環糊精葡基轉移酶的新用途的製作方法

2023-10-09 04:34:29

專利名稱：環糊精葡基轉移酶的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種環糊精葡基轉移酶(CGTase)的新用途，特別是一種藥用 用途。
背景技術：
糖尿病(Diabetes mellitus)是一種近年來世界範圍內較為流行和具有高死 亡率的內分泌一代謝疾病。它是一種慢性非傳染性疾病，並且患病率逐年升高， 死亡率呈現出持續上升的趨勢，其特點為由於胰島素的絕對或相對不足和革巴細 胞對胰島素的敏感性降低，引起碳水化合物、蛋白質、脂肪、電解質和水的代 謝紊亂。目前臨床上以血糖升高至一定水平作為糖尿病的診斷標準，而通常採 用藥物來控制血糖在一定範圍以防治糖尿病，現階段的各類口服或注射的降血 糖藥物的作用機理主要是影響胰島素分泌或是減少葡萄糖的吸收、促進葡萄糖
環糊精葡基轉移酶(CGTase， EC2.4丄19)是一種重要的胞外酶，可以水 解澱粉生成環糊精和寡糖。現有報導示很多細菌可以產生環糊精葡基轉移酶， 如芽孢桿菌屬、短桿菌屬、梭狀芽孢桿菌、棒狀桿菌屬、克氏桿菌屬和微球菌 屬等(CN00819858.6)。由於CGTas的產生受染色體上一段基因控制，該酶基 因可從30多種細菌中分離獲得，故利用基因工程也可以製得重組的 CGTase，如本發明人曾對來源於嗜鹼性芽孢桿菌N-227菌株染色體上一段 編碼環糊精葡基轉移酶基因進行克隆分析、誘導表達並轉化到大腸桿菌中 [王蔭榆，王媛，張紅髮，任大明，郭本恆.來源嗜鹼性芽孢桿菌N-227 e-環糊精 葡基轉移酶基因分析及在大腸桿菌種的誘導表達.工業微生物，2007, 37(3):1-4]，發酵後通過分離純化得到重組的CGTase[王媛，王蔭榆，郭本恆,
張紅髮.表達環糊精葡基轉移酶基因的重組大腸桿菌發酵條件的研究.工業微
生物，2007,37(3):10-14;王媛，王蔭榆，張紅髮，郭本恆.P-環糊精葡基轉移酶 的分離純化及酶學性質的研究.工業微生物,2007, 37(6)]。 CGTase現已廣泛用 於食品、洗滌用品等行業，如用於麵包生產、釀酒以及洗衣粉的添加劑，但目 前CGTase尚無藥用報導。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供環糊精葡基轉移酶(CGTase)的一種新的 用途，特別是藥用用途。
本發明人根據文獻通過四氧嘧啶來誘發小鼠糖尿病以作為試驗動物模型 (鄭建仙，功能性食品[M].北京，中國輕工業出版社，1999. 486-487)。本 實驗結果表明，將環糊精葡基轉移酶採用腹腔注射對試驗小鼠給藥時，可以明 顯降低高血糖小鼠的血糖值，與對照值相比具有顯著性差異；樣品注射組的小 鼠在經過10天的給藥治療後多飲、多食、多尿和體重減輕的"三多一少"症 狀有所緩解，體重有所增加。
可見，糊精葡基轉移酶有望於製備成控制血糖或防治糖尿病的藥物。其中， 控制血糖是指將高血糖降低至正常範圍，並進一步將血糖保持在正常範圍不反 彈。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。 試驗實施例1糊精葡基轉移酶的降血糖作用 1.實驗方法 1.1實驗材料 l丄l動物
昆明種小白鼠，雌雄各半，雄性小鼠22 30g，雌性小鼠18 25g，由中
科院上海動物實驗中心提供。 l丄2受試樣品
環糊精葡基轉移酶純品(上海寶豐生化有限公司產品)，用生理鹽水溶解 後配製成一定濃度的溶液，過濾後注射給藥。
l丄3其他藥品
胰島素注射液，100IU/mL，丹麥諾和諾德公司，避光^C保存，用時生理 鹽水稀釋；
四氧嘧啶(Alloxan), sigma公司產品。冰上配製，用冰的生理鹽水溶解、 稀釋。
l丄4主要儀器
血糖測定儀羅氏血糖儀，Roche活力型血糖試紙，羅氏診斷產品(上海) 有限公司。
1.2實驗方法
1.2.1腹腔注射給藥對四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖和體重的影響 取小白鼠80隻，雌雄各半，分籠飼養2 3天，正常飼養2 3天，選取 10隻作為注射空白對照組，試驗前24h禁食不禁水，腹腔注射2w/wX的四氧 嘧啶溶液，給藥劑量為150mg/kg。 72h後經尾靜脈取血測定空腹血糖值(測血 糖前禁食12h)，並記錄為零時血糖值。血糖值高於13mmol/L的小鼠隨機分成 6組空白對照組和模型對照組注射生理鹽水；環糊精葡基轉移酶注射組分3 組，劑量分別為1.0mg/kg， 10mg/kg和40mg/kg;陽性胰島素對照組6U/kg。 連續注射10天，第l、 4、 7、 10天注射lh後測定空腹血糖值，每次測定血糖 值前稱量小鼠重量。 1.3統計學分析
測量值以平均值±標準方差(X土SD)表示，採用One-Way ANOVA統計分析。
2.結果
2丄1腹腔注射給藥對糖尿病小鼠血糖、體重的影響
注射樣品第l、 4、 7、 10次給藥後測定空腹血糖值，採用分析結果見表l。 表l 注射樣品對DM小鼠血糖(mmol/L)的影響
組別劑量 mg/kg014710
空白照 組8.23±0.957.55±1.147.45±1.296.50±0.846.78±0.75
模型對 照組25.9±3.3423.5±2.6121.85±3.4521.3 ±2.8621.88±3.65
1.023.02±4.3820.23±5.1120.85士8.0218.18±6.79,#11.22±3.23，
樣品組10 4025.90±4.44 23.64±2.8621.43±5.10 22.04±4.3916.77±5.94*# 20.43±7.2912.30±7.95*， 18.46±5.92,#12.13±4.84*'** 13.16±5.89，
胰島素 組6U/kg29.2±7.1422.95±4.3212.57±5.42*#10.93士8.85'柳15.05±11.58，
注與零時值差異*p<0.05， **p<0.01;與模型對照組差異#p<0.05，
p<0.01。
結果表明，與正常組相比，模型組及樣品組給藥前血糖均明顯升高，說明
模型成立；腹腔注射不同劑量組的血糖值自第七次注射後出現差異，在第10 次注射給藥後lh測得的空腹血糖值明顯降低，與給藥前相比具有顯著性差異， 降低百分率分別為51.2%、 53.2%、 44.3%;與模型對照組相比也存在顯著差異； 給藥環糊精葡基轉移酶血糖降低幅度超過胰島素組。腹腔注射結果說明環糊精 葡基轉移酶腹腔注射給藥效果明顯。
通過治療，測定各組的小鼠體重數據見表2，空白組小鼠隨著時間的增加 體重明顯增加，與初始體重存在顯著性差異；高血糖模型組在注射四氧嘧啶之 後，體重下降明顯，在治療的過程中只注射生理鹽水，其體重值基本保持穩定 趨勢；樣品治療組不同劑量在給藥期間體重均有所增加，但同一時間點與空白
對照組相比增加不明顯，具有顯著性差異，這可能是因為建立高血糖模型時機 體中的組織器官發生變化在短期內沒有恢復到正常水平。
表2注射樣品對DM小鼠體重(g)的影響
組別初始體重014710
空白組25.35±2.7329.0±4.76b30.3±4.16b30.2±4.58b32.15±4.56b32.9±4.26b
模型組28.67±3.9627.42±4.38a27.25±2.68a27.92士2.9r27.42±2.78ab27.25±2.23ab
樣1.027.92±2.8926.5±2.28a26.42±2.04a28.5±2.43a28.83±1.54abc29.42±2.08abc
品 1026.75±2.9825.5±3.95a25.67±4.29a27.25±4.13a29.17±4.12abc29.75±3.37abc
組 4027.21±4.124.86±4.02a26.29±4.46a27.0±3.89a29.07±4.15abc29.57±3.82abc
胰島素 組26.58±3.2324.67±3.24a27.08±2.87a27.33±2.71a28.17±2.54abc29.42±2.89abc
注a代表與空白對照組有顯著性差異；b代表與初始體重有顯著性差異;
c代表與注射Alloxan後體重有顯著性差異。
2.1.2小鼠情況觀察
小白鼠注射四氧嘧啶後，與空白對照組相比，毛色變得灰暗，精神狀況變 差，略有焦躁不安，體重變輕，同時伴有多飲、多食、多尿的典型症狀。注射 酶樣品和胰島素組的小鼠較高血糖模型組的小鼠相比，精神逐漸轉好，體重略 微增加，尿量相對減少，毛色也逐漸恢復。
權利要求
1、環糊精葡基轉移酶在製備控制血糖藥物中的應用。
2、 環糊精葡基轉移酶在製備防治糖尿病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了環糊精葡基轉移酶(CGTase)的降血糖用途，可用於製備控制血糖藥物和防治糖尿病的藥物。
文檔編號A61K38/43GK101391101SQ200710046239
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月21日 優先權日2007年9月21日
發明者王蔭榆, 艾連中, 郭本恆, 龔廣予 申請人:光明乳業股份有限公司