多功能納米顆粒設計和應用的製作方法

2024-03-29 01:48:05 1

多功能納米顆粒設計和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了用於裝配和實施具有空芯和可密封孔的納米顆粒的方法、結構、裝置以及系統。在一方面，納米顆粒裝置可以包括殼結構和在中空內部區域內包含的物質，該殼結構包括至少兩層，所述至少兩層包括內層和外層，該內層被構造成封閉中空內部區域且包括一個或多個貫穿內層的孔，該外層為多孔材料且在內層周圍形成並密封一個或多個孔，所述物質不能穿過該外層。
【專利說明】多功能納米顆粒設計和應用
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求於2011年4月14日提交的第61/475，649號美國臨時專利申請的優先權，前述專利申請的全部內容通過援引併入本文作為本申請的公開的一部分。
[0003]關於聯邦政府資助的研究或研發的聲明
[0004]在國立衛生研究院所給予的政府支持下(批號CA119335)進行本發明。政府對本發明擁有某些權利。
【技術領域】
[0005]本專利文件涉及納米技術。
[0006]發明背景
[0007]納米技術提供了用於裝配以分子尺度或原子尺度為特徵的結構、裝置和系統的技術或方法，例如在一些應用中的一納米至數百納米的結構。例如，納米尺度的裝置可以配置為尺寸比人細胞小100倍至1，000倍，例如，與一些諸如酶和受體的大生物學分子(生物分子)的尺寸相近。納米尺寸的材料用於創建納米結構、納米裝置或納米系統，其可以展現出以較大尺寸按比例縮放的相同材料中不存在的多種獨特形式，並且可以開發此類性質以用於廣泛的應用。
[0008]發明概述
[0009]描述了用於裝配和實施納米結構或納米顆粒的技術、系統和裝置，所述納米結構或納米顆粒包括空芯和可密封孔。
[0010]在所公開的技術的一方面，裝配顆粒的方法包括將芯顆粒與一個或多個掩蔽顆粒組合以形成模板，其中一個或多個掩蔽顆粒與芯顆粒結合併且覆蓋芯顆粒表面的一個或多個區域，所述一個或多個區域中每一個區域對應於一個或多個掩蔽顆粒中每一個掩蔽顆粒與芯顆粒之間所形成的表面區域，在模板之上形成多孔材料層，其中該層形成在除已覆蓋的一個或多個區域之外的芯顆粒的表面之上，以及移除模板以產生由多孔材料形成的顆粒，該顆粒具有一個或多個在中空的內部區域與顆粒的外表面之間延伸的孔，所述一個或多個孔在外表面上具有基本為所述表面區域尺寸的尺寸，並且分布在顆粒上的一個或多個區域。
[0011]實施可以任選地包括下列特徵中的一個或多個。例如，方法還可以包括將物質通過一個或多個孔裝載入顆粒的內部區域，該物質不能穿過多孔材料，以及在顆粒之上形成允許所選顆粒穿過的外部多孔層，其中外部多孔層密封顆粒的一個或多個孔，從而將物質封閉在顆粒內。
[0012]在另一方面，用於運載負荷的納米顆粒裝置包括殼結構，該殼結構包括至少兩層，所述至少兩層包括內層和外層，內層被構造為封閉中空內部區域並且包括一個或多個貫穿內層的孔，外層在內層周圍形成，其中殼結構包括在中空內部區域內的物質，該物質已通過一個或多個孔進入殼結構並且不能穿過外層。
[0013]在另一方面，納米顆粒裝置包括:殼結構，殼結構被構造為包括在中空內部區域與殼結構的外表面之間延伸的一個或多個孔；以及至少一個中心顆粒，其包含於內部區域內並具有比一個或多個孔中每一個孔的尺寸更大的尺寸，其中一個或多個孔被構造為接收進入內部區域的物質，並且該物質與至少一個中心顆粒結合。
[0014]在另一方面，裝配顆粒的方法包括將芯顆粒與一個或多個掩蔽顆粒組合以形成模板，其中一個或多個掩蔽顆粒與芯顆粒結合併且覆蓋芯顆粒表面的一個或多個區域，該一個或多個區域中每一個區域對應於在一個或多個掩蔽顆粒中每一個掩蔽顆粒與芯顆粒之間所形成的表面區域，在模板之上形成層，其中該層形成在除已覆蓋的一個或多個區域之外的芯顆粒的表面之上，以及移除模板以產生具有一個或多個在中空內部區域與外表面之間延伸的孔的殼結構，該一個或多個孔在外表面上具有基本為所述表面區域尺寸的尺寸，並且分布在殼結構上的一個或多個區域。
[0015]實施可以任選地包括下列特徵中的一個或多個。例如，方法還可以包括將物質通過一個或多個孔裝載入殼結構的內部區域，並且在殼結構之上形成外部層，其中外部層密封殼結構的一個或多個孔並且將所述物質封閉在內部區域內。
[0016]在另一方面，納米顆粒裝置包括殼結構和物質，該殼結構包括至少兩層，所述至少兩層包括內層和外層，內層被構造為封閉中空內部區域並且包括一個或多個貫穿內層的孔，外層為多孔材料且在內層周圍形成並密封所述一個或多個孔，所述物質包含在空芯內部區域內且不能穿過外層。
[0017]可以以特定方式實施本專利文件中所述的主題，所述方式提供了下列特徵中的一個或多個。例如，所公開的納米和微觀結構可以包括具有中空內部的可密封孔的納米顆粒，所述可密封孔可以封裝在中空區域內包含的其他物質。例如，示例的具有可密封孔的中空納米顆粒還可以包括允許所選顆粒或物質傳輸而不允許所封裝的物質傳輸的孔隙。描述了用於裝配所公開的納米顆粒(例如，示例的中空多孔納米顆粒(HPNP))的示例性方法，所述方法例如利用各種材料在納米顆粒的尺寸和滲透性方面提供精確的控制和柔韌性。所述的納米和微觀結構包括示例的特徵，包括例如高表徵表面區域和能夠裝載物質的中空內部，這可使得實施能用於廣泛的應用，例如包括納米醫學、催化作用、光學、廢棄物排除以及諸多其他應用。所公開的納米和微觀結構可以應用於醫療診斷、監控和治療，例如前物-酶治療、酶或基因遞送以及傳感器應用。示例性納米醫學應用可以包括藥物、生物分子和化學品的控制釋放，生物分子和生物活性物質的免疫分離和防護，建造光子晶體模塊，以及廢棄物質的排除。例如，一個或多個大分子或大分子系統可以被封裝在示例性HPNP中，然後被密封，例如，形成密封的中空多孔納米顆粒(SHPNP)，此後，示例性大分子仍然可以與環境保持連通，例如，經由可通過SHPNP的孔隙出入的小分子。
[0018]在一利用所公開技術的應用的實例中，封裝在示例性SHPNP中的示例性大分子可以為能夠信號傳導諸如PH變化的特定事件的發生的分子。當環境中的pH改變時，可以通過示例性封裝的大分子檢測到PH變化，例如，由於離子可以穿過示例性SHPNP的孔隙。例如，在這種配置中，沒有將用於檢測PH變化的示例性大分子引導到環境中，因此不能激活任何免疫反應。類似地，示例性SHPNP可以用於不同的應用，例如，其中所封裝的結構為酶。例如，酶可以被封裝在SHPNP中並且用於激活藥物分子，例如酶一旦與藥物分子結合就激活，否則就失活。使示例性酶在示例性SHPNP內以免於免疫系統，並且示例性SHPNP的外部可以與靶向劑結合以實現與環境內的靶位點特異性結合。一旦具有封裝的酶的示例性SHPNP被遞送到靶位點(例如，腫瘤)，就可以將失活的藥物引入到有機體的血流中(例如，因為藥物是失活的，所以沒有藥物劑量的限制)。另外，例如，因為藥物為小顆粒，因此它可以擴散到許多與靶位點有關的區域。然而，只有在具有封裝示例性酶的SHPNP的區域處才可以激活藥物，例如，該SHPNP可以靶向於特定位點或區域。因此，在這一實例中，藥物只有在靶位點被激活，例如，通過穿過SHPNP孔隙並且與封裝的酶相互作用(例如，激活藥物)，然後通過SHPNP孔隙穿出以治療腫瘤。例如，經由所公開的納米顆粒的藥物遞送可以用於提供穩定性、延長的循環以及靶向。在其他實例中，封裝的負荷可以包括負責激活某些機制的蛋白、其他的納米顆粒、和/或毒性物質，例如，其免於示例性SHPNP所布置的生物環境。
[0019]附圖簡述
[0020]圖1A-1C示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0021]圖2A-2B示出了示例性納米顆粒合成方案的流程圖。
[0022]圖3示出了示例性透射電子顯微鏡(TEM)圖像，該圖像示出示例性中空多孔納米顆粒的結構特性。
[0023]圖4示出了掃描電子顯微照相(SEM)圖像，該圖像展示了對示例性中空納米顆粒特徵的合成自由度。
[0024]圖5A和5B示出了示例性聚集體和所得中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0025]圖5C示出了示例性未密封的和密封的中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0026]圖6示出了利用所公開的密封的中空多孔納米顆粒的示例性實施的例示。
[0027]圖7A和7B示出了示例性中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0028]圖8A-8I示出了示例性中空多孔二氧化矽納米顆粒的電子顯微圖。
[0029]圖9A-9D示出了用以創建密封的中空多孔納米顆粒的示例性裝配過程的示意圖。
[0030]圖1OA和IOB示出了數據圖，該數據圖示出所公開的技術的密封的中芯多孔納米顆粒的活性。
[0031]圖10C-10E示出了顯示示例性納米顆粒的電子顯微圖。
[0032]圖11示出了展示所公開的技術的體內活性的圖。
[0033]圖12示出了數據圖，該數據圖示出與蛋白酶K孵育或不與蛋白酶K孵育的游離蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)青黴素酶的活性。
[0034]圖13示出了數據圖，該數據圖示出與蛋白酶K孵育或不與蛋白酶K孵育的游離海腎(Renilla reniformis)突光素酶的活性。
[0035]圖14示出了數據圖，該數據圖示出蠟樣芽孢桿菌青黴素酶活性的標準曲線。
[0036]圖15示出了數據圖，該數據圖示出與封裝在密封的中空多孔納米顆粒內的蠟樣芽孢桿菌青黴素酶比較，不同濃度的游離蠟樣芽孢桿菌青黴素酶的活性。
[0037]圖16示出了數據圖，該數據圖示出海腎螢光素酶活性的標準曲線。
[0038]圖17示出了數據圖，該數據圖示出與封裝在密封的中空多孔納米顆粒內的海腎螢光素酶比較，不同濃度的游離海腎螢光素酶的活性。
[0039]圖18A和18B示出了例示示例性金屬納米顆粒合成方案的示意圖。
[0040]圖18C示出了示例性中空多孔金納米顆粒的圖像。
[0041]圖19示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0042]圖20示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。[0043]各種圖中相同的標號和命名指示相同的元素。
[0044]詳細描述
[0045]諸如納米顆粒的納米結構可以用於運載作為負荷的化學或生物物質(例如藥物)並且被布置以用於在各種環境中遞送所裝載的物質，所述環境包括生物環境，諸如有機體內。例如，布置在體內環境中的納米結構載體自身可以觸發免疫反應和/或引起毒性問題，例如，這可以歸因於納米顆粒載體材料和/或所裝載的物質材料。在某些情況下，經由納米顆粒的藥物遞送系統可能需要所裝載的物質的修飾，這可能降低所裝載的物質的所需功倉泛。
[0046]描述了用於裝配和實施包括空芯和可密封孔的納米顆粒的技術、系統和裝置。
[0047]所公開的納米顆粒和納米顆粒系統可以包括基於中空納米顆粒的載體平臺，所述載體平臺能夠封裝和保護納米顆粒內部區域內的物質，例如通過可密封孔。例如，基於所公開的納米顆粒的載體平臺可以包括中空多孔納米顆粒，所述納米顆粒能夠封閉分子負荷，以使其在空芯內而躲避免疫系統，同時允許所封閉的負荷在期望的環境中受控地相互作用，例如，經由通向納米顆粒內部區域的在表面上的孔隙。例如，示例性中空多孔納米顆粒可自身為生物相容的，但包裹非生物相容性負荷。例如，將所公開的納米顆粒和納米顆粒系統用於某些應用的實施可以消除修飾有效負荷物質的需要，當布置有機體中時避免觸發不期望的免疫反應，允許納米顆粒的柔性表面功能化(例如用於靶向)，或延長納米顆粒的循環壽命(與所裝載的物質無關)。還例如，所公開的納米顆粒和納米顆粒系統還可以包括基於中空無孔納米顆粒的載體平臺，所述載體平臺能夠通過可密封孔來封裝和保護納米顆粒內部區域內的物質並且將所封裝的物質釋放入納米顆粒所布置的環境中，例如，其中可密封孔可以溶解並且將負荷釋放到入所布置的環境中。在其他實例中，所公開的納米顆粒和納米顆粒系統可以包括基於中空納米顆粒的載體平臺，所述載體平臺能夠通過可密封孔來封裝和保護納米顆粒內部區域內的物質並且將所封裝的物質釋放入納米顆粒所布置的環境中，例如，其中納米顆粒可以溶解並且將負荷釋放入所布置的環境中。
[0048]在一方面，所公開的技術包括裝配技術，其可以用於創建具有可密封孔和小孔隙(各自為可控尺寸)的納米尺度結構(例如，諸如納米籠或納米殼的顆粒)，例如，其中結構可以封裝內部區域內所包含的其他物質。描述了裝配方法，其可以產生具有配置為可控尺寸的孔的中空多孔納米顆粒(HPNP)，例如所述可控尺寸可以允許其他的物質或顆粒(例如大分子)進入到中空內部。所述的裝配方法包括密封HPNP的孔的技術，例如，形成密封的中空多孔納米顆粒(SHPNP)，其可以封閉SHPNP內所裝載的物質或顆粒。例如，為裝配HPNP，芯顆粒被用作起始模板材料，例如，其可以為任何形狀的形式，包括球體、圓錐、棒、長方體、管，以及其他形狀。掩蔽顆粒可以結合模板材料的外表面，例如通過分子間相互作用。可以通過將塗覆材料應用到形成芯殼納米顆粒的模板材料周圍，從而形成多孔殼。然後，可以去除芯和結合的掩蔽顆粒，例如通過溶解或煅燒或其他類似方法，其中多孔外殼得到保留。這一過程的實施可以形成中空多孔納米顆粒，並且其他分子可以被封裝在所產生的納米顆粒的內部之內。例如，所述的裝配方法可以包括裝載和完全密封孔的技術，例如，一旦將示例性大分子封裝在內部，則使多孔殼顆粒能夠作為負荷的載體。例如，不依賴於納米顆粒尺寸的大小，可以調節孔的尺寸。例如，所述的裝配方法可以包括獨立地調節孔隙尺寸的技術。
[0049]描述了基於示例性模板的技術，該技術可以使用各種材料(例如包括聚合物、陶瓷和金屬)來製備具有單分散尺寸的HPNP，例如，芯顆粒直徑範圍從幾十納米到微米。基於示例性模板的技術可以用於沿著中空顆粒殼產生可控尺寸的表面孔，例如，孔直徑範圍從幾納米到數十或數百納米。所述的裝配技術可以提供HPNP滲透性的獨立控制。例如，可以通過控制殼材料的多孔性來配置HPNP的滲透性，例如，產生的孔隙的尺寸範圍可以從幾納米到數納米(a few to several nanometers)。例如,納米孔隙尺寸可以導致大分子擴散入/出HPNP的相對較低的滲透性，例如，避免酶、蛋白或較大的生物活性物質擴散穿過HPNP，但仍然允許較小的物質擴散穿過孔隙。例如，描述了利用二氧化矽和金HPNP的示例性實施，其例示了對顆粒尺寸和表面多孔性的精確控制。可以修改所述的裝配技術來產生不同材料的HPNP，例如，包括但不限於，基於鈣的納米顆粒，諸如磷酸鈣或鈣塗覆的顆粒、氧化鐵納米顆粒，以及其他材料。例如，裝配不同材料的HPNP可以提供可適用於特定所需應用的HPNP性質的設計。
[0050]示例性技術可以包括在具有不同化學和物理性質的表面上的膠體制模反應(templating reaction)。例如,殼材料層在具有由較小的掩蔽膠體顆粒所封閉的表面部分的膠體顆粒模板上生長。隨後，通過諸如煅燒和/或溶解的方法去除模板和掩蔽顆粒，從而留下在表面上具有開放的孔的中空顆粒。例如，顆粒的總尺寸由模板顆粒來決定。例如，可以通過改變掩蔽顆粒的尺寸來調節孔的直徑，並且可以通過模板和掩蔽顆粒的相對摩爾濃度來控制顆粒表面上的孔的數量。
[0051]所公開的技術包括用於裝配具有空芯、多孔表面和可密封孔的納米顆粒的幾個方案。圖1A-1C示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0052]圖1A示出了過程110的實例，其中掩蔽顆粒115與一個或多個芯或模板顆粒111混合在一起。例如，掩蔽顆粒115可以是配置為具有表面電荷、例如負表面電荷的納米顆粒。例如，掩蔽顆粒115還可以包括具有功能化外表面116的顆粒，例如具有表面電荷。例如，示例性掩蔽顆粒115可以為聚苯乙烯納米顆粒，並且示例性功能化表面116可以為羧化功能層。例如，模板顆粒111可以是配置為具有與掩蔽顆粒115的表面電荷的極性相反的表面電荷、例如正表面電荷的納米顆粒。例如，模板顆粒111還可以包括功能化外表面112。例如，示例性模板顆粒111可以為聚苯乙烯納米顆粒，並且示例性功能化表面112可以為胺功能層。例如，一旦將示例性羧化掩蔽顆粒115與胺化模板顆粒111混合，則羧化顆粒115可以與胺化模板顆粒111結合。
[0053]圖1A還示出了例如通過靜電相互作用來使具有羧化功能化表面116的掩蔽顆粒115與模板顆粒111的胺化功能化表面112結合的過程120的實例。例如，當示例性羧化顆粒115具有帶負電荷的表面時，它們排斥負離子並且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應，例如，封閉示例性胺化模板顆粒111的外表面的某些帶正電荷的區域。在其他實例中，過程120可以包括通過其他顆粒吸引方式來使掩蔽顆粒115與模板顆粒111的表面112結合，例如，所述顆粒吸引方式包括但不限於氫鍵、共價鍵、磁吸引、疏水性相互作用等。
[0054]圖1A還示出了將層131添加至掩蔽顆粒115—模板顆粒111複合體的過程130的實例。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至包含與模板顆粒111結合的掩蔽顆粒115的溶液。示例性溶膠凝膠反應可以只發生在沿著模板顆粒111的表面112的帶正電荷的區域中，例如沒有被掩蔽顆粒115覆蓋或封閉的區域。例如，過程130可以用覆蓋層131覆蓋模板顆粒111暴露的表面，而不覆蓋存在掩蔽顆粒115的位置。例如，覆蓋層131可以為多孔的材料。例如，層131可以為一種材料(例如二氧化矽)，以使過程130可以產生形成在模板顆粒111表面上的多孔層。例如，過程130中的溶膠凝膠試劑的添加可以啟動二氧化矽生長，例如根植於示例性胺化功能化表面112的氨基。例如，覆蓋層131還可以為無孔材料。在某些實例中，過程130可以包括通過其他方式將層131添加至掩蔽顆粒115—模板顆粒111複合體，例如所述方式包括但不限於基於材料的排他性、或氧化還原化學，以及其他技術，所述氧化還原化學只在一顆粒(例如模板顆粒111)的表面上而不在其他顆粒(例如掩蔽顆粒115)的表面上形成層131。用作覆蓋層的示例性材料可以包括多孔的或無孔的材料，或可降解的材料(例如，其可以在某些環境中或在特定條件下或通過示例性觸發而溶解或降解，例如，條件和/或觸發包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他條件和/或觸發)。
[0055]另外，圖1A示出了例如通過移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115而形成中空納米顆粒的過程140的實例。例如，一旦形成了具有期望厚度的層131，則例如通過各種方法，包括通過溶劑將它們溶解、煅燒、熔融、或燃燒、或這些方法或其他相似方法的組合來移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115。例如，過程140可以包括將二甲基甲醯胺(DMF)、丙酮、或其他溶劑和/或熱引入到層覆蓋的掩蔽顆粒115—模板顆粒111複合體。例如，過程140的實施產生了 HPNP，所述HPNP包括具有孔145的空(empty)的或中空的多孔殼141和空的或中空的內部142，例如，當層131由多孔材料形成時。在某些實例中，可以實施過程140以形成中空無孔納米顆粒，例如，通過移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115。例如，可以通過將示例性無孔材料用作覆蓋層131來實施過程130，從而形成中空無孔納米顆粒。在此類實例中，示例性殼141為中空無孔殼。
[0056]一旦創建了示例性HPNP，則它們可以裝載有其他物質並且進行密封以封裝所裝載的物質。
[0057]圖1B示出了用於將負荷顆粒151裝載入殼結構141的中空內部區域142中的過程150的實例。例如，通過將高濃度的負荷物質的溶液添加至殼結構的溶液，可以使殼結構(例如HPNP)的溶液裝載有負荷物質。可以通過幾種方法之一來實施過程150。例如，負荷顆粒151可穿過孔145而擴散入殼結構141中。在其他實例中，負荷顆粒151可通過包括例如電泳力在內的非擴散方式穿過它們的孔145而進入殼結構141的內部區域142。將各種類型的材料用作負荷，可以實施過程150以用於各種應用，所述材料例如包括但不限於藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶、激素、和/或其他蛋白、糖蛋白、糖脂、碳水化合物、脂質、核酸、適配子、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。
[0058]在用負荷顆粒151裝載殼結構141之後，可以密封孔145。圖1C示出了過程160和170，所述過程示出例如通過密封示例性HPNP141的孔145而形成密封的中空多孔納米顆粒175，其將負荷顆粒151封閉在中空內部區域142內。在該實例中，可以用所示為層171的其他的多孔材料(例如二氧化矽)層來密封孔145。在其他實例中，可以用其他的無孔材料層(例如，金屬層或其他無孔材料)(其也可以由層171表示)來密封孔145。
[0059]過程160可以包括用層161 (例如，大的帶正電荷的聚合物，諸如聚-L-賴氨酸(PLL))部分地覆蓋孔145。例如，PLL聚合物可以在示例性HPNP141的表面和孔145之上創建網格狀結構。過程170可以包括在示例性HPNP141內密封負荷顆粒151以形成密封的中空多孔納米顆粒175。例如，過程170可以包括在示例性PLL覆蓋的HPNP141之上形成層171。例如，溶膠凝膠試劑的進一步添加可以在覆蓋孔145的初始層(例如，層161)的頂部上創建另一層(例如，層171)，例如，通過在示例性PLL聚合物上的成核位點，由此形成示例性SHPNP175。例如，示例性負荷顆粒151可以被永久地密封和封閉在示例性SHPNP175內部。在某些實例中，在不實施過程160的情況下，可以實施過程170以形成示例性密封的中空多孔納米顆粒175，例如，通過直接在示例性殼結構141之上形成層171。在某些實例中，將示例性無孔材料用作覆蓋層131，通過實施過程160和170，可以形成密封的中空無孔納米顆粒。在此類實例中，示例性殼141為中空無孔的殼(例如，具有在中空內部區域142內的負荷顆粒151)，所述殼141可以覆蓋有層161 (例如，大的帶正電荷的材料，在示例性殼結構141和孔145之上形成網格狀結構)，並且通過在示例性層161覆蓋的殼結構141之上形成層171，可以密封孔145(例如，將負荷顆粒151封閉在示例性殼結構141內)，由此形成示例性密封的中空納米顆粒175。在該實例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和多孔層171，例如，其中小的顆粒或物質可以進出示例性納米顆粒175。在此類實例中，在不實施過程160的情況下，還可以實施過程170以形成示例性密封的中空納米顆粒175，例如通過直接在示例性殼結構141 (例如，裝載有在中空內部區域142內的負荷顆粒151)上形成層171。
[0060]例如，過程170可以包括可基於所需應用來確定用於層171的材料。在某些實例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括多孔層141和多孔層171。在其他實例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和多孔層171。在其他實例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括多孔層141和無孔層171。以及在其他實例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和無孔層171。
[0061]示例性負荷顆粒151可以包括可降解的材料(例如，其在某些環境中或在特定條件下或通過示例性觸發而溶解或降解，例如條件和/或觸發包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他的條件和/或觸發)。例如，可以在特定環境中布置示例性密封的中空納米顆粒175負荷顆粒151，其中示例性負荷顆粒151(例如，為可降解材料)可以經受降解(例如，基於特定環境的條件)並且通過示例性SHPNP175的孔隙而被釋放到顆粒外，或在某些實例中，與示例性密封的中空納米顆粒175的降解相組合。
[0062]將具有氨基官能團的聚苯乙烯納米顆粒用作示例性模板顆粒並且將具有羧基官能團的聚苯乙烯納米顆粒用作示例性掩蔽顆粒，可以實施圖1A所述的示例性裝配過程。例如，氨基官能團為帶正電荷的，並且可以促進示例性裝配過程中所用的化學過程。在某些實例中，示例性溶膠凝膠試劑需要帶正電荷的成核位點，可以通過胺化功能化表面來提供所述成核位點。將諸如囊液(vesicular solution)、膠體、乳滴和聚合物的材料用作模板以用於形成靶材料的層或其前體，可以實施示例性HPNP的裝配。例如，利用用作前體的矽酸，可以實施示例性裝配過程。例如，矽酸向溶液給予將帶負電荷的含矽的離子。這些示例性帶負電荷的離子被帶正電荷的模板納米顆粒表面吸引。例如，可以將二氧化矽選作掩蔽的模板表面之上的覆蓋層材料；例如，二氧化矽的性質可包括可調節的多孔性、熱力和機械穩定性、低密度、高比表面積、以及生物可相容性和生物可降解性，這些可為基於醫學和生物學的應用中重要的性質。
[0063]裝配示例性二氧化矽HPNP以用於所公開的技術的示例性實施。例如，胺官能化的聚苯乙烯納米顆粒(APNP)可以用作模板，該模板用於納米多孔二氧化矽溶膠凝膠網絡的成核生長。例如，在水溶液中水解四甲氧基矽烷(TMOS)，從而產生矽酸，其用作用於在顆粒表面上的縮聚反應的前體。下列的示例性化學反應描述了娃酸的縮聚反應的起始階段，產生了二氧化矽層的生長。
[0064]Si (OCH3) 4+4H20 — Si (OH) 4+4H0CH3+40H ^
[0065]Si (OH) 4+0H- — Si (OH)3CT+H2O
[0066]Si (OH) 4+Si (OH)3CT — (HO)3S1-O-Si (OH) 3+0H_
[0067]例如，示例性裝配過程可以包括在水溶液中將APNP與羧基官能化聚苯乙烯乳膠納米顆粒(CPNP)混合(例如，圖1A的過程110所例示)。示例性APNP和CPNP可以聚集在一起，例如，由於官能團的靜電相互作用(例如，圖1A的過程120所例示)。例如，在溶液中，帶有相反電荷的表面官能團的示例性顆粒相互吸引。例如，與酸性羧基官能化表面比較，胺官能化表面創建了更有效率的用於鹼催化的矽膠生長的成核位點。在接觸點處，CPNP用作帶負電荷的納米掩模(nanomask)以用於在顆粒表面上的溶膠凝膠反應。示例性裝配過程可以包括將矽烷添加至待水解的溶液並且產生矽酸，例如，其用作二氧化矽層的前體。例如，APNP上的鹼性胺基可以有效地模塑(template)矽膠生長，而CPNP上的酸性羧基可以掩蔽與APNP的接觸點的反應(例如，圖1A的過程130所例示)。示例性裝配過程可以包括例如通過煅燒或溶解來去除APNP和CPNP。一旦形成具有所需厚度的二氧化矽層，則通過溶解或煅燒來去除聚苯乙烯顆粒，留下二氧化矽HPNP結構(例如，圖1A的過程140所例示)。在某些實例中，示例性裝配過程可以包括利用渦旋混合和溫和超聲處理而在水中再懸浮和分散HPNP。例如， 煅燒後的最終顆粒直徑可為初始500nm模板APNP的直徑的約85%，這可能與在加熱或用無水溶劑的萃取期間，矽膠羥基的部分脫水有關。
[0068]例如，可以實施裝配過程以產生具有允許小分子通過的孔隙的二氧化矽殼顆粒(例如，圖1A中的HPNP141和圖1C中的SHPNP175)。然而，大的分子負荷(例如，圖1C所示的負荷顆粒151)不能通過孔，因此被密封在顆粒內。可存在能夠基於所需應用的該示例性裝配技術的其他各種變體(圖1A-1C中所述的)。例如，HPNP可由金屬(例如金)形成，或可存在形成HPNP的不同材料的多個或多個不同的層，例如，金屬的第一內層和聚合物的第二外層(例如二氧化矽)。可以由模板顆粒的尺寸來確定顆粒的尺寸，並且可以由封閉或掩蔽顆粒的尺寸來確定孔的尺寸。可以相互獨立地配置所公開的中空多孔納米顆粒的尺寸和它的孔的尺寸。另外，可不依賴於HPNP的尺寸和它的孔的尺寸來配置HPNP的多孔性。
[0069]圖2A-2B示出了示例性合成方案的流程圖，所述合成方案產生了中空多孔納米顆粒和密封的中空多孔納米顆粒。圖2A示出了流程圖200，所述流程圖200包括將納米掩模顆粒結合於芯顆粒的過程201，在納米掩模結合的芯顆粒之上形成層的過程202，以及例如通過去除納米掩模顆粒和芯顆粒來形成包括孔的中空多孔殼顆粒的過程203。圖2B示出了流程圖210，所述流程圖210包括通過孔將分子或其他物質裝載至中空多孔殼顆粒的過程211和密封中空多孔殼顆粒的孔以在內部封閉所裝載的分子或其他物質的過程212。
[0070]所公開的技術的示例性裝配方法獨立地提供了對納米多孔性和顆粒直徑的精確控制。例如，示例性裝配方法可以應用於廣泛的可通過溶膠凝膠合成路線而獲得的材料。另外，示例性裝配方法可以應用於包括基於金和氧化還原化學過程在內的不同化學過程，例如，將HPNP的適用性擴展至廣泛的應用。
[0071]例如，利用四甲氧基矽烷(TMOS)溶液來應用示例性裝配方法，所述四甲氧基矽烷獲取自Aldrich-Sigma Ltd。示例性化學物質被原樣使用(used as received)。例如,胺官能化聚苯乙烯球獲取自Polysciences, Inc,以及羧基官能化聚苯乙烯乳膠顆粒獲取自LifeTechnologies, Inc。
[0072]所公開的技術的示例性實施包括製備中空多孔二氧化矽納米球。例如，50iiL模板顆粒溶液與相應量的掩蔽顆粒溶液混合以製備所需的顆粒濃度比例。振蕩所得的混合物過夜並且向溶液添加IOOOiI L無水乙醇。為了產生二氧化矽前體並啟動二氧化矽生長，向溶液添加1000 的四甲氧基矽烷。振蕩混合物過夜，並且通過離心分離(例如5分鐘，14000rpm)來收集懸浮顆粒，用去離子水洗滌數次，並在蓋玻片上真空乾燥過夜。為除去有機化合物，將運載納米顆粒粉末的蓋玻片置於熱板之上並且在450°C下煅燒過夜。煅燒的粉末被轉移至管，並且懸浮在水中(例如50UL)並通過溫和超聲處理而分散。
[0073]所公開的技術的示例性實施包括製備密封的中空多孔二氧化矽納米球。例如，將
4ii L的lOmg/mL酶溶液添加至50 y L示例性中空多孔二氧化矽納米球溶液並孵育過夜。用1000 u L磷酸鹽緩衝鹽水和50 u L0.1%的具有150-300kDa分子量的聚-L-賴氨酸稀釋示例性溶液。例如，可以稀釋溶液以防止聚集。以74:500的體積比將TMOS添加至ImM HC1，並且混合幾分鐘以產生矽酸溶液。在稀釋後立即將25 y L示例性矽酸溶液添加至以上多孔二氧化矽納米球溶液，並且振蕩I小時,從而例如產生密封的中空多孔二氧化矽納米球。稍後，通過離心分離(例如，5分鐘，14000rpm)來收集懸浮的密封的中空多孔二氧化矽納米球，並且用水洗滌幾次。在37°C下，以在IX磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溶液中為0.lmg/mL的濃度，將樣品暴露於蛋白酶-K酶過夜，隨後通過離心分離(例如，5分鐘，14000rpm)，再用IX PBS連續洗滌以除去蛋白酶-K。所述的方案可以用於有效負荷物質的封裝。例如，示例性實施中所利用的有效負荷物質包括青黴素酶和海腎(Renilla reniformis)螢光素酶,例如,其被封裝在示例性中空多孔二氧化矽納米球內。
[0074]例如，來自臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的青黴素酶獲取自Sigma-AldrichC0.LLC0 CCF2-AM 獲取自 Life Technologies, Inc., San Diego, California, USA。兔多克隆生物素化抗體獲取自GeneTex, Inc.(San Antonio, Texas, USA)。所有的突光強度都在Infinite200Pro (TECAN, Switzerland)上測量。
[0075]所公開的技術的示例性實施包括中空二氧化矽納米球的製備，其中實施了與所述中空多孔二氧化矽納米球的裝配方案類似的裝配方案，但省略了納米掩模。
[0076]所公開的技術的示例性實施包括用Cy5標記青黴素酶。例如，Cy5馬來醯亞胺被用作標記劑以用於例示所述方案的示例性實施。例如，以10mg/mL濃度，將Img青黴素酶溶解於100 u L脫氣的PBS緩衝液。例如，在脫氣的溶劑/緩衝液中，在氮氣下進行硫醇修飾。將示例性溶液在室溫下保持30分鐘左右。將約100摩爾的過量的TCEP添加至示例性溶液。小瓶用氮氣衝洗，加蓋，徹底地混合。在室溫下孵育該反應10分鐘。將IOOiig Cy5馬來醯亞胺溶解在2 UL 二甲基甲醯胺(DMF)中，並將其添加至酶溶液。小瓶再次用氮氣衝洗，力口蓋，徹底地混合。在室溫下孵育該反應2小時，同時每隔30分鐘進行混合。最終，將反應在2_8°C下保持過夜。稍後，通過分子量截留為7kDa的脫鹽柱來除去未結合的染料。
[0077]通過409nm的激發來測量在100%正常小鼠血清中的活性，作為藍色螢光(447nm)與綠色螢光(520nm)之比的增加的初始速率。
[0078]通過測量620nm激發和665nm發射的螢光強度來檢測酶載量(例如示例性Cy5標
記的青黴素酶)。[0079]以下列示例性方式測量抗體結合。例如，用生物素基團功能化抗青黴素酶。將具有鏈黴親和素的Alexa488染料添加至所有的樣品，隨後連續的洗滌。在480nm激發和530nm發射處進行螢光強度測量。
[0080]所公開的技術的示例性實施包括體內活性測量，以下列示例性方式製備和進行所述體內活性測量。例如，BALB/c小鼠用於示例性實施。例如，用IOOyL海腎螢光素酶(RenLuc)酶肌內注射一小鼠，所述海腎螢光素酶被密封的中空多孔二氧化矽納米球溶液封裝。以5.68X IO12個顆粒/mL濃度，將示例性密封的中空多孔二氧化矽納米球懸浮在IX磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。例如，用IOOii L的g/mL濃度的游離RenLuc肌內注射其他小鼠。游離RenLuc被懸浮在IX PBS中。5分鐘後，將10 y g苄基-腔腸素(benzyl-coelenterazine)靜脈給予入每一小鼠的側面尾靜脈中。將10 ii g節基-腔腸素溶解於95%酒精中，並用IX PBS稀釋到酒精的最終濃度為10%。給予小鼠異氟烷，並且通過2秒的暴露來測量靜脈注射後的每一小鼠的發光強度。
[0081]所公開的技術的示例性實施包括納米結構的表徵。例如，在FEI/PhilipsXL30FEG ESEM上進行SEM測量，並且在IOkV加速電壓的FEI SFEG UHR SEM(例如，在加州大學聖地牙哥分校，Calit2Nano3設施)上進行超高解析度(UHR)SEM測量。使用FEI Technai Sphera200kV(例如，加州大學聖地牙哥分校，冷凍電子顯微鏡)獲取TEM圖像。在200kV下操作的日立HD-2000儀器用於掃描透射電子顯微鏡(STEM)圖像。來自 Xenogen Corporation (Alameda, California)的 IVIS 成像系統 200 系列(ImagingSystem200Series)用於體內發光測量。
[0082]描述了所進行的示例性實施，所述實施例示了利用所公開的技術的裝配技術，對示例性二氧化矽中空多孔納米顆粒的顆粒直徑、孔徑和孔濃度的精確控制。例如，所公開的裝配技術的穩健性(robustness)和靈活性提供了在許多領域的各種通用的和獨特的應用中實施所裝配的納米顆粒的能力。
[0083]圖3展示了揭示所產生的孔的結構的高解析度電子顯微圖。圖3示出了示例性透射電子顯微鏡(TEM)圖像301、302、303和304，所述圖像展示了示例性HPNP的結構性質。例如，將500nm APNP用作模板顆粒和將IOOnm CPNP用作掩蔽或封閉顆粒，可以產生示例性HPNP。圖301示出了示例性HPNP的表面特徵的近貌圖，例如，通過掃描透射電子顯微鏡(STEM)的次級電子模式所採集的，所述近貌圖揭示了在模板與掩蔽顆粒的接觸點處所形成的30±10nm孔的形成。圖302示出了示例性HPNP的TEM圖像，所述TEM圖像展示了孔結構和二氧化矽殼的厚度。圖303示出了 SEM顯微圖，例如，用超高解析度模式所採集的，所述SEM顯微圖從內部視角示出了整個殼的開放孔結構和殼的厚度。圖304示出了寬場電子顯微圖，例如，通過STEM的透射模式所採集的，所述電子顯微圖示出了示例性均勻HPNP的單分散性和均勻度。例如，圖3的圖像示出了在兩個顆粒之間的接觸點周圍完全防止二氧化矽的形成，並且由所得顆粒的表面形貌來反映掩蔽CPNP表面的曲率。例如，利用500nmAPNP模板且TMOS與APNP重量比為3:1的示例性合成可以產生25nm厚度的二氧化矽殼。該厚度可與產生穩定顆粒有關。
[0084]圖4示出了掃描電子顯微鏡(SEM)圖像401、402、403和404，所述圖像展示了對示例性HPNP特徵的合成自由度。圖401示出了示例性HPNP表面，所述表面展示出約25-30個孔，例如通過利用500nm APNP模板顆粒和IOOnm CPNP掩蔽顆粒且APNP與CPNP數量比為1:30而製備的。圖402示出了示例性HPNP表面，所述表面展示出約10-15個孔，例如通過利用相同的模板和掩蔽顆粒且APNP與CPNP數量比為1:15而製備的。圖403示出了通過SEM所採集的利用500nm APNP和40nm CPNP所獲取的HPNP的顯微圖。圖404示出了利用200nm APNP和40nm CPNP所產生的HPNP的SEM圖像。插圖405示出了這些示例性顆粒的更高解析度的近貌TEM顯微圖，例如，其中示例性箭頭表示在顆粒表面上的孔。圖401、402、403和404所示的示例性比例尺代表IOOnm,以及插圖405所示的示例性比例尺代表50nm。
[0085]所公開的裝配程序可以包括在產生HPNP中的多重自由度。例如，示例性裝配過程可以包括控制表面上的孔的數量(例如，圖402所例示的)，孔的直徑(例如，圖403所例示的)和總顆粒尺寸(例如，圖404所例示的)。例如，通過APNP與CPNP的相對摩爾濃度可以控制表面上的孔的平均數量。圖401和402中的SEM顯微圖示出，當溶液中APNP與CPNP摩爾比率分別為1:30和1:15時，表面上的孔分布。APNP與CPNP的示例性摩爾比率可以產生約25-30個孔/顆粒(對1:30比率而言)和約10-15個孔/顆粒(對1:15比率而言)。
[0086]例如，通過選擇不同直徑的掩蔽CPNP可以調節表面上所創建的孔的尺寸(例如孔直徑)，這與HPNP的總直徑無關。圖401所示的HPNP的示例性孔尺寸包括30±6nm直徑的孔，例如在500nm APNP上利用IOOnm直徑的CPNP所創建的。圖402所示的HPNP的示例性孔尺寸包括20±3nm直徑的孔洞，例如在500nm APNP上利用60nm直徑的CPNP所創建的。可以配置直徑約20nm的示例性CPNP以產生具有直徑為幾納米的孔的HPNP。
[0087]例如，HPNP的總尺寸取決於模板顆粒尺寸。可以在廣泛的尺寸範圍內，例如在約30nm至幾個微米的範圍內，配置示例性APNP以製備HPNP。例如，模板移除後，由500nm APNP模板創建的HPNP可以收縮約15%，例如，產生了 430nm直徑的HPNP (如圖401中示例性HPNP所示)。然而，例如，隨著改變APNP模板顆粒尺寸，收縮的百分比不是恆定的；在示例性實施中，通過利用200nm APNP和40nm CPNP所裝配的HPNP產生了 150nm的總顆粒尺寸，這相當於煅燒後收縮了約25%(如圖404中示例性HPNP所示)。例如，當使用較小的顆粒時，由脫水的羥基與總二氧化矽體積的較高的相對體積比率可解釋收縮增加。示例性模板和掩蔽顆粒組合產生的孔為初始掩蔽顆粒直徑的約25-35%，例如，通過較小的尺寸而略微減少。例如，對較小的納米掩模而言，略微的減少可與增加表面曲率以產生更小的接觸點有關。例如，150nm HPNP的插圖405中所示的更放大的且更高解析度的TEM顯微圖包括指示在顆粒表面上的孔的箭頭。例如，在利用200nm APNP/40nm CPNP對所裝配的HPNP上所形成的孔的直徑為12±2nm。
[0088]圖5A示出了示例性聚集體的SEM圖510,所述示例性聚集體是通過500nm APNP作為模板顆粒和IOOnm CPNP作為掩蔽或封閉顆粒所形成的。圖5B示出了利用圖510中顆粒框架的所得示例性HPNP的SEM圖520。圖510和520所示的示例性比例尺代表200nm。
[0089]圖5C示出了示例性未密封的HPNP(圖531所示)和密封的中空多孔的納米顆粒(SHPNP)(圖532所示)的SEM圖像。圖5C所示的示例性比例尺代表IOOnm0
[0090]可以在各種應用中實施所公開的多孔納米顆粒，所述應用包括不可能通過任何其他方法的非常獨特的應用。例如，非人源的酶可用於各種治療應用。然而，產生了針對這些異種蛋白的免疫反應、以及內吞細胞器和新陳代謝清除的器官之內的蛋白水解，並且可以阻礙它們的治療功能。
[0091]在另一方面，所公開的技術可以包括基於多孔殼的納米載體平臺，所述平臺可以封裝並保護來自於可能使貨物的所需功能受損的抗體、蛋白酶和其他生物分子的異種大分子貨物(cargo)。所述的基於多孔殼的納米載體平臺也可以稱作HPNP。例如，基於多孔殼的納米載體平臺可以包括能夠高容量裝載未修飾的大分子的包括孔(例如介孔)的中空球狀納米殼，其中隨後可以用納米多孔材料密封所裝載的顆粒，所述納米多孔材料仍然允許小分子易於擴散進出，但是阻止大分子進入或離開。基於所述的密封多孔殼的納米載體平臺也可以稱作SHPNP。
[0092]示例性SHPNP可以應用於體內醫療診斷、監測和治療，例如酶-前藥治療、酶替代治療、基於腫瘤營養物的酶消耗的治療以及體內生物傳感。例如，因為SHPNP可以被配置為薄的中空納米殼，所以引入最少的無機物質，同時使體內負荷容量最大。例如，可以實施所公開的SHPNP以防止針對它們的異種酶貨物的免疫反應並且使它們免於蛋白水解。在該示例性實施中，SHPNP可以包括在它們表面上的納米孔(例如<2nm直徑)，以使底物觸及空芯內部內所封裝的酶，與酶相互作用及被酶修飾，以及擴散出(如圖6所例示的)。
[0093]圖6示出了示意圖600，例示了所公開的密封中空多孔納米顆粒的示例性實施，所述納米顆粒已裝載了用於酶-前藥治療應用的酶貨物。圖600示出了密封中空多孔納米顆粒611，其將酶615封閉在它的中空內部內以與前藥分子616相互作用，相互作用發生在SHPNP611之內。例如，在SHPNP611內部保護所封閉的酶615以例如免於免疫系統或SHPNP611所布置的環境中的其他物質。例如，因為顆粒表面為多孔的，所以前藥分子616可以擴散入SHPNP611並且隨後與酶615相互作用，例如，被描述為前藥-酶複合體617。例如，酶615可以用於激活前藥分子616，例如，否則其是失活的。前藥-酶複合體617處的酶615與前藥616之間的相互作用可以導致激活的藥物626的形成。激活的藥物626可以從SHPNP611擴散出並且隨後與藥物所要處理的靶標相互作用。
[0094]SHPNP611的示例性實施可以包括在活體中布置以用於治療性藥物遞送。例如，SHPNP611的外表面可以結合靶向劑，例如以能與環境內的靶向位點特異性結合。例如，一旦將具有已封裝的酶615的SHPNP611遞送到靶位點(例如腫瘤)，則可以將失活的藥物(例如前藥616)引入有機體的血流中。儘管可以將前藥616暴露在有機體內多個區域，但前藥616僅可以在具有示例性酶封裝的SHPNP611的區域處被激活，例如，所述前藥616可以靶向於該特定位點或區域。因此，在該實例中，只在靶位點處激活前藥616，例如，通過穿過孔隙移動進入SHPNP611並且與封裝的酶615相互作用(例如激活前藥616)，之後將激活的藥物626通過孔隙移動出SHPNP611以處理示例性腫瘤。
[0095]利用前述的和圖1A-1C中所示的技術可以裝配示例性SHPNP的裝配(例如圖600所例示的)，例如，其包括高產率和可擴展的利用納米掩模的合成方法，阻止在部分殼表面上進行制模反應。例如，所述的裝配技術導致在HPNP和SHPNP中形成介孔(例如，範圍為2-50nm)以用於有效裝載較大的分子,例如酶。例如,示例性HPNP可以由表面上帶有介孔的納米多孔材料的殼製成，其允許大的生物分子擴散入顆粒的中空內部空間。例如，一旦裝載了目標大分子，則可以用納米多孔殼材料(例如用於形成HPNP的相同的材料)密封介孔，因此形成了負荷的SHPNP。
[0096]例如，還可以功能化示例性SHPNP的表面以用於靶向和改善的循環半衰期。SHPNP的示例性另一功能化可以消除對所裝載的物質進行任何修飾的需要。例如，在這些條件下，可以遞送隱匿的SHPNP到靶向區域並且允許連續且可控的底物通路以與SHPNP的受保護的環境內的酶貨物相互作用，例如使它們成為用於體內酶遞送的理想治療平臺以用於包括癌症在內的疾病的前藥治療。
[0097]中空多孔納米顆粒的示例性SEM圖像示於圖7A和7B中，例如，其例示了所述HPNP合成技術的實施，例如先前圖1A-1C中所述的。圖7A示出了聚集的APNP和CPNP的SEM圖710。例如，CPNP與較大的APNP混合，並且具有帶相反電荷的表面官能團的CPNP和APNP在溶液中相互吸引，引起聚集。圖710例示了用於示例性HPNP合成技術的框架，所述框架示出500nm APNP和IOOnm CPNP0例如，胺官能化表面的鹼性性質可以創建與酸性羧基官能化表面相比更有效率的用於鹼催化的矽膠生長的成核位點。例如，在接觸點，CPNP用作用於在顆粒表面上溶膠凝膠反應的帶負電荷的納米掩模。例如，一旦形成具有所需厚度的二氧化矽層，則將聚苯乙烯顆粒移除，留下二氧化矽中空多孔納米顆粒結構。圖7B示出了二氧化矽中空多孔納米顆粒的SEM圖720。例如，圖720所示的煅燒後的最終HPNP直徑為初始500nm模板APNP(如圖710所示)的直徑的約85%，例如這可能與在加熱或用無水溶劑萃取期間矽膠羥基的部分脫水有關。圖710和720中的示例性比例尺代表200nm。
[0098]所述中空多孔納米顆粒的結構特徵示於圖8A-8I中。圖8A-8I包括由500nm模板和IOOnm納米掩模製成的二氧化矽HPNP的電子顯微圖。圖8A示出了電子顯微圖801，其揭示了用STEM的次級電子模式所採集的示例性中空多孔納米顆粒的表面形貌。例如，圖801示出在兩個顆粒之間的接觸點周圍完全阻止二氧化矽形成以及掩蔽CPNP表面的曲率，其可通過所得顆粒的表面形貌來反映。圖8B示出了示例性HPNP的透射電子顯微圖802。例如，利用500nm APNP模板且TMOS與APNP重量比為3:1的示例性合成技術產生了 25nm厚度的二氧化矽殼。該示例性厚度可產生在該尺寸範圍內的穩定的顆粒。圖8C示出了示例性破裂的HPNP的掃描電子顯微圖803，其從內部視角示出開放孔結構。圖8D示出了用STEM的透射模式所採集的電子顯微圖804，其示出示例性HPNP的單分散性。
[0099]所公開的裝配程序可以應用於廣泛尺寸的具有不同特徵的顆粒。例如，HPNP的裝配中3個自由度可以包括表面上的孔的數量、孔直徑和總顆粒尺寸。圖SE示出了 SEM圖805，其示出由500nm模板和IOOnm納米掩模，例如，以1:30的特定數量比所形成的示例性HPNP。圖8F示出了 SEM圖806，其示出由500nm模板和IOOnm納米掩模，例如，以1:15的特定數量比所形成的示例性HPNP。例如，通過APNP與CPNP的相對摩爾濃度可以控制表面上孔的平均數量。圖8E和8F中的SEM顯微圖示出，當溶液中APNP與CPNP摩爾比率分別為1:30和1:15時，表面上的孔分布。這些比率可以產生約25-30個孔/顆粒(對1:30比率而言)(例如，如圖8E所示)和約10-15個孔/顆粒(對1:15比率而言)(例如，如圖8F所示)。圖8G示出了 SEM圖807，其示出由500nm模板和60nm納米掩模所形成的示例性HPNP。例如，可以通過選擇具有不同直徑的掩蔽CPNP來調節表面上所創建的孔的大小，這與HPNP的總直徑無關。IOOnm掩蔽CPNP的使用可以產生30±4nm直徑的孔(例如，圖8E和8F所示)，並且60nm掩蔽CPNP的使用可以在接觸點處產生20±3nm直徑的孔(例如，圖8G所示)。可以使用具有20nm直徑的示例性CPNP，例如，以高準確度來產生低至幾個納米的孔。
[0100]圖8H示出了 SEM圖808，其示出由200nm模板和40nm納米掩模所形成的示例性HPNP0例如，可以基於模板顆粒尺寸配置HPNP的總尺寸。例如模板移除後，可以使由500nmAPNP模板所創建的示例性HPNP表現出直徑降低約15%，產生430nm直徑的HPNP (如圖8E-8G所示)。然而，隨著改變APNP模板顆粒尺寸，收縮的百分比不是恆定的；例如，通過利用200nm APNP和40nm CPNP所產生的示例性HPNP產生150nm的總顆粒尺寸，這相當於煅燒後收縮約25%(如圖8H所示)。例如，增加的收縮可歸因於當使用較小的顆粒時表面羥基與總二氧化矽體積的更高的相對體積比率。圖808中示例性比例尺代表50nm。
[0101]進行的示例性實施示出模板和納米掩模顆粒組合產生的孔(例如介孔)為初始納米掩模直徑的約25-35%，例如，通過更小的尺寸而略微減少。例如,對更小的納米掩模而言，略微減少可與增加的表面曲率產生更小的接觸點有關。圖81示出了 SEM圖809，其示出150nm直徑的示例性HPNP。圖809所示的示例性箭頭表示表面上的孔。例如，孔的直徑示出為12±2nm，並且通過200nm APNP和40nm CPNP形成示例性HPNP。圖809中示例性比例尺代表50nm。
[0102]圖9A-9D示出了 SHPNP的示例性裝配技術的示意圖。圖9A示出了產生HPNP911的過程910，所述HPNP911包括中空內芯912和延伸穿過HPNP911的外殼進入到中空內芯912的孔913(例如介孔)。例如，HPNP911可以包括允許小分子進出HPNP911的小孔隙。例如，過程910可以包括過程110、120、130和140的實施以產生HPNP911。圖9B示出了將酶925裝載入HPNP911的過程920。例如，過程920可以包括將高濃度的含酶925的溶液添加至含HPNP911的溶液(例如，其可以在HPNP懸浮液中)。例如，過程920可以包括酶925，其通過擴散穿過孔913擴散入HPNP911的中空內部912。例如，因為與酶比較，孔相對大，所以酶925可以自由地快速擴散入結構中，使HPNP911內部和外部的濃度平衡。在其他實例中，過程920可以使酶925通過電泳力穿過孔913而裝載入HPNP911的中空內部912。圖9C示出了用層931部分覆蓋孔913和HPNP911表面的過程930。例如，過程930可以包括沉澱大的帶正電荷的聚合物，諸如PLL。例如，層931可以配置為PLL聚合物層，其可以在HPNP911和孔913的表面之上創建網格狀結構。圖9D示出了將酶925密封在HPNP911內以形成密封的中空多孔納米顆粒945的過程940。例如，過程940可以包括在層覆蓋的HPNP911之上形成層941。例如，溶膠凝膠反應物的進一步添加可以在覆蓋孔913的初始層的頂部上創建另一層(例如，層941)，例如，通過在示例性PLL聚合物上的成核位點，由此將酶925封閉在SHPNP945 內。
[0103]例如，在二氧化矽HPNP的情況下，HPNP911的表面由於SiO -基而帶負電荷。可以添加諸如PLL的帶正電荷的聚合物以吸附至顆粒的表面並且將表面電荷改變為正的。隨後，可以添加TMOS以在表面上生長新的二氧化矽層，例如，閉合HPNP911的孔(例如介孔)。該示例性反應可以發生在接近中性的緩衝液環境中並且不會損害酶負荷。例如，一旦將介孔閉合，則負荷被封裝在SHPNP945內而不能逃離。然而，負荷仍可以經由擴散穿過納米孔與周圍環境中的小分子相互作用。
[0104]該示例性能力可以用於提供多種益處。例如，示例性酶負荷避開免疫系統，例如，因為抗體過大而不能穿過納米孔以觸及酶。例如，使示例性酶負荷免於免疫系統且免於消化性酶，例如蛋白酶，而仍為完全活性的。例如，可以用鈍化和靶向配體覆蓋示例性SHPNP，而無需任何有效負荷、例如酶負載的化學修飾，從而為體內應用提供了有效的策略。
[0105]進行示例性實施以表徵酶活性和所公開的SHPNP的保護能力。例如，來自蠟樣芽孢桿菌的青黴素酶為催化P -內醯胺環水解的P -內醯胺酶家族的成員之一。在SHPNP的示例性表徵實施中利用蠟樣芽孢桿菌青黴素酶，例如，因為對基於酶-前藥的治療，它可以被認為是優選的(6-內醯胺酶，並且靈敏的顯色和螢光測定是可用的。例如，後者使用底物CCF2，其包含經由頭孢菌素基團而與螢光素連接的香豆素。例如在被青黴素酶分裂之前，409nm處香豆素的激發引起向螢光素的有效的螢光共振能量轉移(FRET)，產生約520nm的綠色發射峰。例如，青黴素酶分裂頭孢菌素基團，將螢光素與香豆素分離並且幹擾FRET，以至於相同的香豆素激發產生藍色的447nm發射。CCF2通常以乙醯氧基甲基(AM)酯形式使用，其在嚙齒類動物血漿和血清以及細胞內部中，當暴露於酯酶時迅速復原為CCF2。
[0106]圖1OA和IOB為示出所公開的技術的密封中空多孔納米顆粒的酶活性的示例性數據圖。圖1OA示出了在正常血清中帶有封裝的青黴素酶SHPNP與作為底物的CCF2-AM的活性比較的數據圖1010。例如，表徵4個示例性樣品，其包括為中空納米殼的樣品1，為HPNP的樣品2，為密封中空納米殼的樣品3以及為SHPNP的樣品4。所有4個示例性樣品都與酶孵育，隨後用IX PBS連續洗滌並且在用IX PBS連續洗滌後再用蛋白酶-K洗滌。在酶孵育後，洗滌前，進行示例性樣品3和4的示例性密封反應。數據圖1010所示的數據例示了封裝在示例性SHPNP內的青黴素酶(例如MW=28kDa)的活性。所有示例性樣品都暴露於蛋白酶-K，例如，其可以消化蛋白。因此，例如，暴露於蛋白酶-K後的封裝的酶的持續不變的活性證明了通過封裝在SHPNP中而使所封裝的酶抗蛋白水解的保護作用(如稍後圖12和13所示)。
[0107]例如,如圖1OA所示,數據圖1010示出，示例性樣品I和示例性樣品2沒有表現出活性或表現出很少的活性，這在暴露於蛋白酶-K之後是可預期的。例如，數據圖1010示出了示例性樣品3與示例性樣品I相比在活性方面有2倍增加，例如，這可以歸因於在粘於表面的酶之上由二氧化矽的第二層提供的保護，確認了額外的二氧化矽層的保護效應。然而，為SHPNP的示例性樣品4示出了活性顯著的增加。例如，數據圖1010示出了 SHPNP與示例性樣品3相比在活性方面有10倍的增加，例如，證明了增加並不歸因於覆蓋表面的酶而是歸因於填滿中空內部的酶分子。示例性HPNP(樣品2)和示例性SHPNP(樣品4)之間所示的顯著差異進一步確認了這一發現，例如，因為這兩個樣品經歷了相同的裝配技術，除了示例性樣品4的額外的密封過程。
[0108]圖1OB示出了針對所封裝的青黴素酶的多克隆抗體結合的活性比較的數據圖1020。數據圖1020包括示例性紅條1021，表示來自具有可使抗體分子與生物素連接的鏈黴親和素的Alexa488的螢光。數據圖1020包括示例性藍條1022，表示來自Cy5標記的青黴素酶的螢光。例如，表徵3個示例性樣品，其包括為空SHPNP的樣品1，為中空二氧化矽殼的樣品2 (其中青黴素酶被吸附在表面上)，為具有所封裝的青黴素酶的SHPNP的樣品3。例如，示例性樣品I和3都與蛋白酶-K孵育以移除任何可能粘於表面的酶。洗滌所有3個示例性樣品幾次以除去未結合的酶。
[0109]圖1OB所示的示例性數據圖1020可以用於評估示例性SHPNP中所封裝的酶的抗體通路。例如，用Cy5螢光標記青黴素酶並且用針對青黴素酶的兔多克隆生物素化抗體探測它的可及性， 例如通過Alexa488標記的鏈黴親和素檢測。數據圖1020示出了示例性樣品I和3所測量的強度為相當的(例如，在標準誤差區間內)，例如，表示來自於示例性樣品3的輕微的螢光與抗體無關，而是來自Alexa488-鏈黴親和素的非特異性吸附。例如，示例性樣品2示出了高約5倍的強度，例如，例示了與二氧化矽表面上的酶分子的顯著抗體結合。例如，數據圖1020示出了沒有來自於示例性樣品I的螢光，例如，由於缺少青黴素酶而是可預期的。例如，數據圖1020示出沒有與示例性樣品3的抗體結合，例如，儘管其具有最高的青黴素酶含量，但這產生了對SHPNP內所封裝的酶的抗體通路的防止。
[0110]圖10C-10E為示出示例性納米顆粒的電子顯微圖。圖1OC示出了示例性200nm中空無介孔納米殼的圖1030。圖1OD示出了由200nm模板和40nm納米掩模所形成的示例性HPNP的圖1040。圖1OE示出了通過密封HPNP所形成的示例性SHPNP (通過利用200nm模板和40nm納米掩模的裝配方法所產生的)的圖1050。圖1030、1040和1050中示例性比例尺代表lOOnm。
[0111]圖11示出了展示BALB/c小鼠中海腎螢光素酶(RenLuc)的體內活性的圖1100。例如，以在先前實施中與青黴素酶相似的方式將示例性RenLuc酶封裝在200nm SHPNP中，例如包括用蛋白酶-K修整以除去任何表面暴露的RenLuc。圖1100中照亮的和發光的圖片是重疊的。例如，用100 u L的濃度為5.68X IO12個顆粒/mL的RenLuc酶封裝的SHPNP溶液肌內注射示例性BALB/c小鼠1101(圖1100左側所示)，隨後,5分鐘後,側面尾靜脈注射IOiig節基-腔腸素。作為對照,用100 ii L的濃度為8 ii g/mK的游離RenLuc酶肌內注射示例性小鼠1102(圖1100的右側所示)。這兩種示例性注射都展示了相似的體外活性(如稍後圖16和17所示)。例如，圖1100中所獲得的數據包括示例性程序，其中肌內注射後5分鐘，在側面尾靜脈中靜脈給予IOu g苄基-腔腸素。靜脈注射後5分鐘測量來自每隻小鼠的發光強度。來自於用RenLuc封裝的SHPNP注射的小鼠的發光強度測量為2.6X 105p/sec/cm2/sr,這表示SHPNP內封裝的酶的局部活性,而來自於用游離RenLuc注射的小鼠的強度低於檢測極限。例如，來自於後者的發光的缺失主要歸因於游離酶擴散出注射位點。
[0112]圖12示出了數據圖1200，其示出在37°C下、於IX正常小鼠血清中，與蛋白酶-K孵育12小時或不與蛋白酶-K孵育12小時的游離蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的活性圖。例如，
5u M CCF2-AM被用作底物，並且通過409nm激發，在100%正常小鼠血清中測量活性，作為藍色螢光(447nm)與綠色螢光(520nm)之比的初始增加速率。數據圖1200包括不與蛋白酶-K孵育的游離蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的繪圖數據1201和與蛋白酶-K孵育的游離蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的繪圖數據1202。
[0113]圖13示出了數據圖1300，其示出在37°C下、於IX正常的小鼠血清中，與蛋白酶-K孵育12小時或不與蛋白酶-K孵育12小時的游離海腎螢光素酶的活性圖。例如，每一反應為100 u L，總計含有10 u g/mL苄基-腔腸素作為底物。數據圖1300包括與蛋白酶-K孵育的游離海腎螢光素酶的繪圖數據1301和不與蛋白酶-K孵育的游離海腎螢光素酶的繪圖數據 1302。
[0114]圖14示出了數據圖1400，其示出蠟樣芽胞桿菌青黴素酶活性的標準曲線。例如，頭孢硝噻測定中吸光度的初始增加速率代表數據圖1400的縱軸。
[0115]圖15示出了數據圖1500，其示出與以1.42 X IO12個顆粒/mL濃度而封裝在密封中空多孔納米顆粒內的蠟樣芽胞桿菌青黴素酶相比，不同濃度的游離蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的活性繪圖。例如，每一反應為100 u L，總計含有250 u g/mL頭孢硝噻作為底物，並且在486nm處測量吸光度。例如，數據圖1500示出包括Omg/mL(曲線1501),0.lmg/mL(曲線1502)、0.02mg/mL (曲線 1503)、0.004mg/mL (曲線 1504)和 0.0008mg/mL (曲線 1505)的濃度的青黴素酶活性，並且示出1.42X1012fSHPNP/mL(曲線1506)。
[0116]例如，與封裝在SHPNP內的蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的所測量的活性相比，游離蠟樣芽胞桿菌青黴素酶的標準曲線(數據圖1400所示)對應於來自於單一 200nm SHPNP的4.58X IO-14個國際單位(IU)，例如基於HPNP合成產率為100%時約50個酶分子/顆粒。例如，酶負荷期間，最初用26.4 ii M孵育HPNP。例如，單一 SHPNP內的酶的測定濃度可以對應於19.5 u M，例如，產生74%的表觀負荷效率。可能影響該百分比的示例性因素包括以下幾個方面。例如，HPNP合成的產率可小於100%，產生了不能被密封但仍被計為SHPNP的破碎的HPNP。例如，在用於二氧化矽縮聚反應的稀釋期間，可能有一些酶從顆粒洩漏出去。例如，底物向酶的通路可能受限於底物穿過多孔殼的擴散。例如，通過密封反應期間酶溶液的濃度，顆粒內的酶濃度可為可調節的。
[0117]圖16示出了數據圖1600，其示出海腎螢光素酶活性的標準曲線。由於與苄基-腸腔素相互作用所產生的發光強度代表數據圖1600的縱軸。
[0118]圖17示出了數據圖1700，其示出與以1.42 X IO12個顆粒/mL濃度封裝在密封的中空多孔納米顆粒內的海腎螢光素酶相比，不同濃度的海腎螢光素酶的活性圖。例如，每一反應為IOOiiL,總計含有IOii g/mL苄基-腸腔素作為底物。數據圖1700示出了包括0.0008mg/mL (曲線 1701)、0.0004mg/mL (曲線 1702)、0.0002mg/mL (曲線 1703)、0.0OOlmg/mL (曲線1704)和0mg/mL(曲線1705)的濃度的海腎螢光素酶活性，並且示出了 1.42 X IO12個 SHPNP/mL(曲線 I7O6)。
[0119]所公開的SHPNP例示了用於封裝諸如酶的功能性生物分子的平臺，所述平臺作用於可以穿過SHPNP的小尺寸孔隙而自由地擴散進出的小分子底物。可以大規模的製造具有嚴格控制的尺寸和特性的所公開的SHPNP，並且酶可以保存在免受來自其他生物分子的任何特異性或非特異性幹擾的受控環境中。所公開的SHPNP的示例性實施例示了所封裝的酶維持它們的活性並有效地被庇護以免於抗體或蛋白酶，例如，因為殼的孔隙比抗體、蛋白酶或此類分子更小。而且，例如，SHPNP的表面修飾可以增強體內循環和靶向，例如，在所封裝的有效負荷上不需要任何修飾。所公開的技術提供了具有顆粒大小控制和滲透性的所述SHPNP的靈活的裝配技術，並且對特定負荷和底物，可以修整和優化所公開的SHPNP。
[0120]在另一方面，所公開的技術可以包括用於裝配具有空芯、多孔表面和可密封孔的金屬納米顆粒的裝配方案。圖18A和18B示出了例示一示例性金屬納米顆粒合成方案的示意圖。
[0121]圖18A示出了例如通過靜電吸引將具有功能化表面1816(例如，羧化表面)的掩蔽顆粒1815與模板芯顆粒1811的功能化表面1812(例如，胺化表面)結合的過程1820。例如，因為示例性羧化顆粒1815具有帶負電荷的表面，所以它們排斥負離子並且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應，例如，封閉示例性胺化模板顆粒1811的外表面的某些帶正電荷的區域。
[0122]圖18A示出了將膠體金屬層1831 (例如，膠體金)添加至掩蔽顆粒1815—模板芯顆粒1811複合體的過程1830。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒結合的掩蔽顆粒的溶液。示例性溶膠凝膠反應可以發生在沿著模板芯顆粒1811的表面1812的帶正電荷的區域中，例如，未被掩蔽顆粒1815覆蓋或封閉的區域，形成示例性膠體金層1831。
[0123]圖18A示出了使初始層1831增厚成厚層1841的過程1840。例如，初始層1831可以由膠體金形成，所述膠體金通過過程1830中的溶膠凝膠反應而產生。示例性膠體金層1831可以用作進一步生長金的成核位點，例如，形成厚層1841。例如，過程1840可以包括添加金酸和甲醛作為還原劑以用於形成示例性厚金層1841。
[0124]圖18A示出了過程1850，其示出形成中空多孔納米顆粒，例如，通過移除模板顆粒1811和掩蔽顆粒1815。例如，一旦形成具有所需厚度的層1841，則將模板和掩蔽顆粒移除，例如，通過各種方法，包括通過溶劑將它們溶解、煅燒、熔融或燃燒，或這些或其他相似方法的組合。例如，過程1850的實施產生了金屬HPNP (例如金HPNP)，其包括具有孔1855的空的或中空的多孔殼1841和空的或中空的內部1852。
[0125]一旦創建了示例性金屬HPNP，則它們可以裝載有其他物質，並且被密封以封裝所述其他物質，例如，通過實施以前所述的和圖1B和IC中例示的方法。例如，圖18B示出了將負荷顆粒1861裝載入金屬HPNP1841的中空內部區域1852的過程1860。例如，通過將負荷物質的高濃度溶液添加至金屬HPNP的溶液，可以使金屬HPNP的溶液裝載有負荷物質。通過幾個方法之一可以實施過程I860。在一實例中，負荷顆粒1861可以通過孔1855擴散入金屬HPNP1841。在其他實例中，負荷顆粒1861可以通過包括例如電泳力在內的非擴散方式穿過它們的孔1855而進入金屬HPNP1841的內部區域1852。將各種類型的材料用作負荷，可以實施過程I860以用於各種應用，例如，所述材料包括但不限於藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶和/或其他蛋白、脂質、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。例如，繼過程1860的實施之後，可以密封金屬HPNP1841以形成密封的金屬HPNP (金屬SHPNP)，例如，通過實施以前所述的和圖1C中所示的過程170。圖18C示出了圖1890，其示出在500nm脂肪族-胺聚苯乙烯芯萃取之前的示例性金HPNP。
[0126]在另一方面，所公開的技術可以包括用於裝配具有空芯內的一個或多個內部顆粒、多孔表面和可密封孔的納米顆粒的裝配方案。圖19示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0127]圖19示出了將具有功能化表面1916(例如羧化表面)的掩蔽顆粒1915與模板芯顆粒1911的功能化表面1912(例如胺化表面)結合的過程1920，所述模板顆粒1911具有至少一個內部顆粒1913。例如，模板顆粒1911可以為至少一個內部顆粒1913的外覆蓋層，或模板顆粒1911可以為中空顆粒，所述空芯顆粒在其中空內部之內封閉至少一個內部顆粒1913。例如，過程1920可以包括將掩蔽顆粒1915與模板顆粒1911的表面1912結合，通過靜電相互作用或通過例如包括但不限於氫鍵、共價鍵、磁性吸引、疏水性相互作用等的方式。例如，因為示例性羧化顆粒1915具有帶負電荷的表面，它們排斥負離子並且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應，例如封閉示例性胺化模板顆粒1911的外表面的某些帶正電荷的區域。
[0128]圖19示出了將層1931(例如二氧化矽)添加至掩蔽顆粒1915—模板芯顆粒1911複合體的過程1930。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒結合的掩蔽顆粒的溶液。示例性溶膠凝膠反應可以發生在沿著模板芯顆粒1911的表面1912的帶正電荷的區域中，例如，未被掩蔽顆粒1915覆蓋或封閉的區域，形成示例性層1931。
[0129]圖19示出了例如通過移除模板顆粒1911和掩蔽顆粒1915形成在內部區域1942內包括內部顆粒1913的中空多孔納米顆粒的過程1940。例如，一旦形成具有所需厚度的層1931，則將模板和掩蔽顆粒移除，例如，通過各種方法，包括通過溶劑將它們溶解、煅燒、熔融或燃燒，或這些或其他相似方法的組合。例如，過程1940的實施產生了包括多孔殼1941和的孔1945的HPNP，所述多孔殼1941包括在其中空內部區域1942中的內部顆粒1913，所述孔1945遍及多孔殼1941而分布，例如基於掩蔽顆粒1915與模板顆粒1911結合的最初位置。
[0130]一旦創建了包括至少一個內部顆粒的示例性HPNP，則可以使它們裝載有其他物質並被密封以封裝所述其他物質，例如，通過實施以前所述的和圖1B和IC中例示的方法。例如，圖19示出了將負荷顆粒1951裝載入HPNP1941的中空內部區域1942的過程1950。例如，通過將負荷物質的高濃度溶液添加至示例性HPNP的溶液，可以用負荷物質裝載包括所封閉的內部顆粒的示例性HPNP的溶液。通過幾個方法之一可以實施過程1950。在一實例中，負荷顆粒1951可以通過孔1945擴散入HPNP1941。在其他實例中，負荷顆粒1951可以通過包括例如電泳力在內非擴散方式穿過它們的孔1945而進入HPNP1941的內部區域1942。將各種類型的材料用作負荷，可以實施過程1950以用於各種應用，例如，所述材料包括但不限於藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶和/或其他蛋白、脂質、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。例如，在HPNP1941的內部區域1942內，示例性負荷顆粒1951可以與內部顆粒1913相互作用，例如，形成修飾的內部顆粒1955。例如，示例性負荷顆粒1951可以結合於內部顆粒1913的外表面，或在其他實例中，示例性負荷顆粒1951可以化學地與內部顆粒1913相互作用。例如，修飾的內部顆粒1955可以展示出在內部顆粒1913上的新的性質，這以其他方式則不能得到。
[0131]在另一方面，所公開的技術可以包括用於裝配具有帶有空芯的一個孔的納米顆粒的裝配方案，例如，其中孔可以為可密封的。圖20示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0132]圖20示出了過程2010的實例，其中大的掩蔽顆粒2015與芯模板顆粒2011混合在一起。例如，大的掩蔽顆粒2015可以是配置為具有表面電荷、例如負表面電荷的納米顆粒。例如，大的掩蔽顆粒2015還可以包括帶有功能化外表面2016、例如具有表面電荷的顆粒。例如，示例性掩蔽顆粒2015可為聚苯乙烯納米顆粒，並且示例性功能化表面2016可為羧化功能化層。例如，模板顆粒2011可以是配置為具有與掩蔽顆粒2015的表面電荷的極性相反的表面電荷、例如正表面電荷的納米顆粒。例如，模板顆粒2011還可以包括帶有功能化外表面2012的顆粒。例如,示例性模板顆粒2011可以為聚苯乙烯納米顆粒，並且示例性功能化表面2012可為胺功能化層。例如，一旦將示例性羧化掩蔽顆粒2015與胺化模板顆粒2011混合，則羧化顆粒2015可以與胺化模板顆粒2011結合。
[0133]圖20也示出了例如通過靜電相互作用將具有羧化功能化表面2016的大的掩蔽顆粒2015與模板顆粒2011的胺化功能化表面2012結合的過程2020的實例。在其他實例中，過程2020可以包括通過其他顆粒吸引方式將大的掩蔽顆粒2015與模板顆粒2011的表面2012結合，所述顆粒吸引方式例如包括但不限於氫鍵、共價鍵、磁吸引、疏水性相互作用等。
[0134]圖20還示出了將層2031添加至模板顆粒2011的過程2030的實例。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒2011結合的掩蔽顆粒2015的溶液。示例性溶膠凝膠反應可以發生在沿著模板顆粒2011的表面2012的帶正電荷的區域中，例如，未被掩蔽顆粒2015覆蓋或封閉的區域。例如，過程2030可以用覆蓋層2031覆蓋模板顆粒2011的暴露的表面，而不覆蓋存在掩蔽顆粒2015的位置。例如，覆蓋層2031可為多孔材料。例如，層2031可為一種材料(例如二氧化矽)以使過程2030可以產生在模板顆粒2011的表面上形成的多孔層。例如，過程2030中的溶膠凝膠的添加可以啟動二氧化矽生長，例如根植於示例性胺化功能化表面2012的氨基。例如，覆蓋層2031還可以為無孔材料。在某些實例中，過程2030可以包括通過其他方式將層2031添加至模板顆粒2011，例如所述其他方式包括但不限於基於材料的排他性、或氧化還原化學過程，以及其他技術，所述氧化還原化學過程僅在一顆粒(例如模板顆粒2011)的表面上而不在其他顆粒(例如掩蔽顆粒2015)的表面上形成層2031。用作覆蓋層的示例性材料可以包括多孔的或無孔的材料，或可降解的材料(例如，其在某些環境中或在特定條件下或通過示例性觸發而可以溶解或降解，例如條件和/或觸發包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他條件和/或觸發)。
[0135]另外，圖20示出了例如通過移除模板顆粒2011和掩蔽顆粒2015而形成中空納米顆粒的過程2040的實例。例如，一旦形成了具有所需厚度的層2031，則例如通過各種方法，包括通過溶劑將它們溶解、煅燒、熔融、或燃燒、或這些方法或其他相似方法的組合，移除模板顆粒2011和掩蔽顆粒2015。例如，過程2040的實施產生了中空納米顆粒，其包括帶有孔2045的空的或中空的多孔殼2041和中空內部2042。在某些實例中，可以實施過程2040以形成中空無孔納米顆粒，例如，當層2031為多孔材料時。在其他實例中，可以實施過程2040以形成中空無孔納米顆粒，例如，當層2031為無孔材料時。一旦形成了示例性中空殼結構，則其可以裝載有其他物質並被密封以封裝所述其他物質，例如，通過實施以前所述的和圖1B和IC中所例示的方法。
[0136]所述納米顆粒平臺的應用可以至少包括以下方面。例如，比孔隙更大的大分子可以穿過表面上的孔而擴散到納米顆粒內，並稍後可以被逐漸地釋放。例如，一旦大分子穿過孔而擴散到納米顆粒內部，則可以將孔密封。因為顆粒表面為多孔的，因此小的分子可以擴散進出，從而提供了大分子與外部環境的連通且同時保護環境免於大分子或保護大分子免於環境。例如，顆粒內部的大分子可以用作報告環境中某些事件的傳感器而不被暴露於環境。例如，一旦大分子擴散到顆粒內，則可以用具有特定性質(例如降解性質)的分子密封孔。例如，可以利用特定性質，並且可以釋放封裝在顆粒內的大分子。例如，密封在HPNP內的大分子可以包括特定性質，諸如與足夠小到穿過孔隙的分子反應。例如，大分子可以為用於激活小的藥物分子的酶分子。因為示例性酶分子被封裝在顆粒內，所以它避免了免疫系統。例如，HPNP的表面可以由靶向劑功能化，例如，用於有效的布置和遞送到靶區域。例如，可以分別將失活的藥物引入循環。因為示例性藥物不為激活的，所以藥物不會有劑量限制。例如，一旦示例性未激活的藥物與酶負荷的HPNP在體內的靶區域中相遇，則藥物可以擴散到HPNP內並且通過酶而變成激活的；並且激活的藥物可以擴散出HPNP達到靶區域，例如，由此只影響靶區域。
[0137]雖然本專利文件包含許多細節，但這些不應該被解釋為對任何發明範圍的或所要求的範圍的限制，而是解釋為對特定發明的特定實施方案的具體特徵的描述。也可以在單個實施方案中組合地實施本專利文獻的單獨實施方案中所述的某些特徵。相反地，也可以在多個實施方案中分別地或以任何適合的亞組合來實施單個實施方案中所述的各種特性。而且，儘管以上所述的特性為在某些實施方案中發揮作用，甚至一開始就要求如此，但來自所要求的組合的一個或多個特性可以在某些情況下從組合中被剔除，並且所要求的組合可涉及亞組合或亞組合變體。
[0138]相似地，雖然在附圖中以特定順序描述了操作，但這不應該理解為必須以所示特定順序或先後次序進行此類操作，或必須進行所有例示的操作來獲得所需的結果。而且，以上所述實施方案中的各種系統組件的分離不應該理解為在所有實施方案中必須此類分離。
[0139]只描述了很少的實施和實例，並且基於本專利文件所描述的和所例示的內容可以進行其他實施、改善和變化。
【權利要求】
1.裝配顆粒的方法，其包括: 將芯顆粒與一個或多個掩蔽顆粒組合以形成模板，其中所述一個或多個掩蔽顆粒與所述芯顆粒結合併且覆蓋所述芯顆粒的表面的一個或多個區域，所述一個或多個區域中每一個區域對應於在所述一個或多個掩蔽顆粒中每一個掩蔽顆粒與所述芯顆粒之間形成的表面區域； 在所述模板之上形成多孔材料層，其中所述層形成在除已覆蓋的所述一個或多個區域之外的所述芯顆粒的表面之上；以及 移除所述模板以產生由多孔材料形成的顆粒，所述顆粒具有一個或多個在中空的內部區域與所述顆粒的外表面之間延伸的孔，所述一個或多個孔在所述外表面上具有基本為所述表面區域尺寸的尺寸，並且分布在所述顆粒的所述一個或多個區域上。
2.權利要求1所述的方法，其還包括功能化所述芯顆粒的表面和所述一個或多個掩蔽顆粒的外表面，其中所述功能化產生了在所述芯顆粒的表面上的正電荷和在所述一個或多個掩蔽顆粒的外表面上的負電荷。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述一個或多個掩蔽顆粒通過靜電相互作用與所述芯顆粒結合。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述形成層包括在所述模板的表面上進行膠體溶膠凝膠反應。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述多孔材料包括二氧化矽或膠體金屬中的至少一種。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述膠體金屬包括金，並且所述方法還包括由用作成核位點的膠體金層增厚所述多孔材料層以用於金的進一步生長。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述移除包括利用所述芯顆粒和所述一個或多個掩蔽顆粒的煅燒、溶解、熔融、或燃燒中的至少一種。
8.如權利要求1所述的方法，其還包括基於所述芯顆粒的尺寸配置所述顆粒的總尺寸。
9.如權利要求1所述的方法，其還包括基於所述掩蔽顆粒的尺寸配置所述顆粒的一個或多個孔的開口尺寸。
10.如權利要求1所述的方法，其還包括通過控制所述芯顆粒和一個或多個掩蔽顆粒的相對摩爾濃度來確定所述顆粒的一個或多個的孔的數量。
11.如權利要求1所述的方法，其還包括: 將物質通過所述一個或多個孔裝載入所述顆粒的內部區域，所述物質不能穿過所述多孔材料；以及 在所述顆粒上形成允許所選顆粒穿過的外多孔層，其中所述外多孔層密封所述顆粒的一個或多個的孔，由此將所述物質封閉在所述顆粒內。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述將物質裝載入所述內部區域是通過擴散或電泳力中的至少一種而發生的。
13.如權利要求11所述的方法，其中所述物質包括藥物、生物可降解大分子、pH敏感分子、酶、蛋白、激素、糖蛋白、糖脂、核酸、適配子、脂質、或金屬納米顆粒、聚合物納米顆粒或陶瓷納米顆粒中的至少一種。
14.如權利要求11所述的方法，其中所述形成外層包括在所述顆粒上進行膠體溶膠凝膠反應。
15.如權利要求11所述的方法，其還包括: 在所述顆粒的外表面上形成覆蓋層，其中所形成的覆蓋層具有促進形成所述外多孔層的膠體溶膠凝膠反應的電荷。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述電荷為正電荷並且所形成的覆蓋層包括創建的網格狀結構。
17.如權利要求16所述的方法，其中所形成的覆蓋層為聚-L-賴氨酸。
18.如權利要求11所述的方法，其還包括將配體分子與所述顆粒的外表面結合，所述配體分子對靶結構上的受體分子具有親和性，從而將所述顆粒吸引並結合至所述靶結構。
19.用於運載負荷的納米顆粒裝置，其包括: 包括至少兩層的殼結構，所述至少兩層包括內層和外層，所述內層被構造為封閉中空內部區域並且包括一個或多個貫穿所述內層的孔，所述外層在所述內層周圍形成， 其中所述殼結構包括在所述中空內部區域內的物質，所述物質通過所述一個或多個孔進入所述殼結構並且不能穿過所述外層。
20.如權利要求19所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結構具有包括二氧化矽、金、磷酸鈣中至少一種的材料，或者具有鈣外覆蓋層的材料。
21.如權利要求19所述的納米顆粒裝置，其中所述物質包括藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶、蛋白、激素`、糖蛋白、糖脂、核酸、適配子、脂質、或金屬納米顆粒、聚合物納米顆粒或陶瓷納米顆粒中的至少一種。
22.如權利要求19所述的納米顆粒裝置，其還包括結合於所述殼結構的配體分子，所述配體分子對靶結構上的受體分子具有親和性，從而將所述殼結構吸引並結合至所述靶結構上。
23.如權利要求22所述的納米顆粒裝置，其中所述靶結構為有機體內的活組織，所述殼結構與所述活組織結合。
24.如權利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述活組織為腫瘤。
25.如權利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結構使所述物質免於免疫反應。
26.如權利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述外層具有多孔材料，所述物質不能穿過所述多孔材料。
27.如權利要求26所述的納米顆粒裝置，其中所述有機體內的未激活的分子通過穿過所述外層的孔隙而進入所述殼結構的內部區域並且與所述物質相互作用，其中所述未激活的分子與所述物質的相互作用形成激活的分子。
28.如權利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述激活的分子通過穿過所述外層的孔隙而離開所述殼結構。
29.如權利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質為酶並且所述未激活的分子是構造成與所述酶相互作用的底物。
30.如權利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質為酶並且所述未激活的分子為前藥，其中所述前藥與所述酶的相互作用形成活性藥物。
31.如權利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質為對pH變化敏感的大分子並且所述未激活的分子為離子，其中所述離子與所述大分子的相互作用檢測PH變化。
32.如權利要求19所述的納米顆粒裝置，其中將所述顆粒布置在具有一種或多種廢棄分子的環境中，所述廢棄分子通過多個孔隙進入所述殼結構的內部區域並與所述物質相互作用。
33.如權利要求32所述的納米顆粒裝置，其中所述一個或多個廢棄分子與所述物質的相互作用包括所述一個或多個廢棄分子與所述物質結合，由此從所述環境中移除所述一個或多個廢棄分子。
34.納米顆粒裝置，其包括: 殼結構，其被構造為包括一個或多個在中空的內部區域與所述殼結構的外表面之間延伸的孔；以及 至少一個中心顆粒，其包含於所述內部區域內並具有比所述一個或多個孔中每一個孔的尺寸更大的尺寸， 其中所述一個或多個孔被構造為接收進入所述內部區域的物質，並且所述物質與至少一個中心顆粒結合。
35.如權利要求34所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結構還包括多個從所述內部區域貫穿到所述外表面的孔隙，所述多個孔隙具有尺寸比所述一個或多個孔的開口的尺寸更小的開口。
36.裝配顆粒的方法，其包括: 將芯顆粒與一個或多個掩蔽顆粒組合以形成模板，其中所述一個或多個掩蔽顆粒與所述芯顆粒結合併且覆蓋所述芯顆粒的表面的一個或多個區域，所述一個或多個區域中的每一個區域對應於所述一個或多個掩蔽顆粒中每一個掩蔽顆粒與所述芯顆粒之間形成的表面區域； 在所述模板之上形成層，其中所述層形成在除已覆蓋的所述一個或多個區域之外的所述芯顆粒的表面之上；以及 移除所述模板以產生殼結構，所述殼結構具有一個或多個在中空的內部區域與外表面之間延伸的孔，所述一個或多個孔在所述外表面上具有基本為所述表面區域尺寸的尺寸，並且分布在所述殼結構的所述一個或多個區域上。
37.如權利要求36所述的方法，其中所述層具有多孔材料。
38.如權利要求36所述的方法，其還包括: 將物質通過所述一個或多個孔裝載入所述殼結構的內部區域；以及 在所述殼結構之上形成外層，其中所述外層密封所述殼結構的一個或多個孔並且將所述物質封閉在所述內部區域內。
39.如權利要求 38所述的方法，其中所述外層具有允許所選顆粒穿過的多孔材料。
40.納米顆粒裝置，其包括: 包括至少兩層的殼結構，所述至少兩層包括內層和外層，所述內層被構造為封閉中空內部區域並且包括一個或多個貫穿所述內層的孔，所述外層具有多孔材料且在所述內層周圍形成且密封所述一個或多個孔，以及 在所述中空內部區域內包含的物質，所述物質不能穿過所述外層。
【文檔編號】B82B3/00GK103608285SQ201280029189
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年4月16日 優先權日:2011年4月14日
【發明者】埃南柯·奧泰克, 薩迪科·C·伊賽納, 楊堅, 威廉·特羅格勒 申請人:加利福尼亞大學董事會