無毒微生物及其應用的製作方法

2024-02-29 07:46:15 1

專利名稱：無毒微生物及其應用的製作方法
本申請是與此有關的美國申請的繼續，該美國申請號為058360，申請日是1987年6月4日。
本發明涉及無毒微生物，它們的製備方法及在疫苗中的應用。
以前所用的抗傳染病的疫苗一般組成如下(Ⅰ)由病原因子純化得到的特定組分，包括完整的抗原、抗原片段或天然存在的抗原或抗原決定簇的合成類似物，(Ⅱ)抗個體基因型抗體，(Ⅲ)被滅活的完整病原因子，或(Ⅳ)作為活疫苗的病原因子的無毒衍生物。這些類型的疫苗有許多，下面即是其中的一些實例美國專利4250262公開了從突變鏈球菌(Streptococcusmutans)回收葡糖基轉移酶的方法，並將該純化酶用於抗齲齒的局部免疫，即Ⅰ型疫苗。就突變鏈球菌的血清型a、c或g來說，都對細菌的培養、酶的純化以及用酶刺激唾液中的IgA抗體等有詳細描述。在美國專利4203971和3239749中，可見到從純化細菌特定組分得到疫苗的其他一些例子，這些專利公開了用於抗淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonnorrhoeae)感染的疫苗，該細菌由淋球菌外膜物質中的糖蛋白組成。注射糖蛋白可刺激殺菌的抗體。
美國專利3931398公開了將死的突變鏈球菌細胞施用在口腔中防止牙齒衰敗，這是Ⅲ型疫苗的一個例子。發明者發現，所產生的抗體是免疫球蛋白A(IgA)抗體，它們使蝕斑的形成減少。
活細菌疫苗(Ⅳ型)含有選擇的大腸桿菌(E.coli)菌株，這是美國專利3975517公開的。這種細菌在注射到奶牛乳腺之前要用稀福馬林進行減毒處理，使其部分鈍化。在以後的奶中發現了這樣產生的抗體，它能保護新生豬抵抗大腸桿菌的感染。使大腸桿菌鈍化的福馬林處理只是使細菌暫時減毒，因此在注射之前要小心防止細菌復原。這種復原會造成嚴重感染而不是起到保護作用。
將突變引入上述菌株以產生無毒菌株已是可行的，這樣產生的菌株基本上在寄主內不能存活。這種菌株可以說是遺傳學上的衰減。為了易於敘述，遺傳衰減的原理將參照沙門氏菌系統予以說明，然而，正將如下面所討論的，其原理能夠廣泛應用。
鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、傷寒沙門氏菌(S.typhi)和具有侵染性質的其他沙門氏菌種，在口服之後通過附著、侵染和在與腸道相關的淋巴樣組織(GALT;淋巴集結)的細胞中增殖而進入深層組織(Carter和Collins，J.Exp.Med.1391189-1203，1974)。由於沙門氏菌介導的抗原至GALT的傳遞能誘發分泌型免疫應答及體液與細胞免疫應答，無毒沙門氏菌突變體雖已失去致病能力，但並未損傷其附著並侵襲GALT的能力，因此它們很可能作為有效的載體以傳遞外源抗原，例如將集群或毒性抗原等轉移到GALT，並誘發針對衍生此抗原的病原體的保護性免疫。能夠表達其他微生物抗原的無毒沙門氏菌疫苗菌株的構建，已通過經典的基因轉移方法(Formal等人，Infect.Immun，34746-750，1981))利用DNA重組技術得到實現。利用後一技術，曾經構建了這樣的無毒沙門氏菌菌株，它們能表達與沙門氏菌正常交換遺傳信息的生物的基因(Stevenson和Manning，FEMSMicrobiol.Lett.28317-321，1985;Clements等人，Infect.Imm.53685-692，1986)，以及用經典的基因轉移法不能將遺傳信息轉移給沙門氏菌的微生物的基因(Curtiss，J.Dent.Res.651039-1045，1986)。已經表明，這種二價無毒沙門氏菌菌株能誘發針對表達的抗原的抗體，並在一個例子中對表達的抗原產生細胞免疫應答(Brown等人，J.Infect.Dis.15586-92，1987)，但有關誘導抗提供集群或毒性抗原的病原體的保護性免疫的數據仍然不足。
Bacon等人(Brit.J.Exp.Pathol.3285-96，1951)首先研究了傷寒沙門氏菌營養缺陷型突變體的無毒性。他們指出，要求嘌呤、對氨基苯甲酸和門冬氨酸的突變體已降低對鼠的毒性。Germanier和Furer(Infect.Immun.4663-673，1971)首先用鼠研究了使用鼠傷寒沙門氏菌galE突變體Ty21a作為人體抗傷寒熱的疫苗(J.Infect.Dis.131553-558，1975)。Stocker(美國專利4550081)利用Tn10進行轉座子誘變，再選擇萎
酸抗性，這導致Tn10和鄰近DNA順序的缺失性丟失，從而產生不能回復的缺失突變，這是一個Bacon等人使用的突變體中很明顯的問題。Stocker首先是分離aro A缺失(△)突變體，其缺陷是不能合成芳族胺基酸組的化合物，包括葉酸生物合成所需要的對氨基苯甲酸和二羥基苯甲酸，後者是腸螯合素的前體，並且最近將△aro A突變與排除腺嘌呤生物合成的缺失突變結合。由Tn10誘導和萎
酸抗性產生的△asd突變，產生了對於二氨基庚二酸的要求，這一點被用來使鼠傷寒沙門氏菌變為無毒，並且不損害其誘導全身分泌免疫應答的能力。因為許多沙門氏菌具有一種提供毒性的質粒，曾研究過去除此質粒的衍生物，並提出用它作為活疫苗使用(Nakamura等人，Infect.Immun.50586-587，1985)。
儘管前面描述的提供無毒沙門氏菌而不損害其免疫原性的每一種方法都有其優點，但每一種方法都存在問題。galE突變體難於生長以保持其免疫原性，因為它們對半乳糖敏感，必須在半乳糖存在的場合下生長以產生正常的LPS，然而正常的LPS選擇性地導致非免疫原性的抗半乳糖突變體的產生。儘管△aroA突變體排除了腸螯合素和葉酸二者的合成，腸螯合素對鼠傷寒沙門氏菌的毒性的必要性曾因Benjamin等人(Infect.Immun.50392-397，1985)的大量結果而受到懷疑，這些結果表明，幹擾鼠傷寒沙門氏菌絡合與鐵運輸能力的任何和所有突變都對毒性無很大的影響。因此△aroA突變體的無毒性很可能只是由於不能合成對氨基苯甲酸(pABA)與葉酸。由於Bacon等人(見上)觀察到，在用不能合成pABA的突變體侵染的小鼠的飲食中施用對氨基苯甲酸導致野生型毒性水平，因此人們必須注意疫苗菌株無毒性的表型逆轉，在飲食中消耗了其合成途徑被無毒突變體所阻斷的代謝物時則可能發生這種逆轉。而△asd突變體，儘管沒有這些困難，但它們在口服和侵入GALT後迅速死亡，因此△asd突變體只能有效地誘導全身黏膜性免疫，而不能有效地誘導體液與細胞免疫。
本發明利用轉座子誘導的突變體而克服現有技術中疫苗的許多缺點，在轉座子誘導的突變體中，導致無毒性的損傷不可能通過食物或動物宿主能提供的任何東西進行修復。這些缺失當然可由DNA重組技術引入。
本發明還提供一種使脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，它由一種病原微生物的無毒衍生物組成，所述衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質。
本發明還提供一種使脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，該疫苗由微生物的無毒衍生物組成，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，而能表達由所述脊椎動物或非脊椎動物的病原體衍生的重組基因從而在該脊椎動物或非脊椎動物中產生一種抗原，該抗原能在該動物體內誘發針對所說病原體的免疫應答。
本發明還提供一種刺激脊椎動物或非脊椎動物內免疫系統的方法，其組成步驟如下給予所說的脊椎動物或非脊椎動物施用一種使脊椎動物或非脊椎動物免疫的無毒疫苗，該疫苗由病原微生物的無毒衍生物組成，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質。
本發明還提供刺激脊椎動物或非脊椎動物免疫系統的一種方法，其組成步驟如下給所述脊椎動物或非脊椎動物施用一種無毒的微生物衍生物，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，但能表達由所述脊椎動物或非脊椎動物的病原體衍生的重組基因，從而在所述脊椎動物或非脊椎動物中產生一種抗原，它能在該動物體內誘發針對所述病原體的免疫應答。
本發明還為脊椎動物或非脊椎動物宿主蛋白質的合成提供一種載體微生物，它由病原微生物的無毒衍生物組成，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，而能表達由所述脊椎動物或非脊椎動物宿主衍生的重組基因，從而產生一種能在所述脊椎動物或非脊椎動物體內抑制、調節或增強免疫應答的產物。
本發明還提供一種調控脊椎動物或非脊椎動物免疫應答的方法，該方法包括將病原微生物的無毒衍生物引入所說的脊椎動物中，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，但能表達由所述脊椎動物或非脊椎動物衍生的重組基因，從而產生一種能夠抑制、調節或增強所述脊椎動物或非脊椎動物免疫應答的基因產物。
本發明還提供一種針對變應原而使脊椎動物或非脊椎動物脫敏的方法，該方法包括給所說的脊椎動物施用一種病原微生物的無毒衍生物的步驟，該病原微生物表達一種由某種生物衍生的重組基因，該生物能夠產生針對所述脊椎動物或非脊椎動物的一種活性變應原，從而在該動物中產生一種抗原，它能使所說的脊椎動物或非脊椎動物針對所述脊椎動物的所述變應原脫敏，所說的無毒衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質。
本發明還提供一種產生病原微生物的無毒衍生物的方法，所說的衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，該方法包括使病原微生物產生突變，即使腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質的基因通過轉座子誘變產生缺失突變，並對衍生物進行分離。利用DNA重組技術在腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質基因中產生缺失也可達到相同目的。


圖1說明在用7.4×108CFUχ4064和4.0×108CFUχ3456進行口服接種後一定時間，由淋巴集結(即GALT)回收鼠傷寒沙門氏菌△cya△crp
χ4064(O)和野生型χ3456(O)的情況。垂直線條表示標準偏差。
圖2說明在用7.4×108CFUχ4064和4.0×108CFUχ3456口服接種後一定時間，由隔膜淋巴結(■□)和脾(△△)回收鼠傷寒沙門氏菌△cya△crpχ4064(■▲)和野生型χ3456(□△)的情況。垂直線條表示標準偏差。
圖3說明某些鼠傷寒沙門氏菌菌株的質粒含量。用Birnboim方法(Methods，Enzymol.100243-255，1983)提取質粒DNA，溶於0.5%(重量/體積)瓊脂糖凝膠中，並用溴化乙錠染色。χ3344和χ3337溶解產物用苯酚/氯仿/乙醚提取，不經過密度梯度離心。各道中的菌株(100Kb質粒)a，χ3000(pStLT100);b，χ3344(-);c，χ3347(pStLT101);d，χ3306(pStSR100);e，χ3337(-);f，χ3338(pStSR101);g，χ3339(pStSL100，90Kb，8Kb);h，χ3340(90Kb，8Kb);i，χ3351(pStSR101)。標記質粒是Rldrd(100kb)和二聚pACYC184(8kb)(未示出)。
圖4說明100kb質粒的限制性酶消化的圖譜。用HindⅢ消化質粒DNA，溶於0.6%(重量/體積)瓊脂糖凝膠中，並用溴化乙錠染色。道a含有用HindⅢ消化的噬菌體λDNA。其他道上還示出以下菌株(和相應的質粒含量)b，χ3000(pStLT100);c，χ3306(pStSR100);d，χ3338(pStSR101);e，χ3339(pStSL100，90kb，8kb);以及f，χ3340(90kb，8kb)。
圖5說明用鼠傷寒沙門氏菌SR-11作小鼠口服接種以後在(A)淋巴集結和(B)脾中的總CFU。χ3306(O□)，χ3337(O□)。幾何平均值±標準偏差，n＝2-7隻小鼠。在測定CFU的單向跟蹤的Student氏t試驗中，χ3306比χ3337的P值大a＜0.0125，b＜0.0005。
圖6說明用野生型和去除100kb質粒的SR-11混合口服感染小鼠的結果。由淋巴集結(O)、隔膜淋巴結(△)和脾(□)回收的野生型χ3456與去除型χ3337之比的幾何平均值±標準偏差。n＝3-7隻小鼠，接種7天後為n＝1，在測定比值大於1的幾何平均值的單向跟蹤的Student氏t試驗中的P值a＜0.05，b＜0.0125，c＜0.0025，d＜0.0005。
在感染3天(P＜0.0125)、4天(P＜0.0005)和5天(P＜0.0025)後，脾的比值比淋巴集結的比值大。在感染3天(P＜0.05)和5天(p＜0.005)後，隔膜淋巴結的比值比淋巴集結的比值大。
圖7說明在用SL1344作小鼠的口服接種後，小鼠組織中的CFU。χ3339(空心符號)、χ3340(實心符號)。淋巴集結(□，■)，隔膜淋巴結(△，▲)，脾(O，●)。幾何平均值±標準偏差，n＝2-7隻小鼠。在測定CFU的單向跟蹤的Student氏t試驗中，χ3339的P值比χ3340大;a＜0.025，b＜0.0125，c＜0.0005。
本發明是基於這一發現，即某些突變可以使微生物變為無毒而基本上不影響它的免疫原性。更具體說，本發明涉及微生物疫苗，其中微生物攜有缺失(△)突變△cya和△crp，它們分別除去了合成腺苷酸環化酶(ATP焦磷酸裂合酶(成環)EC4.6.1.1)和環化AMP受體蛋白質(CRP)的能力。
環-3′，5′-AMP(cAMP)和環化AMP受體蛋白質對大量涉及傳輸和降解大量分解代謝產物的基因和操縱子的轉錄是必需的。曾有實驗證據表明，用以傳輸燃料/碳源的系統都處在cAMP正控制之下，好幾種胺基酸透性酶也是如此。除了在分解代謝中非常重要的作用外，細胞中cAMP的濃度還通過溫和噬菌體、傘毛合成、鞭毛合成和至少一種外膜蛋白質的合成影響溶原化。儘管CAMP存在於哺乳動物細胞中，但在沙門氏菌可能侵入和增殖的巨噬細胞和其他細胞中存在的cAMP濃度低於0.1-1.0mMCAMP，這種濃度對於使△cya突變體在體外表現出野生型表型是必需的。而且，所含有的△crp突變會基本上消除由這種△cya突變體在體外吸收cAMP可能積累的任何益處。
一旦因引入△cya△crp突變而賦予無毒性後，該微生物即可作為誘發抗該微生物免疫的疫苗的免疫原性組分。因此，具有腺苷酸環化酶和cAMP受體蛋白質基因的任何微生物，都可考慮按本發明使用，包括而不限於沙門氏菌、大腸桿菌-鼠傷寒沙門氏菌雜種，志賀氏菌屬(Shigella)、歐文氏菌屬(Erwinia)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、拉基歐氏菌屬(Legionella)、或布魯氏菌屬(Brucella)。較好的微生物是沙門氏菌屬的成員，如鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、付傷寒沙門氏菌(S.Paratyphi)、雞沙門氏菌(S.gallinarum)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、霍亂沙門氏菌(S.Choleraesuis)、亞利桑那沙門氏菌(S.arizona)或S.dublin。
本發明的另一個具體方案是，用病原微生物的無毒衍生物(本文還稱為載體細菌)將選定的抗原轉移給GALT，例如轉移給迴腸的淋巴集結。大家都知道某些屬的細菌(如沙門氏菌)寄宿在淋巴集結(Carter，P、B.和F.M.Collins，J.Exp.Med.1391189，1974)。鼠傷寒沙門氏菌-大腸桿菌雜種也表明聚集在小鼠中的淋巴集結(HohmannA.W.等人，Infect.andImmun.22763，1978)。如果這些載體細菌含有並表達病原生物的重組基因，將會誘發出針對由病原體產生的抗原基因產物的抗體。隨著DNA重組技術的出現，現在已有可能研製這樣一種非常獨特的疫苗，它的特異抗原不是由病原因子而是由能表達那種抗原基因的另一種宿主細菌菌株產生。當抗原與哺乳動物宿主的基因可能發生交叉反應，並因此加強自身免疫的誘發時，也有可能使用DNA重組技術改變基因，使其不產生引起交叉反應的抗原決定簇。因此，DNA重組技術可用於研製這樣的疫苗，這種疫苗沒有任何能與脊椎動物宿主抗原發生交叉反應的物質，也不會誘發自身免疫狀態。
很明顯，本發明對研製抗細菌、真菌、寄生蟲或病毒致病因子(在局部免疫是重要的並可能是第一道防線時)的有效疫苗具有廣泛的適用範圍。這些疫苗的例子是，控制由鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis)引起的肺病，由淋病奈瑟氏菌引起的淋病，由鈀密螺旋體(Treponemapallidum)引起的梅毒，以及由沙眼衣菌(Chlamyoliatrachomatis)引起的性病和眼的感染。A組與B組鏈球菌種，如引起咽喉疼痛或心臟病的那些種，Neisseriameningitidis、肺炎分枝支原體(Mycoplasmapneumoniae)、流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenzae)、百日咳博德特氏菌(BordetellaPertussis)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、麻瘋分枝桿菌(Mycobacteriumleprae)、禽類博德特氏菌(Bordetellaavium)、大腸桿菌、等鏈球菌(Streptococcusequi)、肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)、流產布魯氏菌(Brucellaabortus)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahemolytica)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、志賀氏桿菌以及嗜肺拉基歐氏菌(Legionellapneumophila)等都是本發明範圍內附加的可由此獲得基因的細菌實例。病毒疫苗，如抗流感病毒的疫苗，也可為本發明所包括。還可產生抗其他病毒的病毒疫苗，無論是DNA還是RNA病毒都行，例如來自Papovirus、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒、細小病毒、呼吸道和腸道病毒、細小核糖核酸病毒、粘病毒、副粘病毒、或後病毒類的病毒。本發明還可考慮使用預防病原真菌、原生動物和寄生蟲等感染的疫苗。
在進一步的具體方案中，當疫苗的免疫原性組分是一種宿主的變應原時，可在設計的接觸攝取法中使用這種疫苗使敏感宿主特異性脫敏。
在一個具體方案中，本發明可描述為一種使脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，該疫苗含有病原微生物的活的無毒衍生物，所述衍生物不能產生功能性腺苷酸環化酶和cAMP受體蛋白質，但能表達由某種生物得到的重組基因，該生物是所說動物的一種病原體，或該生物產生所說動物的一種變應原。
在另一個具體方案中，可以使用本發明的無毒微生物作為合成各種宿主蛋白質的載體。由於本發明的無毒微生物在引入宿主後能穿越多種免疫活性結構，包括GALT、隔膜淋巴結和脾，所以可用這些微生物瞄準多種免疫調節產物。因此，編碼免疫調節蛋白質或肽的一種或多種基因可通過重組導入無毒微生物中，這樣，當此微生物寄宿在適當的免疫活性組織中時，能夠表達在宿主中抑制、增強或修飾免疫應答的重組產物。免疫調節分子包括但不限於下述例子集落刺激因子(巨噬細胞、粒細胞或混合細胞)、巨噬細胞化學毒素(Chemotoxin)、巨噬細胞抑制因子、白細胞抑制因子、淋巴細胞毒素、胚變因子、幹擾素及白細胞間素。
本發明還有另一個具體方案，即利用此處所述的無毒微生物傳遞與產生藥理活性產物，它們可能刺激或抑制各種生理功能(即增長速率、血壓等)。
對本發明的這些具體方案中的每個術語作如下的分析討論。
疫苗是指用於刺激活體生物免疫系統(因此能對未來的傷害提供保護)的一種製劑。免疫作用是指連續高水平地誘導抗體和/或細胞免疫應答的過程，在該過程中，T-淋巴細胞可在生物內殺死病原體和/或活化其他細胞(例如吞噬細胞)以殺死病原體，該抗體針對於生物體以前已經接觸過的病原體或抗原。儘管「免疫系統」這一短語可能包含單細胞生物對存在的外來物體的反應，例如幹擾素的產生，但在本申請中，該短語限於與解剖學有關的特點和機制，即是指由多細胞生物產生針對侵入該生物的細胞或體液的抗原物質的抗體。如此產生的抗體可能屬於免疫學分類中的任一類，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。對於刺激產生免疫球蛋白A(IgA)的疫苗是特別感興趣的，因為這是由恆溫動物的分泌系統產生的主要免疫球蛋白，當然本發明的疫苗並不限於刺激產生IgA的那些疫苗。例如，具有本文描述的特性的疫苗，除了形成IgA外，很可能產生廣泛的其他的免疫應答，如細胞和體液的免疫。對抗原的免疫應答的研究深入而廣泛。Barrett，James，T.(TextbookofImmunologyFourthEdition，C.V.MosbyCo.，St.Louis，MO，1983)對免疫學作了評述，此書全文被引作為本文的參考文獻。
脊椎動物是指脊椎動物門的主要部-脊椎動物亞門的任何成員，包括魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳動物，它們的特徵是都具有分節骨骼或軟骨脊柱。全部脊椎動物都具有功能性的免疫系統，通過產生抗體對抗原作出反應。因此，所有脊椎動物均能對疫苗發生反應。儘管疫苗一般主要用於哺乳動物，例如人或狗(狂犬病疫苗)，但商業養殖的其他類脊椎動物的疫苗(如魚類和鳥類)，如具有這裡所述的性質，也都在本發明的範圍之內。
非脊椎動物是指動物界的任何成員，脊椎動物除外。這類動物構成非脊椎動物部，它們沒有椎骨或脊柱。這一類包括除魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳動物外的所有動物。很多非脊椎動物能對抗原刺激產生原始免疫應答，並對本發明公開的感染脊椎動物的相同的微生物敏感。這類非脊椎動物的例子有貝類、軟體動物和其他有關動物。雖然至今還沒有很好地記載疫苗在保護非脊椎動物方面的應用，但熟悉本領域的專業人員將知道，本發明通過使用非脊椎動物的原始免疫系統能夠應用於它們。根據本發明舉例來說，貝類受沙門氏菌感染的敏感性將允許導入沙門氏菌的無毒菌株，並因此提供原始免疫系統應答的可能性。因此，應用病原微生物的無毒衍生物(能使非脊椎動物感染的)刺激存在於所述非脊椎動物中的免疫系統對於病原體的應答也在本發明範圍內。
本發明的一個具體方案是應用病原微生物的無毒衍生物作為基因產物的載體寄宿於GALT或BALT，所述基因產物用來刺激對病原體或變應原的抗體應答。無毒性並不意味著那一屬或種的微生物在任何時候都不可能以病原體起作用，而是指對於被治療的特定動物來說，所用的特定微生物是無毒的。這種微生物可能屬於一個通常是病原體的屬或甚至是種，但它必須屬於一種無毒菌株。病原體是指能引起疾病或破壞正常的生理功能。無毒菌株不能誘發通常與相應的毒性病原體相關的全部病症。這裡使用的微生物包括細菌、原生動物和單細胞真菌。
將第一種生物的基因物質轉移到一般不與第一種生物交換基因物質的第二種生物中的技術，近來由於DNA重組技術的迅速發展而得到非常廣泛的採用。在這類應用中，以這樣的方式將遺傳物質由一種生物轉移到第二種生物，即使第二種生物繁殖後能產生含有被稱為重組基因的相同的遺傳物質的後代。這裡使用的術語基因是利用它最廣泛的意義，即代表任一種生物學遺傳單位。重組基因不必如同親本生物中存在的那樣是完整基因，它能夠產生或調節一種大分子的生成，例如一種功能性多肽。基因只要能夠作為模板指導抗原產物的生產就行。這種產物可能是沒有以那種嚴格形式存在於親本生物中的物質。例如，編碼包括100個胺基酸殘基的多肽抗原的功能基因可部分轉移到載體微生物中，使得由宿主細胞的細胞機制產生的肽只由75個，或甚至10個胺基酸殘基組成。然而，如果這種基因產物是這樣一種抗原，它能夠針對親本生物中存在的類似抗原導致抗體形成，則這種基因被認為是在本發明定義的基因範疇之內。另外，如果已知一種特定抗原或其片段的胺基酸順序，則有可能用自動基因合成儀或類似裝置化學合成DNA片段或其類似物，並將所述DNA順序導入合適的表達載體中。在此譜系的另一端是編碼幾種基因產物的一長段DNA，其中一個或全部都能是抗原。因此，本發明定義與要求保護的基因是能產生抗原的任何遺傳單位。基因可以是染色體、質粒或病毒來源的。
為了使基因能有效地誘導免疫應答，該基因必須被表達。基因的表達意味著基因結構中的固有信息(DNA鹼基的順序)通過基因源於其中的細胞的生化機制，以RNA分子、多肽或其他生物分子的形式轉換成一種有形產物。這樣產生的生物分子稱為基因產物。這裡使用的術語基因產物是指在基因控制下由生化反應產生的任一種或多種生物產品。基因產物可以是例如RNA分子、肽、或在酶或最初是基因產物的其他分子控制下產生的產物，即代謝產物。例如，基因可以首先控制RNA分子的合成，RNA分子通過核糖體的作用翻譯成酶，而酶又在與基因來源的原始細胞不同的環境條件下控制葡聚糖的生成。RNA分子、酶、葡聚糖等按本發明使用的術語都是基因產物。這些基因產物中的任何一種，以及其他許多類型的基因產物，如糖蛋白和多糖，如果將它們引入動物的免疫系統都將起抗原作用。蛋白基因產物，其中包括糖蛋白和脂蛋白，是作為抗原用於疫苗中的優選的基因產物。
為了使疫苗能有效地產生抗體，應該以這樣的方式釋放抗原物質，即使接種動物的產生抗體的機制運轉起來。因此，應該把基因產物的微生物載體引入動物中。如同前面所討論，為了刺激GALT或BALT細胞更好地反應，最好以口服、胃插管或以氣溶膠的形式將微生物或基因產品直接引入腸道或支氣管中，當然其他施用疫苗的方法也是可能的，這些方法有例如靜脈、肌肉、皮下注射或乳腺、陰莖、陰道用藥。
當無毒微生物以載體微生物使用以及載體微生物存在於動物中後，抗原需要變成動物免疫系統能夠接觸的。這一點在載體微生物死後可以達到，因為此時抗原分子被釋放。當然，使用不需溶解便釋放周質內含物的「滲漏」無毒突變體也是可能的。另外，可以選擇一種基因以控制抗原的產生，使得載體細胞在其死亡之前就使其外部環境能夠接觸抗原。用這種辦法能使用一種活的微生物，它將滯留在接種動物中(如在淋巴集結處)繼續產生抗原，因而連續地誘發抗體的生成。在這些情況下，一種較好的基因產物是通過細胞膜轉移到外部環境中的產物，或者附著或嵌入外膜中的產物，使得該基因產物的全部或部分都暴露在環境裡。典型的後一類基因產物是通常在生物體表面發現的抗原，而針對它們的預防正是所期望的。如果這些抗原以正常方式轉移到細胞表面，則針對此抗原的抗體生成將會增加。
使用病原體向GALT或BALT傳遞來自其他病原體的抗原是不合適的，除非這種病原體能被賦予無毒性，並同時保持侵染淋巴集結或BALT的能力。
產生重組基因的生物可以是接種動物的任何病原體，或者可以是產生動物變應原或其他抗原的生物。變應原是引起動物變態反應的物質，該動物將進行抗變應原的接種。很多不同的物質都可以是變應原，如動物的毛髮皮屑和花粉，而動物個體的變態反應將因任一種特定的變應原而不同。有可能在通常表現出變態反應的動物中誘導對變應原的耐性。誘導耐性的方法是公知的，通常包括給動物施用劑量不斷提高的變應原。在前面引用的Barrett教科書中對誘導耐性作了進一步的討論。最後，如果免疫調節基因或其他藥理活性物質的基因是通過載體表達的，則宿主生物本身也可作為遺傳物質來源。
給動物服用上面公開的這類活疫苗可用任何已知的或標準的技術。這些技術包括口服、胃插管或支氣管-鼻噴霧。所有這些方法都能使活疫苗很容易到達GALT或BALT細胞誘發抗體生成，它們是優選的施用方法。可以使用其他的施用方法，如靜脈注射使載體微生物達到動物血流中。
正如後面敘述的，靜脈、肌肉或乳腺注射在本發明的其他具體方案中也都是可接受的。
由於施用的較好方法是口服、氣溶膠噴霧和胃插管，因此較好的載體微生物是屬於這些種，即它優先寄宿在接種動物的腸或支氣管的淋巴上皮結構中。這些菌株最好是通過遺傳操作腸病菌株所產生的腸病菌株的無毒衍生物。寄宿在淋巴集結並因此直接刺激IgA生成的菌株是最好的。在動物中，這些菌株包括寄宿在淋巴集結的沙門氏菌和沙門氏菌-大腸桿菌雜種的特殊菌株。
DNA重組技術目前已經是眾所周知和廣為傳布了，以至於可看作是一種常規技術。根據普遍使用的廣泛定義，此方法包括將一種生物的遺傳物質，或更通常是遺傳物質的一部分轉移到第二種生物中，使得這種被轉移的遺傳物質成為該生物遺傳物質的永久部分(與之重組)。這通常包括由親本生物首先得到小片段DNA，該DNA來自質粒或親本染色體。質粒(也稱為染色體外元件)是一種與細胞染色體空間上分離的遺傳單位。DNA可能具有任何大小，常常由限制性核酸內切酶的作用得到，該酶將DNA分子在特定的鹼基對位置切開。與質粒、噬菌體或柯斯載體連接以形成重組分子後，該重組分子可通過各種方法轉移到宿主細胞中，例如轉化(從外部環境中吸收裸露的DNA，這可以通過各種化學試劑如鈣離子人工誘發)。其他方法如轉導也是適用的，這裡重組DNA包裝在諸如轉導噬菌體或柯斯載體之類的噬菌體內。重組DNA處於載體細胞內後，它可能繼續以分離片段存在(一般來說完全轉移的質粒是這樣)或者可能插入宿主細胞染色體中，並在細胞分裂時與染色體一起複製。
儘管遺傳物質的轉移是相當簡單的，但目前仍無法預測哪一個轉移體將導致基因的表達。然而，這種選擇過程對本發明來說不存在任何困難。由於宿主微生物必須表達被轉移的基因並因此產生一種抗原，因此「鳥槍法」能很好地發揮作用。首先，用標準技術生產抗所希望抗原的抗體，例如抗病原微生物的細胞膜片段，來自抗原來源的生物的DNA用核酸內切酶切成多個片段，將這些片段隨機插入載體微生物中，比較好的是通過克隆載體。表達病原體抗原的微生物可以很容易地由它們與針對病原體抗原的抗體的反應進行鑑定。可以選擇並克隆表達抗原的微生物以得到所希望的重組生物。「鳥槍法」克隆是公知的，並在Maniatis，T.等人，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratories(1982)中作了詳細描述，該書列為本文參考文獻。基因轉移技術不被認為是本發明的一部分，能夠產生包括來自某種生物的基因(它在無毒微生物中被表達)的重組生物的任何方法將足以滿足本發明的要求。
在生物種正常地交換遺傳信息的情況下，可以採用更為經典的基因轉移方法如結合、轉化或轉導等。
無毒微生物衍生物也被認為在本發明範圍內。衍生物意指無毒菌株的有性或無性繁衍的後代和突變體，其中包括單鹼基或多鹼基置換、缺失、插入、倒位，它們保留了不能產生功能性腺苷酸環化酶和cAMP受體蛋白質的性質，不論它們是否有天然存在的有毒質粒。例如，帶有gyr A突變的χ4062和χ4064菌株具有萘啶酸抗性，這裡方便地用它作為口服接種後跟蹤菌株的標記。然而，對於用作疫苗的菌株來說，最好不具有抗藥性。因此，通過對緊密連接的Tn10進行遺傳選擇，然後通過選擇萎
酸抗性以去除Tn10，從而將gyr A+(賦予萘啶酸敏感性)基因轉導入菌株，這樣便很容易除去gyr A+突變。
所需要的劑量將隨基因產物的抗原性變化，需要量以誘發典型的現有疫苗的免疫應答就足夠了。常規試驗很容易確定所需要的量。典型的起始疫苗劑量可以是0.001-1mg抗原/Kg體重，按需要增加劑量或劑量次數可提供所希望的保護水平。
疫苗是懸浮或溶解在藥物載體中，這種載體可以是任何溶劑、固體或用一種材料做成膠囊，這種材料對接種動物無毒性，並與載體生物或抗原基因產物是相容的。適當的藥物載體包括液體載體，如一般的生理鹽水和其他無毒鹽溶液，其濃度是或接近生理濃度，還有固體載體如滑石或蔗糖，對於農場動物還可加在飼料裡。如希望的話，可以加入佐劑以提高抗原性。當通過支氣管施用時，疫苗以氣溶膠形式是比較好的。
用產生基因產物的病原體進行免疫，還可與病原微生物的無毒衍生物的在先免疫結合使用，該病原微生物作為載體表達由來自病原體的重組基因編碼的基因產物。在用表達病原體的基因產物(它刺激GALT或BALT的淋巴細胞)的載體微生物進行免疫，從而誘發了分泌免疫系統對於該基因產物的應答後，可用這種腸胃外免疫作為提高分泌性免疫應答表達的加強劑。提高的應答被稱為二次的、增強的或記憶應答，並且能延長宿主的免疫保護。增強免疫可以重複很多次而獲得有益結果。
上述公開一般地說明了本發明。更為完全的理解可參看下面的特殊實例，這些實例只是作為說明，除非特別指出，它們不作為限制。
實例1本實例說明通過導入影響cAMP合成和利用的缺失突變來構建一種無毒衍生物。
細菌菌株所用鼠傷寒沙門氏菌菌株列於表1。它們保存在冰凍培養液裡，其培養物懸浮在含5%甘油的1%細菌腖(Bacto-Peptone)中，並在乾冰-乙醇中快速冷凍，雙份貯存於-70℃，對於常規使用，也可在含50%甘油的1%細菌腖中於-20℃懸浮貯存。
培養基對於常規培養，複合培養基是L-肉湯培養基(Lennox;Virology1190-206，1965)和Luria肉湯培養基(Luria和Burrous，J.Bacteriol.74461-476，1957)。對鹼性瓊脂來說，將1.2%Difco瓊脂加入Luria肉湯中，對軟瓊脂來說，則加入0.65%Difco瓊脂。常規的細菌計數使用Penassay瓊脂。以最終濃度為1%的合適碳水化合物補充MacConkey鹼性瓊脂或Eosin亞甲基藍瓊脂(Curtiss，Genetics589-54，1968)來評價發酵作用。
合成培養基是按前述(Curtiss，J.Bact.8928-40，1965)補充有最佳水平養分的最低液體(ML)和最低瓊脂。按照常規使用帶明膠的緩衝生理鹽水作稀釋劑。
轉導按照常規，使用噬菌體P22HTint按標準方法進行轉導(Davis等人，「Aman for Genet.Eng.-Adv.Bact.Genetics」，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1979)。供體菌株的過夜培養物於預熱的Luria-肉湯中按1∶20稀釋，於37℃振蕩生長60分鐘，然後用0.01倍的P22HTint侵染。侵染混合物振蕩過夜大約15小時。加氯仿後再於37℃振蕩10分鐘，懸浮液離心(Sorvall RC5C，SS-34 rotor，7000轉/分，10分鐘)去除細菌碎片。含噬菌體(約1010/ml)的上清液在氯仿中於4℃貯存。用濃度為12.5μg/ml的四環素選擇Tn10誘發突變的轉導。
缺失突變的萎
酸選擇使用由Maloy和Nunn所述的培養基和方法(J.Bact.1451110-1112，1981)。帶有Tn10誘發突變的菌株，在含12.5μg四環素/ml的L-肉湯中於37℃生長過夜，達到約5×108CFU/ml。培養液以1∶40稀釋於無四環素的預熱L-肉湯中，並於37℃通氣至滴度約為2×109CFU/ml。合適數目(107-108)的細胞稀釋在BSG中，再塗布在含萎
酸的培養基上於37℃培養48小時。用相同的選擇培養基純化抗萎
酸的分離物。挑出單一的提取物，培養後用或者不用12.5μg四環素/ml測定在Penassay瓊脂上的四環素敏感性。
小鼠全部的感染和免疫試驗都使用雌性BALB/c小鼠(Sasco，St.Louis，MO)。購買3或7周齡的小鼠，在用於試驗之前，關在檢疫室一個星期。實驗小鼠放在具金屬絲底板並有Nalgene濾器蓋住的籠子中。隨意地餵飼料和水。動物房的溫度保持在22-23℃，照明期為12小時。
動物感染在口服或腹腔接種後，測定鼠傷寒沙門氏菌菌株的毒性。為小鼠接種的細菌於L-肉湯中在37℃靜置培養過夜。這種培養液以1∶50稀釋於預熱的L-肉湯中，並於37℃通氣約4小時，達到OD600為大約0.8-1.0。在Sorvall RC5C離心機中離心使細胞濃縮50倍，使用GSA轉子，轉速為7000rpm，在4℃離心10分鐘，接著將濃縮細胞懸浮在BSG中。將適當稀釋的濃縮細胞塗布在Penassay瓊脂上以測定滴度，以及塗布在含有1%麥芽糖的MacConkey瓊脂上以檢驗Cya/Crp表型。
對於所有口服接種的小鼠，在侵染前4小時停止進食和進水。在用PipetmanP20口服20μl鼠傷寒沙門氏菌BSG懸浮液前五分鐘，用PipetmanP200給小鼠餵30μl10%(重量/體積)碳酸氫鈉。口服接種以後30分鐘恢復餵食與水。觀察小鼠的病態和死亡率達30天以上。
放鬆的小鼠用26號針頭腹腔接種300μl用BSG稀釋的細菌懸浮液。此後觀察小鼠的病症和死亡率達30天以上。
保護性免疫的評價在初始試驗中，對於用任一種鼠傷寒沙門氏菌突變株侵染30天後存活下來的任何小鼠，在第31天通過口服施用具小鼠毒性的野生型鼠傷寒沙門氏菌SR11χ3306菌株，所用劑量為LD50的103-104倍。接著，對多組小鼠通過口服用不同劑量的無毒突變體進行免疫，然後在初次免疫後的不同時間施用不同劑量的毒性χ3306細胞。整個實驗過程中要觀察病態和死亡率，在施用χ3306細胞後還要觀察至少30天。
活體存活的鼠傷寒沙門氏菌細胞的計數通過上述方法用大約1×109細胞對小鼠進行口服接種後，測定野生型和突變型鼠傷寒沙門氏菌SR11菌株的集群化和持續時間。在口服侵染後4、24、48、72、96小時和7天時，測定小腸和結腸內含物中和淋巴集結、位於已除去淋巴集結的迴腸遠端部分的一段10釐米的小腸壁以及結腸壁的勻漿(8-10)中的鼠傷寒沙門氏菌細胞的滴度。還測定了隔膜淋巴結和脾的勻漿中的細胞的滴度。通過CO2窒息致死小鼠，並立刻將隔膜淋巴結、脾、小腸和結腸置於在冰上冷凍的ML+15%蔗糖最低鹽(MLS)中。小腸置於裝有4.0ml冷凍MLS的培養皿中，並用外科手術剪刀除去淋巴集結。淋巴集結用冷凍BSG衝洗兩次，每次1ml，衝洗後放進一個帶玻璃螺旋帽的管(15×100mm)中，其中裝有10ml冷凍的MLS和玻璃珠。然後將小腸縱向切割，並將內容物和壁放進50ml易處理的錐形管中，把冷凍的MLS加至5.0ml體積，再搖動1分鐘。取出10釐米長的小腸，用5mlBSG衝洗兩次，再放進帶玻璃螺旋帽的管中(15×100mm)，其中裝有2.5ml冷凍MLS和玻璃珠。從縱向切割和洗滌小腸時使用過的冷凍MLS中回收小腸內容物，並將其加進50ml易處理的裝有小腸內容物的錐形管中。用裝有4.0ml冷凍MLS的培養皿裝結腸，縱向切割盲腸。結腸內容物與結腸壁置於50ml的最終體積後，搖動1分鐘。然後取出結腸壁，用5mlBSG衝洗2次，其後放進帶玻璃螺旋帽的管中(15×100mm)，其中裝有2.5ml冷凍MLS和玻璃珠。從縱向切割和洗滌結腸時使用的冷凍MLS中收集結腸內容物，並加其加到50ml易處理的裝有結腸內容物的錐形管中。將隔膜淋巴結與其相連的脂肪組織放進一個帶玻璃螺旋帽的管中(15×100mm)搖動，其中裝有1.0ml冷凍MLS和玻璃珠。把96小時和7天時收集的脾直接放進一個Dounce研棒型組織勻漿器中，與2.5ml冷凍MLS一起研磨。每支帶玻璃珠的管和組織用Super-混合器高速搖動4-5分鐘。懸浮液用BSG稀釋，並塗布在MacConkey瓊脂上，該瓊脂含1%乳糖和40μg萘啶酸/ml。通過懸浮液、稀釋液體積和平板計數確定總的存活滴度。使用含1%各種碳水化合物的MacConkey瓊脂以鑑定所回收的生物具有期待的表型。
用Cya和crp突變構建鼠傷寒沙門氏菌SR11菌株對於BALB/c小鼠的口服侵染使用鼠傷寒沙門氏菌SR11菌株χ3041。五天後嚴重生病的動物死亡，然後由淋巴集結回收到確定為具有完全小鼠毒性的分離物χ3181。用P22轉導把賦予萘啶酸抗性的gyrA突變導入χ3181中而得到χ3306，它即是本文所述所有菌株的親本(表1)。
由於已表明去除100kb毒性質粒的鼠傷寒沙門氏菌分離物完全能附著、侵入和存在於淋巴集結中，但不能穿越隔膜淋巴結和脾，因此，將Cya和Crp突變引入去除質粒的鼠傷寒沙門氏菌SR11菌株χ3337中，以及引入含質粒的SR11衍生物χ3306中。應該強調的是，把pStSR100質粒再引入χ3337能完全恢復該質粒的毒性(見實例3)，因此保證了在去除毒性質粒時不會在χ3337中出現第二次突變。
表2列出所有突變菌株及其親本關於糖的發酵和在各種碳源上生長的表型性質。以關於分解代謝活性對環化AMP和環化AMP受體蛋白的需要而發表的報告為基礎，表型與所期望的一致(χ4060是一個例外，它的行為類似於CyaCrp雙突變體，而與cya單突變體不相似)。所有的cya/crp突變體菌株缺乏傘毛和鞭毛，基於從前的結果，這些都與所期望的一致(Saier等人，J.Bact.134(1)356-358，1978;Yokota和Gots，J.Bact.103513-516，1970;Komeda等人，Mol.Gen′lGenet.142289-298，1975)。另外很明顯的是，pStSR100質粒的存在對這些表型無什麼影響。
在選擇萎
酸抗性四環素敏感性的衍生物以後的每一步構建中，都要確定一下是否能以比χ3306親本菌株更高的頻率觀察到四環素抗性的回覆突變體/突變體。在所有的情況下，未觀察到這種四環素抗性的回覆突變體/突變體。
表3列出了好幾種突變菌株及其親本在含有0.5%葡萄糖的MA上的菌落直徑(以不同的時間保溫時)，以及在含有0.5%葡萄糖的ML中的代時。明顯可見，有或無△crp突變並與pStSR100質粒存在與否無關的△cya菌株，其生長要比其親本χ3306培養物慢得多。

突變菌株對小鼠的毒性用105突變體細胞腹腔侵染單個小鼠，或者用108突變體細胞口服侵染單個小鼠，記錄其病症和死亡率，這樣得到突變體菌株毒性的初步信息。由於cyaTn10突變的χ3395和crpTn10突變的χ3396顯然是無毒的，還由於用這兩者侵染後存活的小鼠對野生型χ3306細胞的攻擊有免疫能力，所以對χ3395和χ3396的毒性進行進一步研究。表4的數據表明，用cyaTn10突變體或crpTn10突變體LD50劑量的大約103倍侵染，小鼠還能繼續存活。然後對缺失Tn10和相鄰DNA順序的菌株開始進行研究。表5列出通過口服鼠傷寒沙門氏菌野生型、△cya和△crp菌株侵染小鼠所出現的症狀和死亡率。很明顯，不考慮侵染時小鼠的年齡，所有小鼠受到任一種突變菌株1000-4000倍野生型LD50劑量的侵染後而存活。表5中關於pStSR100去除的衍生物χ3337的無毒性的數據與實例3中詳盡的研究結果是一致的。
表6還列出另外一些數據，即關於用△cya和△cya△crp菌株χ4060和χ4062(去除質粒的)和χ4032和χ4064(含有質粒的)侵染的數據，用1×109細菌口服侵染小鼠，與未受侵染的小鼠實際上一樣生長。
表7列出了有關鼠傷寒沙門氏菌突變體的腹腔施用的數據。小鼠對各種突變菌株以102-103倍野生型LD50劑量侵染仍然存活。在較高劑量下觀察到疾病，這可能部分是由於內毒素的影響。
無毒突變體免疫作用的效果表8列出有關下述方面的數據鼠傷寒沙門氏菌△cya和△cya△crp不同突變體誘導對於口服104倍於LD50劑量的完全毒性的鼠傷寒沙門氏菌SR11χ3306細胞的免疫能力。在這種強烈侵染的情況下，許多小鼠出現中度疾病而且食量降低，但用χ4064進行免疫的小鼠仍然健康，進食和生長正常。在服用30天後死亡的所有動物(甚至用χ4064免疫的那些動物)顯示脾腫大(Spleenomeglia)，以及能夠回收χ3306野生型服用菌株，但不能回收無毒的△cya或△cya△crp疫苗菌株。相反地，用完全毒性的χ3306親本菌株的僅僅100-1000倍於LD50劑量施用於用大約1×109χ4064免疫的小鼠時，未觀察到脾腫大和服用菌株的回收。
無毒突變體在體內的組織營養作用和穩定性圖1和圖2列出如下數據在口服後的不同時間，△cya△crp菌株χ4064的回收與萘啶酸敏感的野生型菌株χ3456(Tnminitet標記;見表1)的回收的比較。很明顯，△cya和△crp突變沒有嚴重損害鼠傷寒沙門氏菌在淋巴集結上附著、侵入和持續存在的能力，至少在足以誘發保護性免疫的時間內如此(圖1)，但確實損害達到脾臟或在其中存活的能力(圖2)。
無毒突變體的遺傳穩定性以活疫苗口服的菌株必須在無毒性和致免疫能力兩方面具有完全的穩定性。因此，在通氣下用L-肉湯培養幾種優選的疫苗菌株至晚對數期，濃縮50倍後以不同稀釋度塗布在一系列含有碳源的最低瓊脂培養基上，這些培養基不支持親本突變體的生長(表2)。將一組複製平板在紫外光下照射，其光強可造成70%細胞死亡。在△cya菌株χ4032中以低而可測的頻率(表9)觀察到自發回復突變體/突變體，在△cya菌株χ4060中以較高頻率觀察到自發的回覆突變體/突變體。許多這種回復突變體能在大多數碳源上生長，因此很可能是crp＊(Schalte和Postma，J.Bact.141751-757，1980;Gargos和Adhya，Cell 41745-751，1985)或csm(Melton等人，Mol.Gen′l Genet.182480-89，1981)突變，這些突變在無環化AMP時能使CRP活化轉錄。△cya△crp菌株的回覆突變體/突變體如χ4064是極少的(表9)，它們儘管能在選擇它們的碳源(即甘露醇)上生長，但不能在其他任何原始菌株不能利用的碳源上生長(表2)。這些回復突變體/突變體無疑具有啟動子突變，從而使特定基因/操縱子的轉錄與CRP無關。紫外光照射不能提高突變/回復的頻率。
對六種回復突變體/突變體的毒性作了評價。用四隻小鼠試驗了每種回復突變體。一隻口服劑量為105細胞，一隻口服劑量為約108細胞，一隻腹腔劑量為102細胞，一隻腹腔劑量為105細胞。在所有情況下，△cya突變體的四種回復突變體和△cya△crp菌株的二種回復突變體保留它們親本的無毒性，因為所有32隻小鼠仍然健康而無明顯的疾病。因此，看來△cya菌株的無毒性不可能只是由於碳水化合物分解代謝的缺陷所致。
上述結果證明了鼠毒鼠傷寒沙門氏菌SR11菌株χ3306若干衍生物的構建，這些衍生物不能合成腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，而且它們具有或不具有pStSR100毒性質粒。儘管所有菌株經口服接種時均無毒性並且都能對毒性鼠傷寒沙門氏菌野生型細胞的攻擊誘發較高的保護免疫力，但含有△cya和△crp突變的
χ4062和χ4064仍是優先選擇的。使用帶有crp基因缺失的雙突變體能排除crp突變的回覆，此回復能在無需任何環化AMP的條件下允許需要CRP蛋白活化的基因和操縱子進行轉錄。類似地，crp基因的缺乏也能排除cms阻遏基因突變的回覆(該突變和crp基因緊密相連)並也可避免環化AMP的需要。雖然所試驗的△cya△crp＊或cms回復突變菌株仍保留無毒性，但並沒有對足夠的獨立的回覆突變分離菌進行毒性試驗，從而斷定毒性不能恢復，因此，不管這種變化是多麼不可能，△crp突變體應能排除這種毒性恢復。此外，△crpTn10突變有效地降低了鼠傷寒沙門氏菌的毒性(表4)，因此，即使在某些種類的基因轉移過程中失去△cya突變這種不大可能發生的情況下，△crp突變仍然賦予菌株無毒性。
仍具有pStSR100質粒的疫苗菌株χ4064能誘發比無質粒菌株χ4062更高的免疫力(表8)。這無疑得歸因於χ4064(圖1和圖2)和含質粒的菌株增加了這樣一種能力，即在隔膜淋巴結和脾中達到比無質粒菌株更高的效價和更長的持久性(見實例3)。另一方面，在年幼動物或營養不良或遭到損傷的個體中，對於用χ4064進行免疫的耐性不及用χ4062進行免疫的耐性。因此，如果兩種免疫都需要，應首先用χ4062而後用χ4064進行免疫。
疫苗菌株如χ4062和χ4064的一種期望的用途是，作為載體向腸系淋巴組織定向集群化或轉移毒性抗原(由來自其他病原體的基因表達)，從而誘發全身分泌免疫應答和體液及細胞免疫(如有需要的話)。因此，大量克隆載體已被導入χ4062和χ4064中，這些質粒表現出在野生型親本菌株中相等或更大的穩定性。事實上，χ4062和χ4064較慢的生長速率(表3)無疑提高了質粒複製跟上染色體複製的能力，從而確保子代細胞中含有質粒。此外，還構建了多種重組衍生物，而且發現集落抗原SpaA在△cyacrp突變體中的表達水平比在具有賦予無毒性的其他突變的鼠傷寒沙門氏菌中的表達水平更高，所述SpaA抗原對於使突變沙門氏菌(S.mutans)和S.sobrinus群集於唾液糖蛋白覆蓋的牙齒表面是必需的(Curtiss，J.Dent.Res.651034-1045，1986)。
實例2本實例說明如何將△cya、△crp突變體導入其他沙門氏菌種中，以使所說的種具有無毒性並因此能用作疫苗組分。
用來實行本發明此實例的沙門氏菌種包括亞利桑那沙門氏菌和雞沙門氏菌，以作為禽類沙門氏菌菌株。霍亂沙門氏菌作為專一於豬的沙門氏菌，S.dublin作為專一於牛的沙門氏菌以及許多由雞、火雞、小牛、豬和馬分離獲得的鼠傷寒沙門氏菌衍生物。這些菌株可用來構建帶有和不帶有毒性質粒的△cya△crp突變體，從而首先在小鼠中，而後在特定動物宿主中評價其保護性免疫力。這些無毒的沙門氏菌衍生物還可用來構建二價活疫苗菌株，以刺激對集群和其他細菌病原的毒性蛋白質的保護性免疫。具體地說，可以製備得到預防鳥沙門氏菌(B.avium)和大腸桿菌的疫苗，這兩種呼吸道病原體引起家禽的高發病率及死亡率，以及製備在馬群中引起馬腺疫的等鏈球菌的疫苗。
無毒沙門氏菌菌株的構建在培養基中具有帶有△〔gal-uvrB〕1005突變(此突變根據是否有半乳糖存在而分別導致光滑或粗糙表型)的cyaTn10或crpTn10的鼠傷寒沙門氏菌LT-2菌株可用來產生△cya△crp基因型。用P22HTint轉導可以將cyaTn10和crpTn10突變導入由各種宿主獲得的鼠傷寒沙門氏菌菌株、傷寒沙門氏菌、付傷寒沙門氏菌及其他帶有相似的O抗原的沙門氏菌中去。特異於粗糙型的普遍性轉導噬菌體plL4被用來將Tn10誘導的突變導入亞利桑那沙門氏菌、雞沙門氏菌、S.dublin和霍亂沙門氏菌中。上述沙門氏菌的plL4轉導要求將粗糙突變體分離。選擇2-脫氧半乳糖抗性會導致galE突變體。最後可通過plL4轉導除去galE缺陷，所說的plL4是在帶有野生型gal+基因的粗糙突變體上增殖的。
可以通過選擇菌株的萎
酸抗性衍生物來分離穩定的缺失突變體，所說的菌株含有cyaTn10和/或crpTn10插入突變。萎
酸抗性衍生物由於轉座子和相鄰宿主染色體基因的不精確切除而對四環素過敏。要想成功地使用Tn10，就必須證實萎
酸抗性衍生物已完全失去了Tn10(例如，可以採用λTn10載體作為雜交探針)。
去除毒性質粒的沙門氏菌菌株可以用為鼠傷寒沙門氏菌所發展的方法及遺傳工具來構建(見實例1和3)。在此構建環節可採用Way等人所描述的Tnmini-tet(Gene32369-79，1984)。將缺乏轉位酶並且不能自發缺失的轉座子插入到100kb毒性質粒的毒性相關區域中，所說的質粒很可能和S.dublin、雞沙門氏菌和霍亂沙門氏菌的毒性質粒同源(Popoff等人，Ann.Microbiol，(Inst.Pasteur)135A389-398，1984)。轉座子插段被轉導到其他種的galE突變體的同源順序中。通過使細菌在升高的溫度(約43℃)下在新生黴素(一種DNA解旋酶抑制劑)中生長來去除Tnmini-tet標記的毒性質粒。通過用32P標記的天然毒性質粒和去除質粒的衍生物雜交能夠證實毒性質粒的去除。
對所有構建的菌株確定其遺傳屬性的穩定性，並確定在鼠傷寒沙門氏菌突變體中顯示的表型也顯示在其他沙門氏菌種中。用以促進動物研究的最後一步是導入一種藥物抗性標誌，從而在動物試驗期間對跟蹤沙門氏菌菌株提供幫助。使用通常採用的萘啶酸抗性或利福平抗性，因為這些抗性在鼠、雞、火雞的正常菌叢中並不流行。
通過轉導將某些轉座子誘發的突變導入某些沙門氏菌種中去也許是不可能的。但利用結合法可能較好，它是將轉座子誘發的突變克隆在某質粒上，該質粒能從整合有IncF或IncP質粒的Hfr移入沙門氏菌中。轉化提供了另一種方法，其中所進行的步驟是，選擇順序進入染色體中的重組體、質粒的去除及證實精確的基因損傷。
免疫原性、集群化和持久性的評價前面構建的無毒沙門氏菌菌株可以通過對小鼠進行口服接種、胃插管或腹腔注射而進行評價。
在此方法中，首先使沙門氏菌菌株生長到對數期，然後在有明膠的緩衝鹽水中將它們濃縮到接近1010細胞/ml。要口服接種或胃插管的動物在接種前4小時停止進食和水。在接種前5分鐘向小鼠施用碳酸氫鈉以中和胃酸。接種後30分鐘可以讓小鼠進食和水。根據以前在小鼠上使用鼠傷寒沙門氏菌突變菌株的實驗，一般對於小鼠的攻擊劑量為103LD50。如果對各種野生型沙門氏菌的LD50不及在鼠毒鼠傷寒沙門氏菌中觀察到的劑量高，則此劑量就可能是不切實際的。這一點對於口服接種更成問題，因為施用109以上的生物是很困難的。由腹腔接種也可用達到此水平的劑量進行，這將導致內毒素休克(約107細胞)。每月記錄1次動物的重量和健康狀況。
對接種了突變沙門氏菌菌株、存活30天的小鼠用103LD50毒性沙門氏菌親本菌株進行口服或腹腔攻擊。受感染動物的健康狀況可通過每天定期測定其增長速度確定。在進行攻擊前，通過毛果鹼刺激獲取唾液試樣，對每隻動物抽血以收集其血清。然後確定針對沙門氏菌表面抗原的唾液中分泌的IgA和IgG以及血清中IgA和IgG的定量滴度。還測定二次免疫對抗體滴度和免疫持久性的影響。
無毒並能誘發較高免疫力且對體重增加無不利影響的疫苗菌株可用來確定菌株的定量滴度，所說菌株是附著在小腸和結腸的壁上，存在於淋巴集結、小腸和結腸內容物中、隔膜淋巴結中和脾中，測定時間可在4、24、48、72、96小時及以後一周間隔(如有必要)進行。其結果與獲得的免疫應答的數據有關。
然後用對小鼠無毒且致免疫的菌株在適當的動物種中進行試驗，例如亞利桑那沙門氏菌、雞沙門氏菌、鳥類的鼠傷寒沙門氏菌在雞和火雞幼禽中進行測試。確定了在禽類宿主中的無毒性及致免疫性以後，測定沙門氏菌在嗉囊、盲腸和法布裡齊奧氏囊中的毒性滴度，還包括所檢查的鼠組織。
針對禽類博德特氏菌免疫的二價疫苗菌株的構建及檢測針對禽類博德特氏菌的疫苗應表達這種表面結構，該結構涉及到集群化和抗原性，但又不是皮膚壞死毒素的毒性決定子。針對表面蛋白的疫苗應該通過阻斷氣管的集群化產生免疫力，而針對皮膚壞死毒素的抗體應當中和其不利影響。雖然還不了解涉及集群化的禽類博德特氏菌的表面結構，但在λgt11表達載體中的禽類博德特氏菌的基因文庫和轉座子誘發的禽類博德特氏菌突變體的可得性，使得能夠分離和鑑別編碼表面蛋白質的基因。通過將含有表面蛋白質和/或皮膚壞死毒素決定子基因的重組質粒導入無毒沙門氏菌中，就能通過阻斷集群化(並因此鑑別涉及集群化的基因)或中和毒素而選擇出誘發保護性免疫的二價菌株。
根據Curtiss法(ManualofMeth.inBacteriol.，ASM，Washington，D.C.，1981)，通過轉化將禽類博德特氏菌外膜蛋白質和/或皮膚壞死毒素的基因轉移至適當的無毒亞利桑那沙門氏菌、雞沙門氏菌和/或鼠傷寒沙門氏菌衍生物中，這些蛋白質的表達可用Western斑點印跡法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA764350-54，1979)進行檢查。在進行轉化前，在50℃下用5分鐘熱休克來克服沙門氏菌中的任何限制性障礙。以前的報告已經表明，博德特氏菌基因在大腸桿菌中不能有效地表達，除非它們是由大腸桿菌啟動子轉錄的。這一關於禽類博德特氏菌基因表達和蛋白質向沙門氏菌外膜轉移的問題可通過利用一種重組載體而消除，在該載體中，所說基因融合在大腸桿菌LamB或ompA基因中。此外，一旦二價疫苗菌株群集於淋巴集結，則禽類博德特氏菌蛋白質將轉移到沙門氏菌外膜並提高激起強免疫應答的可能性。當禽類博德特氏菌插入沙門氏菌中以後，就可以利用由Chorbit等人(EMBOJ.53029-37，1986)公開的方法，通過利用特異抗體的集落免疫斑點和免疫標記的沙門氏菌的電鏡法分析重組體克隆中基因的表達。
用二價疫苗口服免疫接種到1-3天齡的幼禽上，觀察其血清和呼吸道分泌物以確定抗體應答的類型〔IgY(IgG、7SIg)，IgM，IgA(IgB)〕及數量。比較免疫和未免疫的幼禽的體重減少以觀察二價疫苗可能的付作用。另外，對火雞幼禽由鼻內接種109有毒禽類博德特氏菌，或將它們暴露於感染鳥群中進行攻擊。對受攻擊的火雞幼禽進行疾病觀察、屍體剖檢，察看其氣管組織損傷以及生物滴度的變化。
如果針對禽類博德特氏菌的黏膜免疫應答不足以保護年幼的雞和火雞，可以改對下蛋母雞免疫接種表達禽類博德特氏菌集群化和/或毒性抗原的無毒沙門氏菌，以使母體抗體通過雞蛋轉移。隨著幼雞或火雞幼禽逐漸長大，這種處理將增加其針對禽類博德特氏菌的免疫性能。在生長期間也可以利用同樣的重組載體對其進行保護性的口服免疫。
對禽類大腸桿菌免疫的二價疫苗菌株的構建及檢測通過上述方法，將使無毒大腸桿菌毒性增加或使其具有集群於小雞氣囊能力的重組體克隆導入雞沙門氏菌和/或鼠傷寒沙門氏菌的無毒菌株中。用螢光抗體技術確定毒性決定子在沙門氏菌細胞表面的表達，但應該注意，大腸桿菌細胞表面決定子也可能表達在沙門氏菌的表面。
將二價疫苗菌株口服免疫接種到雞中，並將有毒大腸桿菌注射到其尾氣囊中進行攻擊。如果沒有發展敗血症，可將雞進行屍體剖檢以確定集群於氣囊的能力是否受到影響。接著，如前面對火雞幼禽所述，對呼吸分泌物和血清中抗體應答的類型、數量及持續時間作綜合研究。
疫苗的施用及測定技術和前面對禽類博德特氏菌疫苗一樣。
針對等鏈球菌免疫的二價疫苗菌株的構建及檢測已經構建了表達等鏈球菌M蛋白質的鼠傷寒沙門氏菌的無毒衍生物。
將等鏈球菌M蛋白質基因的DNA酶Ⅰ產生的隨機片段克隆到λgt11表達載體中。然後用能夠誘導保護性免疫的針對M蛋白片段的抗血清，和存在於帶有出血性紫癜的馬免疫複合物中的針對M蛋白決定子的抗血清對文庫進行順序篩選。選擇能表達保護作用但不產生紫癜的克隆基因，將它們融合到LamB或ompA基因中。首先在小鼠身上研究針對攜帶這些決定子的無毒沙門氏菌的免疫應答，然後再在小馬和大馬身上研究。
在其表面表達等鏈球菌M蛋白質的相關抗原決定基的所述沙門氏菌菌株的可用性，構成了激活針對馬腺疫的黏膜性鼻咽保護性免疫應答的有效途徑。M蛋白質中產生紫癜的決定子的切除能增加疫苗的安全性。
實例3此實例說明毒性質粒缺失對幾種沙門氏菌菌株的免疫原性及毒性的影響。
細菌菌株此實例中所用的細菌菌株列於表10中，並附有質粒說明。使用了三種鼠傷寒沙門氏菌菌株來自小鼠的有毒菌株SR-11和SL1344及毒性較小的菌株LT2。大腸桿菌HB101和C600用於遺傳操作中。
培養基和生長條件除非另有說明，否則細菌都是生長在L肉湯中或在L瓊脂平皿上(Lennox，Virology1190-206，1955)，並補充有下列濃度的(μg/ml)的合適抗菌素氨苄青黴素(Amp)100-200，四環素(Tet)12.5-25，氯黴素(Chl)30，卡那黴素(Kan)50，鏈黴素(Str)50和萘啶酸(Nal)50。為了便於粘附、侵入及巨
噬細胞感染，可將某些培養物在腦心浸液培養基(Difco，Detroit)中生長，因為這種培養基能增加細菌對所用哺乳動物細胞的粘附力。所有培養物都在37℃下在適當培養基中靜置生長過夜，然後再使它們在震動培養基中生長至對數期(OD600約0.4～0.7)。
遺傳交換轉化過程採用Bagdasarian和Timmis方法(Curr.Top.Microbiol.Immunol.9647-67，1981)進行。以噬菌體P22HTint作為媒介的轉導過程按Schmeiger所述的方法(Mol.GenlGenet.11975-88，1972)進行。結合過程既可以通過平皿接合，也可以通過濾器接合(Willetts，Meth.inMicrobiol.1733-58，1984)。
DNA操作利用Birnboim法(Meth.Enzymol.100243-255，1983)進行大規模、快速提取微量溶菌產物質粒。用標準方法進行氯化銫密度梯度離心、Southern斑點印跡雜交、集落斑點雜交和凝膠電泳等。根據製造者的指示，用〔r-32p〕ATP(Amershem，Arlington Heights，Ill.;比活1445Ci/mmol)進行的DNA缺口翻譯由Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，Md.(BRL)的藥盒進行。限制酶消化則由來自BRL的酶根據生產廠家的說明進行。
用Tnmini-tet標記鼠傷寒沙門氏菌的100Kb質粒用具有Tnmini-tet的pNK861(Way等，Gene 32369-79，1984)轉化含有pStLT100的菌株χ3000。Tnmini-tet基本上就是倒位重複中Tn10的TetR基因。通過利用FTn5在不相容的來自χ3000(pNK259，FTn5)的質粒pNK259中的轉移，從而將pNK861排除在AmpR、TetRχ3000(pStLT100，pNK861)文庫之外。為了選擇Tnmini-tet的在由F轉移的100kb質粒中的插段，需將χ3000Tnmini-tet(pNK259，FTn5)文庫與大腸桿菌HB101進行接合併選擇TetR、KanR和StrR。HB101中潛在的Tnmini-tet標記的100kb質粒通過選擇TetR和NalR又轉回到鼠傷寒沙門氏菌菌株χ3147中。排出好幾種不具有FTn5的NalR、TetR、KanS分離物。
利用以噬菌體P22HTint為媒介的轉導過程，將100kb質粒中的Tnmini-tet插段轉導到每一個含有100kb質粒的野生型鼠傷寒沙門氏菌菌株中。篩選TetR轉導體中增大的100kb質粒和與親本質粒具有不同限制酶圖譜的轉導體。
另一種分離pStLT100Tnmini-tet插段的方法是由χ3000(pStLT100，pNK861)獲取質粒DNA，並轉化大腸桿菌HB101(pNK259)，選擇TetR和ChlR。
去除鼠傷寒沙門氏菌中Tnmini-tet標記的100kb質粒使100kb質粒中帶有Tnmini-tet插段的鼠傷寒沙門氏菌菌株經受兩種去除過程-在43℃生長或在含有新生黴素的肉湯中生長。對於每一種去除過程，每天都要對Tnmin-tet標記的菌株給以少量接種物(103-104集落形成單位，CFU)。當培養物達到靜止期時(OD600約0.9)，將其一部分稀釋並在含有萎
酸的L瓊脂上進行平皿培養。然後，從萎
酸抗性集落中篩選TetS，然後利用微量溶菌產物分析法檢查萎
酸抗性和TetS的質粒含量。去除型衍生物進一步利用32P標記的pStSR100通過微量溶菌產物的Southern斑點印跡雜交法和細菌細胞的集落斑點雜交法進行檢查，從而證實已經去除並且沒有染色體整合的質粒。
小鼠感染用7-10周齡的雌性BALB/c小鼠(HarlanSprague/Dawley〔Indianapolis〕和Sasco〔St.Louis〕)進行所有的動物感染實驗。較大的小鼠用來獲取腹膜巨噬細胞。由不同年齡的雄鼠獲取正常鼠血清。
對於口服接種，小鼠須6小時不進食和水，然後餵入50μl10%(重量/體積)的碳酸氫鈉，而後再餵入20μl懸浮於含有0.1%(重量/體積)明膠的緩衝鹽水中的細菌(BSG)。口服接種是將微量移液管尖直接放在門牙之後以避免損壞口腔黏膜。小鼠在接種後30分鐘餵入食物和水。
在皮下接種及側向尾部靜脈接種時，用0.1-0.2ml懸浮於BSG中的細菌注射放鬆的小鼠。
檢查受感染小鼠的器官和組織以確定是否存在沙門氏菌，具體過程如下利用CO2窒息法將小鼠殺死。無菌摘取脾臟並勻漿於2.5ml BSG中，勻漿既可在備有小杯的OMNI混合器(Dupont，Wilmington，Del.)中進行，也可在玻璃組織勻漿器中進行。從小腸上摘取淋巴集結，通過在2ml BSG中攪動衝洗2次，將衝洗過的淋巴集結勻漿於2.5ml BSG中，該過程既可在OMNT混合器中進行，也可在含有玻璃珠的玻璃管中攪動進行。隔膜淋巴結用玻璃組織勻漿器勻漿於2.5ml BSG中。將組織和器官勻漿的稀釋液塗在含有合適抗菌素的L瓊脂平皿上。
統計方法為了對用野生型或去除型鼠傷寒沙門氏菌感染的小鼠組織中的CFU作出比較，先確定幾何平均值，並利用單向跟蹤的Student氏t試驗與野生型CFU(大於去除型CFU)作比較。為了分析混合感染，利用單向跟蹤的Student氏t試驗，將來自單個小鼠的野生型與質粒去除型CFU的比值的幾何平均值與其常用對數平均值大於0(即比值大於1)的比值作比較。採用Reed和Muench法(Amer.J.Hyg.27493-497，1938)確定小鼠LD50值。組織培養物中的細菌CFU和巨噬細胞感染通過雙向跟蹤的Student氏t試驗比較CFU平均值/孔。
100kb質粒在鼠傷寒沙門氏菌菌株中的存在所研究的三種鼠傷寒沙門氏菌菌株都具有100kb質粒(圖3)。此外，χ3339還具有90kb和8kb兩種質粒。在此研究中，對鼠傷寒沙門氏菌菌株的100kb質粒採用下述的三部分命名系統。為了識別象鼠傷寒沙門氏菌這樣的血清型，使用「St」符號。後面是菌株符號(LT2中的「LT」，SR-11中的「SR」，SL1344中的「SL」)。最後用數字符號區別野生型質粒(100)或衍生物(101代表特異的Tnmini-tet插段等)。因此菌株SR-11的野生型質粒就是pStSR100。利用限制性酶消化分析純化的質粒製備物，用HindⅢ(圖4)和EcoRⅠ(數據未示出)在三種菌株的100kb質粒中都得到完全相同的圖譜。去除100kb質粒的SL1344、χ3340的限制性酶消化(圖4，f道)表明，相應於pStLT100(圖4，b道)和pStSR100(圖4，c道)的帶已喪失。而這兩個帶存在於χ3339中(e道)。因此，本研究中所檢查的三種鼠傷寒沙門氏菌菌株的每一種100kb質粒即使不是完全相同，也是非常相似的。
菌株構建用Way等人(見上)所述的轉座子Tnmini-tet標記帶有Tet抗性標記的100kb質粒。Tnmini-tet(一種Tn10衍生物)在倒位重複中不具有IS10R轉化酶基因，因此轉化酶基因在由供體質粒(pNK861)轉位時喪失，因此不能作為Tnmini-tet轉位或缺失的媒介。因此，Tnmini-tet插段要比親本的插段(Tn10)穩定得多。
Tnmini-tet插入到菌株χ3000的100kb質粒中(導致pStLT101形成)後，使得能以10-6-10-7/細胞/代的頻率在新生黴素中或在43℃生長以後選擇去除100kb質粒的衍生物，從而產生χ3334。將相同的Tnmini-tet插段轉導到χ3339和χ3306中，並用來去除這些菌株中的100kb質粒，分別產生χ3340和χ3344。χ3340保留有90kb和8kb質粒(圖3，h道)。通過來自洗淨的溶菌液的質粒DNA的凝膠電泳(圖3)，以及通過用32P標記的pStSR100使微量溶菌產物進行Southern印跡雜交與溶解細菌的集落斑點雜交(數據未給出)，可以證明100kb質粒已被去除。去除型衍生物不能進行集落斑點雜交表明，沒有染色體整合的質粒存在。沒有觀察到具有整合質粒的去除質粒的衍生物。
通過轉化將χ3000，pStLT101和χ3306，pStSR101的Tnmini-tet標記質粒導入去除型衍生物中，分別產生χ3347和χ3338。pStSR101被轉化到χ3340中，從而產生χ3351(表3，圖3，i道)。
小鼠毒性確定野生型、去除型和再轉化的衍生物對於BALB/c小鼠的口服LD50劑量(表11)。小鼠排出的χ3306和
χ3339的口服LD50分別是3×105CFU和6×104CFU，而χ3000的口服LD50量大於108CFU。各種去除型衍生物的口服LD50都大於108CFU。用χ3337和χ3340感染的小鼠出現病症，且偶有死亡。用100kb質粒再轉化的衍生物的LD50恢復到親本野生型菌株的水平。這證實去除型衍生物的遺傳損害事實上就是100kb質粒的喪失。
表11野生型和去除100kb質粒的鼠傷寒沙門氏菌的小鼠LD50值a(CFU)菌株100kb質粒口服皮下SR-11χ3306 + 3×105＜50χ3337 - ＞108＜50bχ3338 + 105＜50SL1344χ3339 + 6×104＜50χ3340 - ＞6×108400χ3351 + ＜5×104＜50LT2-2χ3000 + ＞1082×103χ3344 - NTc2×103χ3347 + ＞109NTa用Reed和Meunsch法確定(見上)bχ3337的平均死亡時間(12.3天)大於χ3306
的(7.0天)(p＜0.001，Student氏t試驗)cNT未測野生型和去除型衍生物的皮下LD50值與口服LD50值不一樣(表11)。χ3306和χ3339的皮下LD50小於50CFU，每一種接種物達到100%死亡率。χ3306、χ3337的去除型衍生物還殺死大多數注射量低於50CFU的小鼠。但是χ3337的平均死亡時間(12.3天)高於χ3306的(7.0天)(p＜0.001，單向跟蹤的Student氏試驗)。而去除100kb質粒的SL1344，χ3340的皮下LD50都由低於50CFU提高到400CFU。Tnmini-tet標記的100kb質粒再導入χ3340中則恢復到野生型的皮下LD50值。野生型和去除型LT2菌株的皮下LD50大約分別為2000CFU。
菌株SR-11和LT2之間質粒交換的效應在口服時，菌株LT2的毒性比菌株SR-11的要小得多(表11)。為了確定這兩種菌株的100kb質粒在此毒性差別中是否起作用，將每一種100kb質粒的Tnmini-tet衍生物轉化到異源去除型菌株中。被109CFU具有pStLT101或pStSR101的菌株SR-11感染的小鼠在接種後7天死亡，而具有任一種質粒的菌株LT2卻無毒(口服接種109CFU)。因此，菌株LT2的無毒並不是由於缺乏100kb質粒。除了通過將SR-11質粒、pStSR101導入菌株SL1344以產生毒性χ3351的結果(表11)以外，這一結果也證明這三種菌株的100kb質粒在功能上是等價的。
口服接種後的發病機理野生型和去除型衍生物之間經口服比經皮下途徑存在更為明顯的毒性差別提高了這種可能性即100kb質粒涉及在腸道中的毒性，而不是涉及後來的疾病侵入階段。為了檢查這種可能性，用野生型SR-11，χ3306或100kb質粒去除的SR-11，χ3337口服感染小鼠，並在感染後不同時間檢查其淋巴集結和脾中的鼠傷寒沙門氏菌。三種實驗的綜合結果示於圖5中。感染後3小時，在淋巴集結可以觀察到很少量的鼠傷寒沙門氏菌(＜100CFU)。這不是接種物由口腔向腸無效通過的結果，因為在接種後2小時內，差不多100%接種物由腸道(基本是大腸內容物)回收。進一步，小腸內容物中的CFU在接種後3天，野生型和去除型的SR-11彼此相等。在接種後1-2天內，淋巴集結裡的CFU就逐漸地增加到103-104CFU，而脾中的CFU仍然較低。在接種後3天，淋巴集結和脾所具有的野生型χ3306比去除型χ3337多得多。淋巴集結中CFU的差別不是一直可在不同實驗中觀察到的，這是因為各個時刻指示的數據都是短暫的。但是，脾中χ3306、χ3337的CFU顯著不同，χ3306對於χ3337的超出值逐漸增大，直到用χ3306感染的小鼠在接種後第8天死亡。脾中χ3337達到104CFU的數量級，並且直到接種後25天仍可檢測到。因此，口服接種後，野生型和有毒質粒被去除的鼠傷寒沙門氏菌SR-11之間在發病機理上的基本差別在於鼠傷寒沙門氏菌達到脾中和/或繁殖的數量。
為了更準確地比較野生型和質粒去除的SR-11的相對毒性，需用TetR，野生型SR-11，χ3456和NalR，去除質粒的SR-11，χ3337進行混合感染實驗。對每隻小鼠確定其野生型CFU與質粒被去除的CFU的比率。此外，還需確定隔膜淋巴結的CFU比率，因為隔膜淋巴節是由淋巴集結向脾侵入過程的中介。觀察每隻鼠之間的CFU的大範圍及比率，分析比率的幾何平均值。三種實驗的綜合結果示於圖6中。與用野生型或去除質粒的鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠進行的實驗所觀察到的一樣(圖5)，一直到接種後第3天，當野生型與去除型的比率在淋巴集結、隔膜淋巴結和脾中分別為11∶1、200∶1和79∶1時，才在混合感染的小鼠中檢測到淋巴集結或脾中存在明顯的CFU差別。在接種後第4天，只有脾的比率明顯大於1.0(比率＝160∶1)，而淋巴集結和隔膜淋巴結的比率分別為1.5∶1和13∶1。另外，與在分別感染的小鼠中所看到的一樣，在接種後3天出現短暫的差別後，淋巴集結中野生型和去除型SR-11的CFU幾乎相等。接種後5天，隔膜淋巴結和脾所具有的比率分別為200∶1和1600∶1，淋巴集結的比率為1.1∶1。接種後第7天，只有一隻小鼠存活，其淋巴集結、隔膜淋巴結和脾的比率分別為2.1∶1，290∶1，210∶1。相對於淋巴集結，各種器官中CFU的最大差別是在脾和隔膜淋巴結中。在接種後3、4、5天，脾中比率顯著大於淋巴集結的比率，在接種後第3、5天，隔膜淋巴結的比率顯著大於淋巴集結的比率(圖6)。
通過口服感染小鼠研究野生型SL1344，χ3339和100kb質粒被去除的SL1344，χ3340的發病機理。兩種試驗的結果示於圖7中。接種後3天，在野生型和去除型SL1344之間，看不到淋巴集結、隔膜淋巴結或脾中CFU存在明顯差別。在接種後7-8天，可以看到三種器官中野生型χ3339數目明顯大於去除型χ3340的。而在隔膜淋巴結和脾中能看到比在淋巴集結中更大的差別。進一步，在此實驗之一中，淋巴集結的CFU差別是不明顯的。因此，隔膜淋巴結和脾的感染代表野生型和100kb質粒去除的SL1344之間在發病機理上主要而一致的差別。接種後14天，所有感染野生型χ3339的小鼠都死亡，而感染去除型χ3340的小鼠其淋巴集結和脾中分別感染了2×103CFU和6.3×103CFU。在接種後31天，感染χ3340的小鼠的淋巴集結和脾中分別具有400CFU和320CFU。因此在口服接種後，去除100kb質粒的SL1344能在淋巴集結和脾中存活更長的時間。
靜脈接種後脾的感染上述結果表明，100kb質粒主要與口服接種後由淋巴集結向隔膜淋巴結和脾的侵入有關，而不是與淋巴集結感染或更早的過程有關。為檢查鼠傷寒沙門氏菌在脾中的生長情況，用野生型SR-11，χ3456和去除質粒的SR-11，χ3337的混合物靜脈接種到小鼠上，並監視脾的CFU(表12)。當小鼠由靜脈接種105CFUχ3456和χ3337時，在接種後1小時，這些菌株被同等地清除到脾中。因此，100kb質粒的存在不會影響血液清除。用1×103到4×103CFUχ3456和χ3337的混合物由靜脈接種到其他小鼠身上。在接種後4天，檢測不到脾中CFU存在明顯的差別(表12)。但是，在接種後6-7天，野生型與由脾回收的去除型鼠傷寒沙門氏菌的比率為11.5∶1。此刻，脾中χ3456和χ3337的平均量分別為2.7×106和2.3×105CFU。因此，去除質粒的SR-11能在靜脈接種後在脾中存活並複製更長的時間。靜脈接種後1周，脾中野生型與去除型SR-11的比率為11.5∶1，而口服接種後5和7天，該比率為1600∶1和210∶1，兩者之間形成鮮明對比。由靜脈混合接種獲得的比率之所以較低，其原因不是χ3456和χ3337之間的協同作用，因為在接種後第6天，單用2×103CFUχ3337感染的小鼠或用混合了等量χ3456的χ3337感染的小鼠，其脾中χ3337水平的平均值均為2.3×105CFU(表12)。
表12 小鼠靜脈接種以後脾的感染a接種後時間1小時b4天c6-7天cCFUχ3456d1.9×1054.6×1042.7×106CFU3337d1.4×1052.5×1042.3×105e比率(χ3456∶1.3∶11.8∶111.5∶1χ3337)f(P＜0.0025)比率±SD90.11±0.25 0.26±0.38 1.06±0.39a.小鼠用等量的野生型χ3456和去除100kb質粒的χ3337混合物由靜脈接種，n＝3-5隻小鼠b.接種物＝χ3456和χ3337各5×105CFUc.接種物＝χ3456和χ3337各1×104-4×104CFU(每次實驗給予相等的接種物)d.來自脾的CFU的幾何平均值e.接種後6天，單用2×103CFUχ3337感染的小鼠脾中具有2.3×105CFUχ3337f.χ3456∶χ3337比率的幾何平均值(對於比率＞1.1者作單向跟蹤的Student氏t試驗的P值)
g.比率的常用對數平均值±統計分析中所用的標準偏差去除質粒的鼠傷寒沙門氏菌在口服接種後能在淋巴集結中擴增併到達隔膜淋巴結(圖5、6、7)。但是，一直發現野生型與去除質粒的鼠傷寒沙門氏菌之間向隔膜淋巴結和脾侵入的能力具有差別。還證實在口服接種小鼠以後，野生型鼠傷寒沙門氏菌在感染脾方面更為有效(野生型對去除型比率為1600∶1，圖6)。但是，即使是去除型衍生物所達到的脾水平也高達104CFU，並一直到接種後31天還可在脾中檢測到(圖5)。在用野生型和去除型SR-11的混合物口服接種以後，脾中和隔膜淋巴結中所發現的野生型與去除型SR-11的比率明顯高於淋巴集結中的(圖6)。
去除質粒的SR-11和SL1344的皮下LD50分別小於50CFU和400CFU，這表明去除100kb質粒的鼠傷寒沙門氏菌通過此途徑接種時仍保持較大的毒性。必須注意的是，沒有一種去除型菌株與32P標記的毒性質粒雜交，因而不存在能產生毒性的染色體整合的該質粒的拷貝。研究了野生型和去除型菌株在靜脈接種後感染脾的能力，發現用野生型和去除型鼠傷寒沙門氏菌混合物靜脈接種後1周，脾中CFU出現明顯差別(野生型與去除型的平均比率為7.5∶1和20∶1)。靜脈接種後脾中CFU的差別沒有口服接種後5-7天的大(1600∶1和210∶1倍)。這些實驗再次證明去除質粒的鼠傷寒沙門氏菌在脾中能達到較高的數量並進行擴增，而且100kb質粒對發病機理的最大影響是在口服接種之後。我們假定去除100kb質粒的鼠傷寒沙門氏菌由皮下接種時仍保持毒性，這是因為該細菌能在細胞外快速擴增，在腹腔中沒有被有效地吞噬掉;因此，在小鼠能夠通過巨噬細胞清除細菌以控制感染之前就會發生不可克服的感染。當口服施用時，假設全部或大多數侵入細菌在到達隔膜淋巴結時是位於細胞之內。
權利要求
1.一種使脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，它包括一種病原微生物的無毒衍衍物，所述衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質。
2.根據權利要求1的疫苗，其中的微生物能夠表達由所述脊椎動物或非脊椎動物的病原體分離得到的重組基因，從而產生一種抗原，它能在所述脊椎動物或非脊椎動物中誘發針對該病原體的免疫應答。
3.根據權利要求2的疫苗，其中所述重組基因編碼一種具有藥理活性的產物。
4.根據權利要求1或2的疫苗，其中所述的病原微生物是一種細菌。
5.根據權利要求4的疫苗，其中所述的細菌是志賀氏菌屬、歐文氏菌屬、耶爾森氏菌屬、巴斯德氏菌屬、拉基歐氏菌屬或布魯氏菌屬。
6.根據權利要求4的疫苗，其中的細菌屬於寄宿於所說脊椎動物淋巴上皮結構的種或屬於感染所述非脊椎動物的種。
7.根據權利要求6的疫苗，其中所說的細菌是沙門氏菌屬或沙門氏菌一大腸桿菌雜種。
8.根據權利要求7的疫苗，其中所述細菌是由下組中選出鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、付傷寒沙門氏菌、雞沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、S.dublin、霍亂沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌。
9.根據權利要求1到8中任一項的疫苗，其中所述病原體是病毒、細菌、原生動物、寄生蟲或真菌。
10.根據權利要求9的疫苗，其中所述病原體是淋病萘瑟氏菌、沙眼衣菌、突變鏈球菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、鈀密螺旋體、Neisseria maningitidis、肺炎分枝支原體、流感嗜血桿菌、百日咳博德特氏菌、禽類博德特氏菌、大腸桿菌或等鏈球菌。
11.一種用於脊椎動物或非脊椎動物宿主蛋白質合成的載體微生物，它包括一種病原微生物的無毒衍生物，所述衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，但能夠表達由脊椎動物宿主分離得到的重組基因，從而得到一種能夠在所述脊椎動物或非脊椎動物中抑制、調節或增強免疫應答的產物。
12.根據權利要求11的微生物，其中所述的載體微生物是一種細菌。
13.根據權利要求11或12中的微生物，其中所述的細菌是沙門氏菌屬或沙門氏菌-大腸桿菌雜種，而且該細菌是寄宿於所述脊椎動物的淋巴上皮結構或感染所述的非脊椎動物。
14.根據權利要求13的微生物，其中所述的細菌是鼠傷寒沙門氏菌。
15.一種激活脊椎動物或非脊椎動物中免疫系統的方法，該方法包括下列步驟向所說的脊椎動物或非脊椎動物施用權利要求1到10中任一項中的疫苗。
16.一種激活、調節脊椎動物或非脊椎動物免疫系統或使其脫敏的方法，它包括下列步驟向所說的脊椎動物或非脊椎動物施用權利要求1到10中的任一項所述的疫苗。
17.一種製備病原微生物的無毒衍生物的方法，所說的衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，該方法包括通過DNA重組技術或轉座子誘變使病原微生物發生突變，即使腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白的基因形成缺失突變，並將所說的衍生物進行分離。
全文摘要
本發明提供了一種用於脊椎動物或非脊椎動物免疫的疫苗，該疫苗包括病原微生物的一種無毒衍生物，所說的衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質。本發明還提供了另一種用於脊椎動物或脊椎動物免疫的疫苗，該疫苗包括病原微生物的一種無毒衍生物，其中所說的衍生物基本上不能產生功能性腺苷酸環化酶和環化AMP受體蛋白質，但卻能表達由所述脊椎動物的病原體分離得到的重組基因，從而產生一種抗原，它能夠在所述脊椎動物中誘發針對所述病原體的免疫應答。
文檔編號C12HGK1030018SQ8810431
公開日1989年1月4日 申請日期1988年6月4日 優先權日1987年6月4日
發明者羅伊·柯蒂斯 申請人:分子工程合伙人有限公司