猴免疫缺陷病毒的RT‑LAMP檢測引物組、試劑盒及其檢測方法與流程

2023-10-12 00:13:49 2

本發明屬於分子生物學
技術領域：
，涉及實驗動物相關病原的檢測方法，具體涉及一種猴免疫缺陷病毒(SIV)的RT-LAMP(ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反轉錄環介導等溫擴增反應)檢測引物組、檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：1985年發現了第一個SIV，又稱為猴愛滋病病毒，隨後數個病毒株從非洲猴子和亞洲恆河猴體內分離出來。SIV遺傳學上主要分為SIVcpz、SIVsm、SIVmnd、SIVsyk和SIVagm五大支系，SIV具有宿主依賴性進化特點，從而使其在天然宿主中不致病，如SIVsm感染烏黑白臉猴，SIVagm感染非洲綠猴，SIVcpz感染黑猩猩等都不會使後者發病，但當SIV跨物種傳播至非天然宿主，如亞洲恆河猴，通常會使其發病。SIVmac感染恆河猴的病程進展及臨床表現與人類愛滋病非常相似。在潛伏期，外周血細胞CD4+T持續減少，CD4/CD8淋巴細胞比值下降；到愛滋病發病階段，可出現慢性腹瀉和消瘦,死亡時體重下降60％，同時並發全身性淋巴衰竭；終末階段也可發生多種機會性感染。SIV已經被確認為是導致SAIDS的病原體，因此，在猴愛滋病動物模型建立之前一定要排除這種病原體的幹擾。SIV感染的診斷除了檢查臨床症狀，還要結合實驗室診斷方法，常用的實驗室診斷方法有PCR法、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法、間接免疫螢光(IFA)法、免疫印跡(WB)法、病毒分離法等。PCR法快速、靈敏，但其擴增產物需要進行再一次驗證。病毒分離需要進行細胞培養，周期長、對試驗設備要求高，因此，該方法不適合一般的檢測。目前，對SIV的檢測常用ELISA法和IFA法作為初篩，還必須用WB檢測特異性抗體才能最終確診。ELISA法和IFA法檢測的假陽性率高及WB法操作程序複雜，在一定程度上限制了其應用範圍。因此，不論是為了保障整個猴群的質量還是飼養人員、科研人員的人身安全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強的檢測方法。技術實現要素：本發明的一個目的在於提供一種猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測引物組。本發明的另一個目的在於提供一種猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測試劑盒。本發明的另一個目的在於提供猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測方法。本發明所採取的技術方案是：一種猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測引物組，包括一對外引物、一對內引物和一對環引物。其核苷酸序列分別如下所示：外引物：SIV-F3：5』-GCATTCACGCAGAAGAGA-3』(SEQIDNO:1)；SIV-B3：5』-CTGGCACTACTTCTGCTC-3』(SEQIDNO:2)；內引物：SIV-FIP：5』-TCTGCTGTTCCTGTTTCCACCGAAACACACTGAGGAAGCA-3』(SEQIDNO:3)；SIV-BIP：5』-ACCAACAGCACCATCTAGCGATGGCAGGTGGACATAGT-3』(SEQIDNO:4)；環引物：SIV-LF：5』-ACTAGGTGTCTCTGCACTATCT-3』(SEQIDNO:5)SIV-LB：5』-ACCCAGTACAACAAATAGGTGG-3』(SEQIDNO:6)。一種猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括上述所述的檢測引物組。優選的，檢測試劑盒包含上述所述的引物組、DNA聚合酶、逆轉錄酶、RT-LAMP反應液、陽性對照和陰性對照。優選的，外引物、環引物、內引物的摩爾比為1：4：8。優選的，DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。優選的，逆轉錄酶為AMV逆轉錄酶。優選的，RT-LAMP反應液含有10mMdNTP、10×ThermoPol反應緩衝液、150mMMgSO4水溶液。優選的，陽性對照為含有目的基因片段的質粒DNA，陰性對照為DEPC水。一種猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測方法，包括如下步驟：1)提取待檢樣品RNA；2)反轉錄環介導等溫擴增反應：配製25μl反應體系，含有SIV-F30.2μM，SIV-B30.2μM，SIV-FIP1.6μM，SIV-BIP1.6μM，SIV-LF0.8μM，SIV-LB0.8μM，RT-LAMP反應液12.5μl，DNA聚合酶8U，逆轉錄酶2.5U，待檢DNA1～100ng，用DEPC水補齊到25μl；然後於63～65℃反應45～60min；3)結果分析：通過肉眼觀察反應管中溶液是否變渾濁或通過瓊脂糖凝膠電泳分析是否出現梯狀條帶。如反應管中溶液變渾濁或電泳出現梯狀條帶即為陽性，否則，為陰性。本發明的有益效果是：本發明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡便、結果易讀等有益效果：1)高特異性：本發明根據猴免疫缺陷病毒(SIV)(GenBank登錄號為KC522234.1)的主要核心蛋白基因(gag)的部分序列設計了6條特異性引物，應用上述6條引物，擴增靶序列的8個區域，8個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩定，形成引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行；2)高靈敏度：最低檢測極限可達到1fg/μl含SIV目標片段的質粒DNA；3)快速高效：整個擴增只用45～60min即可完成，擴增產量可達109～1010個拷貝；4)操作簡便：不需要複雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預先進行反轉錄等繁瑣步驟，只需要恆溫水浴鍋即可反應，條件比較溫和；5)結果易讀：通過肉眼觀察反應管中溶液是否變渾濁或通過瓊脂糖凝膠電泳分析是否出現梯狀條帶對檢測結果進行判讀，適合非專業人士的現場檢測。附圖說明圖1是實施例3特異性的檢測結果圖(1：DEPC水對照；2：陰性樣品對照；3：猴D型逆轉錄病毒SRV1RNA；4：猴D型逆轉錄病毒SRV2RNA；5：猴D型逆轉錄病毒SRV3RNA；6：猴D型逆轉錄病毒SRV4RNA；7：猴嗜T淋巴細胞病毒I型STLV-IRNA；8：猴B病毒BVDNA；9：猴免疫缺陷病毒SIVRNA；10：猴免疫缺陷病毒SIV質粒DNA；M-MarkerDL2000)；圖2是實施例4靈敏度的檢測結果圖(1：100pg/μl質粒DNA(SIV)；2：10pg/μl質粒DNA(SIV)；3：1pg/μl質粒DNA(SIV)；4：100fg/μl質粒DNA(SIV)；5：10fg/μl質粒DNA(SIV)；6：1fg/μl質粒DNA(SIV)；7：100ag/μl質粒DNA(SIV)；8：100ag/μl質粒DNA(SIV)；9：DEPC水對照)。具體實施方式以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。實施例1猴免疫缺陷病毒RT-LAMP檢測試劑盒的建立猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP(ReverseTranscriptionandLoop-mediatedIsothermalAmplification，反轉錄環介導等溫擴增反應)檢測試劑盒，包括RT-LAMP引物組、RT-LAMP反應液、BstDNA聚合酶、逆轉錄酶、陽性對照和陰性對照。(1)RT-LAMP引物設計：以猴免疫缺陷病毒(SIV)的主要核心蛋白基因序列(gag)為靶基因，利用軟體設計SIV特異性RT-LAMP引物。引物序列見表1。表1.SIV特異性的RT-LAMP引物序列表(2)RT-LAMP反應液：10mMdNTP、10×ThermoPol反應緩衝液、150mMMgSO4水溶液。(3)BstDNA聚合酶和AMV逆轉錄酶。(4)陽性對照為含有猴免疫缺陷病毒(SIV)要核心蛋白基因(gag)片段的質粒DNA，其製備方法為：以分離鑑定的猴免疫缺陷病毒RNA為模板，利用表1中的外引物(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)對SIVRNA進行反轉錄PCR，所得基因片段長度為258bp，序列如SEQIDNO:7所示，回收該擴增片段，利用常規方法連接到T載體中構建質粒，即為陽性對照。GCATTCACGCAGAAGAGAAAGTGAAACACACTGAGGAAGCAAAACAGATAGTGCAGAGACACCTAGTGGTGGAAACAGGAACAGCAGAAACTATGCCAAAAACAAGTAGACCAACAGCACCATCTAGCGGCAGAGGAGGAAATTACCCAGTACAACAAATAGGTGGTAACTATGTCCACCTGCCATTAAGCCCGAGAACATTAAATGCCTGGGTAAAATTGATAGAGGAAAAGAAATTTGGAGCAGAAGTAGTGCCAG(SEQIDNO:7)(5)陰性對照為DEPC水。實施例2猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測方法用上述試劑盒按以下方法對猴免疫缺陷病毒(SIV)進行檢測：(1)待檢樣品RNA的提取：採用美基生物公司的病毒RNA提取試劑盒提取待檢樣品的RNA；(2)反轉錄環介導等溫擴增反應：25μl反應體系含有：SIV-F30.2μM，SIV-B30.2μM，SIV-FIP1.6μM，SIV-BIP1.6Μm,SIV-LF0.8μM，SIV-LB0.8μM，RT-LAMP反應液12.5μl，BstDNA聚合酶8U，AMV逆轉錄酶2.5U，待檢RNA1～100ng，用DEPC水補齊到25μl；設置陽性對照和陰性對照；將配製好的PCR管混勻後離心，於65℃反應60min。(3)結果判斷：通過肉眼觀察溶液是否變渾濁或通過瓊脂糖凝膠電泳分析是否出現梯狀條帶判定結果；如反應管中溶液變渾濁或電泳出現梯狀條帶即為陽性，否則，為陰性。實施例3特異性實驗用實施例2的方法分別對猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA、猴D型逆轉錄病毒(SRV)RNA、猴淋巴細胞趨向性病毒(STLV)RNA、猴B病毒(BV)DNA進行檢測。鑑定結果顯示：以猴免疫缺陷病毒(SIV)RT-LAMP引物組為引物，SIVRNA及質粒DNA反應管中溶液明顯變渾濁，電泳後出現明顯梯狀條帶，陰性對照及SRV、STLV、BV等反應管溶液未出現渾濁，同時電泳也未出現梯狀條帶，顯示出本發明檢測引物及方法具有良好的特異性。(見圖1)。實施例4靈敏度實驗將已構建的猴免疫缺陷病毒(SIV)質粒DNA作10倍梯度稀釋，用實施例2的操作方法分別對稀釋後的猴免疫缺陷病毒(SIV)質粒DNA進行檢測。鑑定結果顯示：以SIVRT-LAMP引物組為引物，SIV質粒DNA按10倍梯度進行稀釋，結果顯示100pg/μl到1fg/μl的濃度的SIV質粒DNA2個反應管溶液均變渾濁，電泳後出現明顯梯狀條帶，100ag/μl、10ag/μl的濃度及陰性水對照等反應管溶液未出現渾濁，同時電泳也未出現梯狀條帶。(見圖2)。實施例5不同檢測引物及方法檢測效果的比較用實施例2的方法採用不同LAMP檢測按照實施例4中的步驟進行檢測，同時採用及螢光定量PCR引物進行檢測，比較不同檢測引物組及不同檢測方法的檢測效果，其他檢測引物組的序列及檢測效果如表2和表3。表2其他檢測引物組及螢光定量PCR引物表3不同檢測引物及方法檢測效果本發明檢測引物A檢測引物組B檢測引物C螢光定量PCR引物檢測靈敏度1fg/ul(+/+)10fg/ul(+/-)1fg/ul(+/-)10fg/ul(+/+)陰性對照檢測結果陰性(-/-)陰性(-/-)陽性(+/-)陰性(-/-)備註：(+/+)代表2次重複均為陽性，(+/-)代表2次重複有一次為陰性，一次為陽性，(-/-)代表兩次重複均為陰性檢測結果顯示：本發明的引物組與其他引物組及螢光定量PCR檢測方法相比，具有靈敏度高特點，同時也無假陽性現象出現。以上實施例表明，本發明的方法具有高特異性、高靈敏度、快速高效、操作簡便、結果易讀等優點，適於在各基層動物疫病監測單位和實驗猴養殖企業中進行推廣應用。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。廣東省實驗動物監測所猴免疫缺陷病毒的RT-LAMP檢測引物組、試劑盒及其檢測方法22PatentInversion3.5118DNA人工序列1gcattcacgcagaagaga18218DNA人工序列2ctggcactacttctgctc18340DNA人工序列3tctgctgttcctgtttccaccgaaacacactgaggaagca40438DNA人工序列4accaacagcaccatctagcgatggcaggtggacatagt38522DNA人工序列5actaggtgtctctgcactatct22622DNA人工序列6acccagtacaacaaataggtgg227258DNAHerpesvirusSimian7gcattcacgcagaagagaaagtgaaacacactgaggaagcaaaacagatagtgcagagac60acctagtggtggaaacaggaacagcagaaactatgccaaaaacaagtagaccaacagcac120catctagcggcagaggaggaaattacccagtacaacaaataggtggtaactatgtccacc180tgccattaagcccgagaacattaaatgcctgggtaaaattgatagaggaaaagaaatttg240gagcagaagtagtgccag258818DNA人工序列8gagcagaagtagtgccag18921DNA人工序列9tccatctcctgtaaatgttgc211042DNA人工序列10ccaatctgcagcctcctcatttaaattgtgtgggagaccatc421140DNA人工序列11agctccacaacaaggacagcactgaactagttgttcctgc401221DNA人工序列12tgataatctgcatagccgctt211318DNA人工序列13ttagggagccgtcaggat181421DNA人工序列14taaattgtgtgggagaccatc211521DNA人工序列15tccatctcctgtaaatgttgc211638DNA人工序列16agctggttgtgggtgctgaagcggctatgcagattatc381740DNA人工序列17tagggagccgtcaggatcaggttgtctgtacatccactgg401819DNA人工序列18caatctgcagcctcctcat191922DNA人工序列19ttgcaggaacaactagttcagt222026DNA人工序列20ggaggaaattacccagtacaacaaat262123DNA人工序列21cctgaaatcctggcactacttct232229DNA人工序列22actatgtccacctgccattaagcccgaga29當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp