一種雷公藤減毒的方法
2023-12-12 04:41:17 3
專利名稱：：一種雷公藤減毒的方法
技術領域：
：本發明屬於生物解毒
技術領域：
，具體涉及一種對天然有毒植物藥雷公藤進行整體生物轉化，以獲得減毒、增效的雷公藤的方法。
背景技術：
：藥用植物雷公藤(7W^er義^"邁^7/br&7Hook,f)系衛矛科的藤本灌木，藥用部位為其根及根莖。在我國主要分布於長江流域以南山區、東北長白山區，雲南和貴州也有分布。雷公藤作為草藥治療類風溼性關節炎、趺打損傷、皮膚病等已有悠久的歷史。1972年Kupchan首次報導了雷公藤甲素(二萜內酯化合物)具有明顯的抗白血病及抗腫瘤活性，且用量很小，從而引起了'學者廣泛的注意。隨著研究的不斷深入，雷公藤在免疫抑制、器官移植，男性節育，抗菌，抗炎，活血化瘀及降低血液粘度，抗癌防癌及治療疑難雜症與自身免疫性疾病方面越來越顯示出巨大的應用前景。但由於雷公藤的毒性較大，特別是對肝臟、心血管系統、泌尿系統、生殖系統、消化系統及神經系統的毒副作用，一直制約了雷公藤在臨床上的深度應用。面對如此現狀，如何對雷公藤及其所含有的活性成分進行減毒研究，成為了眾多專家、學者爭相研究的重要靶點。已經報導的各種解毒方法，包括利用中藥配方解毒、活性成分的結構修飾或者利用分離純化的單體成分來進行生物轉化解毒等雖然都取得了一些進展，但所獲成果離實際的臨床應用及產業化還有一定的距離。天然藥物的生理活性物質往往是由一系列化合物所組成的，這一系列化合物可能是同系物或者結構類型不一樣的化合物，在生理活性方面具有相互協同、互補增效的作用，在作用範西上往往具有多靶點的特徵。雷公藤的主要活性成分二瞎內酯類化合物在藥材中含量低，結構類型複雜，具有多個不對稱中心，化學合成難度較大，利用純化合物來進行生物轉化缺乏實際的應用價值。新近出現的整體生物轉化技術，是利用微生物在藥材活性成分不被分離狀態下進行的生物轉化，轉化產物的類型和比例會出現較大的變化，從而導致原藥材毒性與功效亦出現較大的改變。這種不分離狀態下的生物轉化具有反應條件溫和、成本低、副產物少、後處理簡單、汙染小等優點，能夠完成傳統有機合成難以進行的反應，成為了創新藥物研究和開發的重要途徑之一。但將該方法應用於雷公藤解毒，現有技術中尚未見有成功的報導。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一種雷公藤減毒的方法，利用微生物對雷公藤原藥材進行整體生物轉化，以達到增強療效和降低毒性的效果。本發明的目的通過以下技術方案予以實現。除非另有說明，否則本發明所採用的百分數均為重量百分數。一種雷公藤減毒的方法，包括以下步驟1、將乾燥雷公藤根莖粉碎過60目篩後，加入雷公藤重量30~60%的麥麩和10~30%豆粉，混合均勻；2、將佔混合物料總重1~10%的普通渥堆發酵普洱茶第4~10天中的發酵物，或者是佔混合物料總重0.01~0.05%的煙麴黴，或者是佔混合物料總重0.01~0.05%的毛黴與煙麴黴的混合菌種，作為接種物；3、在混合物料中加入佔物料總重60%~90%的開水，並充分混合均句，然後在105。C條件下蒸汽滅菌40-120min，冷卻到35。C後，接種步驟2所述的菌種或發酵物，再添加佔混合物料總重30%~60%的純淨水，混合均勻；4、接種後的混合物料再在溫度為25'C40'C,相對溼度為50~80%的條件下進行培養4~10天，經過乙醇提取，回收乙醇，濃縮乾燥後得到雷公藤減毒提取物。進一步的，將步驟(2)所述的接種物置於25-40'C,相對溼度為50~80%的條件下培養4~10天。所述的毛黴與煙麴黴混合比重為l:1~1:5。本發明相對於現有技術具有如下優點通過深入的研究，發現了對雷公藤具有獨特轉化效果的單一微生物或混合微生物，並利用這些微生物的轉化作用，對雷公藤中複雜的有機物質進行分解和轉化，通過生物化學作用使原有成分發生了變化，不同成分之間的比例出現增減以及產生了新的活性物質，從而使雷公藤的功效發生了較大變化。藥理研究表明，轉化產物與原藥材相比，不僅實現了降低毒性的目標，更出現了藥理活性有所增強的效果。同時由於直接運用了未經提取分離的原料藥材，轉化產物可以直接製成適當劑型為臨床所用，避免了轉化單一活性物質造成的資源浪費。該方法操作簡便，成本低廉，其應用對雷公藤的臨床推廣和產業化開發具有重要的意義，並且有利於雷公藤生物資源的充分利用和可持續發展。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，但它們不是對本發明的限定。實施例1稱取雷公藤20kg，粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg，混合，加入20L的開水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105"條件下滅菌40min,冷卻到35°C時接種佔混合物料總重0.01%的毛黴與煙麴黴按1:l混合的菌種，並添加20L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為35'C，相對溼度為70%的條件下進行培養7天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.8kg的雷公藤減毒提取物。實施例2稱取雷公藤20kg，粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg,混合，加入30L的開水，使物料充分混合均句；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌120min，冷卻到35"C時接種佔混合物料總重0.05%的毛黴與煙麴黴按1:5混合的菌種，並添加10L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為40'C，相對溼度為80%的條件下進行培養4天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.6kg的雷公藤減毒提取物。實施例3稱取雷公藤20kg，粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌40min,冷卻到35°C時接種佔混合物料總重0.03%的毛黴與煙麴黴按1:3混合的菌種，並添加15L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為25°C,相對溼度為50%的條件下進行培養10天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實施例4稱取雷公藤20kg,粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg,混合，加入20L的開水，使物料充分混合均勾；將混合物料採用蒸汽進行滅菌，在105X:條件下滅菌40min，冷卻到35°C時接種佔混合物料總重0.01%的煙麴黴菌種，並添加20L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為35°C,相對溼度為70%的條件下進行培養7天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實施例5稱取雷公藤20kg,粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg，混合，加入30L的開水，使其充分混合均勻；將混合物料採用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌120min，冷卻到35°C時接種佔混合物料總重0.05%的煙麴黴菌種，並添加10L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為4(TC,相對溼度為80%的條件下進行培養4天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.6kg雷公藤減毒提取物。實施例6稱取雷公藤20kg，粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開水，使其充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌40min,冷卻到35°C時接種佔混合物料總重0.03%的煙麴黴菌種，並添加15L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為25°C,相對溼度為50%的條件下進行培養10天；結束後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實施例7稱取雷公藤20kg，粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩6kg、豆粉6kg，混合，加入20L的開水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌40min，冷卻到35°C時接種佔混合物料總重1%的普通渥堆發酵普洱茶第6天中的發酵物，並添加20L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為35°C，相對溼度為70%的條件下進行培養7天；結束後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.8kg雷公藤減毒提取物。實施例8稱取雷公藤20kg,粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩12kg、豆粉2kg,混合，加入30L的開水，使物料充分混合均勾；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105'C條件下滅菌120min,冷卻到35'C時接種佔混合物料總重100/。的普通渥堆發酵普洱茶第4天中的發酵物，並添加10L純淨水，混合均勻；接菌種後的物料在溫度為4(TC,相對溼度為80%的條件下進行培養10天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到3.1kg雷公藤減毒提取物。實施例9稱取雷公藤20kg,粉碎，過60目篩，置於容器中，加入麥麩8kg、豆粉4kg,混合，加入25L的開水，使物料充分混合均勻；將混合物料釆用蒸汽進行滅菌，在105t:條件下滅菌40min,冷卻到35°C時接種佔混合物料總重5%的普通渥堆發酵普洱茶第10天中的發酵物，並添加15L純淨水，混合均句；接菌種後的物料在溫度為25匸，相對溼度為50%的條件下進行培養4天；結東後的混合物料經過乙醇提取，回收乙醇，乾燥得到2.9kg雷公藤減毒提取物。為了便於理解本發明的整體生物轉化效果，下面提供3種轉化產物和雷公藤原藥材進行的藥理、毒理研究結果。實驗例1二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗取18~20g小鼠70隻，雌雄各半，按性別和體重隨機分為7組，見表1。樣品均按15g/kg的原生藥劑量折算成相應的提取物劑量，以比較同等生藥劑量的作用差異。各組動物分別按劑量每曰灌胃給藥一次，對照組分別給予純水和5%乙醇，連續7天，容積均為20ml/kg。末次給藥後30min,於每鼠右耳兩面均勻塗抹二甲苯50pl，左耳不塗為對照。l小時後脫臼處死動物，用8mra打孔器將雙耳同部位等面積切下，稱重、並計算耳腫脹度。結果見表1。表1對二'甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響tableseeoriginaldocumentpage8與純水對照相比P<0.01;與5%乙醇對照相比A，AAP<0.05，0.01結果3種不同轉化後的提取物的抗炎作用均比未轉化者強，以渥堆發酵中的普洱茶和煙麴黴、毛黴混合菌種的轉化提取物的抗炎作用最強，是原藥材的8倍；煙麴黴菌種的轉化總提物是原藥材的2倍。實驗例2DNFB致小鼠遲發性超敏反應實驗取20-22g小鼠96隻，雌雄各半，分組及給藥方法同上，見表2。除空白對照外，其餘動物首次給藥後lh於腹部皮膚均勻塗抹1%DNFB混合液50ul/只致敏，並於第2天加強1次。末次給藥後30min,各鼠右耳兩面均勻塗抹1%DNFB混合液10ul進行攻擊，左耳塗等量混合溶媒。激發後24h脫頸推處死動物，取耳片稱重，以兩耳片重之差作為遲發性超敏反應值。並剖取胸腺和脾臟稱重，計算臟器係數。結果見表2。表2對小鼠遲發性超敏反應的影響tableseeoriginaldocumentpage9由表2可見，以15g/kg的相同生藥劑量連續灌胃給藥7天，對由DNFB誘導的小鼠遲發性超敏反應無明顯抑制作用外。實施例7對脾臟係數有明顯抑制；各組均對小鼠胸腺係數有不同程度的抑制作用，實施例1、實施例7與對照組相比均對胸腺係數有明顯抑制作用。實驗結果表明實施例7對細胞免疫的抑制作用明顯增強，提示其可能為轉化後對免疫作用的物質基礎發生了變化所致。實驗例3小鼠免疫器官係數測定實驗取1820g小鼠70隻，雌雄各半，分組及給藥方法同上，見表3。末次給藥後30min,脫臼處死小鼠，剖取胸腺和脾臟稱重，計算臟器係數。tableseeoriginaldocumentpage9表3對小鼠免疫器官係數的影響與空白相比，P<0.05，0.01結果經轉化後的提取物對免疫器官的抑制作用明顯強於未轉化者，尤其是渥堆發酵中的普洱茶，毛黴、煙麴黴混合為菌種的轉化物，提示轉化產物具有免疫抑制作用。實驗例4小鼠臟器係數測定實驗取18-20g小鼠72隻，雌雄各半，分組及給藥方法同上，末次給藥後12小時，脫臼處死小鼠，解剖取肝、脾臟、腎、胸腺稱重，計算臟器係數。結果見表4。表4對小鼠臟器係數的影響tableseeoriginaldocumentpage10與空白組相比，P<0.05，0.01;與溶媒組相比A,AAP0.05)。綜合評價可得轉化產物對臟器的毒性沒有原藥強，並體現了強的抗炎作用於胸腺抑制有關。實驗例5小鼠的血液生化指標實驗取1820g小鼠72隻，雌雄各半，分組及給藥方法同上，末次給藥後12小時，釆用眼眶取血，並測量血液的生化指標。結果見表5。_表5對小鼠的血液生化指標的影響_tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11結果小鼠的血液生化指標表明，轉化產物與空白相比對白細胞、紅細胞的影響不大(與空白相比P>0.05);轉化產物與空白相比對血小板具有升高的趨勢；煙麴黴發酵物具有降低粒細胞的作用。總體看對血液系統沒有較大的影響。權利要求1、一種雷公藤減毒的方法，包括以下步驟(1)將乾燥雷公藤根莖粉碎過60目篩後，加入雷公藤重量30～60％的麥麩和10～30％豆粉，混合均勻；(2)將佔混合物料總重1～10％的普通渥堆發酵普洱茶第4～10天中的發酵物，或者是佔混合物料總重0.01～0.05％的煙麴黴，或者是佔混合物料總重0.01～0.05％的毛黴與煙麴黴的混合菌種，作為接種物；(3)在混合物料中加入佔物料總重60％～90％的開水，並充分混合均勻，然後在105℃條件下蒸汽滅菌40～120min，冷卻到35℃後，接種步驟(2)所述的菌種或發酵物，再添加佔混合物料總重30％～60％的純淨水，混合均勻；(4)接種後的混合物料再在溫度為25℃～40℃，相對溼度為50～80％的條件下進行培養4～10天，經過乙醇提取，回收乙醇，濃縮乾燥後得到雷公藤減毒提取物。2.根據權利要求l所述的方法，其特徵在於將步驟(2)所述的接種物置於254(TC,相對溼度為50~80°/。的條件下培養4~10天。3、根據權利要求l所述的方法，其特徵在於所述的毛黴與煙麴黴混合的比重為1:1~1:5。全文摘要本發明公開了一種雷公藤減毒的方法，將雷公藤原藥粉末與麥麩、豆粉混合均勻，將普通渥堆發酵普洱茶第4～10天中的發酵物，或是毛黴、煙麴黴作為接種物，在混合物料中加入開水，蒸汽滅菌40～120min，冷卻到35℃後，接種所述的菌種或發酵物，再加入純淨水，在溫度25℃～40℃，相對溼度為50～80％的條件下進行培養4～10天，經過乙醇提取，回收乙醇，濃縮乾燥後得到雷公藤減毒提取物。本發明利用微生物的整體轉化作用，不僅實現了降低毒性的目標，更出現了藥理活性有所增強的效果。由於直接運用了未經提取分離的原料藥材，轉化產物可以直接製成適當劑型為臨床所用，避免了轉化單一活性物質造成的資源浪費。有利於雷公藤生物資源的充分利用和可持續發展。文檔編號A61K127/00GK101361779SQ20081005893公開日2009年2月11日申請日期2008年9月19日優先權日2008年9月19日發明者雲畢,馬偉光,黃之鐠申請人:馬偉光