葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒的製作方法

2023-10-11 22:52:59

專利名稱：：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種酶，編碼該酶的核苷s交序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。更具體地，本發明涉及一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，編碼該葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。
背景技術：
：葡萄糖-6-磷酸脫氬酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PDH,ECLU.49)是磷酸戊糖途徑的關鍵性調控限速酶，其主要功能是為脂肪酸合成、氮還原和穀胱甘肽等生物分子合成提供還原力NADPH或NADH,也為核酸合成提供戊糖。其具體催化的反應可以如以下的式一或式二所示葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡萄糖-6-磷酸+NADP+-NADPH+葡萄糖-6-磷酸醛酸(式一)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡萄糖-6-磷酸+NAD+-^NADH+葡萄糖-6-磷酸醛酸(式二)由以上反應式可知，可以通過在340nm波長處監測NADPH或NADH的生成速率來測定葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶活。因而可以製備成包括葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的相應試劑盒，例如檢測肌酸激酶的試劑盒。以;險測肌酸激酶的試劑盒為例，其原理可以是在肌酸激酶的作用下，肌酸磷酸與ADP反應生成ATP和肌酸。在己糖激酶催化下，葡萄糖與ATP反應生成葡萄糖-6-磷酸和ADP。在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的催化下，葡萄糖-6-磷酸與NADP+反應生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在340nm處有最大吸收，通過測定NADPH生成速率來計算J1幾酸激酶活性。但是目前的試劑盒所用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶存在著耐熱性差(參見圖1)，使試劑盒的運輸、保存和使用過程對環境溫度要求較高，容易由於葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的變性而影響到試劑盒測定的有效性和準確性。例如，JP2001-037480中公開了一系列葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的變異體，它們在52。C的溫度下在pH為6.7的咪唑醋酸緩衝液中60分鐘的酶活穩定性都出現顯著下降(參見該專利的圖2)。此外，目前的試劑盒所用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶只能在窄的pH值範圍內保持較高的穩定性(參見圖3),大大局限了試劑盒能夠測定的被測標本的範圍，對測定的pH條件要求較高，從而對使用試劑盒的人員的操作技術水平要求也很高。
發明內容本發明的一個目的是克服現有的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶耐熱性差、僅能在窄的pH值範圍內保持較高的穩定性的缺點，提供一種耐熱性好、能在寬的pH值範圍內保持較高的穩定性，並且反覆凍融後殘留酶活性高的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。本發明的第二個目的是提供編碼所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苷酸序列。本發明的第三個目的是提供包括所述核苷酸序列的重組載體。本發明的第四個目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細胞。本發明的第五個目的是提供包括上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發明的發明人付出了大量地創造性勞動，對假腸膜明串珠菌(丄ewcowo"oc戸eMfcwae"feraWesATCC12291)的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶序列進行隨機定點突變，得到本發明具有SEQIDNO:1所示的氨基S吏序列的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶。並且本發明的發明人意外地發現，所得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、能在寬的pH值範圍內保持較高的穩定性，並且具有反覆凍融後殘留酶活性高的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。本發明提供了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其中，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的胺基酸序列為SEQIDNO:1所示的胺基酸序列。本發明還提供了編碼本發明所述葡萄糖-6-磚酸脫氫酶的核苷酸序列。本發明還4是供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。本發明還提供了包括本發明所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細月包中的至少一種的試劑盒。本發明提供的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶具有如下優點第一，耐熱性好。參見圖1可知，本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在52°C加熱60分鐘後都具有90%以上的相對活性，明顯高於在相同條件下的對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的相對活性。第二，在寬的pH值範圍內穩定性很高。參見圖2和圖3可知，本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在pH值4-7的多種緩沖液中於30。C處理17小時的條件下都具有78%以上的相對活性，明顯高於在相同條件下的對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的相對活性。第三，反覆凍融後殘留酶活性高。參見圖4可知，本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在-2(TC和室溫之間反覆凍融5次的條件下反覆凍融後殘留酶活性仍達27%,而在相同條件下對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶反覆凍融後殘留酶活性僅為6%。圖1製備實施例1和對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶熱穩定性對比圖；圖2製備實施例1的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶pH穩定性曲線圖；圖3對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶pH穩定性曲線圖；圖4製備實施例1和對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反覆凍融後殘留酶活性對比圖5製備實施例1所得蛋白質的SDS-PAGE電泳照片。具體實施例方式本發明提供了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其中，所述葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的胺基酸序列為SEQIDNO:1所示的胺基酸序列。本發明提供的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶還可以進行修飾，得到衍生的蛋白質。本發明所述"衍生的蛋白質"指與具有上述胺基酸序列的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶存在有不影響序列的修飾形式上的差異。即所述"衍生的蛋白質"還包括具有天然L型胺基酸的殘基的類似物(如D型胺基酸)，以及具有非天然存在的或合成的胺基酸(如卩-胺基酸、Y-胺基酸等)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的蛋白的化學衍生形式，如乙醯化或羧基化。^f'務飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露於進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化胺基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。本發明還提供了編碼本發明所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苷酸序列。本領域/>知，組成蛋白質的20種不同的胺基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種胺基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989,見950頁附錄D)。即由於遺傳密碼子的簡併性，決定一個胺基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變胺基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核香S交序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的胺基酸序列，以及由所述胺基酸序列得到的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶活性不變的胺基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的基因的核香酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苦酸序列，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明範圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核酸序列，得到與本發明所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性一致的胺基酸序列。優選情況下，本發明所述核芬酸序列為(l)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或者(2)對SEQIDNO:2所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代而得到的密碼子同義突變的核苷酸序列。所述核苷酸序列更優選為SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3所示的核苦酸序列。所述核苷酸序列最優選為SEQIDNO:3所示的核普酸序列。本發明的發明人通過大量的實驗最終確定的SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，由於可能更符合例如大腸桿菌的基因工程菌的密碼子偏好性，因而更有利於基因工程菌表達蛋白產物。本發明提供的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領域技術人員根據本發明所提供的核苷酸序列和重組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進行擴增獲得有關序列。序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增，然後將所得片段按正確次序拼接。一旦獲得了有關核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關胺基酸序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉入基因工程菌中，然後通過常規的方法從增殖後的宿主細胞分離得到有關核苷酸序列。此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關核苷酸序列。本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本領域公知，所述重組載體一般包括空載體和插入該空載體的目的基因，所述目的基因為本發明所述的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的核苷酸序列。在本發明中，所述"空載體"(或稱"載體")可選用本領域己知的各種載體，如市售的各種質粒、粘粒、噬菌體及反轉錄病毒等，本發明優選pET28b(+)質粒、pMD18-T、pGEMT-Easy或pRSETA。所述空載體可以包括多種常用的4企測標記(例如螢光標記、抗生素標記等報告基因)和酶切位點。重組載體構建可採用空載體本身多克隆位點的各種核酸內切酶(如對於pUC18,可用Sall、BamHI、EcoRI等，對於pET28a,可用Ndel、Xhol、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII等，對於pET28b可用EcoRI、Ndel、BamH、HindIII等)進行酶切獲得線性質粒，與採用相同核酸內切酶切割的基因片段連接，獲得重組質粒。優選所述重組載體為pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)。本發明優選採用Ndel和Xhol雙酶切pET28b及與其連接的PCR產物片段，經連接酶連接，構建本發明的重組載體pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。可以通過本領域常規的方法將所述重組載體轉化、轉導或者轉染到宿主細胞中，如氯化4丐法化學轉化、高壓電擊轉化，優選電擊轉化；所述宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞，優選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(如畢赤酵母)或各種動植物細胞，更優選所述宿主細胞為本領域常用的基因工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。最優選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)或大腸桿菌BL21-Rosetta。可以使用本領域常用的方法從重組宿主細胞中分離和純化葡萄糖-6-磷酸脫氳酶。例如，離心分離培養基和重組宿主細胞，高壓勻漿破碎細胞、離心過濾去除細胞碎片，親和層析純化葡萄糖-6-磷酸脫氬酶。對於分離純化所得的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的產物，可以使用本領域常用的方法進行純度鑑定。例如，考馬斯亮藍法、凱氏定氮法、雙縮脲法、lowry法、紫外吸收法、親和層析、酶活性、抗原抗體法、電泳分析(例如十二烷基磺酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)、沉降分析、擴散分析、恆溶度法、蛋白質譜等。本發明還提供了包括本發明所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。優選情況下，本發明的試劑盒包括葡萄糖-6^痔酸脫氫酶，而不包括核香酸序列、重組載體和重組宿主細胞。更優選本發明的試劑盒包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的千粉，而不包括核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞。可以用本領域常用的方法製備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的乾粉，只要該方法能夠得到葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的乾粉，並且不破壞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的千粉的活性即可。例如使用真空減壓濃縮器得到濃縮的酶液，然後使用冷凍乾燥機乾燥濃縮的酶液；或者使用真空減壓乾燥器等設備。由於本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶耐熱性好，還可以使用噴霧千燥的技術得到該酶的乾粉。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的乾粉在使用時可以通過溶解於pH7.5-10的緩沖液體系(例如三乙醇胺緩衝液、磷酸鹽緩衝液，優選pH為7.6-8)中而轉化為液體形式。本發明的檢測肌酸激酶的試劑盒還可以包括本領域常用於測定檢測肌酸激酶的試劑盒的成分。對應於本發明的試劑盒中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶可以是液體形式和/或固體乾粉形式，本發明的試劑盒中的其他成分也可以是液體形式和/或固體乾粉形式。例如，當本發明的試劑盒為液體形式時，一般可以含有試劑一(Rl)和試劑二(R2);其中，所述試劑一可以包括溶於pH6.5-7.0的80-120mM咪唑緩衝液中的15-25mMN-乙醯半胱氨酸、l-3mM乙二胺四乙酸(EDTA)、l-3mM的NADP、l-3KU/L的G6PDH、2-3KU/L的己糖激酶、l-3mM的ADP;所述試劑二可以含有pH9.0-11.0的40-60mM3-(環已胺)-2-羥基-l-丙磺酸(CAPSO)緩衝液中的15-30mM的葡萄糖和20-40mM的肌酸磷酸。優選情況下，所述試劑一可以包括溶於pH6.8-7.0的80-100mM咪唑緩衝液中的15-20mMN-乙醯半胱氨酸、l-2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、l-2mM的NADP、1.5-3KU/L的G6PDH、2-3KU/L的己糖激酶、1.5-3mM的ADP;所述試劑二可以含有pH9.0-10.0的50-60mM3-(環已胺)-2-羥基-l-丙磺酸(CAPSO)緩沖液中的20-30mM的葡萄糖和25-40mM的肌酸磷酸。以上所述的試劑一和試劑二分別都可以通過冷凍乾燥技術，結合減壓蒸餾技術、反滲透技術及超濾技術等，製備成試劑一乾粉(其中包含本發明的G6PDH乾粉)和試劑二乾粉。所述乾粉可以在檢測待測標本前用選自去離子水、蒸餾水和雙蒸水的溶劑復溶至所述試劑的原有體積。因此本發明的試劑盒可以包括液體形式的試劑一和試劑二，或者可以包括試劑一乾粉和液體形式的試劑二，或者可以包括液體形式的試劑一和試劑二乾粉，或者可以包括固體形式的試劑一乾粉和試劑二乾粉。本發明的試劑盒可以包括記載有上述各種組分使用方法和用量的說明書。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照試劑盒說明書的記載根據現有技術配製即可。適於使用本發明所述試劑盒的待測標本可以是動物體(包括人體)健康狀態下以及病理狀態下產生的各種體液，例如血液、淋巴液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液、乳汁、羊水、膽汁、肋膜積液(又稱胸水)、支氣管液、濾泡液、腹腔積液(又稱腹水)、心包膜積液、關節積液、各器官的嚢腫積液等等。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。製備實施例1(1)現有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PDH基因的合成本發明的發明人設計了引物Gl和G2(見表1),利用引物對Gl和G2從丄ewcowwtoc;^eM^mase"fera/tfesATCC12291菌種中利用PCR擴增G6PDH的親本基因。PCR擴增條件為20mMTris-HCl(pH8.8)、10mMKC1、10mM(NH4)2SO4、2mMMgS04、0.1%TritonX-IOO、50pMdATP、50|aMdGTP、50)iMdTTP、50jiMdCTP、400nM引物Gl、400nM引物G2、1.5UPfuDNA聚合酶(Promega,USA),用接種環挑取少量假腸膜明串珠菌加入反應體系，用無菌水調至反應體積達50jliL。PCR擴增反應程序為將上述反應體系在95'C下反應5分鐘，然後進行30個循環的"95°C45秒、55°C30秒和72°Cl分30秒"，最後在72。C下保持10分鐘。將得到的PCR擴增基因產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，並用QIA快速提取凝膠試劑盒(快而精公司(QIAGEN)，德國)回收1.4-1.6kb的單一條帶的DNA片段。將回收的擴增產物連接至載體pMD18-T，得質粒pMD18-T-親本G6PDH,轉化至宿主大腸桿菌DH5cc,通過LB培養基進行培養，LB培養基配方為蛋白腖1%,酵母提取物0.5%，NaCll%,餘量為水，pH7.0。在37。C培養12小時後，提取質粒DNApMD18-T-親本G6PDH,經酶切且瓊脂糖凝膠電泳分離後獲得擴增的DNA片段。將所得DNA片段用美國應用生物系統公司的310型全自動DNA測序儀測序，測序結果顯示所得DNA片段中含有長度為1461bp(起始於起始密碼子atg並終止於終止密碼子taa)的蛋白編碼基因，為SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。(2)G6PDH突變體(Y207F+N240S+K312R)目的基因的獲得以質粒pMD18-T-親本G6PDH為模板，設計207FF和207FR、312RF和312RR兩對引物(見表1),將親本G6PDH胺基酸序列中第207位點的Tyr(Y)突變為Phe(F),第312位點的Lys(K)突變為Arg(R),獲得突變體G6PDH(Y207F+K312R)。具體步驟如下(A)以質粒pMD18-T-親本G6PDH為模板，利用引物對Gl和207FR,擴增出片段G1207FR。(B)以質粒pMD18-T-親本G6PDH為模板，利用引物對207FF和312RR,擴增出片段207FF312RR。(C)以質粒pMD18-T-親本G6PDH為模板，利用引物對312RF和G2,ii擴增出片段312RFG2。擴增條件為20mMTris-HCl(pH8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgS04、0.1%TritonX-IOO、50pMdATP、50一dGTP、50|aMdTTP、50|iMdCTP,以及400nM引物Gl和400nM引物207FR(或者為400nM引物207FF和400nM引物312RR,或者為400nM引物312RF和400nM引物G2)、1.5UPfuDNA聚合酶(Promega，USA)、20ngpMD18-T-親本G6PDH,用無菌水調至反應體積達50pL。PCR擴增反應程序為將上述反應體系在95。C下反應5分鐘，然後進行30個循環的"95。C45秒、55°C30秒和72。C35秒"，最後在72。C下保持10分鐘。(D)經1%瓊脂糖凝月交電泳分離，並用QIAquickExtractionGelKit(QIAGEN,German)回收，用美國應用生物系統公司的310型全自動DNA測序儀測序，測序結果顯示得到三種擴增片段，即G1207FR、207FF312RR和312RFG2。(E)以G1207FR、207FF312RR和312RFG2三條片段為模板，利用引物對G1和G2,擴增出全長基因。擴增條件為20mMTris-HCl(pH8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgS04、0.1%TritonX-IOO、50|iMdATP、50|aMdGTP、50pMdTTP、50|iMdCTP、400nM引物Gl和400nM引物G2、1.5UPfuDNA聚合酶(Promega,USA)、20ngG1207FR、20ng207FF312RR和20ng312RFG2，用無菌水調至反應體積達50pL。PCR擴增反應程序為將上述反應體系在95。C下反應5分鐘，然後進行30個循環的"95。C45秒、55°C30秒和72°Cl分30秒"，最後在72。C下保持IO分鐘。經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，並用QIAquickExtractionGelKit(QIAGEN，German)回收，用美國應用生物系統公司的310型全自動DNA測序儀測序，測序結果顯示得到突變體G6PDH(Y207F+K312R)的基因序列。然後以突變體G6PDH(Y207F+K312R)的全長基因片段為模板，利用引物對240SF和240SR(見表1),將突變體G6PDH(Y207F+K312R)胺基酸序列中第240位點的Asn(N)突變為Ser(S),得到突變體G6PDH(Y207F+N240S+K312R)的基因序列。具體步驟如下(A)以回收的突變體G6PDH(Y207F+K312R)片l殳為模板，利用引物對G1和240SR，擴增出片段G1240SR。(b)以回收的突變體G6PDH(Y207F+K312R)片段為模板，利用引物對240SF和G2，擴增出片段240SFG2。擴增條件為20mMTris-HCl(pH8.8)、10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、2mMMgS04、0.1%TritonX畫IOO、50pMdATP、50pMdGTP、50pMdTTP、50jiMdCTP、400nM引物Gl和400nM引物240SR(或者400nM引物240SF和400nM引物G2)、1.5UPfuDNA聚合酶(Promega,USA)、20ng突變體G6PDH(Y207F+K312R)片段，用無菌水調至反應體積達50|aL。PCR擴增反應程序為將上述反應體系在95。C下反應5分鐘，然後進行30個循環的"95。C45秒、55°C30秒和72。C45秒"，最後在72。C下保持10分鐘。經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，並用QIAquickExtractionGelKit(QIAGEN,German)回收，得到突變體G6PDH(Y207F+N240S+K312R)的全長基因序列。將突變體G6PDH(Y207F+N240S+K312R)連接到載體.pMD18-T,得質粒pMD18-T-突變體G6PDH(Y207F+N240S+K312R),轉化宿主大腸桿菌DH5oc,用LB培養基培養。在37。C培養12小時後，提取質粒DNApMD18-T-親本G6PDH,經酶切且瓊脂糖凝膠電泳分離後獲得擴增的DNA片段。將所得DNA片段用美國應用生物系統公司的310型全自動DNA測序儀測序，測序結果顯示所得DNA片段中含有長度為1461bp(起始於起始密碼子atg並終止於終止密碼子taa)的蛋白編碼基因，經DNA測序確定引入的突變點無誤，詳細序列如SEQIDNO:2所示。表1引物對序列(5'—3')親本G6PDH正向引物Gl:ATCGCATATGGTTTCAGAAATCAAGACG反向引物G2:ATCGCTCGAGTTAACCTTTAAACACCCAAGCY207F正向引物207FF:AAGGATTTCATCAAGAACGTTCAAGTAACAT反向引物207FR:GTTCTTGATGAAATCCTTGTTCCAAGCAGCN240S正向引物240SF:GATTCAATCCCACACCATGCAAATTGTT反向引物240SR:GGTGTGGGATTGAATCATGTCAAGCAATGK312R正向引物312RF:GCTGATTCTCGTAACAATACCTTCATCGCC反向引物312RR:GGTATTGTTACGAGAATCAGCAGGTACGTC(3)構建重組載體用限制性內切酶NdeI和XhoI酶切(2)得到的蛋白編碼基因，酶切所得大片段通過使用T4DNA連接酶，連接至同樣已經用限制性內切酶NdeI和Xhol酶切過的空載體pET28b(+)上。將連接產物轉化宿主大腸桿菌DH5cc，用LB培養基培養。在37。C培養12小時後，提取質粒，然後用限制性內切酶Ndel和Xhol酶切，經過瓊脂糖凝膠電泳鑑定獲得分別約為1.5kb和5kb的兩條片段，證明獲得了重組表達載體pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)。所述重組表達載體pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)在pH為7的50mmol/L的tris緩沖液中保存。(4)重組載體對宿主細胞的轉化以及所得重組宿主細胞的培養挑取在LB固體培養基上37。C培養16小時的大腸桿菌BL21(DE3)的單菌落，於液體LB培養基中在37°C、150rpm的搖床再培養16小時。取lml所得液體培養物轉接於100ml新鮮液體LB培養基中，在37。C搖床上以250-300rpm的轉速劇烈振蕩培養2.5小時。吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘後，在4。C、3000g下離心5分鐘。棄去上清，加入100pl在水上預冷的O.lmol/L的CaCb溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，在水放置20分鐘。然後在4。C、3000g下離心5分鐘，棄去上清，加入100pl在冰上預冷的O.lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，得到感受態的宿主細胞。取200(il上述感受態的大腸桿菌BL21(DE3)置於1.5ml離心管中，加入體積為lOjil的pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)溶液(其中pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)含量為40ng)輕輕搖勻，水上放置30分鐘。然後在42"水浴中熱擊90秒，接著迅速置於冰上冷卻5分鐘。向離心管中加入lmlLB液體培養基(不含卡那黴素)，混勻後37。C振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的卡那黴素抗生素抗性基因(Ampr)。將上述菌液搖勻後取lOO(il塗布於含Kan的LB篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37。C培養20小時。在篩選平板上出現了大腸桿菌的菌落，即pET28b-G6PDH(Y207F+N240S+K312R)已經轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，得到了本實施例的重組宿主細胞——大腸桿菌BL21(DE3)-pET28bG6PDH(Y207F+N240S+K312R)。配製3LLB培養基加入到5L發酵罐中，在121。C滅菌15分鐘，完全冷卻至室溫後加入卡那黴素，使其終濃度為50嗎/mL。在所得培養基中加入60mL生長至對數生長期的上述大腸桿菌BL21(DE3)-pET28bG6PDH(Y207F+N240S+K312R)(106細胞/毫升)。在37。C下培養至發酵液取樣中的細胞密度達到107細胞/毫升。然後以5%接種量轉接到100mL含有50mg/L的TB培養基3(TC誘導20小時。TB培養基配方如下磷酸二氫鉀3.4g/L,十二水合磷酸氬二鈉8.95g/L,氯化銨2.68g/L,無水石克酸鈉0.71g/L,七水石危酸鎂0.49g/L,酵母粉24g/L，蛋白腖10g/L,葡萄糖0.025%,甘油0.9%,乳糖0.6%,水為溶劑，調整pH至6.8。(5)蛋白產物的分離提純將(4)得到的發酵液在5000rpm下離心10min,收集重組宿主細胞沉澱。棄去上清，將所得重組宿主細胞重懸於等體積的pH為7.5的5Ommol/L的Tris-HCl溶液中。用高壓勻漿機破碎重懸的細胞，在12000rpm下離心20min,收集上清粗酶液，棄取細胞碎片沉澱。將上述所得粗酶液用孔徑為0.22pm濾膜過濾後，所得濾液在美國通用電子公司(GE公司)的安克塔純化者(AKTAPurifier)鎳親和層析柱上進行親和層析。其中，上樣緩沖液為5Ommol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液。在流過兩個柱體積的上樣緩衝液後，使用洗脫緩衝液，其為含有0.5mol/L咪唑的50mmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩衝液。當咪唑濃度達0.3mol/L時開始收集蛋白，收集實時監測到的蛋白單峰結束。向收集到的蛋白溶液中加入40%(W/V)碌。酸銨沉澱，然後在1OOOOrpm的轉速下離心10分鐘。收集蛋白沉澱，並用O.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩衝液復溶。所得溶液用孔徑為0.22jam的濾膜過濾後，所得濾液再用葡聚糖凝膠G-25層析柱(SephadexG-25)脫鹽。所述脫鹽緩沖液是O.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩衝液。在用脫鹽緩沖液平衡好的層析柱上上樣，其中樣品溶液(即上述用O.lmol/L的pH為7.5的Tris-HCl緩沖液復溶的蛋白溶液)的流速為5ml/min,然後用脫鹽緩沖液以lOml/min的流速洗脫3個柱體積。收集洗脫下的液體共300毫升。所收集的液體在普通冰箱中-10。C下冷凍2小時，然後再-40。C深冷水箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA1-4LSC型冷凍乾燥機中，以真空度0.04mbar、安全壓力0.100mbar且冷阱溫度-60。C的條件凍幹10小時。然後等物料溫度與凍幹機隔板溫度差為零，並且觀察在15秒內壓力指示不變時，結束凍幹。凍幹所得蛋白質的量為9.3克。凍幹蛋白在常溫乾燥器中密封保存。採用《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克等，科學出版社(譯)，2002,見1681頁附錄8)記載的SDS-PAGE電泳的方法測定出本實施例的蛋白質的分子量約為54.4KD,電泳結果見圖5,其中1泳道為蛋白marker,2泳道為純化的G6PDH。並且根據《生物化學》(王鏡巖等，高等教育出版社，2002,見168頁)記載的蛋白質一級結構的測定方法(酶解後分肽段測定)，測得本實施例的蛋白質有486個胺基酸殘基(參見SEQIDNO:1所示的胺基酸序列)，與由SEQIDNO:2所示的核苦酸序列編碼結果一致。其中，SEQIDNO:1所示的胺基酸序列與SEQIDNO:4所示的胺基酸序列區別在於SEQIDNO:4第207位上的Tyr被Phe取代，第240位上的Asn被Ser取代，第312位上的Lys被Arg取代。(6)酶活的測定按照如下方法測定酶活(測試結果見下表SX-試劑A:55mMTris-HCl緩衝液(pH7.8,含有3.3mM的MgCl2)試劑B:60mMNAD+水溶液試劑C:lOOmM的葡萄糖六磷酸水溶液酶稀釋液5mMTris-HCl緩沖液(pH7.8，含有0.1%的牛血清白蛋白)具體步驟在比色杯中分別加入2.7mL的試劑A,O.lmL試劑B,O.lmL試劑C,3(TC溫浴5分鐘之後，加入O.lmL的酶液，輕孩b'昆勻。3(TC反應5分鐘，記錄此過程數值的變化。即測定340nm處NADH光吸收值的變化。酶活單位定義為1分鐘內還原生成lpMNADH的量為一個酶活單位。酶活計算公式鸝、工,TT/i、AOD/min(AOD標本-AOD空白)xVtxdf.」0,^6.22x1.0xVs酶活(U/mg)=(U/mL)xl/C其中，Vt:總體積(3.0mL)Vs:酶液樣品體積(O.lmL)6.22:在測定條件下NADH的摩爾吸光係數(cm2/jumoL)1.0:光徑長度(cm)df:稀釋倍數C:溶液中酶濃度綜上，本發明的發明人得到了一種新的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其分子量約為54.4KD,具有SEQIDNO:1所示的胺基酸序列，由SEQIDNO:2所示的核苦S吏序列編碼。其中，本領域技術人員通過閱讀本實施例，可以知曉本發明的核苷酸序列例如SEQIDNO:2,並可以通過化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有該核苷酸序列的核酸後，無需實施本實施例第(1)-(2)步，而是直接從本實施例第(3)步開始重複本實施例。製備實施例2按照SEQIDNO:3對SEQIDNO:2所示的核苷酸序列進行定點突變，得到SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的同義突變核苷酸序列。然後將得到的核苷酸序列按照製備實施例1的方法連接到pET28b(+)空載體上，也轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果本實施例的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶產量比製備實施例l提高了20%。製備實施例3將SEQIDNO:2所示的核苷酸序列按照製備實施例1的方法連接到pRSETA空載體上，也轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果得到的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶9.2克。製備實施例4將SEQIDNO:3按照製備實施例1的方法連接到pET28b(+)空載體上，轉化入大腸桿菌BL21-Rosetta中。在相同條件下培養所得重組宿主細胞，結果得到的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其產量比製備實施例l提高了30%。只十比例1測試實施例1按照製備實施例1記載的方法測試製備實施例2-4和對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶活性:表2葡萄糖-6-磷酸脫氫酶製備實施例1製備實施例2製備實施例3製備實施例4隻於比例1酶活(U/mg)425.31452.60436.95450.58405.09由以上結果可知，製備實施例1-4的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶活力與對比例1相比在同一數量級上，完全能夠滿足臨床上測定待測標本中肌酸激酶濃度的試劑盒的對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的要求。測試實施例2按照如下方法測試製備實施例l-4和對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的熱穩定性將3KU的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶千粉溶於100mMTris-HCl(pH6.7,含2mMEDTA)緩衝液中，分別在52。C下，分別加熱10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘和60分鐘，所述加熱在PCR儀中進行，最後按照製備實施例1中的G6PDH的活性;險測方法測定加熱處理後G6PDH的殘餘活性。按殘存酶活與最大殘存酶活的比值百分數即殘存率為縱坐標，加熱時間為橫坐標繪製曲線。製備實施例1(製備實施例2-4編碼的得到的胺基酸序列與製備實施例118相同)的熱穩定性測試結果如圖1所示，對比例1熱穩定性測試結果如圖1所示。通過比較，製備實施例2-4的熱穩定性(圖中未示出)測試結果與製備實施例l的基本相同。從圖1中可以看出，製備實施例1的熱穩定性顯著大於對比例1，隨著加熱時間的延長，對比例1的殘存率顯著下降，而製備實施例1殘存率只是略有下降。在52。C下加熱60分鐘後，製備實施例1殘存率至少為92%,而對比例1的殘存率卻不到25%。測試實施例3按照如下方法測試製備實施例1-4和對比例1的葡萄糖-6-磷酸脫氯酶的pH穩定性分別配製pH5.0-7.830mM的醋酸鈉緩沖液(pH=4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5),pH7.5-8.50.1M的Tris-HCl緩沖液(pH=7.8、8.0、8.3、8.5),pH8.5-9.50.1M的甘氨酸緩衝液(pH=8.8、9.0、9.3、9.5)。將3KU的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶分別溶於上述緩衝液中，在30。C下靜置17小時，然後按照製備實施例1(製備實施例2-4編碼的得到的胺基酸序列與製備實施例1相同)中G6PDH的活性檢測方法測定。按殘存酶活與最大殘存酶活的比值百分數即殘存率為縱坐標，pH值為橫坐標繪製曲線。製備實施例1的測試結果見圖2，對比例1的測試結果見圖3。通過比較，製備實施例2-4的pH穩定性測試結果與製備實施例1的基本相同(圖中未示出)。從圖2和圖3中可以看出，製備實施例1的pH穩定性顯著好於對比例1，這樣一來包括本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的試劑盒能夠測定的待測標本的種類比現有技術更多，對試劑盒的運輸、保存的條件降低，對使用試劑盒的人員的操作精密精細要求降低，有利於帶有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的試劑盒的普及。測試實施例4將製備實施例l-4(製備實施例2-4編碼的得到的氨基S吏序列與製備實施例1相同)和對比例1的酶分別用50mMTris-HCl緩衝液(pH7.8，含有3.3mM的MgCl2)稀釋成lmg/ml稀釋成lmg/ml，於-20。C冷凍，再在室溫融化，反覆5次，分別按照製備實施例1中的G6PDH的活性才企測方法測定每次凍融後G6PDH的殘餘比活性。以第一次冷凍前的酶活為100%,凍融後的殘存酶活與冷凍前酶活的百分數即殘存率為縱坐標，凍融次數為橫坐標作圖。通過比較，製備實施例2-4的反覆凍融測試結果與製備實施例1的基本相同。從圖4中可以看出，製備實施例1的反覆凍融穩定性顯著大於對比例1,在反覆凍融3次之後，製備實施例1的殘存率約為50%,而對比例的殘存率約為20%。凍融5次之後，製備實施例1的殘存率至少為27%,而對比例僅為6%。製備實施例5-8肌酸激酶試劑盒按照表3的配方配製試劑一和試劑二:表3tableseeoriginaldocumentpage20製備實施例5和6的試劑一和試劑二分別配製成液體形式即可。製備實施例7和8的試劑一和試劑二分別在如下條件下冷凍乾燥在普通冰箱中-l(TC下冷凍2小時，然後再-40。C深冷冰箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA1-4LSC型冷凍乾燥機中，以真空度0.04mbar、安全壓力0.100mbar且冷阱溫度-6(TC的條件凍幹IO小時。然後等物料溫度與凍幹機隔板溫度差為零，並且觀察在15秒內壓力指示不變時，結束凍幹。凍幹得到的試劑乾粉可以在使用前用蒸餾水復溶成原液體形式的體積。凍幹得到的試劑乾粉，比液體形式的試劑保存的時間更長，包裝要求較低，並且體積更小，運輸更容易。製備實施例5-8中所用的G6PDH分別為製備實施例1-4中荻得的G6PDH。對比例2按照與製備實施例5相同的配方配製成液體形式的試劑盒。對比例2中所用的G6PDH為對比例1的G6PDH。測試實施例5本測試實施例測量了兩個待測標本一個是配製的200U/L的肌酸激酶水溶液標準品；另一個為健康狀況良好的25歲男性的血清待測標本，抽取其10ml血液，靜置至血細胞沉澱分層，取上層血清5ml用於對製備實施例5-8和對比例2的試劑盒進行檢驗。試劑盒使用方法如下使用理論因數，以去離子水為空白定標。按照下表4設置測量參數:表4tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22由表5可以看出，製備實施例5-8的試劑盒測試結果比對比例2更接近真實值；並且製備實施例5-8的試劑盒測試結果標準偏差明顯小於對比例2,說明本發明的試劑盒性能更穩定，測量更準確。序列表北京利德曼生化股份有限公司葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及其核苷酸序列、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒<130〉OICN093788<160〉5Patentlnversion3.4〈210〉1<211〉486<212〉PRT<213〉LeuconostocpseudomesenteroidesysProPheGlyThrSerTyrAspThrAlaAlaGlu145150155160LeuGinAsnAspLeuGluAsnAlaPheAspAspAsnGinLeuPheArg165170175lieAspHisTyrLeuGlyLysGluMetValGinAsnlieAlaAlaLeu180185190ArgPheGlyAsnProliePheAspAlaAlaTrpAsnLysAspPhelie195200205LysAsnValGinValThrLeuSerGluValLeuGlyValGluGluArg210215220AlaGlyTyrTyrAspThrAlaGlyAlaLeuLeuAspMetlieGinSer225230235240HisThrMetGinlieValGlyTrpLeuAlaMetGluLysProGluSer245250255PheThrAspLysAsplieArgAlaAlaLysAsnAlaAlaPheAsnAla260265270LeuLyslieTyrAspGluAlaGluValAsnLysTyrPheValArgAla275280285GinTyrGlyAlaGlyAspSerAlaAspPheLysProTyrLeuGluGlu290295300LeuAspValProAlaAspSerArgAsnAsnThrPhelieAlaGlyGlu305310315320LeuGinPheAspLeuProArgTrpGluGlyValProPheTyrValArg325330335SerGlyLysArgLeuAlaAlaLysGinThrArgValAsplieValPhe340345350LysAlaGlyThrPheAsnPheGlySerGluGinGluAlaGinGluAla355360365ValLeuSerlielielieAspProLysGlyAlalieGluLeuLysLeu370375380AsnAlaLysSerValGluAspAlaPheAsnThrArgThrlieAspLeu385390395400GlyTrpThrValSerAspGluAspLysLysAsnThrProGluProTyr405410415GluArgMetlieHisAspThrMetAsnGlyAspGlySerAsnPheAla420425430AspTrpAsnGlyValSerlieAlaTrpLysPheValAspAlalieSer435440445AlaValTyrThrAlaAspLysAlaProLeuGluThrTyrLysSerGly450455460SerMetGlyProGluAlaSerAspLysLeuLeuAlaAlaAsnGlyAspAhTrpVslPheLysGly485<210〉2〈211〉1461〈212〉DNA<213〉Leuconostocpseudomesenteroides<400〉2atggtttcagaaatcaagacgttagtaactttctttggtggcactggtgacttggccaag60cgtaagctttacccatcagttttcaatctttataaaaaaggctacttgcaaaagcatttt120gccattgttggsacggcccgtcasgccctcaatgatgscg33ttca3ac3attggttcgt180gattcaattaaaggLtttcactgacgatcaagcacaagctgaggcgttcatcgaacatttc240tcataccgtgcacacgacgtaacagatgctgcttcatacgctgttttaaaagaggcgatt300gaagaagctgccgacaaatttgatatcgatggcaaccgcattttctatatgtcagttgcg360ccacgtttctttggtacaattgccaaatatcttaagtcagaaggcctactagctgacact420ggttacaaccgtttgatgattgaaaagcctttcggtacatcatacgacacagctgccgaa480ctccaaaatgacttggaaaacgcatttgatgataaccaactattccgtattgaccactac540cttggtaaggaaatggttcaaaacattgctgcccttcgctttggtaacccaattttcgatG00gctgcttggaacaaggatttcatcaagaacgttcaagtaacattgtcagaagtcttgggt660gtcgaagaacgtgccggctactatgacacagccggtgcattgcttgacatgattcaatcc720cacaccatgcaaattgttggttggttagccatggaaaaaccagaatcattcactgacaaa780gacattcgtgccgctaaaaacgcagcctttaatgctttgaagatctatgatgaagcagaa840gttaacaa3tactttgttcgtgcacaatatggtgccggtgattcagctgacttcaagcca900taccttgaagaatt已gacgtacctgctgattctcgtaacaataccttcatcgccggcgaa960ttgcaatttgatttgccacgttgggagggtgtcccattctatgtccgttcaggt鄉cgc1020ttagctgctaaacagacEicgggttgatatcgtctttaaggctggcacgtttaactttggt1080aagcacaagaagctgtcttgtcaattatcattgstccaaagggtgctatc1140gaattgaagttga^cgcc肌gtcagttgaagstgctttcaacacacgtacaattgax:tta1200ggttggactgtatctgacgaaacax:gccagaacc3tacgascgtatgatt1260cscgacactatgaatggtgatggctctaacttcgctgactggaatggcgtttcaatcgct1320tgg卿ttcgttgatgctatttcagccgtttataccgcagataaagcacc1380tacaagtcgggctcaatgggtcctgaagcatccgataaattattggctgccaatggtgat1440gcttgggtgtttaaaggtta1461<210〉3<211〉1461<212〉脆<213〉Leuconostocpseudomesenteroides3atggtgagcgcctggtgaccttttttggcggcaccggcgatctggcgaaa60cgtaaactgtatccgagcgtgtttaacctgt3t3犯3肌ggcta^tctgcsgsascstttt120gcgattgtgggcaccgcgcgtcaggcgctgaacgatgatgaatttaaacagctggtgcgt180gatagcattaaagattttaccgatgatcaggcgcaggcggaagcgtttattgaacatttt240agctatcgtgcgcstgatgtgaccgstgcggcgagctatgcggtgctgaaagaagcgatt300ga卿柳ggcggat犯atttgatattgatggcaaccgtattttttatatgagcgtggcg360ccgcgtttttttggcaccatctgaaaagcgaaggcctgctggcggatacc420ggctataaccgtctgatgattgaaaaaccgtttggcaccagctatgataccgcggcggaa480ctgcagaacgatctggaaaacgcgUtgatgataaccagctgtttcgtattgstcattat540ctgggcaaagaaatggtgcagaacattgcggcgctgcgttttggcaacccgatttttgat600gcggcgtggaacaaagatttgtgcaggtgaccctgagcgaagtgctgggc660gtggaagaacgtgcgggctattatgataccgcgggcgcgctgctggatatgattcagagc720cataccatgc卿ttgtgggctggctggcgatggaaaaaccggaaagcttta^ccgata_aa780gatattcgtgcggcg犯犯acgcggcgtttaacgcgctgaaaatttatgatgaagcggaa840gtgaac犯atattttgtgcgtgcgcagtatggcgcgggcgatagcgcggattttaaaccg900tatctggaagaactggatgtgccggcggatagccgtaacaacacctttattgcgggcgaa960ctgcagtttgatctgccgcgttggg犯ggcgtgccgttttatgtgcgtagcggcaaacgt1020ctggcggcgaaacagacccgtgtggatattgtgtttaaagcgggcacctttaactttggc1080agcg犯caggaagcgc郷aagcggtgctgagcattattattgatccgaaaggcgcgatt1140gaactg犯actgaacgcgaaaagcgtggaagatgcgtttaacacccgtaccattgatctg1200ggctggaccgtgagcgatgaaacaccccggaaccgtatgaacgtatgatt1260catgataccatgaacggcgatggcagca^ctttgcggattggaacggcgtgagcattgcg1320tggaaatttgtggatgcgattagcgcggtgtataccgcggataaagcgccgctggaaacc1380tataa幼gcggcagcatgggcccggaagcgagcgataaactgctggcggcg咖ggcgat1440gcgtgggtgtttaa^ggcts146127<213〉Leuconostocpseudomesenteroides4MetValSerGlulieLysThrLeuValThrPhePheGlyGlyThrGly151015AspLeuAlaLysArgLysLeuTyrProSerValPheAsnLeuTyrLys202530LysGlyTyrLeuGinLysHisPheAlalieValGlyThrAlaArgGin354045AlaLeuAsnAspAspGluPheLysGinLeuValArgAspSerlieLys505560AspPheThrAspAspGinAlaGinAlaGluAlaPhelieGluHisPhe65707580SerTyrArgAlaHisAspValThrAspAlaAlaSerTyrAlaValLeu859095LysGluAlalieGluGluAlaAlaAspLysPheAsplieAspGlyAsn100105110ArgliePheTyrMetSerValAlaProArgPhePheGlyThrlieAla115120125LysTyrLeuLysSerGluGlyLeuLeuAlaAspThrGlyTyrAsnArg130135140LeuMetlieGluLysProPheGlyThrSerTyrAspThrAlaAlaGlu145150155160LeuGinAsnAspLeuGluAsnAlaPheAspAspAsnGinLeuPheArg165170175lieAspHisTyrLeuGlyLysGluMetValGinAsnlieAlaAlaLeu180185190ArgPheGlyAsnProliePheAspAlaAlaTrpAsnLysAspTyrlie195200205LysAsnValGinValThrLeuSerGluValLeuGlyValGluGluArg210215220AlaGlyTyrTyrAspThrAlaGlyAlaLeuLeuAspMetlieGinAsn225230235240HisThrMetGinlieValGlyTrpLeuAlaMetGluLysProGluSer245250255PheThrAspLysAsplieArgAlaAlaLysAsnAlaAlaPheAsnAla260265270LeuLyslieTyrAspGluAlaGluValAsnLysTyrPheValArgAla275280285GinTyrGlyAlaGlyAspSerAlaAspPheLysProTyrLeuGluGlu290295300LeuAspValProAlaAspSerLysAsnAsnThrPhelieAlaGlyGlu305310315320LeuGinPheAspLeuProArgTrpGluGlyValProPheTyrValArg325330335SerGlyLysArgLeuAlaAlaLysGinThrArgValAsplieValPhe340345350LysAlaGlyThrPheAsnPheGlySerGluGinGluAlaGinGluAla355360365ValLeuSerlielielieAspProLysGlyAlalieGluLeuLysLeu370375380AsnAlaLysSerValGluAspAlaPheAsnThrArgThrlieAspLeu385390395400GlyTrpThrValSerAspGluAspLysLysAsnThrProGluProTyr405410415GluArgMetlieHisAspThrMetAsnGlyAspGlySerAsnPheAla420425430AspTrpAsnGlyValSerlieAlaTrpLysPheValAspAlalieSer435440445AlaValTyrThrAlaAspLysAlaProLeuGluThrTyrLysSerGly450455460SerMetGlyProGluAlaSerAspLysLeuLeuAlaAlaAsnGlyAsp465470475480AlaTrpValPheLysGly48551461<212〉DNA<213〉Leuconostocpseudomesenteroides〈400〉5atggtttcagaaatc^gacgttagtaactttctttggtggcactggtgacttggccaag60cgtaagctttacccatcagttttcaatcttgct已cttgcaaaagcatttt120gccattgttggaacggcccgtcaagccctcaattcaaacaattggttcgt180ga^ttcetattatgacgstcaagcacaagctgaggcgttcatcgaacatttc240tcstaccgtgC3C3Cg3Cgt朋C3gatgCtgcttcatacgctgttttaaaag鄉cgatt300ga卿agctgccgacaaatttgatatcgatggcaaccgcattttctatatgtcagttgcg360ccacgtttctttggtacaattgccaaatatctt肪gtcsg33ggCCt3Ctsgctgacact420ggttac犯ccgtttgstgattg朋肪gcctttcggtacatC3t3Cgaracsgctgccgaa480ctccaaaatgacttggaaaacgcatttgatgataaccaactattccgtattgaccactac540cttggtaaggaaatggttcaa肌c3ttgctgcccttcgctttggtaacccaattttcgat600gctgcttggagttc犯gt犯cattgtcagaagtcttgggt腳gtcg犯gaacgtgccggctagccggtgcattgcttgacatgattca犯ac720cacaccatgcaaattgttggttggttagccC￡ictg3C3aB780gacattcgtgccgctaaaaacgcagcctttaatgctttgaagatctatgatg^gcsgaa840gttaacaaatactttgttcgtgcac肌tatggtgccggtgattcagctgacttcaagcca900taccttgaagaattagacgtacctgctgattctaaaaacaataccttcatcgccggcgaa960ttgcaatttgatttgccacgttgggagggtgtcccattctatgtccgttcaggtaagcgc1020ttagctgctaggttgatatcgtctttaaggctggcacgtttaactttggt1080tcagaacaagagctgtcttgtcaattatcattg3tCC犯3gggtgctatc1140gaattgaagttg幼cgcc犯gtcagttgaagatgctttcaacacacgtac1200ggttggactgtatctgacgaagataagaag犯cacgccagacgtatgatt1260t卿tggtgatggctctaacttcgctgactggaatggcgtttcaatcgct1320tggaagttcgttgatgctatttcagccgtttataccgcagataaagcsccacttgaaact1380tacaagtcgggctcaatgggtcctgaagcatccg已taaattattggctgccaatggtgat1440gcUgggtgtttaaaggtta權利要求1.一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其特徵在於，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的胺基酸序列為SEQIDNO1所示的胺基酸序列。2.—種編碼葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的核香酸序列，其特徵在於，所述核香酸序列為編碼權利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苦酸序列。3.根據權利要求2所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為(l)SEQIDNO:2所示的核香S臾序列；或者(2)對SEQIDNO:2所示的核苷酸序列進4f一個或幾個核苷酸取代而得到的密碼子同義突變的核苷酸序列。4.根據權利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為(1)SEQIDNO:2所示的核芬S吏序列；或者(2)SEQIDNO:3所示的核香酸序列。5.—種重組載體，其特徵在於，所述重組載體由空載體和插入該空載體的目的基因組成，所述目的基因為權利要求2-4中任意一項所述的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苷酸序列。6.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於，所述空載體為pET28b(+)。7.—種重組宿主細胞，其特徵在於，所述重組宿主細胞含有權利要求5或6所述的重組載體。8.根據權利要求7所述的重組宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)或大腸桿菌BL21-Rosetta。9.一種4企測肌酸激酶的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括以下U)-(d)中的至少一種(a)權利要求1所述的葡萄糖-6-磷酸脫氳酶；(b)權利要求2-4中任意一項所述的葡萄糖-6-磷酸脫氬酶的核苷酸序列；(c)權利要求5或6所述的重組載體；(d)權利要求7或8所述的重組宿主細胞。10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括溶於pH6.5-7.0的80-120mM咪唑緩衝液中的15-25mMN-乙醯半胱氨酸、l-3mM乙二胺四乙酸、l-3mM的NADP、l-3KU/L的G6PDH、2-3KU/L的己糖激酶、l-3mM的ADP;以及溶於pH9.0-11.0的40-60mM3-(環已胺)-2-羥基-l-丙磺酸緩沖液中的15-30mM的葡萄糖和20-40mM的肌酸磷酸。全文摘要本發明公開了一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，其胺基酸序列為SEQIDNO1所示的胺基酸序列。本發明還公開了編碼所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核苷酸序列，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，以及包括上述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核苷酸序列、重組載體和重組宿主細胞中的至少一種的試劑盒。本發明的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶耐熱性好、反覆凍融後殘留酶活性高，並且在寬的pH值範圍內穩定性很高。文檔編號C12N9/04GK101638640SQ20091009237公開日2010年2月3日申請日期2009年9月7日優先權日2009年9月7日發明者(請求不公開姓名)申請人:北京利德曼生化股份有限公司