多酚氧化酶作為製備抗腫瘤藥物的應用的製作方法
2023-12-11 22:38:37 3
技術領域：
本發明涉及生物醫藥及應用領域，尤其涉及多酚氧化酶作為製備抗腫瘤藥物的應用。
背景技術：
：腫瘤尤其是惡性腫瘤是病患者死亡率極高的惡性疾病，其治療難度極大。20世紀後期近30年以來腫瘤的發病率一直呈趨勢，目前世界癌症發病率和死亡率比1990年上升了22%，今後20年還將大約上升50%。到2020年，全球每年新增癌症患者人數將達到1500萬，並有1000萬人死於癌症，且其中大部分將發生在發展中國家。我國腫瘤引起的死亡率在所有病因中佔17.9%，居第二位，且發病率呈上升趨勢。目前我國每年癌症的發病人數約為200萬，死於癌症的人數超過140萬。長期以來，國際社會花費巨資用於研究治療癌症的新藥和方法。世界製藥公司研究開發抗腫瘤新藥也不遺餘力，抗腫瘤的新技術和新方法隨之不斷湧現。目前治療腫瘤的方法可分為：外科治療、放射治療、化學治療、藥物治療和綜合治療等。長期大量的臨床表明，外科手術適用於某些局部腫瘤的早期和中期治療，但多數人靠手術治療不能防止腫瘤的復發和轉移。放療和化療雖然有較高的治癒率，但是常引起如骨髓抑制、免疫低下等毒副作用，是的患者難以堅持治療。而且，化療藥物在治療過程中出現的耐藥性，也成為目前臨床治療的難題之一。而且各種治療方法所帶來的和患者生存質量的下降問題使如何保護機體以及各個器官的功能，提高人的生活質量也日益成為廣泛重視的課題。由於上述的各種原因，使世界上許多國家把研究重心移向藥物治療和新藥研發方面。申請人發現多酚氧化酶在抑制腫瘤細胞增殖及治療實驗性腫瘤方面具有令人滿意的效果，更令人滿意的是該多酚氧化酶在抗腫瘤的同時，沒有明顯的毒副作用。技術實現要素：本發明針對現有技術存在的不足，提供了多酚氧化酶作為製備抗腫瘤藥物的應用，具體技術方案如下：多酚氧化酶作為製備抗腫瘤藥物的應用，所述多酚氧化酶是茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶、血漿銅藍蛋白中的一種，所述抗腫瘤藥物含有最少一種所述多酚氧化酶。也就是說，所述茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶、血漿銅藍蛋白中的任一種或任兩種以上的組合為所述抗腫瘤藥物的主要活性成分。作為上述技術方案的改進，所述抗腫瘤藥物含有茶多酚氧化酶，所述茶多酚氧化酶的製備方法如下：稱取-4℃茶鮮葉25重量份，放入組織搗碎機內，加聚乙烯吡咯烷酮50重量份，再加入4℃的pH為5.6的檸檬酸-磷酸鹽緩衝液200體積份，啟動組織搗碎機進行搗碎作業3min，關閉組織搗碎機並休息5min，再開啟組織搗碎機進行搗碎作業2min，將組織搗碎機中的混合物利用四層紗布抽濾得到第一濾液和濾渣，將濾渣放入研缽中，加入25重量份的石英砂以及pH為5.6的檸檬酸-磷酸鹽緩衝液25體積份於冰浴中研磨5min，利用尼龍布過濾得到第二濾液，把第一濾液和第二濾液合併放入離心機中進行離心10min，離心機的轉速為4000rpm，離心機中的上清液即為茶多酚氧化酶粗酶液；茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸銨進行鹽析、DEAE-Sepbarose陰離子交換層析，最終得到電泳純的茶多酚氧化酶。作為上述技術方案的改進，所述抗腫瘤藥物含有蘋果多酚氧化酶，所述蘋果多酚氧化酶的製備方法為：將蘋果洗淨後在4℃保溫，再將4℃的蘋果去皮後取果肉200重量份加到組織搗碎機中，往組織搗碎機中加入500體積份-20℃的丙酮，組織搗碎機勻漿作業2min；將組織搗碎機中的混合物用布氏漏鬥抽濾得到濾餅，濾餅用200體積份-20℃的丙酮再次提取抽濾得到白色粉末，白色粉末冷凍真空乾燥即得PPO丙酮粉；將0.5重量份PPO丙酮粉溶於250體積份濃度為0.05mol/L且pH為6.8的磷酸鹽緩衝溶液中，磷酸鹽緩衝溶液的溫度為4℃，用磁力攪拌器攪拌磷酸鹽緩衝溶液20min得到混合液，將混合液倒入離心機中進行離心作業，離心機轉速為5000r/min，離心作業10min後，離心機中的上清液即為蘋果多酚氧化酶粗酶液；所述蘋果多酚氧化酶粗酶液經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後，得到電泳純的蘋果多酚氧化酶。作為上述技術方案的改進，所述抗腫瘤藥物含有血漿銅藍蛋白，所述血漿銅藍蛋白的製備方法為：將500體積份的0℃的人血清倒入離心機中，在4℃且轉速為6000rpm下離心15min後取上清液X，將取出的上清液X倒入容器中，在往容器中倒入與上清液X同等體積的濃度為0.05mol/L且pH為6.5的磷酸鹽緩衝液，在容器中使用磁力攪拌器攪拌，在攪拌過程中還加入250體積份0℃的正丁醇；正丁醇加完後，關閉磁力攪拌器，容器中的物料在4℃下靜止30min，再將容器中的物料倒入離心機中，在4℃且轉速為8000rpm下離心30min後取上清液Y，上清液Y經過滅菌紗布過濾得脫脂血清；脫脂血清經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後，獲得電泳純的血漿銅藍蛋白。作為上述技術方案的改進，所述抗腫瘤藥物用於治療包括宮頸癌、肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌。作為上述技術方案的改進，所述抗腫瘤藥物還含有紫杉醇和華蟾素。作為上述技術方案的改進，用所述多酚氧化酶製備抗腫瘤藥物時，先使用甲氧基聚乙二醇對所述多酚氧化酶進行表面修飾。所述多酚氧化酶是一種含銅的單電子氧化酶，屬於氧化還原酶類，以直連或芳香族化合物等還原性分子及氧氣為底物，能發生催化氧化、脫氫、交聯聚合等化學反應的一類酶；多酚氧化酶具有酶的催化活性，可以對酚類化合物進行降解。茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶、血漿銅藍蛋白均具有抗腫瘤活性。所述多酚氧化酶加入藥物學上可接受的輔料可製備成多種給藥途徑的抗腫瘤藥物，例如通過口服（包括頰內或舌下）、經鼻、局部（包括頰內、舌下或經皮）、不經腸道（包括皮下、皮內肌肉內、關節內、骨膜內、胸骨內、鞘內、病灶內、靜脈內或皮內注射或輸注）途徑給藥。抗腫瘤藥物可通過藥劑學技術中已知的任何方法，例如通過使活性成分與載體或賦形劑結合來製備。例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、微丸、微球、滴丸、控釋製劑緩釋製劑或注射劑。適於口服給藥的藥物製劑可呈現為獨立單位，諸如膠囊、片劑、粉末或顆粒；水性或非水性液體中的溶液、懸浮液、水包油型液體乳液或油包水型乳液。可以以單位計量形式製備口服液體，如溶液、糖漿和酏劑。糖漿可通過使化合物溶解於經適當調味的水溶液中來製備，而酏劑是經由使用無毒載體（vehicle）來製備。還可添加增溶劑和乳化劑（如乙氧基化異十八醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚）、防腐劑。適當時，用於口服給藥的劑量單位製劑可以是微膠囊化的也可通過塗布或包埋顆粒物質於聚合物、蠟或類似物中來製備製劑以延長或持續釋放還可以以脂質體給藥系統（諸如小單層脂質體、大單層脂質體和多層脂質體）的形式給藥，脂質體可由各種各樣的磷脂，如膽固醇、硬脂胺或磷脂醯膽鹼形成。適於經皮給藥的藥物製劑可以以意欲保持與接觸者表皮緊密接觸較長時段的獨立貼片形式呈現。適於局部給藥的藥物製劑可配製為軟膏劑、乳膏、懸浮液、洗劑、粉末、溶劑、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、搽劑或油劑。本發明的有益效果：本發明茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶、血漿銅藍蛋白均具有優異的抗腫瘤活性，能夠顯著抑制宮頸癌、肝癌、肺癌、結腸癌、胃癌等腫瘤細胞增殖及治療實驗性腫瘤的效果，且沒有明顯的毒副作用；尤其是血漿銅藍蛋白分別與紫杉醇、華蟾素合用，顯著提高紫杉醇合華蟾素的抑瘤率，給多酚氧化酶與其他抗腫瘤藥物的聯合應用會顯著提高抗腫瘤藥效帶來技術啟示。具體實施方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1茶多酚氧化酶的製備方法：稱取-4℃茶鮮葉25g，放入組織搗碎機內，加聚乙烯吡咯烷酮50g，再加入4℃的pH為5.6的檸檬酸-磷酸鹽緩衝液200ml，啟動組織搗碎機進行搗碎作業3min，關閉組織搗碎機並休息5min，再開啟組織搗碎機進行搗碎作業2min，將組織搗碎機中的混合物利用四層紗布抽濾得到第一濾液和濾渣，將濾渣放入研缽中，加入25g的石英砂以及pH為5.6的檸檬酸-磷酸鹽緩衝液25ml於冰浴中研磨5min，利用尼龍布過濾得到第二濾液，把第一濾液和第二濾液合併放入離心機中進行離心10min，離心機的轉速為4000rpm，離心機中的上清液即為茶多酚氧化酶粗酶液；茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸銨進行鹽析、DEAE-Sepbarose陰離子交換層析，最終得到電泳純的茶多酚氧化酶。茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸銨進行鹽析、DEAE-Sepbarose陰離子交換層析的純化作業過程如下：1）、向茶多酚氧化酶粗酶液中加入固體硫酸銨粉末直至形成飽和度為20%的硫酸銨溶液，飽和度為20%的硫酸銨溶液在4℃下靜止30min後，將硫酸銨溶液放入離心機中在8000rpm、4℃下離心30min，分別收集離心機中的上層液和沉澱；將沉澱物保存，所餘上層液加固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，重複上述操作直至硫酸銨飽和度為85%為止；上述過程中，硫酸銨溶液的飽和度以5%/次的速率遞增。2）、經硫酸銨沉澱後透析的粗蛋白質溶液，加樣於經50mmol/L磷酸緩衝液(pH=6.8)平衡的DEAESepharoseFastFlow陰離子交換柱(1.0cm×10cm)，用平衡緩衝液衝洗400mL，然後進行NaCl分梯度洗脫。3）、NaCl分梯度洗脫：分別用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸緩衝液進行洗脫，每個梯度洗脫40mL，洗脫速度為0.3mL/min，每管3mL；檢測對應試管中茶多酚氧化酶活性，紫外監測波長為280nm，收集茶多酚氧化酶活性峰。將所得酶活最高的蛋白質組分經30kDa超濾離心管濃縮後即得電泳純的茶多酚多銅氧化酶。茶多酚氧化酶粗酶液利用硫酸銨進行鹽析、DEAE-Sepbarose陰離子交換層析後被純化109.3倍，得到電泳純的茶多酚多銅氧化酶。其中，茶多酚氧化酶活性測定方法如下：取茶多酚氧化酶粗酶液1ml、pH5.6的0.1M檸檬酸鹽緩衝液2ml、反應混合液3ml在37℃恆溫水浴鍋保溫中反應10min後，立即加入1g/L偏磷酸0.7ml終止反應；其中，反應混合液是由濃度為0.1mol/L檸檬酸鹽緩衝液（pH5.6）、質量分數為0.l%的脯氨酸和質量分數為1%的鄰苯二酚按照體積比10:2:3配製；460nm波長處用10mm比色皿比色，空白混合液中用pH5.6的檸檬酸鹽緩衝液代替鄰苯二酚。酶活性以460nm波長處每分鐘OD增加0.1為1個活力單位。實施例2蘋果多酚氧化酶的製備方法：將蘋果洗淨後在4℃保溫，再將4℃的蘋果去皮後取果肉200g加到組織搗碎機中，往組織搗碎機中加入-20℃的丙酮500ml，組織搗碎機勻漿作業2min；將組織搗碎機中的混合物用布氏漏鬥抽濾得到濾餅，濾餅用-20℃的丙酮200ml再次提取抽濾得到白色粉末，白色粉末冷凍真空乾燥即得PPO丙酮粉；將0.5g的PPO丙酮粉溶於250ml濃度為0.05mol/L且pH為6.8的磷酸鹽緩衝溶液中，磷酸鹽緩衝溶液的溫度為4℃，用磁力攪拌器攪拌磷酸鹽緩衝溶液20min得到混合液，將混合液倒入離心機中進行離心作業，離心機轉速為5000r/min，離心作業10min後，離心機中的上清液即為蘋果多酚氧化酶粗酶液；所述蘋果多酚氧化酶粗酶液經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後，得到電泳純的蘋果多酚氧化酶。所述蘋果多酚氧化酶粗酶液經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後的作業過程如下：1）、向蘋果多酚氧化酶粗酶液中加入固體硫酸銨粉末直至形成飽和度為20%的硫酸銨溶液，飽和度為20%的硫酸銨溶液在4℃下靜止30min後，將硫酸銨溶液放入離心機中在12000rpm、4℃下離心15min，分別收集離心機中的上層液和沉澱；將沉澱物保存，所餘上層液加固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，重複上述操作直至硫酸銨飽和度為85%為止；上述過程中，硫酸銨溶液的飽和度以5%/次的速率遞增。2）、經硫酸銨沉澱後透析的粗蛋白質溶液，加樣於經50mmol/L磷酸緩衝液(pH=6.8)平衡的DEAESepharoseFastFlow陰離子交換柱(1.0cm×10cm)，用平衡緩衝液衝洗400mL，然後進行加鹽洗脫。3）、NaCl分梯度洗脫：分別用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸緩衝液進行洗脫，每個梯度洗脫40mL，洗脫速度為0.3mL/min，每管3mL；檢測對應試管中蘋果多酚氧化酶活性，紫外監測波長為280nm，收集蘋果多酚氧化酶活性峰。將所得酶活最高的蛋白質組分經30kDa超濾離心管濃縮後即得電泳純的蘋果多酚氧化酶。蘋果多酚氧化酶粗酶液利用硫酸銨進行鹽析、DEAE-Sepbarose陰離子交換層析後被純化57.30倍，得到電泳純的蘋果多酚氧化酶。蘋果多酚氧化酶活性測定方法如下：取pH為6.8磷酸鹽緩衝溶液1ml於1cm比色皿中，加入0.1mol/L鄰苯二酚溶液1ml，混合均勻後在400mm處比色，蘋果多酚氧化酶的酶液加入後開始記時，每15s記錄一次OD隨時間的變化值，以最初直線段的斜率△OD/t表示酶活力，一個酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。實施例3血漿銅藍蛋白的製備方法如下：將500ml的0℃的人血清倒入離心機中，在4℃且轉速為6000rpm下離心15min後取上清液X，將取出的上清液X倒入容器中，在往容器中倒入與上清液X同等體積的濃度為0.05mol/L且pH為6.5的磷酸鹽緩衝液，在容器中使用磁力攪拌器攪拌，在攪拌過程中還加入250ml0℃的正丁醇；正丁醇加完後，關閉磁力攪拌器，容器中的物料在4℃下靜止30min，再將容器中的物料倒入離心機中，在4℃且轉速為8000rpm下離心30min後取上清液Y，上清液Y經過滅菌紗布過濾得脫脂血清；脫脂血清經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後，獲得電泳純的血漿銅藍蛋白。所述脫脂血清經過硫酸銨鹽析、DEAEFastFlow柱層析分離後的作業過程如下：1）、向脫脂血清中加入固體硫酸銨粉末直至形成飽和度為20%的硫酸銨溶液，飽和度為20%的硫酸銨溶液在4℃下靜止30min後，將硫酸銨溶液放入離心機中在12000rpm、4℃下離心15min，分別收集離心機中的上層液和沉澱；將沉澱物保存，所餘上層液加固體硫酸銨粉末至飽和度為30%，重複上述操作直至硫酸銨飽和度為85%為止；上述過程中，硫酸銨溶液的飽和度以5%/次的速率遞增。2）、經硫酸銨沉澱後透析的粗蛋白質溶液，加樣於經50mmol/L磷酸緩衝液(pH=6.8)平衡的DEAESepharoseFastFlow陰離子交換柱(1.0cm×10cm)，用平衡緩衝液衝洗400mL，然後進行加鹽洗脫。3）、NaCl分梯度洗脫：分別用含0、0.1、0.2、0.4、0.5mol/L的NaCl溶液，pH值6.8的磷酸緩衝液進行洗脫，每個梯度洗脫40mL，洗脫速度為0.3mL/min，每管3mL；檢測對應試管中血漿銅藍蛋白活性，紫外監測波長為280nm，收集血漿銅藍蛋白活性峰。將所得酶活最高的蛋白質組分經30kDa超濾離心管濃縮後即得電泳純的血漿銅藍蛋白。血漿銅藍蛋白活性測定方法如下：取血漿銅藍蛋白50ul及醋酸鹽緩衝液850ul置30℃水浴8分鐘後加入基質液900ul，倒置混均，立即吸入Gilford儀器中。試驗前儀器用蒸餾水校正零點。實驗溫度30℃，分析波長550nm，光路1cm，延遲時間30秒，讀數間隔30秒，讀數點7，因數K4932，以上數字按要求輸入syvaCliniealProcessor5000。以2分鐘△A值為測定結果。用1U/L表示，即反應在最合適的pH值和基質溶液下，每升血漿銅藍蛋白每分鐘能催化轉變1ug分子基質的酶量為一個國際單位（U）。其中基質液：精取DPPD(CH3)2NC6H4NH2·2HCl69.08g，放入100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解並稀釋至刻度，室溫下置20分鐘後使用。須新鮮配製。該溶液室溫下可保留6-8小時。儀器：GilfordStasterSystemⅢinterfacedwithaSyvaCliniealProcessor5000。實施例4用所述多酚氧化酶製備抗腫瘤藥物時，先使用甲氧基聚乙二醇（簡稱：mPEG）對所述多酚氧化酶進行表面修飾；所述多酚氧化酶為實施例1中製備的茶多酚氧化酶或為實施例2中製備的蘋果多酚氧化酶或為實施例3中製備的血漿銅藍蛋白，具體方法如下：1）、mPEG的活化將1.0g的氰脲醯氯與10.0g的mPEG混合，再加入2.0g的無水碳酸鈉和5.0g的5A分子篩，溶於無水苯中，常溫下攪拌反應，離心去除碳酸鈉、5A分子篩等懸浮物，用乙醚沉澱後，再用無水苯溶解沉澱；重複沉澱、溶解6次，去除未反應的氰脲醯氯，真空乾燥，得白色粉末，即為活化的mPEG。2）、固定化酶的製備將600mg活化的mPEG與20ml多酚氧化酶溶於濃度為0.1mol/L且pH為5的磷酸緩衝液中，在常溫下磁力攪拌反應4h，在4℃下，磷酸緩衝液（濃度為0.1mol/L，pH為7.0）中透析24h（透析袋截留相對分子質量8000-14000）將透析液冷凍乾燥，即可得到修飾的多酚氧化酶。所述多酚氧化酶在製備抗腫瘤藥物時，用甲氧基聚乙二醇對多酚氧化酶進行表面修飾，能夠有效減少蛋白質免疫原性，提高多酚氧化酶在體內的抗消化性，延長代謝半衰期，減少抗腫瘤藥物的用量。抗腫瘤實驗1取實施例1製備的茶多酚氧化酶、實施例2製備的蘋果多酚氧化酶和實施例3製備的血漿銅藍蛋白，分別使用無菌水溶解。取處於對數生長期的各種腫瘤細胞，如：宮頸癌腫瘤細胞Hela；人肝癌細胞株SMMC-7721；人肺癌細胞株A549；人結腸癌細胞株Caco-2；胃癌細胞株MGC-803；分別使用離心機離心5min，離心機轉速為2000rpm，用含有質量分數為10%胎牛血清的相應培養液將沉澱細胞濃度調為1×105個/ml細胞懸液後，將細胞接種於96孔培養板。每孔加細胞懸液200ul，然後分別加入一定濃度無菌的多酚氧化酶溶液，使每孔的多酚氧化酶終濃度為0.002、0.01、0.02、0.04、0.05、0.08、0.10、0.20mg/ml，混勻後置37℃、5%CO2孵箱置培養24h後，吸出培養液並用PBS洗滌兩次，再向每孔加入5mg/ml的MTT磷酸緩衝液20ul以及150ul培養基，同樣條件下繼續培養4h後種植培養。2000rpm離心5min，然後棄去培養板孔內的培養液，每孔加入150ul的DMSO，震蕩10min，使形成的甲臢顆粒充分溶解後，選擇測定波長為570nm，酶標儀檢測吸光值。計算多酚氧化酶對腫瘤細胞的IC50，結果見表1。表1三種多酚氧化酶對腫瘤細胞的抑制作用細胞株茶多酚氧化酶蘋果多酚氧化酶血漿銅藍蛋白Hela0.0236mg/ml0.0347mg/ml0.0112mg/mlSMMC-77210.1352mg/ml0.1252mg/ml0.0346mg/mlA5490.0121mg/ml0.0157mg/ml0.0067mg/mlCaco-20.0885mg/ml0.0951mg/ml0.0631mg/mlMGC-8030.1852mg/ml0.0823mg/ml0.0497mg/ml由結果可知，茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白都具有很好的抗腫瘤活性，特別是血漿銅藍蛋白表現出更好的活性。抗腫瘤實驗2：茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白對S180小鼠的影響。選取接種8d健康狀況良好的S180瘤源小鼠，腹部皮膚消毒後抽取腹水，以無菌生理鹽水按1:4（腹水體積:生理鹽水體積）混懸備用。雄性昆明小鼠82隻，18-20g，按體重分層隨機均分為7組，分別為模型對照組（0.5%西黃芪膠）、陽性對照組（環磷醯胺，CTX）、茶多酚氧化酶組、蘋果多酚氧化酶組、血漿銅藍蛋白組，均在其右側腋部皮下接種0.2ml前述懸液。2h後模型對照組和多酚氧化酶組分別灌胃給予受試物或混懸劑，每日一次，連續14日；陽性對照組腹腔注射給予CTX，隔日一次，共7次。末次給藥後24h頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤塊稱重，並計算抑瘤率（1-實驗組平均瘤重/模型對照組平均瘤重）×100%。表2茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白對S180小鼠的影響（±s）組別動物數（只）劑量瘤重（g）抑瘤率（%）模型對照12——1.2±0.45——陽性對照（CTX）1240mg/kg0.35±0.58**70.8茶多酚氧化酶組124.8g/kg0.57±0.45**52.5蘋果多酚氧化酶組124.8g/kg0.44±0.29**63.3血漿銅藍蛋白組124.8g/kg0.34±0.43**71.7與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。實驗結果表明，血漿銅藍蛋白4.8g/kg灌胃給予，可顯著抑制S180在小鼠體內的生長，且其作用強度與環磷醯胺40mg/kg隔日灌胃給予類似；茶多酚氧化酶和蘋果多酚氧化酶4.8g/kg灌胃給予也可有效降低瘤重，抑瘤率均超過50%，表明茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白均具有較好的抗腫瘤活性。抗腫瘤實驗3：茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白對荷艾氏腹水瘤小鼠的影響。選取接種8d健康狀況良好的S180瘤源小鼠，腹部皮膚消毒後抽取腹水，以無菌生理鹽水按1:4（腹水體積：生理鹽水體積）混懸備用。雄性昆明小鼠82隻，18-20g，按體重分層隨機均分為7組，分別為模型對照組（0.5%西黃芪膠）、陽性對照組（環磷醯胺，CTX）、茶多酚氧化酶組、蘋果多酚氧化酶組、血漿銅藍蛋白組，均在其右側腋部皮下接種0.2ml前述懸液。2h後模型對照組和多酚氧化酶組分別灌胃給予受試物或混懸劑，每日一次，持續給藥直至動物垂死；陽性對照組腹腔注射給予CTX，隔日一次，共7次。動物垂死時即頸椎脫臼處死小鼠，垂死時間計為生存天數；處死後稱重體重，隨後放盡腹水，再次稱重，其差值計為腹水重量。表3茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白對荷艾氏腹水瘤小鼠的影響（±s）組別動物數（只）劑量生存天數（天）腹水量（g）模型對照12——16.3±2.521.4±1.8陽性對照（CTX）1240mg/kg17.2±2.315.9±1.5**茶多酚氧化酶組124.8g/kg19.6±2.3**15.5±1.1**蘋果多酚氧化酶組124.8g/kg19.0±3.1*16.9±2.5**血漿銅藍蛋白組124.8g/kg20.1±2.9**17.2±2.2**與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。實驗結果表明，血漿銅藍蛋白4.8g/kg灌胃給予，可顯著抑制艾氏腹水瘤在小鼠體內的生長，延長動物生存時間，且其作用強度與環磷醯胺40mg/kg隔日灌胃給予類似；茶多酚氧化酶和蘋果多酚氧化酶4.8g/kg灌胃給予也可有效延長生存時間，抑制腹水生成，表明茶多酚氧化酶、蘋果多酚氧化酶和血漿銅藍蛋白具有較好的抗腫瘤活性。抗腫瘤實驗4：血漿銅藍蛋白與紫杉醇及華蟾素聯合應用對荷S180小鼠的影響。選取接種8d健康狀況良好的S180瘤源小鼠，腹部皮膚消毒後抽取腹水，以無菌生理鹽水按1:4（腹水體積：生理鹽水體積）混懸備用。雄性昆明小鼠84隻，18-20g，按體重分層隨機均分為7組，分別為模型對照組（0.5%西黃芪膠）、陽性對照組（環磷醯胺，CTX）、血漿銅藍蛋白組、紫杉醇組、華蟾素組、與紫杉醇聯合用藥組、與華蟾素聯合用藥組，均在其右側腋部皮下接種0.2ml前述懸液。2h後模型對照組和多酚氧化酶組分別灌胃給予受試物或混懸劑，每日一次，連續14日；陽性對照組腹腔注射給予CTX，隔日一次，共7次。末次給藥後24h頸椎脫臼處死小鼠，剝離瘤塊稱重，並計算抑瘤率（1-實驗組平均瘤重/模型對照組平均瘤重）×100%。表4血漿銅藍蛋白與紫杉醇及華蟾素聯合應用對荷S180小鼠的影響（±s）組別動物數（只）劑量瘤重（g）抑瘤率（%）模型對照組12——1.30±0.55——陽性對照組（CTX）1240mg/kg0.48±0.41**63.1血漿銅藍蛋白組121.6g/kg1.04±0.4020.0紫杉醇組125mg/kg0.85±0.38*34.6與紫杉醇聯合用藥組12血漿銅藍蛋白1.6g/kg+紫杉醇組5mg/kg0.52±0.26**@60.0華蟾素組121mg/kg0.73±0.42*43.8與華蟾素聯合用藥組12血漿銅藍蛋白1.6g/kg+華蟾素1mg/kg0.37±0.18**#71.5與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紫杉醇組比較@P＜0.05；與華蟾素組比較，#P〈0.05。實驗結果表明，血漿銅藍蛋白1.6g/kg灌胃給予，對S180在小鼠體內腫瘤的生長無明顯抑制作用，紫杉醇5mg/kg、華蟾素1mg/kg則顯示一定效果。但同樣劑量的血漿銅藍蛋白分別與紫杉醇組5mg/kg、華蟾素1mg/kg合用，則均可顯著提高紫杉醇合華蟾素的抑瘤率，表明血漿銅藍蛋白與其他抗腫瘤藥物聯合應用可提高這些藥物的抗腫瘤藥效，同時也給具有抗腫瘤活性的多酚氧化酶與其他抗腫瘤藥物的聯合應用會顯著提高抗腫瘤藥效帶來技術啟示。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。當前第1頁1 2 3