新的人絨毛膜促性腺激素－促黃體素融合蛋白及其製法和用途的製作方法

2023-10-17 02:53:54 1

專利名稱：新的人絨毛膜促性腺激素－促黃體素融合蛋白及其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及DNA重組技術和基因工程疫苗領域。更具體地，本發明涉及人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，以下簡稱hCG)β亞基與非人哺乳動物的促黃體素(luteinizing hormone，以下簡稱LH)α亞基的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在如癌症等疾病治療和抗生育中的應用。
惡性腫瘤(又稱癌)的預防和治療是當今世界性的難題之一。多年來，各國科學家都致力於研究開發安全有效而副作用小的癌症治療手段來取代目前普遍採用的化學療法或放射療法。由於化療或放療在殺傷癌細胞的同時，正常細胞也會受到不同程度的損傷，從而引起較大的副反應，降低了病人的生活質量，也不利於康復。
近年來，國外有不少研究發現許多癌細胞也能表達hCG，並隨著癌細胞的進一步增殖、擴散，其表達的hCG的量不斷增加，在癌細胞發生轉移時達到最高值。並在多種不同組織類型和來源的人癌細胞膜表面可檢測到hCG、hCGβ亞基或其特異性的片段相關表位(決定簇)，而在健康的非孕個體中則檢測不出。Acevedo及其合作者從美國細胞庫隨機取癌細胞株，研究了52種癌，10種肉瘤，4種白血病，6種淋巴瘤和2種視網膜胚細胞瘤，發現所有的癌細胞都能分泌hCG或hCGβ、或hCGβ羧末端(CTP)、或hCGα抗原決定簇(Acevedo等，Cancer，1992，691829-1842)。一些生殖系統癌症病人的外周血淋巴細胞對hCGβ亞基具有特異的增殖反應。這些都提示hCGβ亞基是一種能誘發細胞介導的免疫反應的癌相關抗原。各種證據顯示，hCG在細胞轉化、腫瘤血管生成、腫瘤轉移和免疫逃逸中起重要作用(F.Housseau等，Int.J.Cancer，1995，63633-638；J.Mora，等，1996，British Journal of Cancer，741081-1084；PL.Triozzi和d VC.Stevens，1999，Oncology Reports，67-17)。以上研究結果為抗hCG疫苗用於治療和預防癌症提供了科學依據。
hCG抗癌疫苗則是通過該疫苗刺激患者免疫系統，使其自身產生針對hCG的抗體，從而抑制癌細胞的生長，因此特異性強，不會影響正常細胞的生長，是一種理想的癌症治療手段。
從理論上講，所有癌症都能用抗hCG疫苗防治，因為所有的癌細胞都能分泌hCG，但目前首先選擇的是發病率較高的前列腺癌、結直腸癌和胰腺癌。據統計，在導致男性死亡的癌症中，前列腺癌是主要死因之一(上海地區發病率為7.1/10萬)，而前列腺增生症被認為與前列腺癌的誘發有關。我國60歲以上男性中，43％患有阻塞性前列腺增生。目前我國人口已呈老齡化的趨勢，前列腺癌的高發病率日益突出，但還沒有好的前列腺癌早期診斷手段，一般發現時，已屬中晚期。因此，hCG疫苗還可以用於預防前列腺癌。結直腸癌也是人群中最常見的消化道惡性腫瘤，上海地區男性發病率為16.3/10萬，名列癌症第5位；女性發病率為13.8/10萬，名列癌症第6位。其治療以手術為主，但術後5年生成率僅在50％左右，約半數病例在術後5年會出現復發和轉移。對失去手術機會或轉移性結直腸癌患者，目前主要採用以5-氟尿嘧啶(5-FU)為主的化療法，其副作用很大，對患者的健康帶來極大影響。胰腺癌上海地區的發病率為10/10萬，名列癌症第8位(Fan Jin，Int.J.Cancer，1999，83435-440)。而hCG疫苗免疫已被證明能有效抑制癌細胞的轉移、生長，且無明顯的副作用，顯示了它獨特的優越性。
此外，膀胱癌、肺癌等大部分惡性腫瘤細胞也都能表達hCG，在進一步研究的基礎上也可以用hCG疫苗進行防治。因此，hCG疫苗在惡性腫瘤的防治中有著十分廣闊的應用前景，一旦被實際推廣應用於相關惡性腫瘤的預防和臨床治療，對我們一個擁有13億人口的大國來說，必將產生良好的經濟效益和社會效應。
美國的AVI Biopharma(AVI)和Immunothreapy Corporation(ITC)公司用化學合成的hCGβ亞基羧端37肽與破傷風類毒素(TT)偶聯組成的疫苗hCGβCTP37-TT治療結直腸癌、前列腺癌和胰腺癌，並分別完成了II/III、II、III期臨床試驗，結果表明受試病人在注射疫苗後能產生抗hCG抗體，使癌細胞生長停滯或癌細胞壞死，從而使惡性腫瘤變小或消失(Medical/pharmaceuticalIndustry[MEDICINE]，1998)。目前只有用hCGβCTP37/TT治療癌症的報導(PL.Triozzi和VC.Stevens，Oncology Reports，1999，67-17)。
此外，hCGβ與綿羊促黃體生成素α亞基(oLHα)經體外反應，相互間以非共價鍵相連後與TT和白喉類毒素(DT)偶聯組成疫苗HSD/TT(DT)，目前是用作抗生育疫苗，但也可能用作抗癌疫苗。它的抗原性遠高於hCGβCTP37/TT(GP.Talwar，Immunology and Cell Biology，1997，75184-189)。
這兩種疫苗的抗原中hCGβCTP37是化學合成的，成本較高，且組成的疫苗hCGβCTP37/TT的抗原性低於HSD/TT(DT)；疫苗HSD/TT(DT)中的hCGβ和oLHα是從天然hCG和oLH經拆分而獲得，不僅手續繁，質量難以控制，且十分昂貴。但目前不僅沒有用HSD/TT(DT)疫苗治療惡性腫瘤的報導，更沒有用基因工程技術生產半抗原單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHα的報導。
因此，本領域迫切需要開發新的用於治療惡性腫瘤的藥物(尤其是抗癌疫苗)和抗生育疫苗，以及低成本和高效的生產方法。
本發明的目的是提供一種用基因工程方法生產單鏈嵌合多肽，與載體蛋白偶聯組成疫苗。疫苗用於治療惡性腫瘤，療效顯著而無毒副作用。疫苗也可用於免疫育齡婦女，達到抗生育的作用，抗生育效率高而無副作用。
本發明的一個目的就是提供一種新的可用於治療惡性腫瘤的藥物(尤其是抗癌疫苗)和抗生育疫苗，它是hCG-β和LHα的融合蛋白。
本發明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞。
本發明的另一目的是提供一種成本低廉和/或步驟簡便的生產所述hCGβ-LHα融合蛋白的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列、非人哺乳動物促黃體素α亞基的胺基酸序列、以及位於所述人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列和所述促黃體素α亞基胺基酸序列之間的0-20個胺基酸的連接肽序列。較佳地，所述的接頭序列含3-10個胺基酸。更佳地，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO2中所示的胺基酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發明的上述融合蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
在本發明第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體，以及含所述載體的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發明的融合蛋白。
在本發明的第五方面，提供了一種產生本發明的融合蛋白的方法，它包括步驟在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養上述的宿主細胞，或者培養含所述宿主細胞的動物，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
在本發明的第六方面，提供了一種疫苗，它含有本發明所述的融合蛋白或編碼DNA分子。
在本發明的第七方面，提供了一種抗體，它特異性地結合於本發明的融合蛋白。


圖1顯示了用PCR法獲得hCGβ-oLHα融合蛋白的cDNA序列的流程圖。
圖2顯示了hCGβ和oLHα序列的接頭處的DNA序列。
圖3是質粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα的結構圖。
圖4顯示了三株不同的細胞在不同的MTX濃度下的表達量。
圖5是質粒pVL1393/hCGβ-oLHα的結構圖。
圖6顯示了對hCGβ-oLHα融合蛋白表達產物的SDS-PAGE銀染和Western印跡分析鑑定結果。
圖7顯示了酵母表達質粒pPIC9K/hCGβ-oLHα的構建過程。
圖8顯示了對hCGβ-oLHα融合蛋白進行競爭抑制結合試驗的結果。
圖9顯示了本發明一種hCGβ-oLHα融合蛋白的胺基酸序列和DNA序列。其中，帶下劃線的部分為信號肽。
定義如本文所用，術語「絨毛膜促性腺激素和促黃體素的融合蛋白」、「hCG-LH融合蛋白」等可互換使用，都指由人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列和非人哺乳動物促黃體素α亞基胺基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒有連接肽序列。此外，絨毛膜促性腺激素和促黃體素的融合蛋白包括含有或不含有信號肽，以及含有或不含有起始甲硫氨酸的融合蛋白。
如本文所用，術語融合蛋白中「人絨毛膜促性腺激素胺基酸序列」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的人絨毛膜促性腺激素具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然人絨毛膜促性腺激素基本上相同的抗原活性。優選的人絨毛膜促性腺激素胺基酸序列包括天然的人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列。另一種優選的絨毛膜促性腺激素胺基酸序列形式是在羧基端額外添加有1-4個hCGβCTP37(即絨毛膜促性腺激素羧基端的37肽片段)的胺基酸序列。
如本文所用，術語融合蛋白中「促黃體素胺基酸序列」指在所述融合蛋白中的一部分胺基酸序列，該序列與天然的或變異的非人哺乳動物的促黃體素具有基本上相同的胺基酸序列，並且具有與天然促黃體素基本上相同的免疫刺激活性。優選的促黃體素胺基酸序列是選自下列動物的天然促黃體素序列羊、牛、兔、豬。
絨毛膜促性腺激素胺基酸序列和促黃體素胺基酸序列的連接方式沒有特別限制，可以頭頭相連、頭尾相連、或尾尾相連。
如本文所用，術語「連接肽」(linker)指位於絨毛膜促性腺激素胺基酸序列和促黃體素胺基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長度通常為1-20個胺基酸，較佳地為3-10個胺基酸。連接肽的長度也可為0，此時絨毛膜促性腺激素胺基酸序列和促黃體素胺基酸序列直接相連。關於連接肽的描述，可參見Paul W.Dempsey等人，Science 271(1996)p.346-350。通常，連接肽不影響或不顯著影響絨毛膜促性腺激素胺基酸序列和促黃體素胺基酸序列形成正確的摺疊和空間構象。一些連接肽的例子包括(但並不限於)GlySer(Gly4Ser)GlySer。
另一種廣義的連接肽是功能性基因編碼的蛋白或其片段，代表性的例子包括(但並不限於)GSF、IL-2、TNFα、各種細胞因子、補體(例如插入1-4個C3d補體片段)等。
編碼本發明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴增或合成的方法獲得絨毛膜促性腺激素和/或促黃體素的編碼DNA序列，然後將其拼接在一起，形成編碼本發明融合蛋白的DNA序列。
在獲得了編碼本發明新融合蛋白的DNA序列之後，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最後，培養轉化後的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的融合蛋白。
如本文所用，術語「載體」包括質粒、粘粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然後將編碼本發明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連於表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰近，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳地是家蠶細胞。
在獲得轉化的宿主細胞後，可在適合表達本發明融合蛋白的條件下培養該細胞，從而表達出融合蛋白。然後再分離出表達的融合蛋白。
另一方面，本發明還包括對人hCG-LH融合蛋白或其編碼DNA具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這裡，「特異性」是指抗體能結合於hCG-LH融合蛋白或片段。較佳地，指那些能與hCG-LH融合蛋白或片段結合但不識別和結合於其它非相關抗原分子的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的hCG-LH融合蛋白結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。例如，純化的hCG-LH融合蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用於動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達hCG-LH融合蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來製備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
抗體也可用於設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如hCG-LH融合蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆鹼等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合於抗體上，這種雜交抗體可用於殺滅hCG陽性的細胞(例如腫瘤細胞等)。
多克隆抗體的生產可用hCG-LH融合蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用於增強免疫反應，包括但不限於弗氏佐劑等。
本發明的融合蛋白或抗體有二大治療和預防用途(1)治療腫瘤第一種方式是直接將本發明的融合蛋白作為半抗原與TT和/或DT偶聯形成疫苗組合物，然後施用於癌症患者。癌症患者經免疫後產生抗體，使癌細胞生長停滯或癌細胞壞死，從而使惡性腫瘤變小或消失，達到治療惡性腫瘤的目的。
第二種方式是DNA疫苗方式。近年來興起的DNA疫苗也有著廣闊的應用前景，DNA疫苗是通過將編碼目的蛋白的基因克隆入適當的載體中，然後注射至肌肉、皮內或皮下，在體內目的基因得以表達，體內會產生抗目的蛋白的抗體從而達到防治疾病的作用。因此，本發明的單鏈嵌合多肽基因也可克隆入適當的載體，導入機體，在體內表達嵌合肽，進而產生抗體，達到治療癌症的目的。
第三種方式是將本發明特異性針對hCG-LH融合蛋白的抗體直接施用於癌症患者。
(2)抗生育第一種方式是直接將本發明的融合蛋白作為半抗原與TT和/或DT偶聯形成疫苗組合物，然後施用於育齡婦女。育齡婦女在注射疫苗後，產生抗體，使受精卵不能著床，從而達到抗生育的作用。
第二種方式是DNA疫苗方式施用於育齡婦女。
第三種方式是將本發明特異性針對hCG-LH融合蛋白的抗體直接施用於育齡婦女。
因此，在本發明的另一方面，提供了一種含所述融合蛋白的疫苗。合適的疫苗例子包括(但並不限於)與TT或DT偶聯形成的疫苗。上述的hCGβCTP37/TT和HSD/TT(DD)兩種疫苗先是作為抗生育疫苗開發研製的，到90年代末分別完成了臨床I期和臨床II期試驗，其效果以後者為好(人類生殖研究、發展和研究培訓特別規劃署1998年年度技術報告；Talwar，GP等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，918532-8536)。因此，本發明中用基因工程方法生產的單鏈嵌合多肽與TT或DT偶聯組成的疫苗hCGβ-oLHα/TT(DT)也可能用作抗生育疫苗。
在本發明的另一方面，還提供了一種藥物組合物。本發明的藥物組合物包括有效量的本發明的新型hCG-LH融合蛋白或其特異性抗體，以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在製備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。製劑還可包括溼潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
組合物可製成單元或多元劑型。各劑型包含為了產生所期望的治療效應而計算出預定量的活性物質，以及合適的藥劑學賦形劑。
配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明融合蛋白或其抗體施用於人，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
此外，本發明的融合蛋白還可與其他治療藥物聯用，其中包括(但並不限於)TNF、IL-2。
本發明的優點在於採用基因工程方法，一次表達單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHα，不僅簡化了生產步驟，而且所述融合蛋白的穩定性高，抗原性強。因此，可以大批量，低成本地生產hCG疫苗半抗原。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1用重疊多聚酶鏈反應(PCR)構建編碼單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHα的cDNA以合成引物I和II，用含hCGβcDNA的質粒pβS/hCGβ為模板，進行PCR擴增獲得hCGβcDNA片段；以合成引物III和反向通用引物，用含oLHαcDNA的質粒pβS/oLHα為模板，進行PCR擴增獲得oLHαcDNA片段。最後以合成引物I和反向通用引物，以上述PCR擴增產物為模板，進行PCR擴增獲得單鏈嵌合肽hCGβ-oLHαcDNA(圖1)。
單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA序列經DNA測序證明，其編碼結構是hCGβ5′非翻譯區-起始密碼-信號肽-成熟hCGβ編碼區-成熟oLHα編碼區-終止密碼-oLHα3′非翻譯區。成熟hCGβ羧端最後一個胺基酸(AA)與成熟的oLHα的第一個胺基酸相連，其相連處的DNA序列如圖2所示。
hCGβ-oLHα融合蛋白的編碼序列如圖9所示。由於該融合蛋白帶有信號肽(下劃線部分)，因此編碼成熟的hCGβ-oLHα融合蛋白的序列如SEQ ID NO1所示，共723個核苷酸(不包括終止密碼子)；成熟蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO2所示，共241個胺基酸。一種帶有信號肽的未成熟的hCGβ-oLHα融合蛋白的序列如SEQ ID NO3所示，共1095個核苷酸；成熟蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO4所示，共261個胺基酸。
表1引物序列

實施例2hCGβ-oLHα的表達在本實施例中，構建含單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA不同的表達載體，在相應的表達系統中進行表達。用免疫親和柱及其他常規分離純化技術，從條件培液中純化重組產物。
(A)、hCGβ-oLHα cDNA在CHO細胞內表達(i)表達質粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα的構建將hCGβ-oLHαcDNA經HindIII酶切後，克隆入真核表達質粒pSV2-dhfr的HindIII位點，得到表達質粒pSV2-dhfr/hCGβ-oLHα(圖3)。用限制性內切酶pVUII酶切出現680bp和5.4kb兩個片段，表明插入片段方向正確，外源基因是在啟動子PSV40E的調控下表達(圖3)。
(ii)高效穩定表達細胞株的建立用磷酸鈣共沉澱將表達質粒導入二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞(CHO-dhfr-細胞)中，用氨甲喋呤(MTX)加壓，使目的基因的拷貝數增加，最終篩選高表達細胞株(圖4)。由於MTX是dhfr的拮抗劑。Dhfr缺陷型細胞在導入dhfr基因，並與細胞染色體DNA整合後，通過不斷提高該基因的拷貝數，合成更多的dhfr來抵抗MTX濃度的遞增，而dhfr基因的擴增又會帶動鄰近基因拷貝數的提高，從而在MTX存在下篩選高效穩定表達的克隆細胞株。
圖4為三株不同的細胞在不同的MTX濃度下的表達量。結果顯示，細胞株1和2隨著MTX濃度的增加，表達量明顯增加，而細胞株3的表達量增加較少。
(iii)表達產物的分離純化由於rhCGβ-oLHα能分泌至培養液中。因此有利於產物的分離純化。收集的條件培液經4℃，10000轉/分鐘離心後，直接用偶聯有hCGβ單克隆抗體的免疫親和柱純化，載體為Bio-Rad公司的Affi-gel 10。免疫親和柱先用平衡緩衝液(20mMTris-HCl，pH7.4，0.1M NaCl，0.02％NaN3)平衡，上述條件培液流經柱，用5倍柱體積的20mM Tris-HCl，pH7.4，0.5M NaCl，0.02％NaN3溶液洗除非特異吸附物質，最後用5倍柱體積的50mM甘氨酸-HCl(pH3.0)將專一性結合於免疫親和柱上的重組產物洗脫下來，用1M Tris-HCl pH8.8的溶液將收集的樣品液的pH調至7.0，樣品對0.1％NH4HCO3透析，透析液每4-6小時調換一次，共四次。樣品經冷凍乾燥後保存於-20℃冰箱待用。
(B)、hCGβ-oLHαcDNA在昆蟲細胞中的表達hCGβ-oLHαcDNA克隆入昆蟲細胞表達載體pVL1393的EcoRI位點，得到質粒pVL1393/hCGβ-oLHα(圖5)。採用磷酸鈣共沉澱法，以該質粒與Baculo-GoldTM線性化多角體病毒基因組DNA(PharMingen公司產品)共轉染昆蟲細胞草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)，通過目視法篩選獲得重組病毒AcNPV-hCGβ-oLHα。
用重組病毒感染昆蟲細胞，表達的重組蛋白rhCGβ-oLHα能分泌到培養基中，表達量為4μg/106cells/3天。收集培液，於4℃，100,000×g離心去除細胞碎片和病毒後，上清液用偶聯有hCGβ單抗的免疫親和柱分離，獲得rhCGβ-oLHα。經SDS-PAGE銀染和Western印跡分析鑑定，在還原條件下的表觀分子量為38.0 KDa(圖6)。
(C)、單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA在酵母中的表達(i)酵母表達質粒的構建以單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA(圖1)為模板，以引物IV(5′-GTGAATTCATGTCCAAGGAGCCGCTTCGG-3′)和反向通用引物作引物，進行PCR反應，獲得單鏈嵌合多肽hCGβ-oLHαcDNA經EcoRI酶切，克隆入酵母分泌型表達質粒pPIC9K的EcoRI位點，獲得表達質粒pPIC9K/hCGβ-oLHα(圖7)。
(ii)表達hCGβ-oLHα酵母工程細胞株的建立用電穿孔法，將表達質粒pPIC9K/hCGβ-oLHα導入畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，用G418篩選含高拷貝外源基因的細胞株。在含4mg/ml G418濃度的培養基中生長的菌應含有40個拷貝外源基因。外源基因拷貝數越高，表達量越高。
將獲得的畢赤酵母工程菌於2000年12月26日保藏中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)，保藏號為CCTCC NOM2000041。
(iii)單鏈嵌合多肽的表達用搖瓶培養酵母菌，通過甲醇誘導，外源基因得到表達，並分泌至培養液中，經過96h-120h培養，其表達量的15mg/升或更高，如採用發酵罐培養，細胞，密度可達200OD600nm或更高，表達量可提高5-10倍，即達75-150mg/升。
(iv)表達產物的純化由於產物被分泌至培養液中，這有利於產物的純化。採用硫酸銨沉澱、分子篩和免疫親和柱層析等手段純化，純化產物用SDS-PAGE考馬斯亮藍染色和Western鑑定，純度達90％，表達產物的表觀分子量為44KDa。
實施例3
rhCGβ-oLHα的理化和生物特性在培養瓶中培養實施例2中獲得的表達hCGβ-oLHα的CHO細胞株或酵母細胞株，rhCGβ-oLHα的表達量達5μg/天/106細胞。細胞培養4天後收集細胞培養液，於4℃，10,000轉/分鐘離心15分鐘，吸取上清液，用偶聯有hCGβ單克隆抗體的免疫親和柱進行分離純化，對純化的樣品進行鑑定分析。
(1)SDS-PAGE銀染分析純化的樣品作還原條件下的SDS-PAGE銀染分析。
結果表明，rhCGβ-oLHα的表觀分子量為45KDa(還原條件)，與預計一致。經免疫親和柱一步純化，樣品純度達90％(圖6A)。
(2)免疫印跡反應(Western blot)純化的樣品經SDS-PAGE後，轉移至硝基纖維膜上，先與適當稀釋的抗hCGβ血清反應，再與偶聯鹼性磷酸單酯酶的羊抗兔抗體反應，然後加入Nitro BlueTetrazolion和5′-Bromo-4-Chloro-3-incloding phosphate進行顯色反應。
結果表明，抗hCGβ抗體能專一性地識別rhCGβ-oLHα，其分子量也為45Kda。而昆蟲細胞中表達的hCGβ-oLHα的表觀分子量為38.0KDa。這說明CHO細胞中表達的重組產物的糖基化程度高，與天然的相近(圖6B)。
(3)競爭抑制結合試驗用人絨毛膜促性腺激素(hCG)放射免疫測試盒作競爭125I-hCG結合抗體試驗。即用人絨毛膜促性腺激素(hCG)放射免疫測試盒，以天然hCG、天然hCGβ以及昆蟲細胞中表達的單鏈多肽和CHO細胞中表達的單鏈多肽進行競爭125I-hCG結合抗體的試驗。
結果表明，在CHO細胞中表達的單鏈多肽的抗體結合活性與天然hCG相比較低，但高於天然hCGβ，與昆蟲細胞中表達的單鏈多肽相差不大(圖8)。
(4)表達產物的免疫原性分析用rhCGβ-oLHα免疫C57 BL小鼠，同時分別以hCG和hCGβ免疫小鼠為對照，經三次免疫後(第1次用弗氏完全佐劑，第2，3次用弗氏不完全佐劑)後，放血後，取血清，用ELISA方法測定抗體效價(表1)。
結果表明，rhCGβ-oLHα能有效地產生抗體。以rhCGβ-oLHα，hCGβ，hCG抗原包被，其滴度分別為1∶92萬；1∶96萬；1∶92萬(表1)。
表2 hCGβ-oLHα抗血清的效價及其與hCGβ和hCG的結合活性

分別以對應的抗原包被板，測得的抗體滴度為hCGβ-oLHα抗血清1∶192萬；hCGβ抗血清 1∶192萬；hCG抗血清1∶96萬；以hCG抗原包被，hCGβ-LHα抗血清滴度1∶96萬；以hCGβ抗原包被，hCGβ-LHα抗血清滴度1∶96萬。
以上結果說明，單鏈嵌合多肽不僅能有效地誘發抗體的產生，產生的抗體也能有效地與hCG和hCGβ相結合，因此，用CHO細胞表達純化得到的rhCGβ-oLHα是可以用作半抗原，它進一步與TT或DT偶聯組成疫苗hCGβ-oLHα/TT(DT)能在體內產生抗體，達到治療癌症的目的，疫苗用於育齡婦女，能達到抗生育目的。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表(1)一般信息(ii)發明名稱新的絨毛膜促性腺激素-促黃體素融合蛋白及其製法和用途(iii)序列數目9(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度723bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GATGTGCGCT TCGAGTCCAT CCGGCTCCCT GGCTGCCCGC GCGGCGTGAA CCCCGTGGTC240TCCTACGCCG TGGCTCTCAG CTGTCAATGT GCACTCTGCC GCCGCAGCAC CACTGACTGC300GGGGGTCCCA AGGACCACCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTCCAGGA CTCCTCTTCC360TCAAAGGCCC CTCCCCCCAG CCTTCCAAGC CCATCCCGAC TCCCGGGGCC CTCGGACACC420CCGATCCTCC CACAATTTCC TGATGGAGAG TTTACAATGC AGGGTTGTCC TGAATGCAAG480CTAAAAGAAA ACAAATACTT CTCCAAGCCA GATGCTCCAA TTTATCAGTG CATGGGGTGC540TGCTTCTCCA GGGCATACCC CACTCCAGCG AGGTCTAAGA AGACAATGTT GGTTCCCAAG600AACATCACCT CGGAAGCCAC ATGTTGTGTG GCCAAAGCAT TTACCAAGGC CACAGTGATG660GGAAATGTCA GAGTGGAGAA CCACACCGAG TGCCACTGCA GTACTTGTTA TTATCACAAA720TCT 723(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度241個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT MTRVLQGVLP 50ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC 100GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQFPDGE 150FTMQGCPECK LKENKYFSKP DAPIYQCMGC CFSRAYPTPA RSKKTMLVPK 200NITSEATCCV AKAFTKATVM GNVRVENHTE CHCSTCYYHK S 241(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特徵(A)長度1095bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3AGACAAGGCA GGGGACGCAC CAAGGATGGA GATGTTCCAG GGGCTGCTGC TGTTGCTGCT 60GCTGAGCATG GGCGGGACAT GGGCATCCAA GGAGCCGCTT CGGCCACGGT GCCGCCCCAT120CAATGCCACC CTGGCTGTGG AGAAGGAGGG CTGCCCCGTG TGCATCACCG TCAACACCAC180CATCTGTGCC GGCTACTGCC CCACCATGAC CCGCGTGCTG CAGGGGGTCC TGCCGGCCCT240GCCTCAGGTG GTGTGCAACT ACCGCGATGT GCGCTTCGAG TCCATCCGGC TCCCTGGCTG300CCCGCGCGGC GTGAACCCCG TGGTCTCCTA CGCCGTGGCT CTCAGCTGTC AATGTGCACT360CTGCCGCCGC AGCACCACTG ACTGCGGGGG TCCCAAGGAC CACCCCTTGA CCTGTGATGA420CCCCCGCTTC CAGGACTCCT CTTCCTCAAA GGCCCCTCCC CCCAGCCTTC CAAGCCCATC480CCGACTCCCG GGGCCCTCGG ACACCCCGAT CCTCCCACAA TTTCCTGATG GAGAGTTTAC540AATGCAGGGT TGTCCTGAAT GCAAGCTAAA AGAAAACAAA TACTTCTCCA AGCCAGATGC600TCCAATTTAT CAGTGCATGG GGTGCTGCTT CTCCAGGGCA TACCCCACTC CAGCGAGGTC660TAAGAAGACA ATGTTGGTTC CCAAGAACAT CACCTCGGAA GCCACATGTT GTGTGGCCAA720AGCATTTACC AAGGCCACAG TGATGGGAAA TGTCAGAGTG GAGAACCACA CCGAGTGCCA780CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA AATATTTTGC AGTGGGCCAT GTTGATGATG840GTTGATTTGC TCAAAAGGAA AATTAATTTG TCCAGTGTCT ATGCCTTTGT GAGATAAAAC900CCTCCTTTTC CTTGCCGTAC ATTTTTAACC TGCTTTGAGA ATATACTGCA GCTTTATTGC960TTTTCTCCTT ATCCTACAAT ATAATCAGCA GTCTTGATCT TTTCATTTGG AATGAAATAT 1020GGCATTTAGC ATGACCATAA AAAACTGGTT CCACTGGAAA TAAAGTCTTT TAAATCATCA 1080AAAAAAAAAA AAAAG1095(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特徵(A)長度261個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN 50TTICAGYCPT MTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV100SYAVALSCQC ALCRRSTTDC GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS150PSRLPGPSDT PILPQFPDGE FTMQGCPECK LKENKYFSKP DAPIYQCMGC200CFSRAYPTPA RSKKTMLVPK NITSEATCCV AKAFTKATVM GNVRVENHTE250CHCSTCYYHK S 261(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特徵(A)長度17鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5ATTAACCCTC ACTAAAG 17(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CTCTCCATCA GGAAATTGTG GGAGGATCGG 30(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特徵(A)長度30鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CCGATCCTCC CACAATTTCC TGATGGAGAG 30(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度16鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8AACAGCTATG ACCATG 16(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度29鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO9GTGAATTCAT GTCCAAGGAG CCGCTTCGG 29
權利要求
1.一種融合蛋白，其特徵在於，它包括人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列、非人哺乳動物促黃體素α亞基的胺基酸序列、以及位於所述人絨毛膜促性腺激素β亞基的胺基酸序列和所述促黃體素α亞基胺基酸序列之間的0-20個胺基酸的連接肽序列。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的接頭序列含3-10個胺基酸。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述的融合蛋白包括SEQ IDNO2中所示的胺基酸序列。
4.一種分離的DNA分子，其特徵在於，它編碼權利要求1所述的融合蛋白。
5.如權利要求4所述的DNA分子，其特徵在於，它包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特徵在於，它含有權利要求4所述的DNA分子。
7.一種宿主細胞，其特徵在於，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種藥物組合物，其特徵在於，包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1所述的融合蛋白。
9.一種產生權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特徵在於，包括步驟在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求8所述的宿主細胞，或者培養含權利要求8所述宿主細胞的動物，從而表達出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
10.一種疫苗，其特徵在於，它含有權利要求1所述的融合蛋白或權利要求4所述的DNA分子。
11.一種抗體，其特徵在於，它特異性地結合於權利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本發明提供了絨毛膜促性腺激素與促黃體素的融合蛋白(hCG－LH融合蛋白),編碼該融合蛋白的DNA序列,含該DNA序列的載體,含該載體的宿主細胞,用基因工程製備該融合蛋白的方法,以及含該融合蛋白的藥物組合物。本發明的hCG－LH融合蛋白既具有hCG的抗原性,又具有LHα的免疫刺激活性,可以用於如癌症等疾病的治療和抗生育。
文檔編號C12P21/02GK1361181SQ00137778
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月29日 優先權日2000年12月29日
發明者申慶祥, 王健, 沈正英, 蔣俶 申請人:申慶祥