2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1,3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用的製作方法
2023-10-17 06:32:34 1
專利名稱：2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1,3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種噻唑烷酮衍生物在製備抗腦癌藥物中的應用，尤其涉及一種 2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用。
背景技術：
腦癌是癌症中比較難治的一種，腦癌中神經膠質瘤佔有的比例較大，神經膠質瘤 簡稱膠質瘤，發生在神經的外胚層，起源於神經間質細胞。各種膠質瘤中，以星形膠質瘤最 常見，其次為膠質母細胞瘤等，以星形膠質瘤為代表的小腦膠質瘤多見於兒童患者，自出現 發病症狀至就診時間平均兩年，惡性瘤體生長快，病程短，5年生存率低於5%，具有發病 率、復發率、死亡率高和治癒率低等"三高一低"的特點。 目前治療腦癌的方法主要包括外科切除、放射治療以及藥物化療，這些療法對病 人的壽命延長不到15個月。臨床上使用最多的藥物是替莫唑胺(TMZ)，其體外IQ。值為 100 ii M，以前藥的形式口服給藥在體內降解為活性形式，通過對DNA的烷化作用實現抗癌 效果，臨床試驗顯示替莫唑胺聯合放射治療可將病人生存時間延長至14個月，兩年的生存 率達26. 5%。 噻唑烷酮類化合物是一類重要的雜環類化合物。以往人們對它的研究主要集中於 2、4、5位含有羰基的噻唑烷酮類化合物，研究發現此類化合物具有抗菌抗感染抗病毒抗炎 症等多種生物效應，其中以4-噻唑烷酮在抗腫瘤方面的研究較為廣泛。早期的研究報導， 4-噻唑環核心結構的化合物具有明顯的選擇性殺死耐藥性癌細胞尤其是肺癌細胞，並誘導 細胞凋亡，而對正常細胞無抑制損傷作用。然而，儘管已有研究結果表明噻唑烷酮有廣譜抗 癌性，但在治療腦癌方面的藥理作用研究和應用，經權威機構檢索查新，目前國內外尚未見 報至。 因此，研究和開發抗膠質瘤等抗腦癌的噻唑烷酮衍生物藥物具有極其重要的意 義。
發明內容
針對目前臨床對腦癌治療需求，本發明的目的在於提供一個新型噻唑烷酮衍生物 即2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用。
本發明利用計算化學、組合化學、癌症生物學和藥物化學方法，合成了一類4-噻 唑烷酮類化合物的衍生物，運用神經膠質瘤細胞作為主要篩選模型，將所述化合物對人體 多形型膠質瘤U87MG細胞進行體外高通量篩選，得到了一個能夠特異性誘導多形型膠質瘤 細胞凋亡和自噬且能有效治療常見性腦癌的噻唑烷酮化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2羥 基-苯甲基)-l，3-噻唑-4-酮。 本發明所述噻唑烷酮類化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1，3_噻 唑-4-酮的化學結構如通式(I)所示
(I) 本發明所述2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l，3_噻唑-4-酮在製備抗 腦癌神經膠質瘤藥物中的應用；其中，所述腦癌是神經膠質瘤。 上述化合物能有效抑制腦癌細胞生長，引起細胞凋亡的濃度優選是20 M。 本發明的2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮在抑制腦癌
細胞增殖和引起凋亡中具有明顯作用，為新型抗腦癌藥物開發提供了新的前景。 為了更好的理解本發明的實質及本發明所述化合物的作用，下面結合2-苯醚基
亞氨基_5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮的藥理實驗及結果，來進一步闡述其在抑
制腦腫瘤細胞生長、引起細胞凋亡中的作用。 神經膠質瘤細胞的製備以常規方法培養神經膠質瘤細胞，收集生長狀態良好的 且處於對數期的細胞，備用。 採用細胞生物學和分子生物學方法進行如下實驗，以觀察2-苯醚基亞氨 基-5-(2-羥基-苯甲基)-l， 3-噻唑-4-酮對腦癌細胞的凋亡影響。
1.倒置顯微鏡觀察細胞形態，即凋亡小體的形成 收集對數期腦癌細胞和正常細胞，各加入2-苯醚基亞氨基_5-(2-羥基-苯甲
基)-1， 3-噻唑-4-酮，處理24h、48h、72h和96h，顯微鏡下觀察腦癌細胞形態學變化和凋亡
小體的形成，結果發現2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l， 3-噻唑-4-酮處理24h
後的細胞較對照組細胞可以發現凋亡小體的形成及明顯的形態學變化(見圖1)。 2. Annexin-V染色法檢測化合物作用腦癌細胞對細胞凋亡誘導情況 收集對數期腦癌細胞，加入2-苯醚基亞氨基_5-(2-羥基-苯甲基)-l，3_噻
唑_4-酮，作用12h、24h、48h、72h後進行Annexin-V染色，用流式細胞術分析Annexin-V熒
光強度，結果發現2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1， 3-噻唑-4-酮對腦癌細胞
U87MG的作用有濃度和時間依賴性(見圖2)。 3. WTS-1方法檢測細胞脫氫酶的活性，進行劑量效應分析將腦癌細胞接種於96孔板中，經不同濃度(100、50、20、10、5、1、0. 1、0.01iiM)
的2-苯醚基亞氨基_5-(2-羥基-苯甲基)-1， 3-噻唑-4-酮處理24h和48h後，分別用 WST-1方法檢測琥珀酸脫氫酶的活性，計算存活率。存活率％=(實驗組OD值/對照組OD 值)X 100% (以不含細胞的培養液為空白組)，實驗結果表明2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥 基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮作用於UM7MG細胞，有效抑制生長的濃度IC5。為18. 59 y M (R2 =0. 9771)，實驗組細胞存活率較對照組顯著降低且呈劑量依賴性(見圖3)。
4. TUNEL染色標記凋亡影響 收集對數期腦癌細胞，分別用10、20iiM的2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基苯甲 基)-1， 3-噻唑-4-酮作用24小時後，在(TC下用1 %多聚甲醛固定25min，然後經PBS洗脫 後70%的乙醇-2(TC環境下保存過夜，再用PBS洗脫5min，加入5iUTdr孵育液，37t:孵育 lh， SCC終止反應，用流式細胞術檢測標記凋亡細胞，對下述三組細胞計數分析，分別計算其
4陽性率(圖4)。 正常組細胞7. 38±1. 29%
10iiM組細胞6. 24±1. 08%
20iiM組細胞3. 27±0. 42% 結果顯示2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1， 3-噻唑_4_酮可引起細胞 凋亡。 5. GFP-LC3方法檢測細胞生長情況，以判斷化合物對自噬的影響 將處於對數生長期的GFP標記U87MG細胞接種於96孔板中，經20 ii M的2_苯醚
基亞氨基_5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮作用48h後，用雷射共聚焦顯微鏡觀察
GFP蛋白的變化，發現2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮作用細胞
48h，較對照組螢光變為點狀，說明自噬的發生(圖5)。 上述實驗數據經統計學處理， 實驗數據以平均值±標準誤差表示，經t檢驗，P < 0. 05，表示有明顯性差異。
通過上述實驗及其結果，可以得到以下結論 本發明所述的化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l，3_噻唑_4_酮 能選擇性地殺死U87MG腦癌細胞，同時引起細胞凋亡和自噬，劑量效應關係研究，結果發現 其具有明顯的劑量依賴性，IQ。約為20i!M，這與現在臨床治療腦癌的一線藥物相比較，抗 癌活性較強。實驗結果預示2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮有 望成為選擇性誘導腦癌腫瘤細胞凋亡和自噬以及有效治療頑固性腦癌的有潛力的抗癌藥， 具有很大的開發應用前景。
圖1本發明所述2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l，3-噻唑-4-酮作用 細胞後在不同的時間誘導U87MG細胞形態變化情況(X200)。 其中顯示的細胞為U87MG細胞，藥物化合物為2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯 甲基)-1，3-噻唑-4-酮(橫坐標表示作用時間，縱坐標表示不同濃度的2-苯醚基亞氨 基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮實驗組)。 圖2Annexin-V染色法檢測2_苯醚基亞氨基_5_(2-羥基-苯甲基)_1， 3_噻 唑-4-酮(compound 4)作用U87MG細胞引起的螢光相對變化情況。 橫軸左至右順序依次為對照組、10 ii M12h， 10 ii M24h， 10 ii M48h， 10 ii M72h， 20 ii M12h， 20 ii M24h， 20 ii M48h， 20 ii M72h。 圖3WST-1檢測活性化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2_羥基-苯甲基)-1，3_噻 唑-4-酮作用於U87MG細胞的劑量效應分析。 圖4TUNEL染色檢測化合物2_苯醚基亞氨基_5_ (2-羥基-苯甲基)_1， 3_噻 唑_4_酮誘導細胞凋亡。 其中 (a) TUNEL染色流式細胞術分析細胞凋亡陽性率； (b) TUNEL染色後流式細胞術分析對照組細胞周期情況； (c)化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l，3-噻唑-4-酮(4#化合
5物)作用24h， TUNEL染色後流式細胞術分析細胞周期情況(4#化合物引起細胞凋亡，並將 細胞周期阻滯在G"M期)。 圖5GFP-LC3方法分析噻唑烷酮化合物誘導細胞發生自吞。
(a)電鏡觀察下細胞內出現自噬； (b)化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l，3_噻唑_4_酮(4#化合 物)20 ii M作用U87MG-GFP-LC3細胞24小時。
具體實施例方式
合成化合物表徵使用的儀器紅外光譜，Nicolet380FTIR ;LC/MS， Waters2795 (Waters2996PDA監測器/MicromassZQ質量檢測器，C18柱，2. 0 ii mX 50mm) ;NMR 譜Bruker400MHzNMR光譜儀(溶劑MeOD);計算分子特性TSAR軟體Accelrys (SanDiego， CA)以及PipelinePilotSciTegic (SanDiego， CA)。
實施例1 2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1，3_噻唑_4_酮的製備
按HC1 : H20(1 : 4)的比例配成鹽酸溶液。稱取11.4g(150mmo1)硫氰酸銨溶於 50ml鹽酸溶液中，加入10. 5ml (lOOmmol) 4-苯氧基苯胺，攪拌條件下加熱到85°C ，混合物變 澄清，反應12小時候後，TLC監測反應，反應結束後，將混合物冷卻到室溫，有黏稠的油狀液 體出現，用乙酸乙酯萃取，萃取液用10%鹽酸溶液，氯化鈉飽和溶液，水依次洗滌，萃取液減 壓蒸除溶劑，得到4-苯氧基苯硫脲。 將4-苯氧基苯硫脲1110mg(6. Ommol)，無水乙酸鈉2479mg (30mmo1)，加入到20ml 乙醇中，攪拌條件下，加入氯代乙酸乙酯1. 28ml (12mmo1)，然後在6(TC下加熱6個小時，TLC 檢測反應，反應結束後冷卻到室溫，出現沉澱。將反應液過濾，固體用乙醇洗滌，得到部分粗 產物，濾液減壓蒸餾，然後用乙酸乙酯和水萃取，有機相合併得到更多的粗產物。粗產物在 乙酸乙酯中重結晶，得到產物2-苯醚基亞氨基-1， 3-噻唑-4-酮。稱取2- (4-苯氧基-苯基亞胺基)-1 ， 3-噻唑-4-酮142. 5mg (0. 5mmo1)溶於3ml乙醇中，加入鄰羥基苯甲醛73. 2mg(0. 6mmo1)，哌啶100 y L，在平行合成儀上，6(TC恆溫振蕩， 反應24小時。反應通過TLC監測，反應完畢後冷卻到室溫，在反應過程中有大量沉澱生成， 經過分析表徵，沉澱即為產物2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮。 過濾，用乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次進行洗滌，若沒有沉澱生成，將溶劑蒸乾，按l : 2配比 加入乙醇(乙酸乙酯)或者石油醚，振蕩，則大部分出現沉澱，過濾，濾渣用大量乙酸乙酯， 乙醇，石油醚依次進行洗滌。仍舊沒有沉澱產生的通過矽膠柱層析進行分離，展開液由不同 比例的乙酸乙酯和石油醚組成。產物為黃色粉末，收率86. 5% ,HNMR(400MHz， DMSO) : S (卯m) = 12. 21(s，lH)，
10. 38 (s， 1H) ， 7. 95 (d， J = 40. 0， 1H) ， 7. 79 (dj = 8. 4， 1H) ， 7. 41 (dd， J = 7. 2， 4. 2， 2H)，
7. 27 (dt， J = 17. 8， 8. 8， 1H) ， 7. 15 (t， J = 7. 5， 1H) ， 7. 12-7. 00 (m， 5H) ， 7. 00-6. 84 (m， 2H);
ESI-MS :m/z389. 1(M+l)。 實施例2 選擇性抗癌活性分析 以常規方法採用兩種細胞系(人體腦膠質瘤細胞U87MG，形態與人體正常細胞相 似的HegG2細胞)對本發明合成的化合物進行抗癌活性篩選。 在37。C含5% C02的環境下，用匿EM培養基培養U87MG細胞，1640培養基培養 H印G2細胞，收集對數期的U87MG和H印G2細胞，接種於96孔板中(2 X 104個/孔)，孵育24h 後加經不同濃度(100、50、20、10、5、1、0. 1、0. OliiM)的本發明化合物，作用24h後，每孔加 入lOiUWST-l，後繼續孵育2h，通過酶聯免疫法檢測其吸光度的方法來檢測細胞存活率， 進行劑量效應關係研究，經SigmaPlot軟體分析2-苯醚基亞氨基-5- (2羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮對腦癌細胞的半致死劑量(IC5。)值低於20 ii M，對H印G2則要高於100 y M。
實施例3 2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮影響細胞增殖和細胞形 態的時間效應關係 收集對數期的U87MG和H印G2細胞，接種於96孔板中，37。C含5% C02的環境下 孵育24h後，以0、10、20 ii M的不同濃度加入本發明所述化合物2-苯醚基亞氨基_5-(2-羥 基-苯甲基)-1， 3-噻唑-4-酮，分別在作用24h、72h和96h後觀察化合物對U87MG細胞增 殖和形態的影響(結果見圖l)。結果看到作用時間越長，化合物對細胞的作用越強，2-苯 醚基亞氨基_5-(2-羥基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮對U87MG的作用具有時間依賴性。
實施例4 2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑_4_酮對腦癌細胞的凋亡誘導
抗癌藥通常通過兩導腫瘤細胞凋亡來發揮其作用。為了初步評價噻唑烷酮類化合 物誘導腫瘤細胞凋亡的能力，用A皿exin-V染色法和流式細胞術分析噻唑烷酮化合物作用 於細胞後對細胞的凋亡兩導情況。 將以濃度10iiM、20iiM化合物2_苯醚基亞氨基_5_ (2-羥基-苯甲基)_1， 3_噻 唑-4-酮與U87MG細胞37。C /5% C02的環境下共孵育，在12、24、48、72h分別取lml細胞， 1000rpm， 4"離心10分鐘，棄上清，加入lml冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm， 4°C 離心10分鐘，棄上清，重複加入PBS、離心兩次。再用胰酶消化，再用PBS洗滌，細胞重懸於 200ul Binding Buffer,加入lOul Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘。加入300ul Binding Buffer,在1小時內取樣，用螢光染料Annexin-V染色，流式細胞術分析
螢光強度，結果顯示2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮對U87MG細
胞作用有時間和濃度的依賴性(結果見圖2)。 實施例5 TUNEL染色檢測細胞凋亡 TUNEL染色用來檢測和評價細胞的凋亡的程度，這種分析方法用末端轉移酶標記 DNA末端，通過流式細胞術檢測凋亡情況下代表性的DNA片段，來分析凋亡的狀況。
收集對數期腦癌細胞，10 ii M、20 ii M的2_苯醚基亞氨基_5_ (2-羥基-苯甲基)-1 ， 3-噻唑-4-酮在371:含5% C02的環境下作用24h，離心收集細胞，棄上清，在0t:下用1% 多聚甲醛固定25min，然後經PBS洗脫，預冷的70%乙醇_4°C固定過夜，離心收集細胞，PBS 洗脫5min，後，加入5iilTdr孵育液，37t:孵育lh， SCC終止反應，用流式細胞術檢測標記 凋亡細胞，結果顯示，10、20 ii M的化合物作用細胞24h後，凋亡率分別為7. 38±1. 29 %和 6. 24±1. 08%，而正常對照細胞僅為3. 27 ±0. 42% (結果見圖3)。
實施例6 2-苯醚基亞氨基_5-(2-羥基-苯甲基)-1， 3-噻唑-4-酮誘導肺癌細胞阻滯在 G2/M期 取對數生長期的細胞，按1X107ml以lml體積接種於6孔板內，5 y M2-苯醚基亞 氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮U87MG細胞在37"含5% C02的環境下作用 12、24、48、96h，離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次，加入預冷70%乙醇，於4°C 固定過夜，離心收集細胞，以lml的PBS洗細胞一次，加入500uLPBS含50ug/ml溴化乙錠 (PI) ， 100ug/ml RNase A，O. 2% Triton X-IOO， 4。C避光孵育30分鐘。以標準程序用流式細 胞儀檢測，結果用細胞周期擬和軟體ModFit分析。 結果表明化合物2-苯醚基亞氨基-5- (2-羥基苯甲基)-1 ， 3-噻唑_4_酮能誘導 腦癌細胞阻滯在G2/M期(結果見圖4)。
實施例7 噻唑烷酮類化合物引起細胞自噬 將U87MG細胞用LZRS-GFP-LC3B-IRES-ZE0逆轉錄病毒進行轉染，得到攜帶綠色 螢光的U87-GFP-LC3細胞，將此細胞與2-苯醚基亞氨基_5-(2_羥基-苯甲基)-1， 3-噻 唑-4-酮在37t:含5% C02的條件下作用72h時後，用共聚焦顯微鏡觀察分析，與對照組相 比，實驗組的細胞綠色螢光變為點狀(結果見圖5)。
權利要求
2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用。
2. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述腦癌是神經膠質瘤。
3. 如權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-l， 3-噻唑-4-酮能有效抑制腦癌細胞生長、引起細胞凋亡的濃度是20 i！ M。
全文摘要
本發明公開了化合物2-苯醚基亞氨基-5-(2-羥基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在製備抗腦癌藥物中的應用。所述化合物在抑制腦癌細胞增殖和引起凋亡中具有明顯作用，為新型抗腦癌藥物開發提供了新的前景。
文檔編號A61K31/426GK101791307SQ20101012466
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者劉小軍, 張斌, 張秋, 李長龍, 翟淑梅, 閆兵 申請人:山東大學