抑制vegf-a受體相互作用的結合蛋白的製作方法

2024-04-03 06:17:05

專利名稱：抑制vegf-a受體相互作用的結合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及對VEGF-A特異的重組結合蛋白，以及編碼這類VEGF-A結合蛋白的核酸，包括這類蛋白的藥物組合物，和這類蛋白在治療腫瘤和眼病中的用途。
背景技術：
血管生成(從先存在的血管生長出新的血管)，是數種病理狀況下的關鍵過程，包括腫瘤生長和眼病，尤其是眼的新生血管形成疾病，諸如老年性黃斑變性(AMD)或糖尿病黃斑水腫(DME) (Carmeliet, P.，Nature 438，932 - 936, 2005)。血管內皮生長因子 (VEGFs)刺激血管生成和淋巴管生成，通過激活內皮細胞中的VEGF受體(VEGFR)酪氨酸激酶(Ferrara, N.，Gerber, H. P. and LeCouter, J.，Nature Med. 9，669 - 676，2003)。哺乳動物VEGF 家族由稱為 VEGF-A，VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (亦稱為 FIGF)和胎盤生長因子(P1GF，亦稱為PGF)的5種糖蛋白組成。VEGF-A已被證明是抗血管生成療法的有效靴標(Ellis, L. Μ. and Hicklin, D. J. , Nature Rev. Cancer 8, 579-591， 2008)。VEGF-A配體結合併活化3種結構類似的III型受體酪氨酸激酶，稱為VEGFR-I (亦稱為FLT1)，VEGFR-2 (亦稱為KDR)和VEGFR-3 (亦稱為FLT4)。VEGF配體對這些酪氨酸激酶受體中的每一種都具有獨特的結合特異性，這有助於它們功能的多樣性。響應配體結合，VEGFR酪氨酸激酶激活不同下遊信號傳導途徑的網絡。VEGFR-I和VEGFR-2主要發現於血管內皮，而VEGFR-3大部分發現於淋巴內皮。這些受體都具有胞外結構域，單跨膜區和被激酶插入結構域中斷的共有酪氨酸激酶序列。最近，神經氈蛋白(NRP-I)(最初被鑑定為神經元指引介質的腦信號蛋白/腦衰蛋白家族的受體)，被證明作為VEGF-A的同種型特異性受體。各種同種型的VEGF-A已知由VEGF-A基因內8個外顯子的選擇性剪接產生。所有同種型包含外顯子1-5和末端外顯子，外顯子8。外顯子6和7 (編碼肝素-結合結構域)可以被包括或排除。這產生依據它們的胺基酸數目命名的蛋白家族VEGF-A165，VEGF-A121， VEGF-A189等。但是，外顯子8在核苷酸序列中包含兩個3』剪接位點，這可以被細胞使用產生具有相同長度的兩個家族的同種型，但C端胺基酸序列不同(Varey，Α. H. R. et al., British J. Cancer 98，1366-1379，2008)。利用外顯子8中最接近序列(導致包括外顯子8a)產生VEGF-Axxx ("xxx"表示成熟蛋白的胺基酸數目)(促血管生成家族的同種型)。 最近描述的抗血管生成VEGF-Axxxb同種型是利用遠端剪接位點(從鄰近的剪接位點沿著基因66 bp更遠)產生。這導致剪接出外顯子8a，以及產生編碼VEGF-Axxxb家族的mRNA 序列。VEGF-A165是主要的促血管生成同種型，通常在各種人實體瘤中過表達。VEGF-A165b 是鑑定出的第一個外顯子8b編碼的同種型，顯示具有抗血管生成作用(Varey et al.,在上述引文中；Konopatskaya, 0. et al. , Molecular Vision 12，626—632，2006)。它是VEGF-A的內源抑制形式，其降低VEGF-A誘導的內皮細胞增殖和遷移。儘管它可以結合 VEGFR-2, VEGF-A165b結合不引起受體磷酸化或下遊信號傳導途徑的活化。存在數種方法抑制VEGF-A信號傳導，包括通過抗體中和配體或受體，以及利用酪氨酸激酶抑制劑阻斷VEGF-A受體活化和信號傳導。VEGF-A靶向療法已被證明是AMD，DME，腎細胞癌和肝細胞癌中有效的單一治療劑，而對轉移性結腸直腸癌、非小細胞肺癌和轉移性乳腺癌患者來說只有當其與化療聯用時才是有益的(Narayanan，R. et al. , Nat Rev. DrugDiscov. 5，815-816，2005 ；Ellis and Hicklin,在上述引文中)。除了抗體，可以使用其他結合結構域來中和配體或受體(Skerra，Α., J. Mol. Recog. 13，167-187，2000 ；Binz, H. K.，Amstutz, P. and Pluckthun, Α.，Nat. Biotechnol. 23，1257-1268, 2005)。這類新型結合結構域基於設計的重複結構域(TO 02/20565 ；Binz, H. K. , Amstutz, P., Kohl, Α., Stumpp, Μ. Τ. , Briand, C. , Forrer, P.，Grutter, Μ. G.，and Pluckthun, Α.，Nat. Biotechnol. 22，575-582，2004)。WO 02/20565描述了如何構建重複蛋白的大文庫以及它們的一般應用。儘管如此，WO 02/20565 既沒有公開具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域的選擇，也沒有公開特異性結合 VEGF-Axxx的重複結構域的具體重複序列基序。用現有療法靶向VEGF-A不是在所有患者中都是有效的，或針對所有疾病有效的(例如，表達EGFR的癌症)。以下事實甚至變得日益清楚，與VEGF-A靶向療法有關的治療益處是複雜的，可能涉及多種機制(Ellis and Hicklin,在上述引文中)。例如，市售的抗 VEGF 藥物，諸如 bevacizumab (Avastin )或 ranibizumab (Lucentis )(參見 WO 96/030046, WO 98/045331 和 WO 98/045332)或正在臨床開發的藥物，諸如 VEGF_Trap (TO 00/075319)，不區分VEGF-A的促血管生成形式和抗血管生成形式，因此這兩種形式都被它們抑制。因此它們抑制血管生成，並且剝奪健康組織的一種重要存活因子，即 VEGF-Axxxb，產生細胞毒性和劑量限制性副作用，這進而限制功效。現有抗VEGF-A療法的常見副作用是胃腸穿孔，出血，高血壓，血栓栓子事件和蛋白尿(KambEi，Τ. and McDonald, D.M.，Br. J. Cancer 96，1788-95，2007)。因此，現在需要改進的抗血管生成劑來治療癌症和其他病理狀況。本發明的技術問題是鑑定新的抗血管生成劑，諸如具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域，用於癌症和其他病理狀況(例如眼病諸如AMD或DME)的改進治療。通過提供權利要求所表徵的實施方案來解決該技術問題。發明概述
本發明涉及包括結合結構域的結合蛋白，其中所述結合結構域抑制VEGF-Axxx結合 VEGFR-2，並且所述結合結構域在熱解摺疊時具有高於40°C的中點變性溫度(Tm)，當在 PBS中37°C溫育1天時在高達10 g/L的濃度形成少於5% (w/w)的不溶性聚集體。更具體地，本發明涉及包括至少一個重複結構域的重組結合蛋白，其中所述重複結構域以低於 KT7M的Kd結合VEGF-Axxx，並抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2。尤其是這類結合蛋白以低於 10 nM的IC50值抑制HUVEC球體(spheroids)的生芽(sprouting)，並且這類結合蛋白與 VEGF-Axxxb的相互作用的解離常數Kd是其與VEGF-Axxx相互作用的Kd至少10倍高。尤其是，本發明涉及一種重組結合蛋白，包括具有對VEGF-A的特異性的結合結構域，其是重複結構域，例如錨蛋白重複結構域，尤其是包括重複組件的錨蛋白重複結構域， 所述重複組件具有錨蛋白重複序列基序
1D23G4TPLHLAAMGHLEIVEVLLK7GADVNA (SEQ ID N0:1)
其中丄，2, 3, 4, 5, 6,和I，彼此獨立，代表選自A，D, E, F, H, I，K, L, M, N, Q, R, S, Τ, V, W和Y的胺基酸殘基。
6
本發明還涉及一種重組結合蛋白，包括具有對VEGF-A的結合特異性的重複結構域，其與本發明的錨蛋白重複結構域具有至少70%的胺基酸序列同一性，或其包括與本發明的錨蛋白重複組件具有至少70%胺基酸序列同一性的重複組件，或其中錨蛋白重複組件的一個或更多個胺基酸殘基被在比對錨蛋白重複單位時對應位置上發現的胺基酸殘基替換。本發明進一步涉及包括本發明重組結合蛋白的結合蛋白，其連接有一個或更多個其他的部分，例如，還結合VEGFR-2或不同靶的部分，標記部分，促進蛋白純化的部分，或提供改善的藥代動力學的部分，例如聚乙二醇部分。在一些實施方案中，其他的部分是蛋白部分。在某些其他實施方案中，其他的部分是非蛋白的多聚體部分。本發明進一步涉及編碼本發明重組結合蛋白的核酸分子，以及包括一種或更多種上述結合蛋白或核酸分子的藥物組合物。本發明進一步涉及使用本發明的結合蛋白治療癌症和其他病理狀況(例如眼病諸如AMD或DME)的方法。附圖簡述
SI-挑選的設計的錨蛋白重複蛋白的特異性狗VEGF-A164結合。用粗提物ELISA顯示挑選的克隆與狗VEGF-A164 (VEGF)和陰性對照蛋白(MBP， 大腸桿菌麥芽糖結合蛋白)的相互作用。將生物素化的狗VEGF-A164和MBP固定在 NeutrAvidin上。編號表示在抗狗VEGF-A164或對應的人VEGF-A165的核糖體展示中挑選的單個DARPin克隆。A=吸光度。白色柱圖指示結合狗VEGF-A164，黑色柱圖顯示結合MBP 的非特異性背景。M2.挑選的DARPin的球體生長抑制。在存在各種濃度的(a) DARPin #30 (SEQ ID NO: 29)，對VEGF-Axxx具有特異性的 DARPin,或(b) DARPin NC,對VEGF-Axxx沒有特異性的陰性對照DARPin的條件下，顯示球體生長抑制測定中芽的長度。Ml. VEGF-A同種型的特異性識別。結合蛋白對VEGF-A同種型的表面等離子體共振(SPR)分析。(a)和(b): Avastin 的SPR分析。將250 nM Avastin 添加到固定有狗VEGF-A164 (a)或狗VEGF-A164b (b)的流動池100秒，然後通過緩衝液流動進行清洗。(c)和(d) DARPin #27 (SEQ ID NO: 16)的 SPR 分析。將 250 nM DARPin #_27 添加到固定有狗VEGF-A164 (c)或狗VEGF-A 164b (d)的流動池100秒，然後通過緩衝液流動進行清洗。RU=共振單位。Mi.兔眼中人VEGF-A165的有效抑制。血管滲漏兔模型顯示與Lucentis 相比，DARPin在眼中抑制人VEGF-A165的功效。 在第1天，通過玻璃體內注射將PBS，DARPin #30或Lucentis 施用到每隻兔的一隻眼(治療的眼)。在第4天或第30天，通過玻璃體內注射500 ng人VEGF-A165攻擊每隻兔的兩隻眼。所有眼在VEGF-A165注射後48小時進行評估，通過測量靜脈注射鈉螢光素後1小時所有眼的玻璃體和視網膜中螢光素的含量。R=治療眼的螢光素測量值/未治療眼的螢光素測量值的比例。標準偏差用誤差線表示。4-PBS = PBS注射後4天的比例(對照)；4-D = DARPin #30注射後4天的比例；30-D=DARPin #30注射後30天的比例；4_L = Lucentis 注射後4天的比例；30_L = Lucentis 注射後30天的比例。發明詳述
哺乳動物VEGF-A以兩個家族的選擇性剪接同種型存在(i)促血管生成的 「VEGF-Axxx」同種型，通過外顯子8的鄰近剪接產生和(ii)抗血管生成的「VEGF-Axxxb」同種型，通過外顯子8的遠端剪接產生。優選的，本發明的結合結構域對狗，兔，猴或人來源的促血管生成VEGF-Axxx是特異性的。更優選的，本發明的結合結構域對人來源的促血管生成VEGF-Axxx是特異性的。最優選的，本發明的結合結構域對人VEGF-A165是特異性的。術語「蛋白」是指多肽，其中所述多肽的至少一部分具有或能夠獲得指定的三維結構，通過在其多肽鏈內和/或之間形成二級、三級或四級結構。如果蛋白包括兩個或更多個多肽，單條多肽鏈可以通過例如兩個多肽之間的二硫鍵非共價或共價相連。蛋白的一部分(其通過形成二級或三級結構單獨具有或能夠獲得指定的三維結構)被稱為「蛋白結構域」。這類蛋白結構域是本領域技術人員公知的。當用於重組蛋白，重組蛋白結構域等等時術語「重組」表示所述多肽是利用相關領域技術人員公知的重組DNA技術產生的。例如，可以將編碼多肽的重組DNA分子(例如通過基因合成產生)克隆入細菌表達質粒(例如pQE30，Qiagen)。當這類構建的重組表達質粒被插入細菌(例如大腸桿菌)時，該細菌可以產生所述重組DNA編碼的多肽。對應產生的多肽被稱為重組多肽。術語「多肽標籤」是指與多肽/蛋白連接的胺基酸序列，其中所述胺基酸序列用於所述多肽/蛋白的純化，檢測或靶向，或所述胺基酸序列改進多肽/蛋白的物化性質，或所述胺基酸序列具有效應物功能。結合蛋白的單個多肽標籤，部分和/或結構域可以直接或通過多肽接頭彼此連接。這些多肽標籤都是本領域公知的，並且是本領域技術人員完全可以得到的。多肽標籤的實例是小的多肽序列，例如，His，myc, FLAG，或Mi^p-標籤或部分諸如酶(例如酶，像鹼性磷酸酶)，其允許檢測所述多肽/蛋白，或可用於靶向(諸如免疫球蛋白或其片段)和/或用做效應分子的部分。術語「多肽接頭」是指一種胺基酸序列，其能夠連接，例如，兩個蛋白結構域，多肽標籤和蛋白結構域，蛋白結構域和非多肽部分諸如聚乙二醇或兩個序列標籤。這類其他的結構域，標籤，非多肽部分和接頭是相關領域的技術人員已知的。一系列實例提供於專利申請TO 02Λ0565的說明書。這類接頭的具體實例是可變長度的甘氨酸-絲氨酸-接頭；優選的，所述接頭具有2-16個胺基酸的長度。在本發明的背景下，術語「多肽」涉及由多個(即兩個或更多個)胺基酸通過肽鍵連接的一條或更多條鏈組成的分子。優選的，多肽由通過肽鍵連接的超過8個胺基酸組成。術語「結合蛋白，，是指包括一個或更多個結合結構域蛋白，下面將進一步解釋。優選的，所述結合蛋白包括最多4個結合結構域。更優選的，所述結合蛋白包括最多兩個結合結構域。最優選的，所述結合蛋白只包括一個結合結構域。此外，任何這類結合蛋白可能包括其他的不是結合結構域的蛋白結構域，多聚化部分，多肽標籤，多肽接頭和/或非蛋白聚合物分子。多聚化部分的實例是免疫球蛋白重鏈恆定區，其配對提供功能性免疫球蛋白Fc 結構域，以及亮氨酸拉鏈或包括游離巰基的多肽，其在這樣的兩個多肽之間形成分子間二硫鍵。非蛋白聚合物分子的實例是羥乙基澱粉(HEQ，聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇，或聚氧化火布。術語「PEG化」表示PEG部分共價連接於，例如，本發明的多肽。術語「結合結構域」表示一種蛋白結構域，其顯示與蛋白支架相同的「摺疊」(三維結構)並具有預定的特性，如下文所述。這類結合結構域可以通過合理的或最常見的組合蛋白工程技術(這是本領域已知的技能)獲得(Sken^ 2000,在上述引文中；Binz et al., 2005,在上述引文中)。例如，具有預定特性的結合結構域可以通過包括下列步驟的方法獲得(a)提供顯示與下文指定的蛋白支架相同摺疊的蛋白結構域的多樣集合；和(b) 篩選所述多樣集合和/或從所述多樣集合進行挑選以獲得具有所述預定特性的至少一種蛋白結構域。根據使用的篩選和/或挑選系統，蛋白結構域的多樣集合可以通過數種方法提供，可以包括使用本領域技術人員公知的方法，諸如噬菌體展示或核糖體展示。術語「蛋白支架」表示具有暴露表面區域的蛋白，在該區域中胺基酸插入、取代或缺失是高度耐受的。可用於產生本發明結合結構域的蛋白支架的實例是抗體或其片段，諸如單鏈Fv或Fab片段，來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A，來自大菜粉蝶(ft^ris brassicae)的膽汁三烯結合蛋白或其他脂質運載蛋白，錨蛋白重複蛋白或其他重複蛋白，和人纖連蛋白。蛋白支架是本領域技術人員已知的(Binz et al., 2005,在上述引文中；Binz et al.，2004，在上述引文中)。術語「預定特性」是指一種特性，諸如結合靶，阻斷靶，活化靶介導的反應，酶活性， 以及相關其他特性。根據所需特性的類型，普通技術人員將能夠確定篩選和/或挑選具有所需特性的結合結構域的格式和必需步驟。優選的，所述預定特性是結合靶。優選的，本發明的結合蛋白不是抗體或其片段，諸如Fab或scFv片段。抗體及其片段是本領域技術人員公知的。還優選的，本發明的結合結構域不包括存在於抗體中的免疫球蛋白摺疊和/或 III型纖連蛋白結構域。免疫球蛋白摺疊是常見的全部-β蛋白摺疊，其由排列為兩個β 片層的約7個反平行β鏈的雙層夾層組成。免疫球蛋白摺疊是本領域技術人員公知的。例如，包括免疫球蛋白摺疊的這類結合結構域描述於WO 07/080392或WO 08/097497。進一步優選的，本發明的結合結構域不包括免疫球蛋白樣結構域(如在VEGFR-I 或VEGFR-2中發現)。這類結合結構域描述於WO 00/075319。優選的結合結構域是具有抗血管生成作用的結合結構域。結合結構域的抗血管生成作用可以通過本領域技術人員公知的測定法來確定，諸如實例2描述的HUVEC球體的生芽測定法。進一步優選的是包括70-300個胺基酸的結合結構域，尤其是100-200個胺基酸。進一步優選的是不含游離Cys殘基的結合結構域。游離的Cys殘基不參與二硫鍵的形成。甚至更優選的是不含任何Cys殘基的結合結構域。本發明優選的結合結構域是重複結構域或設計的重複結構域，優選的如WO 02/20565 所述。尤其優選的結合結構域是設計的錨蛋白重複結構域(Binz，H. K. et al. , 2004, 在上述引文中)，優選的如WO 02/20565所述。設計的錨蛋白重複結構域的實例顯示於實施例中。下文關於重複蛋白的定義是基於專利申請WO 02/20565。專利申請WO 02/20565還包含重複蛋白特徵、技術和應用的一般說明。術語「重複蛋白」是指包括一個或更多個重複結構域的蛋白。優選的，所述重複蛋白中的每一個包括最多4個重複結構域。更優選的，所述重複蛋白中的每一個包括最多兩個重複結構域。最優選的，每一重複蛋白只包括一個重複結構域。此外，所述重複蛋白可以包括其他的非重複蛋白結構域，多肽標籤和/或多肽接頭。術語「重複結構域」是指包括作為結構單位的兩個或更多個連續重複單位(組件) 的蛋白結構域，其中所述結構單位具有相同摺疊並緊密堆積產生。例如，具有節點疏水核 (joint hydrophobic core)的超螺旋結構。術語「設計的重複蛋白」和「設計的重複結構域」分別是指重複蛋白或重複結構域， 通過專利申請WO 02/20565說明的創造性方法獲得。設計的重複蛋白和設計的重複結構域是合成的，而非來自自然界。它們分別是人工的蛋白或結構域，通過表達相應設計的核酸獲得。優選的，表達在真核或原核細胞(諸如細菌細胞)中完成，或使用不含細胞的體外表達系統。術語「結構單位」是指多肽局部有序的部分，由沿著多肽鏈彼此鄰近的二級結構的兩個或更多個區段的三維相互作用形成。這類結構單位顯示結構基序。術語「結構基序」是指至少一個結構單位中存在的二級結構元件的三維結構。結構基序是本領域技術人員公知的。單獨的結構單位不能獲得確定的立體結構；但是，它們的連續排列，例如作為重複結構域中的重複組件，導致相鄰單位的相互穩定，以產生超螺旋結構。術語「重複單位」是指包括一個或更多個天然存在的重複蛋白的重複序列基序的胺基酸序列，其中所述「重複單位」被發現是多個拷貝，其顯示對確定蛋白摺疊的全部所述基序共有的限定摺疊拓撲結構。這類重複單位包括骨架殘基和相互作用殘基。這類重複單位的實例是犰狳(armadillo)重複單位，富含亮氨酸的重複單位，錨蛋白重複單位，三角形四肽(tetratricop印tide)重複單位，HEAT重複單位，和富含亮氨酸的變體重複單位。包含兩個或更多個這類重複單位的天然存在的蛋白被稱作「天然存在的重複蛋白」。當彼此比較時，重複蛋白的單個重複單位的胺基酸序列可以具有很多突變，取代，添加和/或缺失， 但仍然基本上保留重複單位的一般模式或基序。術語「骨架殘基」涉及重複單位的胺基酸殘基，或重複組件的相應胺基酸殘基，其有助於摺疊的拓撲結構，即其有助於所述重複單位(或組件)的摺疊或有助於相鄰單位 (或組件)的相互作用。這類貢獻可以是與重複單位(組件)中其他殘基的相互作用，或對 α -螺旋或β -片層中發現的多肽主鏈構象的影響，或形成線性多肽或環的胺基酸延伸。術語「靶相互作用殘基」是指重複單位的胺基酸殘基，或重複組件的相應胺基酸殘基，其有助於與靶物質的相互作用。這類貢獻可以是與靶物質的直接相互作用，或對其他直接相互作用殘基的影響，例如通過穩定重複單位(組件)的多肽構象以允許或增強直接相互作用殘基與所述靶的相互作用。這類骨架和靶相互作用殘基可以通過以下方法鑑定對通過物化方法(諸如X射線結晶，NMR和/或CD光譜法)獲得的結構數據進行分析，或與結構生物學和/或生物信息學技術人員公知的已知的和相關的結構信息進行比較。優選的，用於推斷重複序列基序的重複單位是同源重複單位，其中重複單位包括相同的結構基序，並且超過70%的所述重複單位的骨架殘基是彼此同源的。優選的，超過 80%的所述重複單位的骨架殘基是同源的。最優選的，超過90%的所述重複單位的骨架殘基
10是同源的。用於確定多肽之間同源性百分比的電腦程式(諸如i^asta，Blast或Gap)是本領域技術人員已知的。進一步優選的，用於推斷重複序列基序的重複單位是同源重複單位(獲自從靶上挑選的重複結構域)，例如描述於實施例1，並具有相同的靶特異性。術語「重複序列基序」是指胺基酸序列，其從一個或更多個重複單位推斷得出。優選的，所述重複單位來自於對相同靶具有結合特異性的重複結構域。這類重複序列基序包括骨架殘基位置和靶相互作用殘基位置。所述骨架殘基位置對應於重複單位的骨架殘基的位置。同樣，所述靶相互作用殘基位置對應於重複單位的靶相互作用殘基的位置。重複序列基序包括固定位置和隨機位置。術語「固定位置」是指重複序列基序中的胺基酸位置，其中所述位置被設置為特定胺基酸。最常見的，這類固定位置對應於骨架殘基的位置和/或靶相互作用殘基(對某靶特異的)的位置。術語「隨機位置」表示重複序列基序中的胺基酸位置，其中在所述胺基酸位置允許兩個或更多個胺基酸，例如，允許常見的二十種天然存在的胺基酸的任意一種，或允許二十種天然存在胺基酸的大部分，諸如除了半胱氨酸以外的胺基酸，或除了甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸以外的胺基酸。最常見的，這類隨機位置對應靶相互作用殘基的位置。但是，骨架殘基的一些位置也可以是隨機的。術語「摺疊的拓撲結構」是指所述重複單位的三級結構。通過形成至少部分α -螺旋或β -片層的胺基酸延伸，或形成線性多肽或環的胺基酸延伸，或α -螺旋、β -片層和/ 或線性的多肽/環的任意組合，確定摺疊的拓撲結構。術語「連續的」是指一種排列，其中重複單位或重複組件串聯排列。在設計的重複蛋白中，存在至少2個，通常約2到6個，尤其是至少約6個，通常是20或更多個重複單位。 在大多數情況下，重複單位將顯示高度的序列同一性(對應位置相同的胺基酸殘基)或序列相似性(胺基酸殘基是不同的，但具有類似的物化特性)，一些胺基酸殘基可能是在天然存在的蛋白中發現的不同重複單位中高度保守的關鍵殘基。但是，只要維持常見的摺疊拓撲結構，在天然存在的蛋白中發現的不同重複單位之間的胺基酸插入和/或缺失和/或取代造成的高度序列變異性也是可能的。通過物理化學法諸如X射線結晶、NMR或CD光譜法直接檢測重複蛋白的摺疊拓撲結構的方法是本領域技術人員公知的。用於鑑定和確定重複單位或重複序列基序或鑑定包括這類重複單位或基序的相關蛋白的家族的方法，諸如同源性查找(BLAST等)，在生物信息學領域是完善的，並且是本領域技術人員公知的。改進初始重複序列基序的步驟可以包括迭代過程。術語「重複組件」是指設計的重複結構域的重複胺基酸序列，其最初源自天然存在的重複蛋白的重複單位。重複結構域包括的每個重複組件來源於天然存在的重複蛋白的家族或亞家族的一個或更多個重複單位，例如，armadillo重複蛋白或錨蛋白重複蛋白的家族。「重複組件」可以包括具有在相應重複組件的所有拷貝存在胺基酸殘基的位置(" 固定位置「)和具有不同或「隨機「胺基酸殘基的位置(「隨機位置「)。術語「加帽組件」是指融合到重複結構域的N或C端重複組件的多肽，其中所述加帽組件與所述重複組件形成緊密的三級相互作用從而提供保護所述重複組件的疏水核在側面不與來自溶劑的連續重複組件接觸的帽。所述N和/或C端加帽組件可以是，或可以來自，鄰近於重複單位的天然存在的重複蛋白中發現的加帽單位或其他結構域。術語「加帽單位」是指天然存在的摺疊多肽，其中所述多肽限定與重複單位N或C端融合的特定結構單位，其中所述多肽與所述重複單位形成緊密的三級相互作用從而提供保護所述重複單位的疏水核在一側免於溶劑的帽。這類加帽單位可以具有類似所述重複序列基序的序列。加帽組件和加帽重複描述於WO 02/020565。例如，SEQ ID NO: 21的N端加帽組件由位置1到32 的胺基酸編碼。此外優選的是在位置5具有甘氨酸或天冬氨酸殘基的這類N端加帽組件。
術語「靶」是指單個分子諸如核酸分子，多肽或蛋白，碳水化合物，或任何其他天然存在的分子，包括這類單個分子的任意部分，或兩個或更多個這類分子的複合物。靶可以是全細胞或組織樣品，或它可以是任何非天然的分子或部分。優選的，靶是天然存在或非天然的多肽或包含化學修飾的多肽，例如通過天然或非天然的磷酸化，乙醯化或甲基化進行的修飾。在本發明的特定應用中，靶是VEGF-Axxx或VEGFR-2。術語「共有序列」是指一種胺基酸序列，其中所述共有序列是通過多個重複單位的結構和/或序列比對獲得的。利用兩個或更多個結構和/或序列比對的重複單位，並允許比對中的缺口，有可能確定每個位置最常見的胺基酸殘基。共有序列是包括每個位置最常出現的胺基酸的序列。如果在單個位置有兩個或更多個胺基酸出現高於平均值，則共有序列可以包括這些胺基酸的亞組。所述兩個或更多個重複單位可以獲自單個重複蛋白中包括的重複單位，或獲自兩個或更多個不同的重複蛋白。共有序列以及確定它們的方法是本領域技術人員公知的。「保守胺基酸殘基」是在共有序列的某些位置發現的胺基酸。如果在所述兩個或更多個重複單位中發現具有類似概率的兩個或更多個(例如3，4或5個)胺基酸殘基，共有胺基酸可以是最常發現的胺基酸之一或所述兩個或更多個胺基酸殘基的組合。進一步優選的是非天然存在的結合蛋白或結合結構域。術語「非天然存在，，表示合成的或不是來自自然界的，更具體地，該術語表示由人工製備。術語「非天然存在的結合蛋白」或「非天然存在的結合結構域」表示所述結合蛋白或所述結合結構域是合成的(即通過化學合成從胺基酸產生)或重組的並且不是來自自然界。「非天然存在的結合蛋白」或「非天然存在的結合結構域」分別是通過表達相應設計的核酸獲得的人造蛋白或結構域。優選的，表達在真核或細菌細胞中完成，或使用不含細胞的體外表達系統。進一步的，該術語表示所述結合蛋白或所述結合結構域的序列在序列資料庫中不作為非人工序列條目存在，例如在GenBank，EMBL-Bank或Swiss-Prot中。這些資料庫和其他類似的序列資料庫是本領域技術人員公知的。本發明涉及包括結合結構域的結合蛋白，其中所述結合結構域抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2，並且所述結合蛋白和/或結合結構域在熱解摺疊時具有高於40°C的中點變性溫度(Tm)，當在磷酸緩衝鹽溶液(PBQ中37°C溫育1天時，在高達10 g/L的濃度形成低於 5% (w/w)的不溶性聚集體。結合結構域可以抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2，通過以以下方式結合VEGF-Axxx或結合VEGFR-2 =VEGF-Axxx和VEGFR-2之間的表觀解離常數(Kd)增加超過IO2倍，優選的超過IO3倍，更優選的超過IO4倍，更優選的超過IO5倍，和最優選的超過IO6倍。優選的，結合結構域與VEGF-Axxx或VEGFR-2的相互作用的Kd是小於10〃M，優選的小於10_8Μ，更優選的小於10_9Μ，更優選的小於ΙΟ,Μ，和最優選的小於10_"Μ。用於確定蛋白-蛋白相互作用的解離常數的方法，諸如基於表面等離子體共振(SPR)的技術，是本領域技術人員公知的。
優選的結合結構域結合VEGF-Axxx。甚至更優選的是結合人VEGF-A165的結合結構域。術語「PBS」表示包含137 mM NaCl，10 mM磷酸鹽和2. 7 mM KCl並且具有pH 7. 4 的磷酸鹽緩衝水溶液。優選的，結合蛋白和/或結合結構域在熱解摺疊時具有高於45°C的中點變性溫度 (Tm)，更優選的高於50°C，更優選的高於55°C，和最優選的高於60°C。本發明的結合蛋白或結合結構域在生理條件下具有確定的二級和三級結構。這類多肽的熱解摺疊導致其三級和二級結構的喪失，這可以例如通過圓二色性(CD)測量進行追蹤。在熱解摺疊時結合蛋白或結合結構域的中點變性溫度對應於所述蛋白或結構域在熱變性時(通過從10°C緩慢升溫到約100°C)的生理緩衝液中協同轉換的中點的溫度。熱解摺疊時中點變性溫度的確定是本領域技術人員公知的。熱解摺疊時結合蛋白或結合結構域的所述中點變性溫度提示所述多肽的熱穩定性。還優選的是當在37°C的PBS中溫育超過5天，優選的超過10天，更優選的超過20 天，更優選的超過40天，和最優選的超過100天時，在高達20 g/Ι，優選的高達40 g/L，更優選的高達60 g/L，甚至更優選的高達80 g/L，和最優選的高達100 g/L的濃度，結合蛋白和/或結合結構域形成低於5% (w/w)的不溶性聚集體。不溶性聚集體的形成可以通過可見沉澱、凝膠過濾或動態光散射(其在不溶性聚集體形成時明顯增加)的出現來檢測。通過在10』 OOOxg離心10分鐘可以從蛋白樣品中去除不溶性聚集體。優選的，在37°C的PBS 中，在所述溫育條件下結合蛋白和/或結合結構域形成低於洲，1%, 0. 5%, 0. 2%, 0.1%， 或0.05% (w/w)的不溶性聚集體。不溶性聚集體的百分比可以通過以下方式確定分離不溶性聚集體和可溶性蛋白，然後通過標準定量法確定可溶性和不溶性組分中的蛋白量。還優選的是37°C包含100 mM 二硫蘇糖醇(DTT)的PBS中溫育1或10小時，結合蛋白和/或結合結構域不喪失其天然三維結構。在一個特定實施方案中，本發明涉及一種結合蛋白，其包括抑制VEGF-Axxx結合 VEGFR-2的結合結構域，並且具有指定的或優選的中點變性溫度以及如上所述的非聚集特性，其中所述結合蛋白以低於100 nM的IC5tl值抑制HUVEC球體的生芽。術語「HUVEC」表示人臍靜脈內皮細胞，其可以分離自正常人臍靜脈，並對VEGF-A 刺激有反應。測量HUVEC球體生芽的測定法(諸如實施例2的描述)是本領域技術人員公知的。IC50值是實驗確定的參數(諸如HUVEC球體的生芽)的體外50%抑制所需的物質 (諸如結合蛋白或結合結構域)的濃度。IC5tl值可以由本領域技術人員方便的確定(Korff T. and Augustin H. G. , J. Cell Biol. 143(5)，1341-52，1998)。優選的是結合蛋白和/或結合結構域以低於10 nM，優選的低於1 nM，更優選的低於0. 1 nM,和最優選的低於0. 05 nM的IC50值抑制HUVEC球體的生芽。進一步優選的是單體結合蛋白和/或結合結構域抑制HUVEC球體生芽的IC5tl值低於ranibizumab (Lucentis , Genentech 的註冊商標),bevacizumab (Avastin , Genentech W S Φ ^ fe ), aflibercept (VEGF Trap , Regeneron W S φ ^ fe ), pegaptanib (Macugen ，Pfizer的註冊商標)的對應IC5tl值。具體來說，本發明涉及一種結合蛋白，其包括抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2的結合結構域，並具有指定的或優選的中點變性溫度和如上所述的非聚集特性，其中與所述結合結構域和相應VEGF-Axxx的相互作用的Kd相比，所述結合結構域和VEGF-Axxxb的相互作用的Kd是至少10倍高。優選的，與所述結合結構域和相應VEGF-Axxx的相互作用的Kd相比，所述結合結構域和VEGF-Axxxb的相互作用的Kd是至少IO2倍高，優選的IO3倍高，更優選的IO4倍高， 更優選的IO5倍高，和最優選的IO6倍高。還優選的，結合結構域與VEGF-Axxxb的相互作用的Kd高於IO3 nM,結合結構域與 VEGF-Axxx的相互作用的Kd低於10或1 nM.。優選的結合結構域與VEGF-B，VEGF-C, VEGF-D, PlGF或PDGF的相互作用的Kd高於1 nM，優選的高於10 nM，更優選的高於IO2 nM，甚至更優選的高於IO3 nM，和最優選的高於 IO4 nM。優選的，VEGF-Axxx是狗 VEGF-A164 或猴 VEGF-A165 或人 VEGF-A165，並且 VEGF-Axxxb 是狗 VEGF_A164b 或猴 VEGF_A165b 或人 VEGF_A165b。另一個優選的實施方案是重組結合蛋白包括結合結構域，其中所述結合結構域抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2，並且所述結合結構域是重複結構域或設計的重複結構域。這類重複結構域可以包括一個，兩個，三個或更多個內部重複組件，它們將參與結合VEGF-Axxx。 優選的，這類重複結構域包括N端加帽組件，兩到四個內部重複組件，和C端加帽組件。優選的，所述結合結構域是錨蛋白重複結構域或設計的錨蛋白重複結構域。優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中丄，2, 3, 4, 5, 6,和Z各自獨立的代表選自A，D, E, F, H, I，K, L, M, N, Q, R, S, Τ, V, W和Y的胺基酸殘基。 尤其優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自F，T, N, R, V, A, I，K, Q, S和Y的胺基酸殘基；優選的選自F，T, N, R和V;更優選的選自F和T;
2代表選自W，Y, H和F的胺基酸殘基；優選的選自W，Y和H; 2代表選自M，I，F和V的胺基酸殘基；優選的選自M和I;
4代表選自H，A, K, G, L, Μ, N, Τ, V, W和Y的胺基酸殘基；優選的選自H，A和
K ；
5代表選自E，Y, F, V, H, I，L, N和R的胺基酸殘基；優選的選自E，Y, F, V和 H;更優選的選自E，Y, F和V;和
6代表選自A，N, Y, H和R的胺基酸殘基。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中
1代表選自T，E, A, D, F, K, N, Q, R, S, W和Y的胺基酸殘基；優選的選自T和
E ；
2代表選自V，F, Y, A, H, I，K, R, T和W的胺基酸殘基；優選的選自V，FfPY; 2代表選自S，A, N, F和M的胺基酸殘基；優選的選自S，A和N;更優選的選自S和
A；
4代表選自Y，F, S和W的胺基酸殘基； 5代表選自A，S, L和Y的胺基酸殘基；優選的選自A和S;
6代表選自D，N, Μ, A, I，K和Y的胺基酸殘基；優選的選自D，N和M ；更優選的選自D禾口 N ；
Z代表選自A，Y, H, N和D的胺基酸殘基；和 8代表胺基酸殘基T或A。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自K，T和Y的胺基酸殘基； 2代表胺基酸殘基N或M ； 3代表胺基酸殘基T或F; 4代表胺基酸殘基S或A ； 5代表胺基酸殘基H或R ； 6代表選自A，Y, H和N的胺基酸殘基；和 Z代表胺基酸殘基A或T。甚至更優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有SEQ ID N0:3的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID N0:2的錨蛋白重複序列基序的重複組件和/或之後是具有SEQ ID N0:4的錨蛋白重複序列基序的重複組件。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自A，N, R, V, Y, E, H, I，K, L, Q, S和T的胺基酸殘基；優選的選自A， N, R, V和Y;更優選的選自A和R ；
2代表選自S，A, N, R, D, F, L, P, T和Y的胺基酸殘基；優選的選自S，A, N和
R；
2代表選自T，V，S, A, L和F的胺基酸殘基；優選的選自T，V，S, A和L ；更優選的選自T，V禾口 S ；4代表選自W，F和H的胺基酸殘基；
5代表選自P，I，A, L, S, Τ, V和Y的胺基酸殘基；優選的選自P和I; 6代表選自W，F, I，L, T和V的胺基酸殘基； Z代表胺基酸殘基L或P;和 8代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自H，Q, A, K, R, D, I，L, Μ, N, V和Y的胺基酸殘基；優選的選自H，Q, A, K和R ；更優選的選自A和R ；
2代表選自Y，F和H的胺基酸殘基； 2代表選自Q，F和T的胺基酸殘基；
4代表選自W，M, G, H, N和T的胺基酸殘基；優選的選自W和M ； 5代表選自T，A, M, L和V的胺基酸殘基；優選的選自T，A和M; 6代表選自I，L, V，D和T的胺基酸殘基；優選的選自I，L和V;和 Z代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。甚至更優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有SEQ ID N0:6的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID N0:5的錨蛋白重複序列基序的重複組件。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自K，M, N, R和V的胺基酸殘基； 2代表選自Y，H, M和V的胺基酸殘基； 2代表選自F，L, M和V的胺基酸殘基；
4代表選自R，H, V, A, K和N的胺基酸殘基；優選的選自R，H, V和A; 5代表選自F，D, H, Τ, Y, M和K的胺基酸殘基；優選的選自F，D, H, T和Y ；和 6代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自T，A, H, I，N和S的胺基酸殘基； 2代表選自F，I，Q, R, V和N的胺基酸殘基; 2代表選自A，G, N, Q和V的胺基酸殘基； 4代表胺基酸殘基W或Y;
165代表選自A，S, T和M的胺基酸殘基； 6代表選自N，V，S, F, M和W的胺基酸殘基； Z代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基；和 8代表胺基酸殘基T或A。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自K，A, V和N的胺基酸殘基； 2代表選自N，I和Y的胺基酸殘基； 2代表選自T，F, Y和W的胺基酸殘基； 4代表選自W，D和Y的胺基酸殘基； 5代表胺基酸殘基S或A ； 6代表選自D，I和M的胺基酸殘基； Z代表選自L，T和Y的胺基酸殘基；和 8代表選自A，H, Y和N的胺基酸殘基。甚至更優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有SEQ ID N0:8的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID N0:7的錨蛋白重複序列基序的重複組件和/或之後是具有SEQ ID N0:9的錨蛋白重複序列基序的重複組件。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自L，S和T的胺基酸殘基； 2代表選自G，S和C的胺基酸殘基；優選的選自G和S; 2代表胺基酸殘基S或A ；
4代表選自Q，S, M和N的胺基酸殘基；優選的選自Q和S; 5代表選自L，M和Q的胺基酸殘基；和 6代表選自A，H, N, Y和D的胺基酸殘基。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自Y，H, F, I，L和W的胺基酸殘基；優選的選自Y和H; 2代表選自M，D, I，L, V的胺基酸殘基；優選的選自M和D ； 2代表選自G，S和V的胺基酸殘基； 4代表胺基酸殘基W或F;5代表選自A，G和T的胺基酸殘基； 6代表胺基酸殘基D或W; Z代表胺基酸殘基L或F;和 8代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。甚至更優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有SEQ ID NO: 11的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID NO: 10的錨蛋白重複序列基序的重複組件。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自K，S, I，N, T和V的胺基酸殘基；優選的選自K和S; 2代表選自K，N, W, Α, H, M, Q和S的胺基酸殘基；優選的選自K和N; 2代表選自F，Q, L, H和V的胺基酸殘基；優選的選自F，Q和L; 4代表胺基酸殘基F或T ； 5代表胺基酸殘基Q或H; 6代表胺基酸殘基Y或S;
Z代表選自N，H, Y和M的胺基酸殘基；優選的選自N和H;和 8代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件
其中
1代表選自F，Y, H和W的胺基酸殘基；優選的選自F，Y和H; 2代表選自I，M, D和V的胺基酸殘基；優選的選自I，M和D; 2代表胺基酸殘基F或L ； 4代表胺基酸殘基L或P; 5代表選自H，L和Y的胺基酸殘基；和 6代表選自A，H, N, C和Y的胺基酸殘基。甚至更優選的是一種重組結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域或所述設計的錨蛋白重複結構域包括具有SEQ ID N0:13的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID NO: 12的錨蛋白重複序列基序的重複組件。另一個優選的實施方案是一種重組結合蛋白，其包括具有對VEGF-Axxx的結合特異性的至少一個重複結構域，其中所述重複結構域與選自SEQ ID NOs: 16，22，23，29，30和 33的重複結構域，或選自SEQ ID NOs: 16，22，23，29，30，33，34，36，39和40的重複結構域競爭結合 VEGF-Axxx。術語「競爭結合」表示本發明兩個不同的結合結構域不能同時結合同一靶，而它們兩者能夠單獨結合同一靶。因此，這兩種結合結構域競爭結合所述靶。確定兩種結合結構域是否競爭結合靶的方法(諸如競爭性ELISA或競爭性Sra測量(例如通過使用BioRad的ftOteon裝置))是本領域技術人員公知的。與挑選的重複蛋白競爭結合VEGF-Axxx的重組結合蛋白可以通過本領域技術人員公知的方法鑑定，諸如競爭性酶聯免疫吸附測定(ELISA)。另一個優選的實施方案是一種重組結合蛋白，其包括具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域，所述VEGF-Axxx選自SEQ ID NOs: 14到33，或選自SEQ ID NOs: 14到 40。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中具有對VEGF-Axxx的結合特異性的所述重複結構域包括與所述重複結構域組的重複結構域具有至少70%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。優選的，所述胺基酸序列同一性是至少75%，更優選的80%，更優選的85%，更優選的90%，和最優選的95%。進一步優選的是一種重組結合蛋白，其中具有對VEGF-Axxx的結合特異性的所述重複結構域包括與所述重複結構域組的重複結構域的重複組件具有至少70%胺基酸序列同一性的重複組件。優選的，所述胺基酸序列同一性是至少75%，更優選的80%，更優選的 85%，更優選的90%，和最優選的95%。在本發明包括重複結構域的重組結合蛋白的進一步優選的實施方案中，所述重複結構域的重複組件的一個或更多個胺基酸殘基被比對重複單位時在對應位置上發現的胺基酸殘基替換。優選的，高達30%的胺基酸殘基被替換，更優選的，高達20%，和甚至更優選的，高達10%的胺基酸殘基被替換。最優選的，這類重複單位是天然存在的重複單位。甚至更優選的，所述重複結構域具有對VEGF-Axxx或VEGFR-2的結合特異性。在仍然另一個具體的實施方案中，高達30%的胺基酸殘基，更優選的，高達20%，和甚至更優選的，高達10%的胺基酸殘基被不是在重複單位的對應位置發現的胺基酸替換。在進一步的實施方案中，此處描述的任一種VEGF-Axxx結合蛋白或結構域可以與一種或更多種其他的部分共價結合，包括，例如，也結合
VEGFR-2的部分(例如VEGFR-2結合多肽)，結合不同的靶諸如P1GF，人血清白蛋白，細胞受體(例如Her2)，免疫球蛋白(例如IgGl)，細胞因子(例如TNF-alpha或白介素)或生長因子以產生雙特異性結合劑的部分，標記部分(例如螢光標記諸如螢光素，或放射性示蹤劑)，促進蛋白純化的部分(例如小肽標籤，諸如His-或str印-標籤)，提供改善的治療效果的效應物功能的部分(例如提供抗體依賴性細胞介導的細胞毒性的抗體Fc部分，毒性蛋白部分諸如綠膿桿菌iPseudomonas aeruginosa)外毒素A (ETA)或小分子毒性劑諸如美登素類或DNA烷化劑)或提供改善的藥代動力學的部分。可以根據感知的治療需要評價改善的藥代動力學。經常希望增加生物利用度和/或增加給藥之間的時間，可能通過增加給藥後血清中仍然可用的蛋白的時間。在一些情況下，希望改善蛋白血清濃度隨時間的連續性(例如，減少在剛剛施用後和下次施用前不久之間蛋白血清濃度的差異)。傾向於減慢蛋白從血液中清除的部分包括羥乙基澱粉(HES)，聚乙二醇(PEG)，糖(例如唾液酸)，良好耐受的蛋白部分(例如Fc片段或血清白蛋白)，以及對豐富的血清蛋白具有特異性和親和力的結合結構域或肽，諸如抗體Fc片段或血清白蛋白。本發明的重組結合蛋白可以連接到降低多肽在哺乳動物(例如小鼠，大鼠或人)中清除率的部分，相對於未修飾的多肽降低至少於1/3。一個或更多個聚乙二醇部分可以連接到結合蛋白的不同位置，這類連接可以通過與胺、巰基或其他合適反應基的反應實現。聚乙二醇部分的連接(PEG化)可以是定點的，其中將合適的反應基引入蛋白以產生PEG化優選發生的位點，或合適的反應基原來就存在於結合蛋白中。硫醇基可以存在於半胱氨酸殘基中；和胺基可以是，例如，在多肽N端發現的伯胺或存在於胺基酸側鏈的胺基，諸如賴氨酸或精氨酸。在優選的實施方案中，結合蛋白被改造以便在所需位置具有半胱氨酸殘基，允許半胱氨酸的定點PEG化，例如通過與載有馬來醯亞胺功能團的聚乙二醇衍生物反應。聚乙二醇部分的分子量可以變化較大(即從約1 kDa到約100 kDa)，並且可以是分枝或線性的。優選的，聚乙二醇具有約1到約50 kDa的分子量，優選的約10到約40 kDa，甚至更優選的約15到約30 kDa，和最優選的約20 kDa。在進一步的實施方案中，本發明涉及編碼特定重組結合蛋白的核酸分子。此外，還涉及包括所述核酸分子的載體。進一步的，涉及包括一種或更多種上述結合蛋白(尤其是包括重複結構域的重組結合蛋白)的藥物組合物，或編碼特定重組結合蛋白的核酸分子，以及任選的藥學上可接受的載體和/或稀釋劑。藥學上可接受的載體和/或稀釋劑是本領域技術人員已知的，將在下文更詳細的解釋。甚至進一步的，涉及包括一種或更多種上述重組結合蛋白(尤其是包括重複結構域的結合蛋白)的診斷組合物。本發明的結合蛋白抑制或預防VEGF誘導的病理性血管生成，血管滲漏(水腫)，肺動脈高血壓，腫瘤形成和/或炎性病症。利用「抑制」表明重組蛋白將所述疾病預防到某種程度，例如到10%或20%，更優選的50%，尤其是70%，80%或90%，或甚至95%。術語「水腫」表示由血管滲漏引起的狀況。炎症期間血管舒張和增加的通透性是主要致病機制。例如，水腫導致中風後的梗塞擴大，有可能在癌症患者中引起危急生命的顱內高壓。此外，血漿蛋白的外滲有助於隱性腫瘤的轉移性擴散，而氣道充血可能造成致命的氣喘發作。在炎症期間發生的增加的血管滲漏可能導致呼吸窘迫，腹水，腹膜硬化(在透析患者中)，粘連形成(腹部手術)和轉移性擴散。術語「血管生成」表示形成新血管的基本過程。人的初始血管生成期發生在胚胎發育的前三個月，但血管生成還作為正常的生理過程在組織生長期間發生，諸如肌肉或脂肪的增加以及月經周期和懷孕期間。術語「病理性血管生成」是指數種疾病狀態的維持和進展期間血管的形成和生長。 病理性血管生成的具體實例發現於血管(動脈粥樣硬化，血管瘤，血管內皮瘤)，骨和關節 (類風溼性關節炎，滑膜炎，骨和軟骨損傷，骨髓炎，血管翳生長，骨贅形成，腫瘤和轉移瘤)， 皮膚(撫，膿性肉芽腫，毛髮生長，卡波西氏肉瘤，疤痕瘢痕疙搭，變應性水腫，腫瘤)，肝，腎， 肺，耳和其他上皮細胞(炎性和感染性過程包括肝炎，腎小球腎炎，肺炎；和哮喘，鼻息肉， 耳炎，移植病症，肝再生病症，腫瘤和轉移瘤)，子宮，卵巢和胎盤(子宮內避孕器造成的功能障礙性子宮出血，卵泡囊腫形成，卵巢超刺激症候群，子宮內膜異位，腫瘤)，腦、神經和眼睛(早產兒的視網膜病，糖尿病性視網膜病，脈絡膜和其他眼內病症，白質軟化，腫瘤和轉移瘤)，工作超負荷造成的心臟和骨骼肌，脂肪組織(肥胖症)，內分泌器官(甲狀腺炎，甲狀腺腫大，胰移植病症)，造血作用(AIDS中的Kaposi症候群)，血液惡性腫瘤(白血病)，和淋巴管 (腫瘤轉移，淋巴組織增生病症)。術語「視網膜局部缺血病」表示視網膜的血液和氧供給減少，視網膜的外周部分失去它們的營養來源並終止正常功能。視網膜局部缺血病的具體實例是視網膜病。引起視網膜病的常見疾病是糖尿病性視網膜病，視網膜中央靜脈阻塞，頸動脈狹窄，和鐮狀細胞視網膜病。糖尿病性視網膜病是糖尿病患者視覺喪失的主要原因。在局部缺血性視網膜中，存在新血管的生長(新生血管形成)。這些血管經常生長在視網膜的表面，視神經中，眼睛前部的虹膜上。新血管無法代替必需營養物的流動，相反，可能造成許多問題諸如玻璃體出血， 視網膜剝離和不受控制的青光眼。存在這些問題是因為新血管是脆弱和易於出血的如果在其早期發現，利用全視網膜光凝術有時可以阻滯增生性糖尿病性視網膜病。但是，一些情況下，玻璃體切割(vitrectomy)手術是唯一的選擇。除了這些視網膜病外，眼睛的血管病還包括眼新生血管形成病，諸如黃斑變性和糖尿病黃斑水腫(DME)。黃斑變性源於斑點下脈絡膜血管的新生血管生長。存在兩種類型的黃斑變性乾性和溼性。儘管溼性黃斑變性只包括全部黃斑變性的15%，但幾乎所有的溼性黃斑變性都致盲。此外，溼性黃斑變性幾乎總是源於乾性黃斑變性。一旦一隻眼染上溼性黃斑變性，該病症通常感染另一隻眼。溼性黃斑變性經常被稱為溼性-AMD的年齡相關性溼性黃斑變性，因為它主要發現在老人中。糖尿病性視網膜病(DR)和DME是大部分發達國家的勞動年齡人口失明的主要原因。世界範圍內糖尿病患者數量的增加表明DR和DME仍將是未來數年內視力喪失以及相關功能性損傷的主要原因。數種生化機制(包括蛋白激酶C-β活化，增加的血管內皮生長因子產生，氧化應激，和胞內山梨糖醇和高度糖基化最終產物的積聚)可能導致表現為DR/ DME的血管破壞。這些途徑的抑制有希望幹預DR和DME。術語「肺部高壓」表示肺部動脈的血壓異常高的病症。在沒有心臟或肺的其他疾病情況下，它被稱為原發性肺動脈高壓。肺部小動脈的彌散性狹窄是作為病理性動脈生成的結果發生的，然後是作為對血流阻礙增加的應答的肺動脈高壓。發病率是100』 000人中 8個。但是，肺動脈高壓還可以作為慢性阻塞性肺病(COPD)的併發症(諸如肺氣腫，慢性支氣管炎或瀰漫性間質纖維化)以及在哮喘樣COPD患者中發生。COPD的發病率是10』 000 人中大約5個。此外，本發明的結合蛋白可用於治療炎症和更具體的來說炎性病症。本文使用的術語「炎症」表示，對活組織損傷的局部反應，尤其是小血管，它們的內容物以及它們的相關結構的局部反應。血液組分穿過血管壁進入組織是炎症的標誌，如此形成的組織收集物被稱為滲出液或水腫。破壞活組織的任何有害步驟，例如感染細菌，過熱，冷，機械性損傷諸如擠壓，酸，鹼金屬，輻射，或感染病毒都可以引起炎症，與涉及的器官或組織無關。應清楚，分類到「炎性疾病」的疾病以及範圍從燒傷到肺炎，麻瘋病，肺結核， 和類風溼性關節炎的組織反應都是「炎症」。本發明的結合蛋白可用於治療腫瘤形成。術語「腫瘤」表示異常組織團，其無明顯原因的來自先前存在的體細胞，沒有預期功能，特徵在於自發和無限生長的傾向。腫瘤與炎性或其他腫脹完全不同，因為腫瘤內的細胞在其形態和其他特徵方面是異常的。異常細胞，即通常組成腫瘤的細胞種類，與正常細胞的不同之處在於經歷下列改變中的一種或更多種(1)肥大，或單個細胞大小的增加；( 增生或指定區域內細胞數目的增加；C3)退行性變化，或細胞生理特徵向更原始或未分化類型的退化。腫瘤可以是良性的，例如脂肪瘤， 血管瘤，骨瘤，軟骨瘤，和腺瘤。惡性腫瘤的實例是癌(諸如乳腺瘤，呼吸道和胃腸道、內分泌腺和生殖泌尿系統的癌)，肉瘤(在結締組織中，包括纖維組織，脂肪(脂)組織，肌肉，血管，骨，和軟骨)，癌肉瘤(在上皮和結締組織兩者中)，白血病和淋巴瘤，神經組織(包括腦)瘤，和黑色素瘤(著色皮膚細胞的癌症)。本發明結合蛋白抗腫瘤的使用還可以結合本領域已知的任何其他腫瘤療法諸如放療，光動力療法，化療或手術。藥物組合物包括如上所述的結合蛋白和藥學上可接受的載體，賦形劑或穩定劑 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。技術人員已知的合適載體，賦形劑或穩定劑是鹽水，Ringer』 s溶液，葡萄糖溶液，Hank』 s溶液，非揮髮油，油酸乙酯，5%葡萄糖鹽溶液，增強等滲性和化學穩定性的物質，緩衝劑和防腐劑。其他合適的載體包括自身不誘導產生對接受組合物的個體有害的抗體的任何載體， 諸如蛋白，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚胺基酸和胺基酸共聚物。藥物組合物還可以是組合製劑，包括其他的活性劑，諸如抗癌劑或抗血管生成劑(例如人VEGF-Axxxb ；優選的，人 VEGF-A165b)。優選的用於治療眼病的藥物組合物包括如上所述的結合蛋白和去汙劑諸如聚山梨酯20 (例如約0.04%)，緩衝劑諸如組氨酸，磷酸鹽或乳酸和糖諸如蔗糖或海藻糖。優選的，這類組合物包括如上所述的結合蛋白和PBS。所述藥物組合物可以局部施用，或局部施用到眼睛的一部分或注射到眼中，例如注射入結膜下，眼球周圍或眼球後間隙或直接注射入眼。可選的，可以通過腸胃外施用將所述組合物全身施用。優選的，通過玻璃體內注射將所述藥物組合物應用於眼。還優選的，所述藥物組合物被局部應用於眼，並作為滴眼劑。滴眼劑可用於角膜(眼中心的澄清部分)，從而允許分子滲入眼中。為了治療感染眼睛後部的疾病，最希望當在結膜下或眼球周圍注射時結合蛋白能夠穿透鞏膜。結合蛋白的施用可以在調節眼睛表面以提高分子穿透的預備步驟之後進行。優選的，通過穿透增強子調節上皮層諸如角膜上皮以允許例如上文描述的分子的足量和快速穿透。本發明結合蛋白抗眼病的使用還可以結合本領域已知的任何其他療法諸如光動力療法。用於體內施用的製劑必須是無菌或消毒的。這可以通過過濾除菌膜進行過濾方便地實現。可以製備緩釋製劑。在本發明的一個實施方案中，可以使用眼內植入物來提供本發明的結合蛋白。緩釋製劑的合適實例包括固態疏水多聚體(包含本發明多肽)的半滲透基質，所述基質採用成形產品的形式，例如膜或微膠囊。緩釋基質的實例包括聚酯，水凝膠 (例如，聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚丙交酯，L-穀氨酸和gamma-乙基-L-穀氨酸酯的共聚物，不可降解的亞乙基-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-羥基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的注射用微球)，和聚-D-(-)-3-羥丁酸。可以使用技術人員已知的任何合適方法施用藥學組合物。優選的施用途徑是腸胃外。在腸胃外施用中，本發明的藥物將與上文所述的藥學上可接受的賦形劑一起被配製為單位劑量的注射形式，諸如溶液，懸液或乳液。施用的劑量和方式將取決於待治療的個體和具體疾病。通常，施用藥物組合物使得給予本發明結合蛋白的劑量為1 yg/kg到20 mg/kg, 更優選的10 yg/kg到5 mg/kg，最優選的0. 1到2 mg/kg。優選的，其作為快速濃注劑量給藥。還可以使用連續輸注，包括通過滲透性微型泵的連續皮下輸送。這樣的話，藥物組合物的輸注劑量為5到20 μ g/kg/分鐘，更優選的7到15 yg/kg/分鐘。尤其是，通過注射入眼睛來施用藥物組合物，使得給予本發明結合蛋白的劑量為0.1 mg到10 mg每次注射，更優選的0.3到6 mg每次注射，最優選的1 mg到4 mg每次注射。此外，通過滴眼劑給眼睛施用藥物組合物，使得施用於眼的單滴溶液包含本發明結合蛋白的濃度為10到120 mg/ ml，更優選的20到100 mg/ml，最優選的40到80 mg/ml。在本發明的另一個實施方案中，如上所述抑制VEGF-Axxx活性的結合蛋白，可以與抑制PlGF活性的結合蛋白或小分子(具有與上述針對VEGF-Axxx的相同PlGF抑制水平)聯用。該實施方案基於以下事實在VEGF-Axxx水平增加的位置發現PlGF是生成血管的。此外，如上所述抑制VEGF-Axxx活性的結合蛋白，可以與抑制以下物質活性的結合蛋白或小分子聯用血小板衍生生長因子(PDGF) ,VEGF-C或蛋白VEGF家族的其他成員，腫瘤壞死因子alpha (TNFalpha)，delta-配體樣4 (DII4)，白介素6 (IL-6)，神經氈蛋白或促血管生成素2 (Ang2)。本發明還提供新的治療方法。一方面，提供治療視網膜病的方法，所述方法包括給需要其的患者施用治療有效量的本發明結合蛋白，尤其是抑制人VEGF-Axxx和人VEGFR-2 相互作用、但不抑制VEGF-Axxxb和人VEGFR-2相互作用的結合蛋白，並且所述結合蛋白抑制VEGFR-2介導的血管生成。本發明還涉及使用所述結合蛋白抑制細胞中VEGF-A生物活性或抑制VEGFR-2介導的生物活性的方法。細胞可以位於體內或離體，並且可以是，例如，活生物體的細胞，培養的細胞或組織樣品中的細胞。該方法包括將所述細胞與本文公開的VEGF-A/VEGFR-2相互作用抑制結合蛋白中的任一種按照足以抑制這類生物活性的量和時間進行接觸。本發明提供治療患有對VEGF-Axxx或VEGFR-2的抑制產生應答的狀況的受試者的方法。這類方法包括給所述受試者施用有效量的本文所述結合蛋白。狀況可以是特徵為不當血管生成的狀況。狀況可以是高增殖(hyperproliferative)狀況。適於治療的狀況(或病症)的實例包括自身免疫病，炎性病症，視網膜病(尤其是增殖性視網膜病)，和癌症，尤其是上述疾病的一種。本文描述的任一種結合蛋白可用於製備治療下述病症的藥物，尤其是選自以下組的病症自身免疫病，炎性病症，視網膜病，和癌症。適於治療的優選狀況(或病症)是第一線轉移性腎細胞癌，復發的多形性膠質母細胞瘤，輔助(adjuvant)結腸癌，輔助 HER2-陰性乳腺癌，輔助HER2-陽性乳腺癌，輔助非小細胞肺癌，彌散性大B細胞淋巴瘤，第一線晚期胃癌，第一線HER2-陰性轉移性乳腺癌，第一線HER2-陽性轉移性乳腺癌，第一線轉移性卵巢癌症，胃腸間質腫瘤，高風險類癌瘤，激素難治性前列腺癌，新診斷的多形性膠質母細胞瘤，轉移性頭和頸部癌症，復發的鉬敏感性卵巢癌，第二線轉移性乳腺癌，泛發性小細胞肺癌，非鱗狀、非小細胞肺癌以及先前治療的CNS轉移瘤和復發的多發性骨髓瘤，前列腺癌，非小細胞肺癌(NSCLC)，結腸直腸癌和胰腺癌，晚期卵巢癌(A0C)，具有徵兆性惡性腹水的AOC患者和非霍奇金氏淋巴瘤。本發明的重組結合蛋白可以通過以下數種方法獲得和/或進一步發展，諸如噬菌體表面展示(wo 90/02809, WO 07/006665)或細菌細胞表面展示(W0 93/10214)，核糖體展示(W0 98/48008)，質粒展示(W0 93/08278)或使用共價的RNA-重複蛋白雜合構建體 (W0 00/3觀23)，或胞內表達和挑選/篩選諸如通過蛋白互補測定(W0 98/341120)。這類方法是本領域技術人員已知的。用於本發明重組結合蛋白的挑選/篩選的錨蛋白重複蛋白庫可以根據本領域技術人員已知的方案(W0 02/020565，Binz, H. K. et al.，JMB, 332，489-503，2003,和Binz et al. , 2004,在上述引文中)獲得。用於VEGF-Αχχχ特異性DARPins挑選的這類文庫的使用在實施例1中給出。類似的，上文描述的錨蛋白重複序列基序可以用於構建錨蛋白重複蛋白的庫(其可用於VEGF-Axxx特異性DARPins的挑選或篩選)。此外，利用標準重組DNA技術(例如WO 02/020565, Binz et al.，2003,在上述引文中，和Binz et al., 2004,在上述引文中)，本發明的重複結構域可以從本發明的重複組件和合適的加帽組件模塊化組裝(Forrer, P.，et al.，FEBS letters 539，2-6, 2003)。本發明不局限於在實施例描述的具體實施方案。可以按照如下所述的一般概述使用和處置其他來源。
實施例下文公開的所有起始原料和試劑都是本領域技術人員已知的，可以商購獲得或利用公知的技術製備。材料
化學製劑購自 Fluka (Switzerland)。寡核苷酸購自 Microsynth (Switzerland) 除非另有說明，DNA聚合酶、限制性內切酶和緩衝液購自New England Biolabs (USA)或 Fermentas (Lithuania) 克隆菌株和蛋白生成菌株是大腸桿菌XLl-blue (Stratagene, USA)。VEGF變體購自R&D Systems (Minneapolis, USA)，或在中國倉鼠卵巢細胞或巴斯德畢赤酵母中產生並根據標準步驟進行純化(Rennel，Ε. S. et al.，European J. Cancer 44，1883-94，2008 ；2008 ；Pichia表達系統購自hvitrogen)。生物素化的VEGF變體通過化學法獲得，利用標準的生物素化試劑和方法將生物素部分偶聯到純化的VEGF變體的伯胺(Pierce, USA)。分子生物學
除非另有說明，根據描述的方案(Sambrook J.，Fritsch E. F. and Maniatis Τ.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York)實施方法。設計的錨蛋白重複蛋白文庫
N2C和N3C設計的錨蛋白重複蛋白文庫被描述(W0 02/20565 ；Binz et al. 2003,在上述引文中；Binz et al. 2004,在上述引文中)。N2C和N3C中的數字描述加帽組件N端和C端之間存在的隨機重複組件的數目。用於定義重複單位和組件內位置的命名法是基於 Binz et al. 2004,在上述引文中，改變是重複組件和重複單位的邊界遷移一個胺基酸位置。例如，Binz et al. 2004 (在上述引文中)的重複組件的位置1對應於本文重複組件的位置2，所以Binz et al. 2004 (在上述引文中)的重複組件的位置33對應於本文下一個重複組件的位置1。所有DNA序列都通過測序確認，所有描述蛋白的計算分子量都通過質譜確認。實施例1 具有對VEGF-Axxx的結合特異性的包括重複結構域的結合蛋白的祧選利用核糖體展示(Hanes, J. and PlUckthun, Α., PNAS 94, 4937-42，1997)，許多設
計的具有對VEGF-Axxx的結合特異性的錨蛋白重複蛋白(DARPins)選自Binz等2004 (在上述引文中)描述的N2C或N3C DARPin文庫。通過粗提物ELISA評價挑選的克隆對特異性(VEGF-Axxx)和非特異性(MBP，大腸桿菌麥芽糖結合蛋白)靶標的結合，表明VEGF-Axxx結合蛋白被成功挑選(

圖1)。SEQ ID NO: 14到40構成所選結合蛋白的胺基酸序列，所述結合蛋白包括具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域。所選結合劑的序列分析顯示某些挑選的結合劑家族固有的特定錨蛋白重複序列基序。具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域中存在的這類錨蛋白重複序列基序提供於SEQ ID NO: 1到13。通過核糖體展示挑選VEGF-Axxx特異性錨蛋白重複蛋白
通過核糖體展示(Hanes and Pluckthun,在上述引文中)進行VEGF-Axxx特異性錨蛋白重複蛋白的挑選，使用狗VEGF-A164或人VEGF-A165作為靶蛋白，如所述的設計的錨蛋白重複蛋白文庫(W0 02/020565, Binz et al.，2003,在上述引文中和Binz et al.， 2004，在上述引文中)和確立的方案(Zahnd, C., Amstutz, P. and Pluckthun, Α.，Nat. Methods 4，69-79，2007)。使用確立的方案(Binz et al. 2004,在上述引文中)，利用 N2C和N3C DARPin文庫對狗或人VEGF變體(包括生物素化的變體，固定於neutravidin或鏈黴親和素)進行核糖體展示挑選循環。每輪挑選後逆轉錄(RT)-PCR循環的數目恆定的從40減少到30，以適應結合劑富集得到的產出。對狗VEGF的4輪初步挑選得到納摩親和力DARPins的混合物，這通過單個克隆的ELISA和SI3R測量顯示。為了發現具有進一步改善的親和力的DARPins，對固定於neutravidin或鏈黴親和素的生物素化人或狗VEGF進行額外的解離速率篩選(off-rate selections)，採用第二輪和第三輪初始核糖體展示挑選後的混合物，然後是對人VEGF的結合速率篩選(on-rate selection)。如粗提物ELISA所示，挑選的克隆特異性結合VEGF-Axxx
使用標準步驟，利用DARPin表達細胞的粗製大腸桿菌提取物，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)鑑定特異性結合VEGF-Axxx的所選單個DARPins。所選克隆被克隆入pQE30 Oliagen)表達載體，轉化大腸桿菌XLl-Blue (Mratagene)，然後在包含1 ml生長培養基 (2YT包含1%葡萄糖和100 μδ/πι1氨苄青黴素)的96深孔板(單孔中每個克隆)中37°C 生長過夜。將100 μ 過夜培養物接種到新的96深孔板中的1 ml新鮮2YT (包含50 μδ/ ml氨苄青黴素)。在37°C溫育2 h後，利用IPTG (1 mM終濃度)誘導表達並持續3 h。收集細胞，重懸於100 μ B-PERII (Pierce)，並在室溫振蕩條件下溫育15分鐘。然後，添加 900 μ PBS-TB (PBS 添加 0. 2% BSA, 0.1% Tween 20, ρΗ 7. 4)，通過離心去除細胞碎片。 將100 μι每種裂解的克隆加入NeutrAvidin包被的MaxiSorp板的孔(包含通過它們的生物素部分固定的VEGF-Axxx變體或無關MBP)，並在室溫溫育1 h。用PBS-T (PBS添加 0. 1% Tween 20，ρΗ 7.4)徹底清洗後，使用單克隆抗RGS (His) 4抗體(34650, Qiagen)作為一抗和綴合鹼性磷酸酶的多克隆山羊抗小鼠抗體(A3562，Sigma)作為第二試劑通過標準ELISA法將板顯色。然後使用4-硝基苯基磷酸二鈉GNPP，Fluka)作為鹼性磷酸酶的底物檢測結合。在405 nm測量顯色。用於鑑定結合VEGF-Axxx的DARPins的示例性粗提物ELISA的結果顯示於圖1。通過這種粗製細胞提取物ELISA篩選數百個克隆顯示，超過上百個不同的DARPins具有對VEGF-Axxx的特異性。挑選這些結合蛋白用於進一步分析。挑選的特異性結合VEGF-Axxx的錨蛋白重複結構域的胺基酸序列的實例提供於SEQ ID N0:14 到40。從具有對VEGF-Axxx的結合特異性的所選重複結構域推定重複序列基序通過本領域技術人員已知的序列分析工具進一步分析所選重複結構域(具有對
VEGF-Axxx的結合特異性)的胺基酸序列(W0 02/020565 ；Forrer et al.，2003,在上述引文中；Forrer, P. , Binz, H. K. , Stumpp, Μ. T. and Pliickthun, A. , ChemBioChem, 5(2)，183-189，2004)。但是，與WO 02/020565 (其中使用天然存在的重複基序推導重複序列基序)不同，本文從挑選的具有對VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域的重複單位推導出重複序列基序。從而確定包括常見重複序列基序的所選重複結構域的家族。具有對 VEGF-Axxx的結合特異性的重複結構域中存在的這類重複序列基序提供於SEQ ID Ν0:1到 13。DARPins的高水平和可溶性表達
為了進一步分析，將在所述粗製細胞提取物ELISA中顯示特異性VEGF-Axxx結合的挑選克隆在大腸桿菌XLl-blue細胞中表達，並通過標準步驟使用它們的His標籤進行純化。 使用25 ml靜止過夜培養物(LB，1%葡萄糖，100 mg/1氨苄青黴素；37°C )接種1升培養物 (相同培養基)。在A(600) = 0.7時，用0.5 mM IPTG誘導培養物，並在37°C溫育4 h。將培養物離心，所獲沉澱重懸於40 ml TBS500 (50 mM Tris - HCl, 500 mM NaCl, pH 8)並進行超聲處理。將裂解物再次離心，向所獲上清中添加甘油(10% (ν/ν)終濃度)和咪唑 (20 mM終濃度)。根據製造商的說明書(QIAgen, Germany)，在Ni-氮川三乙酸柱(2.5 ml 柱體積)上純化蛋白。根據SDS-15% PAGE估算，從1升大腸桿菌培養物可以純化出高達 200 mg的高可溶性DARPins (具有對VEGF-Axxx的結合特異性)，其純度>95%。這種純化的 DARPins用於進一步表徵。^MM 2 在球體牛長測丨定中確定祧詵的H有對VEGF-Axxx的結合特異t牛的 DARPins 的 IC=倌
向埋入膠原基質的HUVEC球體添加VEGF-Axxx導致球體生芽。添加VEGF-Axxx的抑制劑將阻斷芽形成，這可以通過芽的數目和長度在統計上定量。通過添加不同濃度的抑制劑和恆定量的VEGF，可以確定IC5Q。VEGF-Axxx特異性DARPins對球體生芽的抑$lj
根據標準步驟(Korff et al.,在上述引文中)完成球體生長測定。挑選具有對 VEGF-Axxx的特異性的DARPins，並按實施例1所述純化到>96%純度。人臍靜脈細胞在單層培養中生長到匯合。胰酶消化後，將細胞懸液置於懸滴條件以形成球體，即大約500個有組織聚集的HUVECs。將球體埋入膠原基質，並用VEGF-A165刺激以起始芽生長。另外添加生芽抑制劑以觀察它們對生芽抑制的作用。使用圖形軟體定量每個球體的芽數目和芽長度。來自2個示例性球體生芽測定的結果顯示於圖加(具有對VEGF-Axxx的結合特異性的DARPin #30)和圖2b (DARPin NC，沒有對VEGF-Axxx的結合特異性的陰性對照 DARPin ；例如DARPin E3_5 (Binz et al.，2005，在上述引文中))。在該測定各種表現最好的DARPins顯示範圍為10到50 pM的IC50值，而平行實驗中Avastin ，Lucent is ^P Macugen 顯示範圍為150到500 pM的IC50值。實施例3 通過表面等離子體共振分析確定DARPin #27與Avastin 相比的靶特異性
將狗 VEGF-A164 或狗 VEGF-A164b 固定於流動池，並分析 DARPin #27 (SEQ ID NO: 16) 和Avastin 與固定靶的相互作用。表面等離子體共振(SPR)分析
使用 ProteOn 裝置(BioRad)測量 SPR。運行緩衝液是 20 mM HEPES, pH 7. 4，150 mMNaCl 和 0.005% Tween 20。將約 1200 RU 的狗 VEGF-A164 或狗 VEGF_A164b 固定於 GLC 晶片 (BioRad)。測量相互作用，60 μ 1/min流速的5分鐘緩衝液流動，濃度為250 nM的Avastin 或DARPin #27的100秒注射，以及具有緩衝液流動的數分鐘解離速率測量。從測量值減去未包被參照池的信號。結果顯示於圖3a (Avastin與狗VEGF-A164的相互作用)，圖3b (Avastin與狗 VEGF-A164b的相互作用)，圖3c (DARPin #27與狗VEGF-A164的相互作用)和圖3d (DARPin #27與狗VEGF-A164b的相互作用)。Avastin與兩種固定的VEGF同種型均明顯相互作用， 而DARPin #27隻顯示與VEGF-A164而非VEGF_A164b的相互作用。實施例4 血管滲漏兔樽型中DARPin #30抑制VEGF-A165的體內功效通過玻璃體內注射將聚乙二醇化的DARPin #30 (SEQ ID NO: 29)或Lucentis 施用於
兔的眼睛以檢測它們抑制血管滲漏(通過人VEGF-A165的後續玻璃體內的注射誘導)的功效。兔中血管滲漏抑制的測量
在第一天，通過玻璃體內注射將PBS、聚乙二醇化的DARPin #30 (125 μ g)或等摩爾量的Lucentis (162 μ g)施用於每隻兔的一隻眼(治療眼)。在第4天或第30天，通過玻璃體內注射500 ng人VEGF-A165攻擊每隻兔的治療眼。在VEGF-A165注射後48小時評價所有動物的兩隻眼，通過靜脈注射鈉螢光素(50 mg/kg動物體重，10%(w/v)溶於0.9% (w/ ν)鹽溶液)後1 h測量所有眼睛中的螢光素含量。計算每隻動物的治療眼與未治療眼的螢光量的比值。比值為1相當於治療眼中不存在額外的螢光滲漏，比值大於1表示治療眼比未治療對照眼更多的螢光滲漏。聚乙二醇化DARPin的製備
利用單個Cys殘基和馬來醯亞胺化學法將蛋白PEG化是本領域技術人員公知的， 可以根據確立的方案(例如來自Pierce)進行。使用標準層析法將包括附加C端接頭 (GGGSGGGSC，SEQ ID N0:41)的DARPin #30純化到接近均質。使用DTT將蛋白完全還原，並通過凝膠過濾進行純化以去除DTT，將緩衝液更換為PBS。將溶於PBS的PEG-馬來醯亞胺 (甲氧基-聚(乙二醇)-氧代丙胺基-丙基馬來醯亞胺；NOF，no. Sunbright ME-200MA) 與溶於PBS的DARPin在室溫下混合2_4小時，其中PEG-馬來醯亞胺大約15%摩爾過量。然後使用標準陰離子交換層析，將聚乙二醇化的DARPin與未反應的DARPin和未反應的PEG 部分分離。結果顯示於圖4。在通過玻璃體內注射施用聚乙二醇化的DARPin #30和 Lucentis 後4天，它們能夠保護兔眼免於VEGF-A165誘導的血管滲漏。儘管如此，只有聚乙二醇化的DARPin #30,而不是Lucentis ，在直至玻璃體內注射後30天仍能夠保護兔眼免於VEGF-A165誘導的血管滲漏。
權利要求
1.包括至少一個重複結構域的重組結合蛋白，其中所述重複結構域以低於1(ΓΜ的Kd 結合 VEGF-Axxx，並抑制 VEGF-Axxx 結合 VEGFR-2。
2.權利要求1的結合蛋白，其中所述重複結構域以低於10nM的IC5tl值抑制HUVEC球體的生芽。
3.權利要求1的結合蛋白，其中與所述重複結構域與相應VEGF-Axxx的相互作用的Kd 相比，所述重複結構域與VEGF-Axxxb的相互作用的Kd是至少10倍高。
4.權利要求1的結合蛋白，其中所述重複結構域是錨蛋白重複結構域。
5.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中1代表選自κ，τ和γ的胺基酸殘基； 2代表胺基酸殘基N或M ； 2代表胺基酸殘基T或F; 4代表胺基酸殘基S或A ； 5代表胺基酸殘基H或R ； 6代表選自A，Y, H,和N的胺基酸殘基；和 Z代表胺基酸殘基A或T。
6.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中丄代表選自A，N,R，V,Y，E, H, I，K, L, Q, S和T的胺基酸殘基2代表選自S，A,N,R，D, F, L, P, T和Y的胺基酸殘基；2代表選自T,V,S,A,L和F的胺基酸殘基；4代表選自W，F和H的胺基酸殘基； 5代表選自P，I，A, L, S, Τ, V和Y的胺基酸殘基； 6代表選自W，F, I，L, T和V的胺基酸殘基； Z代表胺基酸殘基L或P;和 8代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
7.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中1代表選自K，M,N, R和V的胺基酸殘基；2代表選自Y，H,M和V的胺基酸殘基；2代表選自F，L,M和V的胺基酸殘基；4代表選自R，H,V，A, K和N的胺基酸殘基；5代表選自F，D, H, Τ, Y, M和K的胺基酸殘基；和 6代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
8.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中1代表選自L，S和T的胺基酸殘基； 2代表選自G，S和C的胺基酸殘基； 2代表胺基酸殘基S或A ； 4代表選自Q，S, M和N的胺基酸殘基； 5代表選自L，M和Q的胺基酸殘基；和 6代表選自A，H, N, Y和D的胺基酸殘基。
9.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有以下錨蛋白重複序列基序的重複組件其中1代表選自K，S, I，N, T和V的胺基酸殘基；2代表選自K，N, W, Α, H, M, Q和S的胺基酸殘基；2代表選自F，Q, L, H和V的胺基酸殘基；4代表胺基酸殘基F或T ；5代表胺基酸殘基Q或H;6代表胺基酸殘基Y或S;Z代表選自N，H, Y和M的胺基酸殘基；和8代表選自A，H, N和Y的胺基酸殘基。
10.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有SEQID N0:6的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID N0:5的錨蛋白重複序列基序的重複組件。
11.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括具有SEQID N0:3的錨蛋白重複序列基序的重複組件，其中所述重複組件之前是具有SEQ ID N0:2的錨蛋白重複序列基序的重複組件和/或之後是具有SEQ ID N0:4的錨蛋白重複序列基序的重複組件。
12.權利要求4的結合蛋白，其中所述重複結構域與選自SEQID N0s:16，22，23，29， 30，33，34，36，39和40的錨蛋白重複結構域競爭結合VEGF-Axxx。
13.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域選自SEQID N0s:14到40。
14.權利要求4的結合蛋白，其中所述錨蛋白重複結構域包括與選自SEQID N0s:14到 40的一個錨蛋白重複結構域具有至少75%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
15.權利要求4的結合蛋白，其中所述重複結構域的重複組件的一個或更多個胺基酸殘基被比對重複單位時在對應位置上發現的胺基酸殘基替換。
16.權利要求1到15中任一項的結合蛋白，還包括非蛋白的多聚體部分。
17.一種核酸，編碼權利要求1到15中任一項的結合蛋白。
18.—種藥物組合物，包括權利要求1到16中任一項的結合蛋白或權利要求17的核酸，以及任選地藥物可接受的載體和/或稀釋劑。
19.權利要求18的藥物組合物，其用於眼病的治療。
20.一種治療哺乳動物包括人的病理性血管生成的方法，包括給需要其的患者施用有效量的權利要求1到17中任一項的化合物。
全文摘要
本發明涉及對VEGF-A特異的結合蛋白，尤其涉及包括結合結構域的重組結合蛋白，其抑制VEGF-Axxx結合VEGFR-2。這類結合蛋白的實例是包括具有所需結合特異性的錨蛋白重複結構域的蛋白。該結合蛋白可用於癌症和其他病理狀況的治療，例如眼病諸如年齡相關性黃斑變性。
文檔編號C07K14/47GK102272148SQ200980153604
公開日2011年12月7日 申請日期2009年11月3日 優先權日2008年11月3日
發明者K. 賓茨 H., T. 施圖姆普 M., 福雷爾 P. 申請人:分子組合公司