一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法
2023-10-17 05:45:44 4
專利名稱：一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法
技術領域：
本發明涉及一種基因的鑑定方法，特別涉及一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法。
背景技術：
稻瘟病是全球性的水稻最主要的病害之一，可給水稻造成11% -30%的產量損失，損失稻穀高達數億公斤，全球每年約值損失1.57億美元。實踐證明，利用抗性品種是防治稻瘟病最經濟有效的措施的措施之一，也符合人類綠色食物的要求。然而，由於稻瘟病菌生理小種的多樣性和易變性，抗性品種連續使用3-5年後，品種的抗性就會明顯衰退。因此，尋找和篩選穩定持久的抗病品種，尤其是從古老的地方品種和野生稻資源中發掘利用持久抗性資源，是防治稻瘟病經濟、有效的措施，也是保證稻作穩產、高產的主要途徑之一。無論是常規育種，還是分子育種，研究清楚不同水稻品種所蘊藏的基因和發現它們的新基因是關鍵的一步。稻瘟病抗性鑑定的方法有2種:(I)人工接種鑑定。這種方法根據選用菌株的接種方式不同，又可分為①抗譜測定，即多個菌株單個接種鑑定:②多個菌株混合接種鑑定。(2)自然誘發鑑定。人工接種鑑定的優點是接種的菌株是已知的，尤其是抗譜測定能知道被鑑定品種的抗菌株頻率和抗哪些小種，這對抗病基因的鑑定、定位、以及抗性品種利用和推廣有明確的指導作用，通常作為精細研究時採用人工接種鑑定。自然誘發鑑定通常是在稻瘟病病區設立病圃，發病條件好，葉瘟和穗瘟鑑定都很方便，由於病圃鑑定無論是葉瘟鑑定還是穗瘟鑑定，都是多次連續侵染，因此鑑定的結果準確性高，但它的不足在于田間稻瘟病菌是一種混合群體，鑑定的結果不知道品種抗那些小種和抗譜，通常作為傳統的抗病育種和大批量的抗源篩選。野生稻的抗稻瘟病性鑑定主要是通過對宿根進行分盆種植，並利用其長出的新葉進行鑑定。但可用於移植的宿根很有限，只能滿足接種幾個稻瘟病菌生理小種的需求。
發明內容
本發明的目的在於解決上述現有技術中的不足，提供一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法，本發明方法利用離體接種具有方法簡便，準確可靠，易於控制溫度、溼度等外界環境因素，故在植物抗性鑑定中應用價值較大。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案:一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具體步驟:(4)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻和感病對照品種麗江新團黑谷(LTH)的葉片，放入冰盒中保鮮，並帶回實驗室，把葉片剪成長5cm的片段；(5)把濾紙放入直徑為9cm培養皿中，並加入無菌水2ml，使濾紙變溼；把上述剪好的葉片平置於濾紙上，每個培養皿放置4段葉片；在每個葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個點，並蓋上蓋子，放入光照培養箱內培養，24-260C，相對溼度100%，黑暗培養24小時，然後光照培養，每天24小時光照,光照強度3400Lux/1310Lux (12h/12h)，每天觀察濾紙溼度，以保持培養皿內的溼度(相對溼度為100% )，培養6-7天後調查發病情況。(3)發病調查及標準:調查病斑大小，並以LTH為對照品種，判定抗感，病級分5級，0-2級的為抗病，3-4級的為感病。病斑分級:O級:無病斑；I級:深棕色，病斑沒有可見的中心2級:病斑直徑為0.1釐米，病斑小，沒有顯著的中心:
3級:病斑直徑為0.2釐米，病斑小，沒有顯著的中心:4級:病斑大，形成菌絲和分生孢子。本發明的優點是:本發明優化了接種稻瘟病菌的方法，創立了更簡便、大批量快速的野生稻抗稻瘟病的鑑定方法。解決了因野生稻不育率高、容易落粒，採種困難，且有程度不同的休眠性和發芽生長的不一致性等造成的抗病性鑑定困難的問題，加速了野生稻抗稻瘟病基因的鑑定及利用效率，為水稻抗性基因的發掘和抗性育種提供方法。
具體實施例方式實施例1:1、供試菌株:採自雲南省水稻種植區的2個稻瘟病菌株YNC08-30和YNC08-20。2、水稻的種植:野生稻(普通野生稻、藥用野生稻、疣粒野生稻)3種和感病對照品種麗江新團黑谷(LTH)，LTH在30°C的培養箱內催芽3天後，播於塑料育苗盒(15 X 5 X IOcm)內，土壤為滅菌土，每品種一行播5粒，置於24_30°C溫室育苗，每盒追施尿素0.2-0.3g，3種野生稻為宿根再生植株，保存於溫室。3、稻瘟病菌株的培養及產孢:用稻穀粉瓊脂培養基培菌，菌絲長滿培養基表面時，用自來水洗去氣生菌絲，置於日光燈下約40小時促其產孢。用蒸餾水洗下孢子，製成孢子懸浮液(孢子濃度5 X IO6個/m)加入適量0.02% Tween-20使，並置於冰上以保持稻瘟病菌孢子的侵染活力。4、稻瘟病菌接種:(6)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻的心葉，放入冰盒中保鮮，並帶回實驗室，選取葉片中部，把葉片剪成長5cm的片段；(7)稻瘟病菌的接種:把濾紙放入直徑為9cm培養皿中，並加入無菌水2ml，使濾紙變溼；把上述剪好的葉片平置於濾紙上，每個培養皿放置4段葉片；用IOuL的移液槍取5uL前面製備好的稻瘟病菌孢子懸浮液，並點接種於水稻葉片上，每段葉片接種5個點，蓋上蓋子，放入光照培養箱內培養，24-26°C，相對溼度100%，黑暗培養24小時，然後光照培養，12小時光照(光照強度3400LuX/1310LuX)，每天觀察濾紙溼度，並加2ml無菌水，以保持培養皿內的溼度(相對溼度為100% )。培養6-7天後調查發病情況。5、接種後發病調查及標準:調查接種點的病斑大小，並以LTH為對照品種，判定抗感。調查病級分5級，0-2級的為抗病，3-4級的為感病。病斑分級:
O級:無病斑；I級:深棕色，病斑沒有可見的中心；2級:病斑直徑為0.1釐米，病斑小，沒有顯著的中心；3級:病斑直徑為0.2釐米，病斑小，沒有顯著的中心；4級:病斑大，並產生菌絲 和分生孢子。
權利要求
1.一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法，包括以下具體步驟: (1)葉片的取樣:在溫室中，剪取野生稻和感病對照品種麗江新團黑谷的葉片，放入冰盒中保鮮，並帶回實驗室，把葉片剪成片段； (2)把濾紙放入直徑為9cm培養皿中，並加入無菌水2ml，使濾紙變溼；把上述剪好的葉片平置於濾紙上，每個培養皿放置4段葉片；在每個葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個點，並蓋上蓋子，放入光照培養箱內培養，24-260C，相對溼度100%，黑暗培養24小時，然後光照培養，每天24小時光照，光照強度分別為3400LUX和1310LUX，每天觀察濾紙溼度，以保持培養皿內的溼度(相對溼度為100% )，培養6-7天後調查發病情況， (3)發病調查及標準:調查病斑大小，並根據對照品種，判定抗感，病級分5級，0-2級的為抗病，3-4級的為感病。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述(I)中把葉片剪成長5cm的片段。
3.如權利要求1所述的方法，其中(2)中光照強度3400Lux照射12h，1310Lux照射12h。
4.如權利要求1所述的方法，其中(3)中病斑分級為: O級:無病斑； I級:深棕色，病斑沒有可見的中心 2級:病斑直徑為0.1釐米，病斑小，沒有顯著的中心: 3級:病斑直徑為 0.2釐米，病斑小，沒有顯著的中心: 4級:病斑大，形成菌絲和分生孢子。
全文摘要
本發明公開了一種鑑定野生稻抗稻瘟病基因的方法，該方法包括從野生稻植株上剪取葉片中部並放於放有單層濾紙的培養皿內，每皿加適量的無菌水，在每個葉片上滴入5uL的孢子懸浮液，各接種5個點，並蓋上蓋子，將培養皿放入23℃的光照培養箱中，黑暗培養24小時，然後光照培養，光照強度為3400Lux/1310Lux(12h/12h)，培養6-7天後調查病情，調查病級分5級，0-2級的為抗病，3-4級的為感病；本發明優化了接種稻瘟病的方法，創立了更簡便，大批量的野生稻抗性鑑定方法。解決了因野生稻不育率高、容易落粒，採種困難，且有程度不同的休眠性和發芽生長的不一致性等造成的抗病性鑑定困難的問題。
文檔編號C12Q1/18GK103205501SQ20131013669
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月19日 優先權日2013年4月19日
發明者李進斌, 李成雲, 劉林, 楊靜 申請人:雲南省農業科學院農業環境資源研究所