含硫Janus型可離子化脂質體及其用途的製作方法

2024-04-16 01:43:05

含硫janus型可離子化脂質體及其用途
技術領域
1.本發明屬於醫藥生物領域，具體涉及一種可用於遞送mrna的含硫janus型可離子化脂質體脂質體及其製備方法及用途。


背景技術：

2.janus粒子指的是具有兩種不同化學性質的粒子。兩面性使這種粒子能形成特殊結構，具備比單一性質的納米粒子更多的應用前景。janus粒子可以根據顆粒的表面性質分為具有親水和疏水分區的雙親janus粒子及帶正、負電荷分區的janus粒子。其中，雙親性janus粒子的性質與表面活性劑分子相似。他的一面親水，一面疏水，在油水界面吸附能力顯著大於同尺寸的均一表面納米粒子，可以用作抗癌藥物封裝和藥物靶向輸送等。
3.mrna疫苗除了被用於病毒性肺炎的預防，mrna療法在許多領域也具有巨大潛力。mrna療法的原理是向靶細胞導入外源mrna，使靶細胞自行合成目標蛋白。mrna療法設計製備簡便、安全性較高，與傳統基因療法相比，mrna的表達由於無插入基因組的風險而較為安全，與以蛋白質為靶點的傳統靶向藥物相比，mrna療法研發周期短、候選靶點豐富。更重要的是，mrna藥物不局限於分裂細胞，沒有整合宿主基因組的風險，且會在體內自動降解。目前mrna療法憑藉其高效、安全、豐富的治療特點已廣泛應用於罕見病、腫瘤、感染性疾病等多種疾病的治療。mrna平臺的挑戰是其固有的免疫原性、對酶降解的易感性和較少的細胞對裸mrna的攝取。將mrna用遞送系統包載運輸既保護了mrna免受酶降解，又促進細胞攝取。事實上，合適的mrna遞送載體一直是制約mrna疫苗和mrna療法發展的一大瓶頸，一個合適的mrna遞送載體可實現對mrna的高效包載，並在體內實現良好的表達效果。目前常用的幾種mrna遞送載體主要包括聚合物材料和脂質納米粒(lipid nanopar ticles，lnps)。早期人們採用聚合物材料來進行核酸的遞送，如聚乙烯亞胺(pei)、聚氨基酯(pbae)等，但因為其毒性和難以降解而應用受限。lnps主要通過磷脂材料與其他輔助磷脂完成顆粒的構建，通過rna所帶的負電與可離子化磷脂的正電相互作用(gupta k c，ono e，xu x.biochemistry，1996，35(4)∶1223-1231.)，可實現較高的包載效果(圖1)，並且在體內由低密度脂蛋白介導的胞吞機制可使納米粒子成功被細胞攝取，實現良好的細胞攝取效果。在胞內經由內涵體途徑將mrna成功釋放，轉運到細胞質中進行表達，產生相應的蛋白表達。同時良好的體內安全性也使其更具競爭力，在多種傳染性疾病的預防及治療方面展現出了較好的效果。含有陽離子/可離子化脂質、膽固醇、脂質peg和結構脂質(例如dspc)的配製脂質納米粒(1ipid nanoparticle，lnp)是目前最有效的sirna遞送系統。
4.雖然研究者已經證明了使用陽離子脂質進行生物活性劑的細胞遞送具有很多優點(wo2015095340a1)，但本領域內仍然需要適合於常規治療用途的改進的mrna遞送脂質體，需要具有更多功能、更快釋放rna的脂質體，以改善生物活性劑向特定器官和腫瘤的遞送效果。基於janus結構的遞送脂質體具有很好的潛在應用價值。


技術實現要素：

5.本發明的目的在於提供一種用於遞送mrna的含有硫元素的可離子化脂質分子，以實現對核酸的藥物的高效裝載和保護，同時硫元素具有一定的還原性，有助於降低活性氧(reactive oxygen species，ros)水平，減輕炎症，更快地釋放mrna。
6.本發明的一方面，提供一種式(i)所示的脂質分子，
[0007][0008]
其中，a1和a2各自獨立地選自-c
1-20
烷基-nrarb、-c
1-20
烷氧基-nrarb、-nrar
b-c
1-20
烷基-nrarb、-(nh-c
1-3
烷基)n-nh2、-nrar
b-(c
1-3
烷基-nh)n-nrarb、-c
1-20
烷氧基-o-nrarb、4至10元雜環烷基、-nrar
b-4至10元雜環烷基、-o-c
1-20
烷基-4至10元雜環烷基、-c(o)-c
1-20
烷基-4至10元雜環烷基、4至10元雜環烷基-4至10元雜環烷基，所述-c
1-20
烷基、-c
1-20
烷氧基、4至10元雜環烷基任選地被1、2、3或4個獨立地選自滷素、甲基、乙基、丙基、異丙基、氨基、-n(ch3)2、羥基、羧基的取代基取代；其中，n為1、2或3，條件是，a1和a2至少有一個含有n原子。
[0009]
在一實施方式中，a1和a2獨立地選自-c
1-10
烷基-nrarb、-c
1-10
烷氧基-nrarb、-nrar
b-c
1-10
烷基-nrarb、-nrar
b-(c
1-3
烷基-nh)n-nrarb、-c
1-10
烷氧基-o-nrarb、4至10元雜環烷基、-nrar
b-4至10元雜環烷基、-o-c
1-6
烷基-4至10元雜環烷基、-c(o)-c
1-6
烷基-4至10元雜環烷基、4至10元雜環烷基-4至10元雜環烷基，所述c
1-3
烷基、-c
1-10
烷基、-c
1-10
烷氧基、4至10元雜環烷基任選地被1、2、3或4個獨立地選自滷素、甲基、乙基、丙基、異丙基、氨基、n(ch3)2、羥基、羧基的取代基取代；其中，n為1、2、或3，條件是，a1和a2至少有一個含有n原子。
[0010]
在一實施方式中，r1和r2各自獨立地選自氫、-c
1-20
烷基、-c
1-20
烯基、-c
1-20
炔基、-c(o)-c
1-20
烯基、-c
1-10
烷氧基-c(o)-c
1-10
烷基、-c
1-10
烷基-c(o)-c
1-10
烷氧基、-c
1-10
烷基-c(o)-o-crarb、-c
1-10
烷基-c(o)-c
1-20
烯基、-c
1-10
烯基-crarb、-c
1-10
烷基-nr
c-c
1-10
烷基-nrdre、-c
1-10
烷基-5或6元雜環烷基-c
1-3
烷基nrcrd、膽固醇；所述-c
1-10
烷基、-c
1-10
烷氧基、-c
1-20
烷基、-c
1-20
烯基、-c
1-20
炔基、5或6元雜環烷基任選地被1、2或3個獨立地選自滷素、甲基、乙基、丙基、異丙基、氨基、羥基、羧基的取代基取代。
[0011]
l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自含有c
1-20
烷基、酯基、醯胺基、脂肪烴基、醚基、酮羰基或亞胺基的二價連接基團。
[0012]
其中，ra、rb各自獨立地為氫、c
1-16
烷基、c
1-8
烷氧基；rc、rd、re各自獨立地選自-c
1-10
烷基、-c
1-10
烷基-c(o)-c
1-10
烷基、-c
1-18
烯基，所述雜環烷基具有至少一個選自n、o和s的雜原子作為環原子。
[0013]
在一實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2是相同地。
[0014]
本發明中，r1和r2不同時為氫。式(i)所示的脂質分子，
[0015][0016]
其中，a1和a2獨立地選自胺類結構，所述胺類結構包括伯胺、仲胺和叔胺。
[0017]
l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自單鍵或含有c
1-20
烷基、酯基、醯胺基、脂肪烴基、醚基、酮羰基或亞胺基的二價連接基團。
[0018]
r1和r2各自獨立地選自氫、c
1-20
脂肪烴基、或者含有脂肪烴基的醯胺、酯、縮酮、半縮酮、縮醛和半縮醛；r1和r2不同時為氫。
[0019]
本發明在脂質分子的骨架上引入了硫元素，用於發揮一定的抗氧化性，幫助減輕炎症反應。通過可離子化脂質分子在酸性條件下發生質子化，增強與mrna之間的靜電相互作用，從而實現對mrna的高效地穩定地包載，用於遞送mrna以實現治療。同時，該脂質分子的骨架具有較多的支鏈，有利於引入更多的疏水基團以及質子化位點，從而在脂質分子的疏水性和質子化能力方面提供更豐富的可調節性。
[0020]
在一實施方式中，所述a1和a2可選擇的胺類結構包括但不限於以下代表性結構：
[0021]
[0022][0023]
在一實施方案中，a1和a2各自獨立地選自下組：
[0024]
[0025][0026]
在一優選的實施方式中，所述a1和a2可獨立地選自以下結構：
[0027][0028]
更優選地，選自以下結構：
[0029][0030]
在一實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2為連接基團，其各自獨立地選自包含c
1-20
的脂肪烴基二價連接基。
[0031]
在一優選的實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自包括但不限於以下代表性結構：含c
1-20
烷基、二硫鍵、乙烯醚鍵、酯基、硫酯基、硫代酯基、二硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、二硫代碳酸酯基、三硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、二硫代氨基甲酸酯基、縮醛、環縮醛、縮硫醛、氮雜縮醛、氮雜環縮醛、氮硫雜縮醛、二硫代縮醛、半縮醛、硫代半縮醛、氮雜半縮醛、縮酮、縮硫酮、氮雜縮酮、氮雜環縮酮、氮硫雜縮酮、亞胺鍵、腙鍵、醯腙鍵、肟鍵、硫肟醚基、半卡巴腙鍵、硫代半卡巴腙鍵、肼基、醯肼基、硫代碳醯肼基、偶氮羰醯肼基、硫代偶氮羰醯肼基、肼基甲酸酯基、肼基硫代甲酸酯基、卡巴肼、硫代卡
巴肼、偶氮基、異脲基、異硫脲基、脲基甲酸酯基、硫脲基甲酸酯基、胍基、脒基、氨基胍基、氨基脒基、亞氨酸基、亞氨酸硫酯基、磺酸酯基、亞磺酸酯基、磺醯肼基、磺醯脲基、馬來醯亞胺、原酸酯基、磷酸酯基、亞磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、磷矽烷酯基、矽烷酯基、碳醯胺、硫代醯胺、磺醯胺基、聚醯胺、磷醯胺、亞磷醯胺、焦磷醯胺、環磷醯胺、異環磷醯胺、硫代磷醯胺、烏頭醯基、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脫氧核苷酸及其衍生物骨架中任一種的二價連接基、任兩種或任兩種以上二價連接基的組合。
[0032]
在一優選的實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2為連接基團，其獨立地選自包含c
1-10
的脂肪烴基二價連接基。
[0033]
在一更優選的實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自以下結構：脂肪烴基、二硫鍵、乙烯醚鍵、酯基、硫酯基、硫代酯基、碳酸酯基、硫代碳酸酯基、氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基、縮醛、環縮醛、縮硫醛、氮雜縮醛、氮雜環縮醛、氮硫雜縮醛、二硫代縮醛、半縮醛、硫代半縮醛、氮雜半縮醛、縮酮、縮硫酮、氮雜縮酮、氮雜環縮酮、氮硫雜縮酮、亞胺鍵、腙鍵、醯腙鍵、馬來醯亞胺、磷酸酯基、亞磷酸酯基、次磷酸酯基、膦酸酯基、矽烷酯基、碳醯胺、磷醯胺、亞磷醯胺、焦磷醯胺、多肽片段、核苷酸及其衍生物骨架、脫氧核苷酸及其衍生物骨架中任一種二價連接基、任兩種或任兩種以上二價連接基的組合；
[0034]
在一優選的實施方式中，所述l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自包含c
1-6
的脂肪烴基二價連接基。
[0035]
在一更優選的實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自以下結構：脂肪烴基、二硫鍵、乙烯醚鍵、酯基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、縮醛、半縮醛、縮酮、縮硫酮、亞胺鍵、腙鍵、醯腙鍵、馬來醯亞胺、磷酸酯基、亞磷酸酯基、碳醯胺、磷醯胺、多肽片段中任一種二價連接基、任兩種或任兩種以上二價連接基的組合。
[0036]
在一實施方式中，a1和a2獨立地選自-nrarb、-c
1-10
烷基-nrarb、-(nh-c
1-3
烷基)n-nh2，ra、rb為-c
1-10
烷基；n為選自1-6的整數。
[0037]
在一實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自-c
1-10
烷基-、-c
1-10
烷氧基-、-c
1-10
烷基-c(o)、-c
1-10
烷氧基-c(o)中任一種的二價連接基、任兩種或任兩種以上二價連接基的組合。
[0038]
在一實施方式中，r1和r2各自獨立地選自-c
1-20
烷基、-c
1-20
烯基、-c
1-20
炔基、-c(o)-c
1-20
烯基。
[0039]
在一實施方式中，a1和a2獨立地選自-c
1-10
烷基-nrarb、-(nh-c
1-3
烷基)n-nh2，ra、rb為c
1-10
烷基；
[0040]
在一實施方式中，l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自-c
1-10
烷基-、-c
1-10
烷氧基-、-c
1-10
烷基-c(o)、-c
1-10
烷氧基-c(o)。
[0041]
在一實施方式中，r1和r2各自獨立地選自-c
1-20
烷基、-c
1-20
烯基、-c(o)-c
1-20
烯基。在一實施方式中，a1和a2獨立地選自-c
1-10
烷基-nrarb，ra、rb為c
1-10
烷基；l1、l2、l3、l4、b1和b2各自獨立地選自-c
1-10
烷基-；r1和r2各自獨立地選自-c
1-20
烷基、-c
1-20
烯基、-c(o)-c
1-20
烯基。在一實施方式中，b1和b2各自獨立地選自含有羰基的二價連接基團；優選地，b1和b2各自獨立地選自-(ch2)
0-6
c(o)(ch2)
0-6-；更優選地，b1和b2為c(o)。
[0042]
在一實施方式中，l2和l4各自獨立地選自單鍵或含有c
1-6
烷基的二價連接基團；優選地，l2和l4為單鍵。
[0043]
在一實施方式中，所述r1和r2可選擇的c
1-20
脂肪烴基結構包括但不限於以下代表性結構(其中碳-碳雙鍵和碳-碳三鍵的位置包括但不限於脂肪烴末端)：
[0044]
[0045]
[0046][0047]
在一實施方式中，所述r1和r2可選擇的c
1-20
脂肪烴基包括但不限於以下結構：
[0048][0049]
在一優選的實施方式中，所述r1和r2可選擇的c
1-20
脂肪烴基結構包括：
[0050][0051]
更優選地，所述r1和r2可選擇的c
1-20
脂肪烴基結構包括：
[0052][0053]
式(ii)所示的脂質分子：
[0054][0055]
其中，a1、a2、l1、l3各自定義同式(i)化合物；r3為-r
31r32
，r4為-r
41r42
。
[0056]
在一實施方式中，r
31
、r
32
、r
41
、r
42
各自獨立地選自-c
1-19
烷基、-c
1-19
烯基、-c
1-19
炔基
或其中，x選自1-6的整數；條件是r
31
、r
32
、r
41
、r
42
不同時為氫。
[0057]
在一實施方式中，r
31
、r
32
、r
41
、r
42
各自獨立地選自-c
7-19
烷基、-c
7-19
烯基、-c
7-19
炔基或其中，x選自1-6的整數。
[0058]
在一實施方式中，r
31
、r
32
、r
41
、r
42
各自獨立地選自-(ch2)
m1
ch3、-(ch2)
m2
ch＝ch(ch2)
n1
ch3、-(ch2)
m3
ch≡ch(ch2)
n2
ch3、或其中，m1選自1-19的整數；m2、m3、n1、n2各自獨立地選自1-16的整數。
[0059]
在一實施方式中，l5選自單鍵、-o-、-c(o)-或-nh-；更優選地，l為-c(o)-。
[0060]
在一實施方式中，-l
1-或-l
3-選自-(ch2)
m4-、-(ch2)
m4
c(o)-、-(ch2)
m4
c(o)o(ch2)
m5-或-(ch2)
m4
oc(o)(ch2)
m5-，其中，m4、m5各自獨立地選自1-6的整數；優選地，m4、m5各自獨立地選自1-3的整數。
[0061]
在一實施方式中，-l
1-a1、-l
3-a2選自選自
[0062]
以下化合物：
[0063][0064][0065]
本發明的另一方面，提供一種上述脂質分子的製備方法，包括以下步驟：
[0066][0067]
其中，a1和a2、l1、l2、l3、l4、r1和r2的定義同上，b1和b2為羰基。
[0068]
具體地，(a1)通過含r1的脂肪酸、含r2的脂肪酸與二氯亞碸在溶劑1中在鹼1的作用下以一定溫度反應一定時間得到脂肪醯氯，其中，r1和r2的定義同上。
[0069]
(a2)步驟(a1)中所得到的脂肪醯氯與二溴新戊二醇在鹼2的作用下在溶劑2中以一定溫度反應一定時間，得到對應的脂肪酸二溴新戊二酯。
[0070]
(a3)步驟(a2)得到的脂肪酸二溴新戊二酯在鹼3的作用下與含硫的胺類結構在溶劑3中以一定溫度反應一定時間，得到含有硫元素的可離子化脂質分子。所述含硫的胺類結構為包括如a1和a2、l1、l2、l3、l4所定義的基團與硫原子所構成的化學結構。
[0071]
可以理解地，步驟(al)為使用二氯亞碸與不同脂肪酸反應得到對應的脂肪酸醯氯的反應，該反應是普適的，其反應活性及反應過程幾乎不受脂肪烴基的影響，反應均可高效進行：
[0072]
步驟(a2)為步驟(a1)得到的脂肪醯氯與二溴新戊二醇的反應，其發生在醯氯與羥基之間，同樣幾乎不受脂肪烴基的種類影響，可高效獲得對應的脂肪酸二溴新戊二酯。
[0073]
上述製備方法具有普適性，適合於不同的烷基鏈，可以得到不同疏水性的脂肪酸二溴新戊二酯。
[0074]
本發明的另一方面，提供式(ii)所示脂質分子的製備方法，包括以下步驟：
[0075][0076]
其中，r3和r4的定義同式(ii)化合物；sh-r5為sh-l
1-a1或可進一步反應得到式(ii)化合物的含有硫原子和胺的化學結構，其中，l1和a1的定義同式(ii)化合物。溶劑1、溶劑2、溶劑3各自獨立地選自二氯甲烷、甲苯、n，n-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸或四氫呋喃；鹼1、鹼2、鹼3各自獨立地選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、異丙胺、碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0077]
在一實施方式中，步驟(a1)和(a1)』的反應溫度為25-120℃，反應時間為1-24h；步驟(a2)和(a2)』的反應溫度為0-60℃，反應時間為1-48h；步驟(a3)的反應溫度為0-100℃，反應時間為1-48h。
[0078]
在一實施方式中，溶劑1選自二氯甲烷、甲苯、n，n-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸或四氫呋喃；優選地，選自二氯甲烷、甲苯或n，n-二甲基甲醯胺；更優選地，選自二氯甲烷或甲苯。
[0079]
在一實施方式中，鹼1選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、異丙胺、碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀；優選地，選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或異丙胺；更優選地，選自吡啶，n，n-二甲基甲醯胺、三乙胺或異丙胺。
[0080]
在一實施方式中，步驟(a1)和(a1)』的反應溫度為25-120℃：優選地，為25-80℃：更優選地，為25-60℃。
[0081]
在一實施方式中，步驟(a1)和(a1)』的反應時間為1-24h；優選地，為2-12h；更優選地，為4-6h。
[0082]
在一實施方式中，溶劑2選自二氯甲烷、甲苯、n，n-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸或四氫呋喃；優選地，選自二氯甲烷、四氫呋喃或n，n-二甲基甲醯胺；更優選地，選自二氯甲烷或n，n-二甲基甲醯胺。
[0083]
在一實施方式中，鹼2選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、異丙胺、碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀；優選地，選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺或異丙胺：更優選地，選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、三乙胺或異丙胺。
[0084]
在一實施方式中，步驟(a2)和(a2)』中的反應溫度為0-60℃；優選地，為0-40℃；更優選地，為0-25℃。
[0085]
在一實施方式中，步驟(a2)和(a2)』的反應時間為1-48h；優選地，為6-24h；更優選地，為6-12h。
[0086]
在一實施方式中，溶劑3選自二氯甲烷、甲苯、n,n-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸或四氫呋喃；優選地，選自二氯甲烷、四氫呋喃、二甲基亞碸或n，n-二甲基甲醯胺；更優選地，選自四氫呋喃或n，n-二-甲基甲醯胺。
[0087]
在一實施方式中，鹼3選自吡啶、n，n-二甲基甲醯胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、異丙胺、碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀；優選地，選自吡啶、三乙胺、二乙胺、異丙胺、碳酸鉀、碳酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀；更優選地，選自碳酸鉀或碳酸鈉。
[0088]
在一實施方式中，步驟(a3)的反應溫度為0-100℃；優選地，為25-80℃；更優選地，為25-60℃。
[0089]
在一實施方式中，步驟(a3)的反應時間為1-48h；優選地，為6-24h；更優選地，為6-12h。
[0090]
在一實施方式中，式(i)所示的脂質分子為式(ia)所示脂質分子，其通過包括以下步驟的方法製備得到：
[0091][0092]
將油酸溶於甲苯中，加入二氯亞碸和n，n-二甲基甲醯胺，60℃反應6h，除去甲苯和二氯亞碸，得到油醯氯；
[0093]
油醯氯和二溴新戊二醇溶解於二氯甲烷中，加入三乙胺，過夜反應，洗滌、乾燥、濃縮、分離純化後得到油酸二溴新戊二酯；
[0094]
油酸二溴新戊二酯溶於四氫呋喃，加入碳酸鉀，在四氫呋喃中與2-二乙氨基乙硫醇反應，分離純化後得到式(ia)所示脂質分子。
[0095]
本發明的另一方面，提供一種包含上述的脂質分子的脂質體，以質量百分含量計，其包含10％-70％脂質分子、1％-20％-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、5％-50％膽固醇以及1％-30％二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(dspc)。
[0096]
在一實施方式中，所述脂質體包含30％-60％脂質分子、5％-15％dspe-peg、20％-40％膽固醇以及5％-15％dspc。
[0097]
在一優選的實施方式中，所述脂質體包含50％脂質分子、10％dspe-peg、30％膽固醇以及10％dspc。
[0098]
本發明的另一方面，提供一種核酸藥物組合物，其包含上述脂質體和核酸藥物。
[0099]
在一實施方式中，所述核酸藥物選自mrna、sirna以及microrna。
[0100]
在一優選的實施方式中，所述核酸藥物為mrna。
[0101]
本發明的另一方面，提供一種上述核酸藥物組合物的製備方法，其包括以下步驟：
[0102]
(b1)將脂質分子、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇、膽固醇、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼按比例混合，用溶劑4溶解得到有機相脂質體溶液；
[0103]
(b2)將核酸藥物用一定ph一定濃度的緩衝溶液溶解得到水相核酸藥物溶液；
[0104]
(b3)將步驟(b1)得到的有機相脂質體溶液和步驟(b2)得到的水相核酸藥物溶液混合，均質後超濾得到所述核酸藥物組合物。
[0105]
在一實施方式中，所述溶劑4選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、丙酮、二甲基亞碸或n，n-二甲基甲醯胺；優選地，選自乙醇、四氫呋喃或丙酮；更優選地，為乙醇。
[0106]
在一實施方式中，步驟(b2)所述緩衝溶液為醋酸/醋酸鈉溶液或檸檬酸/檸檬酸鈉溶液；優選地，為檸檬酸/檸檬酸鈉溶液。
[0107]
在一實施方式中，步驟(b2)中緩衝溶液的ph為3-9；優選地，為4-6；更優選地，為5。
[0108]
在一實施方式中，步驟(b2)中緩衝溶液的濃度為1mm-1m；優選地，為20mm-500mm；更優選地，為100mm。
[0109]
在一實施方式中，步驟(b3)中的混合是通過將步驟(b2)得到的水相核酸藥物溶液滴入有機相脂質體溶液中。
[0110]
在一實施方式中，步驟(b3)中脂質體與核酸藥物的質量比為5∶1-50∶1；優選地，為10∶1-30∶1；更優選地，為16∶1。
[0111]
在一優選的實施方式中，所述核酸藥物為mrna，所述脂質分子與mrna為的質量比為16∶1。
[0112]
在一實施方式中，步驟(b3)中有機相脂質體與水相核酸藥物的體積比為步驟(b3)中有機溶液與水溶液的體積比為1∶1-1∶10；優選地，1∶1-1∶5；更優選地，為1∶3。
[0113]
本發明的另一方面，提供一種上述脂質分子、上述製備方法製備得到的脂質分子、脂質體、核酸藥物組合物或藥物組合物在製備藥物遞送系統中的應用。
[0114]
本發明的另一方面，提供一種上述脂質分子、上述製備方法製備得到的脂質分子、脂質體、核酸藥物組合物或藥物組合物在製備核酸疫苗中的應用。
[0115]
在一實施方式中，所述核酸疫苗用於治療癌症或者傳染性疾病。
[0116]
在一優選的實施方式中，所述癌症為腎癌。
[0117]
在一優選地實施方式中，所述核酸為rna。
[0118]
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0119]
1.硫元素具有一定的還原性，有助於降低ros水平，減輕炎症，更快地釋放mrna。
[0120]
2.含該脂質分子的脂質體與mrna結合緊密，能夠實現對mrna的高效包載和穩定保護。
[0121]
3.該脂質體適合於不同核酸分子量長度以及不同核酸序列的mrna遞送，具有普適性。
[0122]
4.該脂質分子含有可電離的胺結構，可在酸性條件下發生質子化，並形成可離子化脂質體，有助於溶酶體逃逸，有利於mrna的釋放，提高細胞遞送效率，增加目的蛋白表達。
[0123]
5.本發明技術合成簡單，原料價格低廉，適合大規模生產，形成的lnps穩定性較高、生物相容性好。
附圖說明
[0124]
圖1示出了lnps的結構組成。
[0125]
圖2示出了實施例1製備的二溴新戊二酯的分子的1h nmr譜圖。
[0126]
圖3示出了實施例1製備的二溴新戊二酯的分子的
13
c nmr譜圖。
[0127]
圖4示出了實施例1製備的含硫可離子化脂質分子(s1)的1h nmr譜圖。
[0128]
圖5示出了實施例1製備的含硫可離子化脂質分子(s1)的
13
c nmr譜圖。
[0129]
圖6示出了含硫可離子化脂質分子的esi-tofms譜圖。
[0130]
圖7示出了實施例2製備的lnps@mrna的dls測試結果。
[0131]
圖8示出了實施例2製備的lnps@mrna的tem照片。
[0132]
圖9示出了實施例3中lnps@mrna的細胞內表達實驗結果。
[0133]
圖10示出了實施例4中可離子化脂質分子s1的細胞毒性實驗結果。
[0134]
圖11示出了實施例5中lnps@mrna的轉染實驗結果。
[0135]
圖12示出了實施例6中lnps@mrna的肝功能指標檢測結果。
[0136]
圖13示出了實施例6中lnps@mrna的組織切片結果。
具體實施方式
[0137]
i.定義
[0138]
在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的相關術語和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0139]
除非另有其它明確表示，否則在整個說明書和權利要求書中，術語「包括」或其變換如「包含」或「包括有」等等將被理解為包括所陳述的元件或組成部分，而並未排除其它元件或其它組成部分。
[0140]
本發明化合物可以是不對稱的，例如，具有一個或多個立體異構體。除非另有說明，所有立體異構體都包括，如對映異構體和非對映異構體。本發明的含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或通過使用手性原料或手性試劑合成。外消旋體、非對映異構體、對映異構體都包括在本發明的範圍之內。
[0141]
在本發明中，以及是指取代基鍵合的位置。
[0142]
術語「任選」或「任選地」是指隨後描述的事件或情況可能發生或可能不發生，該描述包括發生所述事件或情況和不發生所述事件或情況。
[0143]
本文中的數字範圍，是指給定範圍中的各個整數。例如，「c
1-c
6」是指該基團可具有1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子、4個碳原子、5個碳原子或6個碳原子；「c
3-c
6」是指該基團可具有3個碳原子、4個碳原子、5個碳原子或6個碳原子。
[0144]
術語「疏水性脂肪烴基」是指對水無親和力，不溶於水或溶解度極小的基團。
[0145]
術語「被取代的」是指特定原子或基團上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子或基團的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為酮基(即＝o)時，意味著兩個氫原子被取代。除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。
[0146]
當任何變量(例如rn)在化合物的組成或結構中出現一次以上時，其在每一種情況下的定義都是獨立的。因此，例如，如果一個基團被1-5個r所取代，則所述基團可以任選地至多被5個r所取代，並且每種情況下的r都有獨立的選項。此外，取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。
[0147]
術語「脂肪烴基」包括飽和或不飽和，直鏈或支鏈的鏈狀或環狀烴基，不含雜原子的和含有雜原子的脂肪烴基；所述雜原子指的是氮原子、氧原子、氟原子、磷原子、硫原子、和硒原子。所述脂肪烴基的類型可選自烷基、烯基、炔基等。如術語「c
1-6
脂肪烴基」包括：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、1-丁烯基、1-乙基乙烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、1-戊烯基、1-己烯基、乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，1-甲基-2-丙炔基，3-丁炔基，1-戊炔基、1-己炔基、環丙基、環丁基、環戊基和環己基等。
[0148]
術語「烷基」指飽和脂肪族烴基團，包括直鏈的或支鏈的飽和烴基，所述烴基具有所示出的碳原子數。如術語「c
1-6
烷基」包括c1烷基、c2烷基、c3烷基、c4烷基、c5烷基、c6烷基，實例包括，但不限於，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基、3-己基等。其可以是二價的，例如亞甲基、亞乙基。
[0149]「烯基」是指具有2至20個碳原子、一個或多個碳碳雙鍵並且無三鍵的直鏈或支鏈烴基的基團(「c
2-c
20
烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至10個碳原子(「c
2-c
10
烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至8個碳原子(「c
2-c8烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至6個碳原子(「c
2-c6烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至5個碳原子(「c
2-c5烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至4個碳原子(「c
2-c4烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2至3個碳原子(「c
2-c3烯基」)。在一些實施方案中，烯基具有2個碳原子(「c2烯基」)。所述一個或多個碳碳雙鍵可在內部(例如在2-丁烯基中)或在末端(例如在1-丁烯基中)。c
2-c4烯基的實例包括乙烯基(c2)、1-丙烯基(c3)、2-丙烯基(c3)、1-丁烯基(c4)、2-丁烯基(c4)、丁二烯基(c4)等。c
2-c6烯基的實例包括上述c
2-4
烯基以及戊烯基(c5)、戊二烯基(c5)、己烯基(c6)等。烯基的其他實例包括庚烯基(c7)、辛烯基(c8)、辛三烯基(c8)等。烯基的每個情形可獨立地任選地被取代，即未被取代(「未被取代的烯基」)或被一個或多個取代基(例如1至5個取代基、1至3個取代基或1個取代基)取代(「被取代的烯基」)。在某些實施方案中，烯基是未被取代的c2-10烯基。在某些實施方案中，烯基是被取代的c
2-6
烯基。
[0150]
術語「取代的」或「取代」是指特定原子或基團上的任意一個或多個氫原子被取代基取代，只要特定原子或基團的價態是正常的並且取代後的化合物是穩定的。當取代基為
酮基(即＝o)時，意味著兩個氫原子被取代。除非另有規定，取代基的種類和數目在化學上可以實現的基礎上可以是任意的。取代基可以選自以下的一個、兩個或更多個取代基取代：氘、滷素基團、氰基、硝基、-c(＝o)r、-c(＝o)or』、-oc(＝o)r」、醯亞胺基、醯胺基、羥基、經取代或未經取代的胺基、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的環烷基、經取代或未經取代的滷代烷基、經取代或未經取代的烷氧基、經取代或未經取代的烯基、經取代或未經取代的炔基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的芳氧基、經取代或未經取代的雜芳基等，但不限於此。
[0151]
術語「酮羰基」或「羰基」指的是
[0152]
術語「酯基」指-c(o)o(烷基)，其中烷基如上所定義。
[0153]
術語「藥物組合物」意指包含本發明所述化合物或其藥學上可接受的鹽，以及依施用方式和劑型的性質而定的至少一種選自以下藥學上可接受的成分的組合物，包括但不限於：載體、稀釋劑、佐劑、賦形劑、防腐劑、填充劑、崩解劑、潤溼劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、矯味劑、香味劑、抗菌劑、抗真菌劑、潤滑劑、分散劑、溫敏材料、溫度調節劑、黏附劑、穩定劑、助懸劑等。
[0154]
本發明的藥物或藥物組合物可以經腸胃外遞送，即，通過靜脈內(i.v.)、腦室內(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜內(i.p.)、肌內(i.m.)、皮下(s.d.)或皮內(i.d.)施用，通過直接注射，經例如快速濃注或連續輸液。用於注射的配製劑可以單位劑型呈現，例如在具有添加的保藏劑的安瓿瓶或多-劑量容器中。所述組合物可以採用賦形劑(excipient)的形狀，在油或水性載體中的混懸液、溶液或乳液的形式，並可以包含配製試劑如防沉降劑、穩定劑和/或分散劑。備選地，所述活性成分可以以粉末形式在使用前用適宜的載體(例如無菌無熱原水)重構。
[0155]
術語「炎性疾病」包括所述自身免疫、過敏性病症和炎性病症，例如選自關節炎，強直性脊柱炎，炎性腸病，潰瘍性結腸炎，胃炎，胰腺炎，克羅恩氏病，乳糜瀉，多發性硬化，全身性紅斑狼瘡，類風溼性關節炎，風溼熱，痛風，器官或移植排斥，急性或慢性移植物抗宿主病，慢性同種異體移植物排斥，貝切特氏病，葡萄膜炎，牛皮癬，皮炎，特異性皮炎，皮肌炎，重症肌無力，格雷夫氏病，橋本甲狀腺炎，斯耶格倫症候群，和起泡病症(例如尋常天皰瘡)，抗體介導的脈管炎症候群，包括anca-相關的血管炎，紫癜，和免疫複合血管炎(癌症或感染一期或二期)。所述過敏性病症可尤其選自接觸性皮炎，乳糜瀉，哮喘，對屋塵蟎的超敏性，花粉和相關的過敏原，鈹中毒。所述呼吸病症可尤其選自哮喘，支氣管炎，慢性阻塞性肺病(copd)，囊性纖維化，肺水腫，肺栓塞，肺炎，肺肉瘤病，矽肺病，肺纖維化，呼吸衰竭，急性呼吸窘迫症候群，原發性肺動脈高壓和肺氣腫等。
[0156]
術語「病毒感染」包括但不限於逆轉錄病毒感染、肝炎病毒感染、covid-19新冠病毒感染，寨卡病毒感染，登革病毒感染等。
[0157]
縮寫：
[0158]
cdi：n-n
′‑
羰基二咪唑；
[0159]
ii.具體實施方式
[0160]
實施例
[0161]
實施例1：化合物s1的製備
[0162][0163]
步驟一：將油酸溶在甲苯中與二氯亞碸在60℃反應6h，隨後真空除去溶劑和二氯亞碸，得到化合物a油醯氯。
[0164]
步驟二：將油醯氯和二溴新戊二醇溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，過夜反應。得到的反應液經洗滌、乾燥和濃縮後用色譜柱分離純化，所得化合物b油酸二溴新戊二酯進行1h nmr(圖2，測試條件：cdcl3，400m，298.15k)、
13
cnmr(圖3，測試條件：cdcl3，400m，298.15k)表徵。
[0165]
步驟三：將製備得到的油酸二溴新戊二酯在四氫呋喃中與2-二乙氨基乙硫醇反應，經色譜柱分離純化後得到化合物s1。所得產物進行1h nmr(圖4，測試條件：cdcl3，400m，298.15k)、
13
c nmr(圖5，測試條件：cdcl3，400m，298.15k)以及esi-tof ms(圖6)表徵。
[0166]
從圖6可見，製備得到的含硫元素的可離子化脂質分子[m+2h]
2+
理論值為m/z＝448.4，測得m/z＝448.7。
[0167]
實施例2：化合物s2的製備
[0168][0169]
步驟一：將實施例1步驟二所得化合物b油酸二溴新戊二脂溶解在吡啶中，加入2-巰基乙醇，60℃反應48h，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物c。
[0170]
步驟二：稱取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入化合物c室溫攪拌過夜，旋幹溶劑過柱子純化得到產物s2。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝5.33(d，j＝3.5，4h)，4.26(t，j＝4.5，4h)，4.02(s，2h)，2.84-2.76(m，8h)，2.68(s，2h)，2.53(t，j＝6.6，4h)，2.36(d，j＝1.9，16h)，2.03(dq，j＝7.9，3.9，8h)，1.60-1.56(m，6h)，1.34-1.23(m，42h)，0.88(t，j＝5.2，6h).
[0171]
實施例3：化合物s3的製備
[0172][0173]
步驟一：大的圓底燒瓶裡用甲苯溶解油酸和2-己基正癸酸，室溫攪拌條件下逐滴加入二氯亞碸，升溫60℃攪拌6h，待反應結束，停止加熱除去溶劑和二氯亞碸，得到兩種醯氯化合物a和化合物d。
[0174]
步驟二：將上一步產物的兩種醯氯化合物a和化合物d溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反應過夜，洗滌乾燥，純化得到化合物e。
[0175]
步驟三：把化合物e溶解在吡啶中，加入2-巰基乙醇，60℃反應過夜，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物f。
[0176]
步驟四：稱取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入化合物f，室溫攪拌過夜，停止反應，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s3。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝5.34(dd，j＝14.6，11.6，2h)，4.32-4.23(m，6h)，4.19-3.98(m，6h)，2.84-2.72(m，10h)，2.59-2.50(m，3h)，2.36(t，j＝8.5，6h)，2.11-1.98(m，6h)，1.72-1.62(m，12h)，1.34-1.23(m，40h)，0.88(t，j＝5.8，9h).
[0177]
實施例4：化合物s4的製備
[0178][0179]
步驟一：大的圓底燒瓶裡用甲苯溶解十八烷酸，室溫攪拌條件下逐滴加入二氯亞碸，加熱60℃攪拌6h，待反應結束，停止加熱除去溶劑和二氯亞碸，得到化合物g十八醯氯。
[0180]
步驟二：將化合物g溶解在二氯甲烷溶液中，分別加入二溴新戊二醇，三乙胺，反應過夜，洗滌乾燥純化得到化合物h。
[0181]
步驟三：化合物h溶解在吡啶中，加入2-巰基乙醇，60℃反應48h，停止反應自然恢
復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物i。
[0182]
步驟四：將化合物i和cdi溶解在dmso中，室溫反應過夜，反應結束將反應液倒進盛有丙酮的大燒杯中反覆洗滌三次除去多餘cdi和未反應完的原料，抽濾得到化合物j。
[0183]
步驟五：化合物j溶解在二氯甲烷中，加入n-(2-氨基乙基)-1，2-乙二胺，室溫反應過夜，反應結束旋幹過柱，得到化合物s4。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝5.43(t，j＝5.5，2h)，4.29(t，j＝4.5，4h)，4.20(s，2h)，3.27-3.21(m，4h)，2.90-2.84(m，4h)，2.80(d，j＝4.7，4h)，2.80-2.74(m，7h)，2.74-2.70(m，5h)，2.68(s，2h)，2.36(t，j＝8.5，4h)，2.12(p，j＝4.8，2h)，1.65-1.55(m，6h)，1.34-1.22(m，58h)，0.89(t，j＝5.5，6h).
[0184]
實施例5：化合物s5的製備
[0185][0186]
步驟一：將實施例4步驟二所得化合物h十八烷酸二溴新戊二脂溶解在吡啶中，加入3-巰基丙酸丁酯，60℃反應48h，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物k。
[0187]
步驟二：將化合物k溶解在甲醇溶液，加1m的氫氧化鈉溶液室溫(或者冰水浴降溫)反應，控制反應時間停止反應，將溶液倒進乙酸乙酯萃取，純化得到化合物1。
[0188]
步驟三：稱取n，n-二甲基乙醇胺溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入l，室溫攪拌48h，停止攪拌恢復室溫，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s5。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝4.36(t，j＝6.7，4h)，4.01(s，4h)，3.26(t，j＝6.7，4h)，2.84(t，j＝6.1，6h)，2.68(s，6h)，2.59(t，j＝5.9，8h)，2.32(t，j＝8.5，4h)，1.64-1.60(m，6h)，1.34-1.24(m，58h)，0.88(t，j＝5.2，6h).
[0189]
實施例6：化合物s6的製備
[0190][0191]
步驟一：稱取n-(2-氨基乙基)-1，2-乙二胺溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入實施例5步驟二所得化合物1，室溫攪拌48h，停止攪拌，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s6。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝6.85(t，j＝5.0，2h)，4.19(s，2h)，3.33(q，j＝4.7，8h)，2.86(q，j＝4.6，4h)，2.85-2.74(m，12h)，2.67(s，2h)，2.45(t，j＝5.3，6h)，2.38(t，j＝8.5，6h)，2.03(dt，j＝9.7，4.7，4h)，1.65-1.55(m，2h)，1.34-1.22(m，58h)，0.88(t，j＝5.2，6h).
[0192]
實施例7：化合物s7的製備
[0193][0194]
步驟一：將實施例3步驟二所得化合物e溶解在吡啶中，加入2-二乙氨基乙硫醇，60℃反應48h，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物s7。1h nmr(500mhz，chlorofonn-d)δ＝5.34(s，2h)，4.12-3.98(m，2h)，2.78(d，j＝13.8，1h)，2.74-2.68(m，6h)，2.63(s，4h)，2.61(d，j＝6.9，6h)，2.53(d，j＝13.8，1h)，2.37(t，j＝8.5，2h)，2.05-2.01(m，7h)，1.72(dq，j＝13.3，8.3，2h)，1.69-1.59(m，2h)，1.48-1.33(m，4h)，1.35-1.22(m，40h)，1.16-1.08(m，12h)，0.87(t，j＝5.6，9h).
[0195]
實施例8：化合物s8的製備
[0196][0197]
步驟一：將實施例4步驟四所得化合物j溶解在二氯甲烷中，加入n，n-雙(2-羥乙基)乙二胺，室溫反應過夜，反應結束旋幹過柱，得到化合物s8。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝6.34(s，2h)，5.33(t，j＝5.0，4h)，4.27(t，j＝4.5，4h)，4.20(s，2h)，3.76-3.69(m，4h)，3.64(q，j＝5.9，8h)，3.28(q，j-5.3，4h)，2.79(t，j＝4.5，4h)，2.76-2.66(m，14h)，2.36(t，j＝8.5，4h)，1.65-1.55(m，2h)，1.26(dd，j＝4.0，1.4，58h)，0.88(t，j＝5.3，6h).
[0198]
實施例9：化合物s9的製備
[0199][0200]
步驟一：稱取n，n-雙(2-羥乙基)乙二胺溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入實施例5步驟二所得化合物1，室溫攪拌48h，停止攪拌恢復室溫，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s9。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝6.94(s，2h)，5.33(t，j＝4.5，4h)，4.20(s，2h)，3.77-3.71(m，4h)，3.64(q，j＝5.9，8h)，3.34-3.27(m，4h)，2.73(td，j＝5.5，1.8，16h)，2.67(s，2h)，2.45(t，j＝5.2，4h)，2.36(t，j＝8.5，4h)，1.65-1.55(m，2h)，1.33-1.24(m，58h)，0.88(t，j＝5.6，6h).
[0201]
實施例10：化合物s10的製備
[0202][0203]
步驟一：大的圓底燒瓶裡用甲苯溶解油酸和9-十八炔酸，室溫攪拌條件下逐滴加入二氯亞碸，升溫60℃攪拌6h，待反應結束，停止加熱除去溶劑和二氯亞碸，得到兩種醯氯化合物a和化合物m。
[0204]
步驟二：將上一步產物的兩種醯氯化合物a和化合物m溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反應過夜，洗滌乾燥，純化得到化合物n。
[0205]
步驟三：化合物n溶解在吡啶中，加入2-巰基乙醇，60℃反應48h，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物o。
[0206]
步驟四：稱取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入化合物o，室溫攪拌過夜，停止攪拌，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s10。1h nmr(500mhz，chlorotorm-d)δ＝5.33(s，2h)，4.26(t，j＝4.4，4h)，4.20(s，3h)，2.84-2.72(m，9h)，2.59-2.50(m，6h)，2.37(s，12h)，2.36(t，j＝8.5，4h)，2.02(dq，j＝7.8，3.8，4h)，1.64-1.56(m，4h)，1.49-1.42(m，4h)，1138-1.23(m，42h)，0.88(t，j＝5.3，6h).
[0207]
實施例11：化合物s11的製備
[0208][0209]
步驟一：大的圓底燒瓶裡用甲苯溶解油酸和化合物p-1，室溫攪拌條件下逐滴加入
二氯亞碸，升溫60℃攪拌6h，待反應結束，停止加熱除去溶劑和二氯亞碸，得到兩種醯氯化合物a和化合物p。
[0210]
步驟二：將上一步產物的兩種醯氯化合物a和化合物p溶解在二氯甲烷溶液中，加入二溴新戊二醇和三乙胺，反應過夜，洗滌乾燥，純化得到化合物q。
[0211]
步驟三：將化合物q溶解在吡啶中，加入2-巰基乙醇，60℃反應48h，停止反應自然恢復到室溫，旋幹溶劑，dcm/meoh矽膠過柱得到化合物r。
[0212]
步驟四：稱取3-(二甲氨基)丙酸溶解在二氯甲烷裡，分別加edc和dmap，攪拌均勻後加入化合物r，室溫攪拌過夜，停止攪拌，旋幹溶劑過柱子純化得到化合物s11。1h nmr(500mhz，chloroform-d)δ＝5.38-5.35(m，2h)，5.33-5.21(m，1h)，4.30-4.15(m，7h)，2.84-2.66(m，15h)，2.69-2.60(m，3h)，2.59-2.50(m，5h)，2.47-2.26(m，3h)，2.07-1.80(m，13h)，1.80-1.69(m，2h)，1.67-1.46(m，8h)，1.49-1.23(m，33h)，1.26-1.13(m，3h)，1.16-1.06(m，3h)，1.04-0.94(m，7h)，0.92(dd，j＝6.6，1.5，3h)，0.89(t，j＝6.3，3h)，0.81(dd，j＝6.7，3.0，5h)，0.67(s，2h).
[0213]
實施例12：包載mrna的lnps的製備
[0214]
將化合物s1、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、膽固醇以及二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(dspc)按照質量比：50％：10％：30％：10％混合，用乙醇溶解。可編碼egfp的mrna用ph為5.2的檸檬酸鈉(100mm)緩衝溶液溶解。有機相溶液和水相溶液體積比為1∶3，所含脂質與mrna質量按16∶1的比例混合，得到白色乳液。隨後超濾除去乙醇，得到包載mrna的脂質體納米粒子(lnps)，以下簡稱為lnps@mrna。
[0215]
使用動態光散射(dls)和透射電鏡(tem)對所獲得的lnps進行粒徑分布表徵以及形貌表徵。dls結果顯示(圖7)，lnps@mrna的水合粒徑約為53nm。tem結果顯示(圖8)，lnps@mrna呈球形，粒徑約為55nm。
[0216]
實施例13：lnps@mrna的細胞內表達實驗
[0217]
將人胚胎腎細胞(hek293t)與實施例12製備得到的lnps@mrna共孵育24h，之後用dapi對細胞核染色1分鐘，pbs衝洗三次。使用螢光顯微鏡觀察細胞的螢光強度。
[0218]
結果顯示(圖9)，超過90％的細胞具有來自egfp綠色螢光蛋白的螢光，可見超過90％的細胞均成功表達了綠色螢光蛋白，說明egfp-mrna對細胞進行了高效轉染並表達，本發明製備的可離子化脂質體可高效遞送mrna並實現高效轉染。
[0219]
實施例14：可離子化脂質分子的細胞毒性實驗
[0220]
將hek293t細胞與不同濃度的實施例1製備得到的s1化合物的溶液分別共培養24h和48h，去除培養基，pbs衝洗一次，在新的培養基裡加入mtt，共培養6h，棄去培養基，然後pbs衝洗一次，加入dmso，37℃孵箱靜置4h，使用酶標儀檢測各孔的吸光度。結果顯示(圖10)，s1分子在1-200μm的濃度下對細胞均未表現出明顯毒性，說明該可離子化脂質分子具有良好的生物相容性。
[0221]
實施例15：lnps@mrna的轉染實驗
[0222]
以實施例12製備的lnps@mrna(s1組)為轉染劑。在轉染4h和12h後，統計不同時間節點的轉染比率。使用商業轉染劑lipo8000作對照，轉染24h後用螢光顯微鏡統計兩種轉染方式處理的細胞的綠色螢光蛋白的發光強度。
[0223]
結果顯示(圖11)，在轉染4h後，lnps@mrna的轉染比例達到44.1％，轉染12h後，
lnps@mrna的轉染比例達到80.5％，分別轉染4h、12h和24h後，lnps@mrna均表現出與商業染試劑lipo8000相當的轉染能力。
[0224]
實施例16：lnps@mrna的生物安全性分析
[0225]
將balb/c小鼠分為2組，分別經尾靜脈注射pbs和lnps@mrna(s1組)，注射5天後取小鼠靜脈血，離心取上清液，測定肝功能各項指標。對注射5天後的pbs和lnps@mrna組的小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟進行he染色，觀察其是否出現病變。
[0226]
肝功能指標檢測結果顯示(圖12)，s1組小鼠的各項肝腎功能均未出現明顯變化，其指標均與pbs相當。組織切片實驗結果顯示(圖13)，經lnps@mrna處理的小鼠的各主要器官均未出現明顯的病變，其組織結構均與pbs組保持相同。說明lnps@mrna納米粒子具有良好的生物安全性。
[0227]
實施例17：化合物s1-s11構建的可離子化脂質體的性質及效率
[0228]
根據實施例12所記載的方法，製備包含化合物s2-s11的包載mrna的lnps。根據實施例13-15記載的方法計算其包裝效率，根據tem結果統計lnps的粒徑，計算轉染效率以及細胞毒性ic
50
，並測定lnps的zeta電位。其結果與實施例12製備得到的脂質體的該些性質測試結果合併見下表1。
[0229]
表1：各種可離子化脂質體構建的lnp遞送系統的性質及效率
[0230][0231]
前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述並非想將本發明限定為所公開的精確形式，並且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在於解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現並利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的範圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。