黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL及其編碼基因和應用的製作方法

2023-10-17 00:43:49 1

專利名稱：黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL及其編碼基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，涉及一種黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL及其編碼基因和應用。
背景技術：
環境中的非生物脅迫，例如乾旱、鹽鹼、冷害和熱害等影響植物的生長和發育，造成農作物的減產，也影響林木、果樹、花卉、園藝觀賞植物的正常生長和品質，培育耐逆的植物品種是種植業的主要目標之一。然而，植物耐逆性是一個數量性狀，涉及至少幾百個基因的作用，因此從耐逆性強的植物中分離耐性基因是十分必要的。脂質轉運體(Iipocalins)是一個廣泛分布於生物界蛋白家族(Akerstromet al. 2000),但這個蛋白家族成員的胺基酸序列同源性低，其功能是運輸疏水性化合物(Flower et al. 2000)。植物脂質運載蛋白可分為兩大類溫度誘導的脂質轉運體(temperature induced lipocalins, TIL)和葉綠體脂質轉運體(chloroplasticlipocalins, CHLs)(Charron et al. 2005)。植株中的脂質轉運體 的研究並不多。主要在模式植物擬南芥有過研究，TIL基因受低溫和高溫誘導(Charron et al. 2002),具有抗溫度脅迫的功能(Charron et al. 2008 ；Chi et al. 2009)。黃花苜猜(Medicago sativa subsp. falcata)是一種非常耐寒的豆科牧草種質，在寒冷的西伯利亞也有分布，從中克隆抗寒基因，能為轉基因育種提供更為優良的目的基因，而且對於農林植物抗逆分子育種尤為重要和迫切。

發明內容
為克服現有技術的缺點和不足，本發明的首要目的是提供一種黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL。本發明的另一目的在於提供編碼所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL的基因。本發明的再一目的在於提供所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL，其胺基酸序列如下所示MGNTVGKDKEVVKGVDLERYMGRWYEIASFPSFFQPKNGENTRATYTLNSDGTVHVLNETWNGGKRTSIEGSAYKADPKSDEAKLKVKFYVPPFLPIIPAVGDYfflLYLDQDYQYALlGGPTNKYLffILCRQPHLDEAIYNQLVEKAKEEGYDVSKLHKTPQSDPPPE ；編碼所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL的核苷酸序列如下所示 ATGGGAAACACCGTAGGGAAGGACAAGGAGGTTGTGAAGGGTGTAGACTTGGAGAGGTACATGGGTAGGTGGTATGAGATAGCTTCTTTCCCTTCATTCTTCCAGCCCAAAAATGGAGAGAACACAAGAGCCACATACACTCTCAACAGTGATGGGACTGTTCATGTTCTCAACGAGACTTGGAATGGTGGTAAAAGAACCTCCATAGAAGGAAGTGCTTATAAAGCTGACCCCAAAAGTGATGAAGCCAAGCTCAAGGTTAAATTCTATGTTCCTCCATTCTTGCCAATTATTCCTGCTGTTGGAGATTACTGGATTTTGTACCTTGATCAAGATTATCAATATGCTCTCATTGGTGGGCCTACCAATAAATATCTATGGATACTATGCAGGCAACCCCATTTGGATGAAGCAATCTACAACCAGCTTGTTGAGAAAGCTAAGGAAGAAGGCTATGATGTGAGTAAATTGCACAAGACTCCACAGAGTGATCCTCCACCTGAGTAA ；上述黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL在提高植物抗寒性中的應用該應用包括用本發明的MfTIL基因構建植物表達載體；用構建的表達載體轉化植物組織；將轉化的植物組織培育成轉基因植株。所述的用本發明的MfTIL基因構建植物表達載體，可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體；所述植物表達載體包括但不限於雙元農桿菌載體以及用於單子葉基因槍轉化的載體；所述的雙元農桿菌載體包括pBI121，pCAMBIA系列載體；所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它效應mRNA加工或基因表達的DNA片段；使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可使用任何一種強啟動子或誘導型啟動子；這些啟動子包括但不限於花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子和泛素(Ubiqutin)啟動子，它可單獨使用或與其他的植物啟動子結合使用；此外使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，這些增強子區域包括但不限於ATG起始密碼子和鄰接區域。起始密碼子必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。翻譯控制信號和起始密碼子可以使多種不同的來源，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或來自結構基因。

為了便於對轉基因植株進行鑑定及篩選，可對所使用的植物表達載體進行加工，包括加入或替換植物可選擇性標記。可使用的選擇性標記包括編碼抗除草劑的酶的基因或具有抗性的抗生素標記物；所述的除草劑包括草丁膦、草甘膦等，所述的抗生素包括卡那黴素、潮黴素、慶大黴素等。從轉基因植物的安全性考慮，可以不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。含有MfTIL基因的表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬於本發明的保護範圍。本發明的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接的DNA轉化，顯微注射、電穿孔等各種常規或特異的遺傳轉化方法導入植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主可以是雙子葉植物或單子葉植物。所述的MfTIL基因片段的獲得和植物表達載體的製備方法，包括以下步驟(I)引物設計① MfTIL 擴增上遊引物 RTl 13 TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；②MFTIL 擴增下遊引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；③引入Xba I 酶切位點的上遊引物 RT31 : TCCATCTAGATGAAATAGAGGAAGCAATAACATC；④引入BamH I 酶切位點的下遊引物 RT32 TAGAGGATCCAGGCATTTGTGTCTTGAGG ；(2) MfTIL基因片段的獲得以黃花苜蓿(Medicago falcata)的cDNA為模板，使用引物①和引物②擴增MfTIL基因片段，並連接進入PGEM-T easy載體中，構建獲得pGEM_MfTIL載體；(3)植物表達載體pB1-MfTIL的構建以pGEM-MfTIL載體為模板，使用引物③和引物④使MfTIL基因片段引入Xba I和BamH I兩個酶切位點，進而構建獲得植物表達載體pBI_MfTIL ；所述的轉基因植物優選為轉基因菸草；所述的轉基因菸草的獲得，包括以下的步驟(I)用電轉的方法將pB1-MfTIL導入根瘤農桿菌EHA105中，獲得含表達載體pB1-MfTIL農桿菌陽性菌落；(2)將活化的含有表達載體pB1-MfTIL的農桿菌EHA105浸染菸草無菌苗，經共培養和抗生素篩選，獲得轉基因菸草。本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果發明人已從黃花苜蓿中克隆了脂質轉運體基因的cDNA序列MfTIL。MfTIL基因的表達受低溫和ABA誘導，構建了適合於雙子葉植物的表達載體，轉化雙子葉模式植物菸草，轉基因植株明顯提高了抗凍和抗冷性。


圖1是植物表達載體pB1-MfTIL的表達框示意圖。圖2是本發明所述MfTIL基因開放閱讀框序列的PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標準DNA分子；1是M fTIL基因的擴增片段。圖3是MfTIL基因的植物表達載體的PCR鑑定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M是標準DNA分子；1是陽性重組子；P是陽性對照。圖4是低溫和脫落酸(ABA)誘導MfTIL基因表達的特徵柱狀圖，其中，圖(a)是低溫對MfTIL基因轉錄的影響，圖(b)是ABA對MfTIL基因轉錄的影響；柱上方的字母a、b、c、d和e表示不同處理之間的差異顯著(P ( 0. 05)，即數據柱上方字母相同時表示沒有顯著差異，數據柱上方字母不同時表示存在顯著差異。圖5是導入MfTIL基因的轉基因菸草的PCR鑑定結果瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，W表示野生型；P表示pB1-MfTIL載體，為陽性對照；編號I 8表示不同的轉MfTIL基因菸草。圖6是3個導入MfTIL基因的轉基因菸草的Southern雜交、實時定量PCR和Western雜交鑑定，其中，W表示野生型；編號Tl、T2和T29表示不同的轉基因菸草；圖(a)是Southern雜交，圖(b)是實時定量PCR檢測，圖(c)是Western雜交；柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。圖7是導入MfTIL基因的轉基因菸草抗凍性存活率檢測，其中圖(a)是凍處理後的存活率，圖(b)是凍處理後各個植株的照片；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。圖8是表達MfTIL基因的轉基因菸草抗冷性的相對電導率檢測。其中，W表示野生型；編號Tl、T2和T29表示不同的轉基因菸草；柱上方的字母a和b表示不同材料之間的差異顯著(P ( 0. 05)。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。黃花苜蓿種子品種為海拉爾，中國農科院北京畜牧獸醫研究所牧草種質資源庫。根癌農桿菌(Aggobacterium tumefaciens) EHA105 :購自北京天恩澤基因科技有限公司。菸草或菸草(Nicotiana tabacum L.)種子品種為中煙90,廣東省農科院作物研究所。pBI121表達載體購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。大腸桿菌DHlOB :購自上海超研生物科技有限公司。實施例1MfTIL的克隆一、黃花苜蓿cDNA模板製備 將黃花苜蓿(Medicago falcata)種子用60°C熱水浸泡5分鐘，於28°C黑暗條件下催芽，當種子露白時，點播於盛有泥土的塑料盆(直徑15cm)中，於溫室內培養，自然光照，溫度25-28°C。將苗齡8-10周的黃花苜蓿植株放入溫度為5°C的人工氣候箱(光照強度為200 u mo I HT2s-1)內，光/暗周期為12小時光照，進行5°C低溫處理，連續處理2天。取黃化苜猜的成熟葉片，用Trizol方法提取總RNA,用M-MLV逆轉錄酶試劑盒(Promega公司)反轉錄獲得cDNA模板，_20°C保存備用。二、設計擴增MfTIL基因引物根據本實驗室構建的黃花苜蓿冷誘導基因cDNA縮減文庫中發現的MfTIL基因cDNA片段的序列，在NCBI上進行BLASTn比對EST序列，並下載相應核苷酸序列一致性最高的序列，利用DNAStar軟體的Seqman工具進行序列拼接，如此反覆直到拼接得到該基因的全長序列。通過DNAstar軟體分析以上全長序列的開放閱讀框，根據開放閱讀框兩端的序列設計引物MfTIL 擴增上遊引物 RT113 : TGAAATAGAGGAAGCAATAACATC ；MfTIL 擴增下遊引物 RTl 14 CAGGCATTTGT GTCTTGAGG ；三、擴增獲得MfTIL基因並構建載體用上述步驟一製備的模板和步驟二設計的引物進行PCR擴增。PCR 反應體系(50ii L) :K0D-Plus_DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司，IU u L-1) I U I,10Xbuffer5ii 1，dNTPs (IOmmol L-1) 1，MgSO4 (25mmol L-1) 1，上遊弓丨物(10 u mo I L-1)1. 5 u 1，下遊引物(10 u mo I L-1)1. 5 U I,反轉錄第一鏈 cDNA2 u I, ddH20 補足至50u I0PCR 反應程序=PCR 反應程序94°C 3 分鐘；94°C 0. 5 分鐘，55°C 0. 5 分鐘，72°C 0. 5分鐘，35個循環；72°C 10分鐘。擴增產物以0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)。獲得與預期片段長度(571bp) —致的PCR片段(圖2)。將獲得的PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒(Qiagen公司)回收後進一步通過Taq酶催化的反應進行末端加A,反應體系如下2ii llOXbuffer，I ii 14mM dATP，11 ii gPCR回收片段，0.1 ii I Taq DNA聚合酶，加入無菌的去離子水總體積為20 yl，70°C反應20分鐘。用PCR產物回收試劑盒回收上述獲得的PCR片段。用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將PCR回收片段與pGEM-T easy載體(Promega公司)進行連接，反應體系如下liillOXT4連接酶緩衝液，回收目的片段60ng，I ill T4連接酶，2 ill pGEM-T easy載體(10ng)，加無菌水至總體積為10iU，16°C連接過夜。大腸桿菌感受態細胞的製備用接種環取保存於_80°C超低溫冰箱的大腸桿菌DHlOB菌液，在SOB固體培養基上劃板，於37°C培養箱內培養過夜；挑取大腸桿菌DHlOB單菌落接種於Iml的SOB液體培養基中，在37°C恆溫搖床上以200rpm振蕩培養約6h，接種於200ml SOB液體培養基中，於37°C恆溫搖床上以200rpm振蕩培養至OD550 = 0. 6-0. 8。以2500rpm離心10分鐘收集菌體，加入預冷的10%甘油洗滌，離心收集細菌。重複用10%甘油洗滌，離心收集細菌。最後將細菌分裝，於_70°C保存備用。連接產物電激轉化大腸桿菌將上述的末端加A的PCR片段和pGEMT-vector連接產物在 1/3 的 TE (1M NaCl, IOmM Tris-HCl pH8. 0, ImM EDTA)中透析 30 分鐘。取20 Ul大腸桿菌感受態細胞至電極杯(孔徑1_)，加入I Ul經過透析的連接產物，用電激儀(MicroPulser，Bio-RAD公司)電激轉化。電激參數為電阻200 Q，1800V, 25 U F。電激後的菌體轉入Iml SOC液體中，於37°C恆溫搖床上以200rpm振蕩培養I小時。取100 yl菌液塗布於含IPTG和X-gal的LB固體(含100 u g/mL Amp)培養基上，於37°C培養箱內倒置培養過夜。重組質粒pGEM-MfTIL的篩選、純化及測序呈藍斑的菌落不含插入片段，僅挑取呈白斑的菌落，做菌落PCR檢測。挑取PCR陽性菌落，接種於2ml含100 u g/ml氨苄青黴素的LB液體培養基中，於37°C恆溫搖床上以200rpm振蕩培養過夜。吸取2ml菌液，用質粒DNA純化試劑盒(Qiagen公司)提質粒，4°C保存備用。對獲得的質粒用Xba I /BamH I雙酶切，電泳檢測插入片段的大小 ，進一步確定陽性克隆。純化的重組質粒命名為pGEM-MfTIL，送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果如下
權利要求
1.一種黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL，其特徵在於其胺基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.編碼權利要求1所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL的核苷酸序列如SEQID NO. 2 所示。
3.權利要求1所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL在提高植物抗寒性中的應用。
4.根據權利要求3所述的黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL的應用，其特徵在於該應用包括用本發明獲得的MfTIL基因構建植物表達載體；用構建的表達載體轉化植物組織；將轉化的植物組織培育成轉基因植物。
全文摘要
本發明公開了一種黃花苜蓿溫度誘導的脂質轉運體MfTIL及其編碼基因及應用，屬於植物基因工程領域。本發明通過獲得MfTIL基因，並將獲得的MfTIL基因構建植物表達載體，用構建的表達載體轉化植物組織，然後培育成轉基因植株。MfTIL基因受低溫和脫落酸刺激的誘導；本發明提供了利用MfTI基因培育耐寒植物的方法，將該基因在植物過量表達後，提高了轉基因植物的耐凍性和耐冷性。
文檔編號C12N15/29GK103059114SQ20121059394
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者郭振飛, 塗慶華, 何雪英 申請人:華南農業大學