒的保留時間應為19.0+/-1分鐘。
2.按上述方法製備試樣。注射50μl。每個試樣測定三次。
第Ⅲ節 線性度、精確度和再現性整個0.75-12.0μg/ml範圍的13條校準曲線在5周時間內於不同天裡製作。對每條曲線得到的回歸方程用於計算包括該曲線的各校準標準物的濃度。與這6種校準標準物的標定濃度相比較的由13條曲線計算的結果列於下表1。
表17-1純A型肝炎病毒的測量濃度與標定濃度的比較，以回歸線為基礎計算校準曲線 A型肝炎病毒校準標準物的標定濃度(數據mm/dd)12μg/ml9μg/ml6μg/ml 3μg/ml1.5μg/ml0.75μg/ml曲線1(10/6) 11.91 8.93 6.03 3.03 1.54 0.73曲線2(10/7) 11.88 8.88 6.00 3.04 1.52 0.74曲線3(10/8) 12.26 8.81 5.95 3.00 1.49 0.76曲線4(10/10) 11.97 9.04 6.00 3.04 1.45 0.76曲線5(10/13) 11.89 8.97 6.06 3.02 1.52 0.74
曲線6(10/14) 11.75 9.08 6.07 3.06 1.47 0.75曲線7(10/20) 11.94 8.98 5.96 2.98 1.60 0.72曲線8(10/21) 11.99 8.95 5.99 3.01 1.53 0.74曲線9(10/22) 11.98 8.94 5.90 2.97 1.45 0.70曲線10(10/26) 12.08 - 6.00 2.98 1.48 0.76曲線11(10/28) 12.01 9.05 6.00 2.95 1.51 0.75曲線12(11/18) 11.48 9.23 6.14 3.00 1.52 0.73曲線13(12/3) 11.88 8.90 6.10 3.04 1.50 0.74平均 11.92 8.98 6.02 3.01 1.51 0.74標準方差 0.17 0.10 0.06 0.03 0.04 0.02RSD 0.01 0.01 0.01 0.01 0.03 0.03對於全部6個校準水平，各天之間的再現性很好，同時在整個濃度範圍內RSD值小於3%。精確度也很好;對於12、9、6、3、1.5μg/ml和0.75μg/ml的標準物，全部被測量濃度均在標定濃度的5%之內。
摻料研究為進一步估價HPSEC測定的特性和精確性，進行了摻料試驗。
向陰離子交換產物和氯仿萃取的水相試樣摻入等體積的取自同一組的SEC產物。結果列於以下表2。全部試樣均重複測定3次。
表17-2摻入過程試樣的A型肝炎病毒的回收測量濃度 理論濃度 回收的摻試樣 (μg/ml) (μg/ml) 入物,%氯仿萃取的水相 7.27陰離子交換產物 8.87SEC產物 5.40被摻入的試樣氯仿萃取的水相 1:1 W/SEC 6.40 6.33 101陰離子交換產物 1:1 W/SEC 7.18 7.14 101對於兩種試樣均實現了摻料的完全回收，證實了HPSEC濃度檢測的特性和精確性。
第Ⅳ節 分析結果概述作為一個系列，色譜法提供了A型肝炎病毒純化過程圖。過濾的溶胞產物和核酸酶處理的該溶胞產物的比較使得能證實BENZONASE的活度對於這些試樣，在214nm和260nm處均獲得色譜並將其綜合。
比較最後4個過程試樣，即PEG小片重懸浮試樣、氯仿萃取的水相試樣、陰離子交換產物試樣和SEC產物試樣，表明清除了2種主要的過程汙染物，即聚集物和660kDa蛋白質汙染物。對這些試樣計算A型肝炎病毒峰面積百分數使得有把握認為每個過程階段被設計成起著去除這些汙染物的作用。最後，HPSEC測定被用於計算最後3個過程階段中A型肝炎病毒的濃度。
已用HPSEC測定了取自MMD生產的10個組A型肝炎病毒的以下各試樣過濾的溶胞產物試樣、核酸酶處理的溶胞產物試樣、PEG小片再懸浮試樣、氯仿萃取過的水相試樣、陰離子交換產物試樣和SEC產物試樣。對於每個過程試樣而言色譜的圖形在這10個組中是十分可再現的。
在本節中，說明該6個過程試樣每一個的色譜，同時敘述由各試樣獲得的信息，以及三次測定的典型結果。
過濾的溶胞產物和核酸酶處理過的溶胞產物在波長214nm和260nm處獲得了取自每個組的過濾的溶胞產物試樣和核酸酶處理的溶胞產物試樣的色譜。對於這些試樣中的每一個，在214nm獲得的色譜圖形完全不同於在260nm獲得的圖形。對這些色譜的比較分析反映出對這些試樣進行HPSEC測定的目的，即要找到過濾的溶胞產物和核酸酶處理過的溶胞產物之間的差別，該差別能表明BENZONASE消化的完整性。因而本節中對過濾的溶胞產物與核酸酶處理過的溶胞產物的圖形作比較，首先在214nm比較，然後在260nm作同樣比較。列出由每個試樣獲得的特徵數據，推薦用於BENZONASE活度完整性的定量值。
在214nm的過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物在214nm的過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物的色譜圖示於圖32。在214nm，兩個試樣都顯示出一系列部分分辨的峰。由於這些試樣所得到的低解析度，在A型肝炎病毒區域內綜合各個峰是不可能的，在214nm，由這些試樣可獲得的信息僅為所有峰的總UV面積。還將試樣的三次分析的結果示於圖32。該總UV214nm面積不包括在36分鐘時的保留峰。作為BENZONASE消化的結果核酸酶處理的溶胞產物試樣的總UV214nm面積比過濾的溶胞產物試樣的低15%，並且兩個色譜圖(圖32)的目測比較表明了A型肝炎病毒區域內的吸收度的損失。但是因為所包括峰的低解析度，所以對該消化的準確測量是不可能的。已對9個組測得了總的UV214nm面積，這些數值在附錄A中給出。這些總的UV214nm面積未提供任何直接的或單獨的過程效能信息，它們的用途只是監測試樣的穩定性，因而常規的報告中不必計算總的UV214nm面積。
(A)過濾的溶胞產物過濾的溶胞產物 總UV面積214nm(μV)1 272482382 264047443 26782947平均 26811976標準方差 344966(B)核酸酶處理的溶胞產物核酸酶處理的溶胞產物 總UV面積214nm(μV)1 227282632 228415643 22784419平均 22784749標準方差 46256在260nm的過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物在260nm的過濾的溶胞產物和核酸酶處理的溶胞產物的色譜圖示於圖33。在260nm，過濾的溶胞產物顯示出具有5-6個可分辨峰的截然不同的圖形。保留時間為17.2分和19.1分的前兩峰包括A型肝炎病毒-核酸加合物和A型肝炎病毒。由於兩個峰都在某種程度上有與其伴隨的核酸，因此它們在260nm HPSEC圖形中佔支配地位。
過濾的溶胞產物試樣與核酸酶處理的溶胞產物在260nm的比較(圖33A和33B)提供了BENZONASE活度的清楚而明顯的證明。過濾的溶胞產物試樣的凸出的峰已經由於BENZUNASE的消化而完全去除，圖33B在17-19分鐘時看不出有可辨別的峰值。
BENZONASE消化作用的證實對取自9個組的過濾的溶胞產物和核酸處理的溶胞產物試樣所進行的分析示於以下表17-3。這些試樣在17和19分鐘峰的UV260nm面積表明，對於所有的試驗組而言，加入BENZONASE導致這些峰的完全消除。因而對於該試樣而言，證實BENZONASE活度所推薦的判據，應當是將核酸酶處理的濾胞產物中的17+19分鐘峰UV260nm減小至小於過濾的溶胞產物中的17+19分鐘峰值UV260nm的10%。
表17-3對9個組用BENZONASE減小UV260nm面積過濾的溶胞產物(A) 核酸酶處理的溶胞 殘餘的17+19分鐘 產物(B) A260峰的面積 17+19分鐘峰的面積組號# (260nm) (260nm) (B/A×100)984 1240987 0 0985 947988 0 01047 1085719 0 0102 708663 0 0101 831179 0 0108 1060441 0 0100 895005 0 0139 1377974 0 0236 1281608 0 0平均= 1018495 0 0標準方差=205034圖33(A) 過濾的溶胞產物過濾的溶胞 17+19分鐘峰(UV)的面積 總UV面積(VV)260nm產物1 1192597 31930552 1259216 30348913 1271147 3094820平均 1240987 平均 3107589標準方差 34562 標準方差 65198
圖33(B)核酸酶處理的溶胞產物核酸酶處理的溶胞產物 17+19分鐘峰(VU)的面積1 02 03 0平均和標準方差＝0PEG小片再懸浮試樣下面圖34示出了PEG小片再懸浮試樣在214nm的色譜圖。該試樣的特徵圖形由以下幾部份分辨的峰組成聚集的物料、A型肝炎病毒、660kDa汙染物、其它低分子量汙染物、以及鹽的峰。
對該試樣計算了A型肝炎病毒的峰面積百分數(A型肝炎病毒峰面積/總峰面積×100)，該總面積不包括鹽的峰面積。下面示出對PEG小片再懸浮試樣三次分析的結果。
PEG小片再懸浮試樣 A型肝炎病毒峰面積百分數1 25.92 27.03 27.4平均 26.8標準方差 0.7該試樣的典型圖形具有作為主要組分的660kDa汙染物，並且聚集體的量是最可變的組分。典型組中聚集體的量小於所看到的量。對取自10個組的PEG小片再懸浮試樣進行HPSEC分析的結果示於附錄A的表A2。A型肝炎病毒的峰面積百分數數值範圍是18.5%-32.0%，全部由下述過程階段成功地純化。
因此對該試樣不需要嚴格的報警極限，面積百分數值大於18%無疑是可接受的，但是直到在A型肝炎病毒過程中遇到它們為止，將不會知道具有較低面積百分數值的作用。
氯仿萃取的水相試樣所取的氯仿萃取的水相試樣的色譜圖示於以下圖35。A型肝炎病毒的峰在該試樣中是主要的峰(除了鹽的峰之外)，並且它與660kDa汙染物和少量聚集體很好地分辨。
對該試樣確定了A型肝炎病毒的濃度，並計算了A型肝炎病毒峰的面積百分數。面積百分數的計算不包括鹽的峰。下面示出對氯仿萃取的水相試樣三次分析的結果。
氯仿萃取的水相 A型肝炎病毒濃度(μg/ml) A型肝炎病毒峰面積分數1 28.64 61.02 29.76 62.83 30.65 61.2平均 29.68 平均 61.7標準方差 0.82 標準方差 0.8對取自10個組的氯仿萃取的水相試樣進行HPSEC分析的結果示於附錄A的表A2。全部組的A型肝炎病毒峰面積百分數值的範圍為60.0-72.8%，兩個取一半的組顯著較高，其峰面積百分數值分別為79.4和85.2%。A型肝炎病毒的濃度是比較可變的，範圍為14.4-29.7μg/ml。A型肝炎病毒濃度的可變性可能與貫穿各連貫組的上遊試樣的變化有關。
PEG小片(圖34)與氯仿萃取的水相(圖35)的HPSEC圖形的比較清楚地表明該萃取步驟對A型肝炎病毒生產過程的重要性，該步驟選擇性地去除了大量660kDa汙染物而沒有顯著的使A型肝炎病毒產量損失。雖然在兩個順次的色譜法步驟中能夠去除660kDa汙染物，但在二者的情況下如果660kDa是所供溶液的主要組分，那麼就需要會降低A型肝炎病毒產量的峰修整對策。此外，擴大的優化試驗已經表明，萃取效率對混合時間的變化是相當靈敏的(見實施例15)。對於氯仿萃取的水相而言A型肝炎病毒峰的面積百分數值使得能夠在過程中對完全萃取和雜質的去除作定量的檢驗。
因而，對於氯仿萃取的水相試樣推薦將＞60%作為A型肝炎病毒峰面積百分數值的報警極限。面積百分數值小於60%應被看作是可能表明操作有問題(例如過程的混合裝置問題)，特別是如果經常發生這種情況的時候。
陰離子交換產物圖36示出了陰離子交換產物試樣。A型肝炎病毒峰是試樣的主要組分，同時還存在少量聚集體、660kDa汙染物、以及低分子量的汙染物。
對於該試樣確定了A型肝炎病毒的濃度，以及該A型肝炎病毒峰的面積百分數，但不包括鹽的峰和殘留峰。對取自R×2009854的陰離子交換試樣三次分析的結果列於下面。
1 31.98 82.82 32.63 81.43 32.37 81.6平均 32.32 平均 81.6標準方差 0.27 標準方差 0.6
對取自10個組的陰離子交換產物試樣進行HPSEC分析的結果列於附錄A的表A2。所得的面積百分數值對全部組而言均在78.6-87.4%的範圍內，同時半組的值大於90%。鑑於這些組供料純度的增高，半組的面積面分數值的增加是在意料之中。
這些組的濃度值明顯地分布在兩倍的範圍內，象對萃取步驟所觀察到的那樣，這種不同是可能的，因為對這些組的取樣不同。
在A型肝炎病毒生產過程中，陰離子交換色譜法起著作為拋光步驟的作用，它去除了一些660kDa汙染物和其它低分子量的化合物，但陰離子交換產物的純度取決於該步驟供料的純度，它不能去除大量660kDa，但不因峰修整造成產量損失。因而該步驟不能對上一步操作的破壞給予補償。一般情況下，整個陰離子交換色譜法步驟中A型肝炎病毒峰面積百分數增加10-20%，供料純度越高則所得產物的純度越高。對於該試樣，推薦的報警極限為面積百分數值＞75%，並推薦在該整個步驟中面積百分數的增加＞10%。當這兩個判據均被滿足時，生產過程和陰離子交換步驟就都起到了進展的作用。如果上一步驟失效，那麼離子交換步驟自身要達到面積百分數值＞75%是可能失敗的，而為達到面積百分數增加12%遇到失敗則似乎表明陰離子交換步驟的很具體的過程中的問題，例如峰收集故障或柱中形成溝流。
大小排陰色譜法(SEC)產物如SEC產物的圖37所示，SEC產物的圖形顯示出高度純化的A型肝炎病毒。
對於該試樣確定了A型肝炎病毒的濃度。下面示出SEC產物重複分析的結果。
試樣測定 A型肝炎病毒濃度(μg/ml)1 17.342 16.34平均 16.84標準方差 0.50對於取自10個組的SEC產物作HPSEC分析結果示於附錄A的表A2。未對該試樣計算面積百分數值。圖37示出的圖形清楚地顯示出高純的產物，沒有可察覺量的聚集體和660kDa的汙染物。但是，在整個60分鐘內的SEC產物測定表明，在約49分鐘晨存在有如圖38所示的小的保留峰。該峰的大小由組與組不同而改變，同時所示出的組(圖38)是觀察數據的最高數量。該保留峰的鑑別應在該試樣面積百分數值的計算之前進行，該計算表現出其純度。直到進行這種鑑別為止，該試樣的百分數值僅包括不計入的值和計入的值(保留時間16-32分鐘)之間的峰值。由於這些限制，全部試驗組的面積百分數值均為100%。
第Ⅴ節 試樣的穩定性已證實通過HPSEC和EIA測量，過程試樣可在達幾個月的時間內保持穩定。在離子交換步驟可觀察到少量的損失，一般在兩周內小於10%。但是在這種初始的下降之後，這些試樣甚至更保持穩定。此外，最終的SEC產物在長達至少一年的期間內是穩定的。
第Ⅵ節 EIA和HPSEC結果的比較對取自11個組(組2至12)的各3個試樣(氯仿萃取的水相、陰離子交換產物和SEC產物)所得到的EIA和HPSEC結果進行了比較。
標繪出這33個試樣HPSEC濃度10g值與EIA濃度10g值之間關係的曲線示於圖45。適合於該數據的回歸線的斜率為0.88，相關係數(r)為0.94。接近於1的斜率和為0.94的r值表明在兩種測定法間存在很好的相關性，特別是考慮到每次測量的固有差異則更是如此。
第Ⅶ節 過程效能的一致性對組2-14的HPSEC分析顯示出十分穩定的和可再現的過程。在對取自生產中產出的組的過程試樣進行擴展的HPSEC分析基礎上，該純化過程保證了為清除主要汙染物的優良再現性。圖46提供了一這樣的測定，其中對各組標繪出了單體病毒的面積%。對純化過程最後4個步驟流動組合物的測定顯示出整個這些料的極大的一致性。在萃取和陰離子交換步驟顯示出較高純度的組10和11都是一半大小(half-size)的組。
實施例17附錄A表17-A1對溶胞產物試樣核酸酶處理過的溶胞產物試樣進行綜合的數據。對全部試樣均測定3次，並將三個檢測結果平均。
過濾的溶胞產物試樣組號 總面積,(214nm) 總面積,(260nm) 面積17+19分鐘(260nm)1 26811976 3107589 12409872 22032023 2722501 9479883 24322218 2696138 10857194 19934567 1588166 7086635 23633378 1657484 8311796 26311501 2590678 10604417 20336561 2225138 895058 27019891 3195019 13779749 25671116 2804591 1281608平均= 23800264 2472839 1018495標準方差= 2648361 565612 205034核酸酶處理的溶胞產物試樣組號 總面積,(214nm) 面積17+19分鐘,(260nm)1 22784749 02 21417391 03 22658768 04 17766458 05 17984377 06 23280554 07 17231064 08 23218865 09 21797999 0平均＝20904469標準方差＝2491146
表17-A2對PEG小片再懸浮試樣，氯仿萃取的水相試樣，陰離子交換產物試樣，以及SEC產物試樣數據的綜合。全部試樣均測定三次，對三次測定的結果取平均值。

實施例18臨床研究結果本發明的純化疫苗已被接種給健康人。沒有發現一系列與疫苗相關的不利影響。
單個的25單位劑量的疫苗的效力已在Monroe研究中在兒童身上得到證實，其結果公開在1992年8月13日出版的New England Journal of Medicine中[Werzberger等人，NEJM 327(no.7);453-457，(1992年8月13日)]。都作為構成本發明一部份的Monroe研究的物質和生產的物質之間的區別在圖1中突出出來，並將二者與在輥式瓶中生產的並用機械方法收穫的階段Ⅰ/Ⅱ研究的物質對照、(在該過程中具有不言而喻的附帶的生產規模的限制)。本發明的A型肝炎病毒的25單位劑量(25ng HAV蛋白質)的純化製劑足夠使2-16歲的兒童和青年在4周的免疫期內達到超過95%的血清轉化。該同樣的劑量已顯示出能對兒童和青年在接種單劑量疫苗後早至21天開始提供100%的防護。
現已證實，體重和年齡是成年人的應答變量。在接種單個25單位劑量後一個月內，83%的成年人(≥18歲)和97%的兒童和青年(2-17歲)血清轉化。間隔兩周施用兩個25單位劑量使成年人血清轉化率提高到93%。在這兩個年齡組中，施用第2或第3個25單位劑量之後血清轉化七個月均導致大於99%的血清轉化。血清陽性的持續性兩個年齡組均為約100%達到12個月和36個月。因此顯然單個的25單位劑量足以達到任何受體人群的至少80%在1個月免疫期內血清轉化。該數據綜合列於表18-1(「方式」欄表明在0和24周或0，2和24周施用25單位劑量;GMT＝幾何平均的抗HAV抗體滴定度)。使用較大劑量能使較高百分數的受體血清轉化。
表18-1在初始免疫後指定周的血清轉化方式 年令 4 24 280和24 18-29 83% 87% 100%(100/120) (33/38) (24/24)GMT-應答者 21 41 21320,2,24 18-29 98% 100% 100%(115/118) (33/33) (24/24)GMT-應答者 33 90 43790和24 30-89 72% 80% 100%(265/370) (111/138) (71/71)GMT-應答者 22 34 13320,2,24 30-89 85% 89% 100%(321/380) (118/132) (75/75)GMT-應答者 28 59 1976除了以上數據外，在4周時呈血清陰性的一組患者(總共23例)在24周重新試驗，並在28周引導回憶應答(在抗體滴定度增加＞10倍)。兩個個體在投藥6個月後的滴定度呈現近似6倍的增長。剩下的21個個體中，91%顯示出血清轉化和回憶應答。因此這些個體儘管在免疫後延長期內明顯地呈血清陰性，但卻是隱蔽的血清轉化者，並且看來是通過本發明疫苗的免疫作用而受到防護。
權利要求
1.一種商用規模的製備A型肝炎病毒的方法，該病毒的純度就SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和銀染色分析的蛋白質而言大於95%，該方法包括以下步驟a)在大表面積靜態表面反應器(SSR)內於細胞片上大量培養A型肝炎病毒；b)通過使除垢劑滲透被感染的細胞片而由細胞片培養物上去除A型肝炎病毒，使得A型肝炎病毒從細胞培養物中放出；c)通過核酸酶處理，在本階段中任意地從收穫的A型肝炎病毒中去除非A型肝炎病毒的特性核酸；d)濃縮由細胞培養物通過膜或完全過濾去除的或由離子交換俘獲的A型肝炎病毒；e)通過以下的聯合步驟從步驟D)濃縮的A型肝炎病毒中去除非A型肝炎病毒特性的蛋白質有機萃取、PEG沉積、離子交換(如果步驟C未予先完成，則包括去除汙染的游離核酸)、和凝膠滲透色譜法步驟；以及f)回收由步驟e)純化的A型肝炎病毒。
2.通過權利要求1的方法得到的純化的A型肝炎病毒。
3.權利要求1的方法，其中步驟a)包括將由HAV上清液感染的SSR取得的A型肝炎病毒接種到靜表面反應器，在其中於細胞片上培養MRC-5細胞，並且培養基通過靜態表面反應器和一個迴路恆定地循環，在該迴路中完成反應器的控制、通氣和培養物組分的補足。
4.權利要求1的方法，其中步驟b)包括通過用約0.05%-1%的Triton-X100溶液處理A型肝炎病毒感染的細胞片以放出A型肝炎病毒的方法收穫A型肝炎病毒。
5.權利要求1的方法，其中步驟c)包括用BENZONASE消化。
6.一種以商用規模生產失活的A型肝炎病毒疫苗的方法，該疫苗以蛋白質為基，純A型肝炎病毒大於95%，該方法包括a)在包括有一臺SSR的NUNC CELL FACTORIES、COSTAR CUBES、或STATIC SURFACE REACTORS (SSRs)中培養大量的A型肝炎病毒(HAV)，該SSR有常規的網元件，細胞可在其上以每單位體積高密度地生長，在其中MRC-5細胞的細胞片已被確立;b)通過去除培養基並加入含0.1%TritonX-100的收穫溶液收穫被培養的HAV;c)用BENZONASE處理收穫的HAV，以消化汙染的游離核酸;d)通過在離子交換柱上俘獲來濃縮BENZONASE處理的HAV，並用約0.35M NaCl洗脫俘獲的HAV，繼而用聚乙二醇沉澱;e)再懸浮PEG沉澱的HAV並在劇烈攪拌下用氯仿/異戊醇(24∶1，v/v)萃取該濃縮的HAV，分離並保留水相;f)對由DEAE TOYOPEARL 650M陰離子交換基質上以約90-150mM NaCl有機萃取的水相進行色譜分析，並用梯度達約1M NaCl洗脫HAV，稀釋匯集的峰值HAV餾份至鹽濃度小於約150mM而HAV濃度小於約20μg/ml，使得HAV沉澱變得最小或消除;g)收集由步驟f)得到的峰值HAV餾分，並在串列式大小排陰柱TOYOPEARL HW55S和HW65S上的HAV進行色譜分析;h)通過用1/1000濃度的富爾馬林處理5天使凝膠過濾的HAV失活，繼而無菌過濾，吸附到氫氧化鋁上或與氫氧化鋁共沉澱，再配製成相當於每劑量25-100ng失活的純化HAV的單位劑量。
7.一種防止HAV感染的方法，該方法包括用免疫有效量的權利要求6方法的產物免疫。
8.按照權利要求6所述方法製備的HAV疫苗。
9.一種培養HAV的方法，該方法包括使HAV在任意包括鈦和不鏽鋼網的常規網元件的COSTAR CUBE或STATIC SURFACE REACTOR中生長。
10.權利要求9的方法，該方法包括生產約5000-50000劑量每劑量25ng的取自單個COSTAR CUBE培養容器的含大於95%純HAV的失活HAV疫苗。
11.一種A型肝炎病毒的純化製劑，其中大於95%的蛋白質是A型肝炎病毒特性物，該製劑小於7%的蛋白質物質是非HAV核酸或脂類，而製劑的約0-180%是葡萄糖的碳水化合物。
12.權利要求11的製劑，其中A型肝炎病毒被福馬林失活。
13.權利要求12的製劑，它是由以含約100-1000μg氫氧化鋁的蛋白質為基的25-100ng劑量的HAV配製的。
14.一種A型肝炎病毒的純化製劑，它含有下列特性物，其中各種特性物均按每μg蛋白質為基礎給出，並且括弧中的方法用於確定該特性物a)脂類含量(氣相色譜法)＜0.1μgb)由葡萄糖確定的碳水化合物 0.1-2.5μg非葡萄糖碳水化合物 ＜0.1μg(TFA水解，Dionex)c)A型肝炎病毒特性蛋白質 ＞0.95μg(胺基酸分析和Western印跡)d)A型肝炎病毒特性RNA 0.1-0.2μge)汙染的DNA ＜0.001μg。
15.權利要求14的製劑，其中A型肝炎病毒被福馬林失活。
16.權利要求15的製劑，該製劑被吸收在氫氧化鋁之上。
17.一各失活A型肝炎病毒的純化製劑，使相當於約25ng胺基酸分析為基的A型肝炎病毒蛋白質的單個25單位劑量足以使2-16歲的兒童和青年在4周免疫期內達到95%或更大的血清轉化。
18.一種失活A型肝炎病毒的純化製劑，使相當於約25ng-100ng胺基酸分析為基的A型肝炎病毒的1-3個25-100單位劑量足以使受體人群在4-28周免疫期內達到80-95%的血清轉化。
19.權利要求1的方法，該方法包括在靜態表達反應器中培養A型肝炎病毒，並以約0.010-0.3ml/cm2/日的速率補充和去除適當的培養基。
20.權利要求1的方法，該方法包括在靜態表面反應器中培養A型肝炎病毒，並以恆定的速率補充和去除培養基。
21.一種A型肝炎病毒病菌，該疫苗每25-100單位/0.1-1ml的劑量中含有下列額定組分
22.一種A型肝炎病毒疫苗，該疫苗每25單位/0.5ml劑量含有下列額定組分
23.一種失活A型肝炎病毒的純化製劑，使相當於約25ng胺基酸分析為基的A型肝炎病毒蛋白質的單個25單位劑量足以使2-16歲的兒童和青年在免疫後早至21天達到95%或更高的防護作用。
全文摘要
一種完整的，商用規模可高度再現的生產穩定A型肝炎病毒(HAV)的方法，包括最佳的生長、收穫和抗原純化條件，以產出以蛋白質為基大於95％的純HAV。進一步的加工步驟產出失活的HAV疫苗配製劑，該配製劑是致免疫的、有良好耐藥能力的，並針對致病力強的HAV感染起有效防護作用。產物的蛋白質、碳水化合物、脂類、DNA和RNA含量作為其特徵。
文檔編號C12N7/01GK1099798SQ9311763
公開日1995年3月8日 申請日期1993年8月6日 優先權日1992年8月7日
發明者R·A·阿布德, B·C·布克蘭, A·J·海根, B·曾克, J·G·歐寧斯, P·A·迪菲利斯, 小·J·P·亨尼賽, J·A·路易斯, C·N·奧利弗, C·J·奧雷拉, R·D·西特林 申請人:麥克公司