(r)－2－辛醇脫氫酶,產生此酶的方法,編碼此酶的dna,以及使用此酶生產醇類的方法

2024-03-27 02:13:05

專利名稱：(r)－2－辛醇脫氫酶,產生此酶的方法,編碼此酶的dna,以及使用此酶生產醇類的方法
技術領域：
本發明涉及新的(R)-2-辛醇脫氫酶，可用於生產醇類，酮類，特別是生產具有光學活性的醇類，例如(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物；編碼此酶的DNAs；此酶生產方法；用此酶生產醇類，酮類，特別是生產具有光學活性的醇類，例如(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。
背景技術：
化合物(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯作為中間體，用於合成HMG-CoA還原酶抑制劑，如D-肉鹼等。此類化合物可用於藥物和殺蟲劑的合成。特別是如何(合成或分解)得到(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的光學純的對映異構體是工業上的重要問題。如今，已知利用微生物如麵包酵母進行不對稱合成，結晶，和不對稱還原的方法(尚未審查已公開的日本專利申請(JP-A)Sho 61-146191，JP-A Hei 6-209782等)可用於(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的生產。但是由於存在一些問題，如產品光學純度低，產量低等，這些方法不適於工業應用。
此外，也檢索了能還原4-滷乙醯乙酸酯為(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的酶。例如，下列已知的酶。已有報導採用這些酶可用於合成(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯。但是這些酶是還原酶，它們採用還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)為輔酶。因此，利用這些酶合成(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯需要NADPH的參與和再生，而NADPH是昂貴的和化學性不穩定的，不利於工業應用。
●一些得自麵包酵母的還原酶(D-酶-1，D-酶-2，美國化學學會會志(J.Am.Chem.Soc.)107，2993-2994，1985)
●得自赭色擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的乙醛還原酶2(Appl.Environ.Microbiol.65，5207-5211，1999)●得自馬其頓假絲酵母(Candida macedoniensis)的酮泛酸酯還原酶(Arch.Biochem.Biophys.294，469-474，1992)●得自白地黴(Geotrichum candium)的4-氯乙醯乙酸乙酯還原酶(EnzymeMicrob.Technol.14，731-738，1992)●得自Candida magnoliae的羰基還原酶(WO 98/35025)●得自乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)的羰基還原酶(JP-A Hei11-187869)●β-酮醯基-醯基載體蛋白還原酶，作為II型脂肪酸合成酶之一(JP-A2000-189170)儘管已知得自假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)PED的3-羥基類固醇脫氫酶(JP-A Hei 1-277494)，甘油脫氫酶(Tetrahedron Lett.29，2453-2454，1988)，和乙醇脫氫酶(有機化學雜誌(J.Org.Chem.)57，1526-1532，1992)可作為以還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為電子供體的還原酶，但這些酶由於合成(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的反應活性低而不利於工業應用。
如上面指出的，採用微生物和酶生產(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的已知方法在某些方面不令人滿意如光學純度，產量，活性等。這些問題使已知方法難於進行工業應用。
在另一方面，(R)-丙氧苯衍生物(JP-A hei 02-732)作為中間體可用於合成藥物，特別是氧氟沙星(ofloxacin)((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪)-7-氧代-2，3-二氫-7H-吡啶並[1，2，3-脫][1，4]苯噁嗪-6-羧酸，JP-A Sho 62-252790)這種合成抗細菌藥物的光學活性物質。如何得到(合成或分解到)這些化合物的光學純的對映異構體在工業上是一個重要問題。
已知利用脂肪酶和酯酶使丙氧苯衍生物的外消旋物不對稱醯化是一種用於生產(R)-丙氧苯衍生物的方法。在此方法中，需要一種在使(R)型醯化後將剩餘的原料和醯化產物分離的方法和一種使醯化產物脫醯的方法。因此，由於這些方法很複雜，此已知方法不適於工業應用。
採用微生物使丙酮氧苯衍生物不對稱還原的方法已有報導。但是，由於產生的(R)-丙氧苯衍生物的光學純度低至84-98％(JP-A Hei 03-183489)或8.8-88.4％(JP-A Hei 05-68577)，以及由於底物濃度低至0.1-0.5％，此已知方法不適於工業應用。鑑於通過不對稱還原得到高光學純度的方法，有報導可採用產生自Candida magnoliae的羰基還原酶(JP-A 2000-175693)合成光學純度為99％或更高的(R)-丙氧苯衍生物。但是，此羰基還原酶使用NADPH作為輔酶。因此採用此酶合成(R)-丙氧苯衍生物需要添加或再生昂貴且化學性不穩定的NADPH，這在工業應用上是不利的。

發明內容
本發明的一個目的是提供利用NADH作輔酶還原4-滷乙醯乙酸酯並生產高光學純度的(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的新型酶。此外，本發明的一個目的是提供利用此酶生產高光學純度(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的方法。
另外，本發明的一個目的是提供以NADH作輔酶的新的酶，它可以生產用作合成抗細菌藥物的中間體的光學高純度(R)-丙氧苯衍生物。此外，本發明的一個目的是提供利用此酶生產有著高光學純度的(R)-丙氧苯衍生物的方法。
本發明人認為可利用NADH作電子供體的乙醇脫氫酶可用於工業應用。NADH比NADPH更廉價且化學性質更穩定。為發現可以有效產生光學活性(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的酶，本發明人篩選了對(R)-2-辛醇有高活性的乙醇脫氫酶，所述(R)-2-辛醇有著與(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯相同的構型以及與4-滷乙醯乙酸酯同樣長的長鏈。
以前的發現報導得自過濾弧菌(Comamonas terrigena)，畢赤酵母屬(Pichia)NRRL-Y-11328株，和假單胞菌屬(pseudomonas)SPD6株的酶作為仲醇脫氫酶，所述酶可以立體選擇性氧化(R)-2-辛醇，並且有生產2-辛醇的活性。但是，沒有關於這些酶可以還原4-滷乙醯乙酸酯和產生(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的報導。因為這些酶對(R)-2-辛醇的活性並不明顯大於對仲醇如2-丙醇(其側鏈較短)的活性，因此通過還原4-滷乙醯乙酸酯(其碳醯基結合在體積大的側鏈上)生產(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯的活性預計較低。
因此，本發明人大量篩選含有能優選氧化(R)-2-辛醇的酶類的微生物。結果，他們發現下類屬的微生物具有優選氧化(R)-2-辛醇的能力畢赤氏酵母屬(Pichia)假絲酵母屬(Candida)
Ogataea屬具體地，發現下列微生物具有優選氧化(R)-2-辛醇的能力Pichia finlandicaPichia jadinii產朊假絲酵母(Candida utilis)Ogataea wicherhamii而且，本發明人培養了這些微生物並從這些微生物中純化得到了能氧化(R)-2-辛醇的酶。對這些酶的性質進行檢測，發現這些酶對(R)-2-辛醇的氧化具有高度立體選擇性，此外，與(R)-2-辛醇相比更易於立體選擇性氧化仲醇。還發現這些酶不但具有還原4-氯乙醯乙酸乙酯和生產(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯的高活性，還具有還原2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯和生產2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的高活性。這樣，本發明得以完成。
具體地，本發明涉及新的(R)-2-辛醇脫氫酶，其可用於生產醇類，酮類，特別是生產具有光學活性的醇類，例如(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯；編碼此酶的DNA；此酶生產方法；用此酶生產醇類，酮類，特別是生產具有光學活性的醇類，例如(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。
一種(R)-2-辛醇脫氫酶，具有下列(1)和(2)的物化性質(1)作用i)以氧化型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶，此酶通過氧化醇生產酮，且ii)以還原型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶，此酶通過還原酮生產醇，且(2)底物特異性i)此酶優先氧化2-辛醇兩種光學異構體中的(R)-2-辛醇，且ii)此酶通過還原4-滷乙醯乙酸酯生產(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯。
[1]中的(R)-2-辛醇脫氫酶，其有著下列(3)和(4)的物化性質(3)最佳pH用於氧化反應的最佳pH範圍為8.0-11.0，還原反應的最佳pH範圍為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現出更高的活性，且
ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現出顯著更高的活性。
[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中此(R)-2-辛醇脫氫酶由挑選自畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬的微生物衍生。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於畢赤酵母屬的微生物是Pichiafinlandica。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於畢赤酵母屬的微生物是Pichiajadinii。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於假絲酵母屬的微生物是產朊假絲酵母。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於Ogataea屬的微生物是Ogataeawickerhamii。
[1]或[2]的用於生產(R)-2-辛醇脫氫酶的方法，此方法包括培養從畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中挑選的微生物，所述微生物生產[1]或[2]的酶。
下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸編碼了具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的蛋白(a)多核苷酸，其含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，(b)多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2胺基酸序列的蛋白，(c)多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2胺基酸序列的蛋白，在此胺基酸序列中有一個或多個胺基酸的取代，缺失，插入和/或添加，(d)多核苷酸，其在嚴謹條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交，且(e)編碼與SEQ ID NO2胺基酸序列有著不少於70％同源性的胺基酸序列的多核苷酸。
為[9]的多核苷酸編碼的蛋白。
重組載體，其中插入了[9]中的多核苷酸。
[11]的重組載體，其中進一步插入一種多核苷酸，其編碼以β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶並能催化氧化還原反應的脫氫酶。
以可表達的方式含有[9]中多核苷酸或[11]中載體的轉化體。
生產[10]中蛋白的方法，此方法包含培養[13]中的轉化體。
生產醇的方法，此方法包含將[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，可生產此酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產物與酮反應以使酮還原。
[15]的方法，其中的微生物是[13]的轉化體。
[15]的方法，其中的酮是4-滷乙醯乙酸酯的衍生物並且其中的醇是(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯衍生物。
[17]的方法，其中4-滷乙醯乙酸酯的衍生物是4-氯乙醯乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[15]的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示通式1 其中x1和x2表示滷原子；其中的醇是丙氧苯衍生物，由通式2表示通式2 [20][19]的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯。
[15]的方法，該方法還包括將氧化型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸轉換成其還原型。
用於生產酮的方法，此方法包括使[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，可生產此酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產物與醇反應以使醇氧化。
生產光學活性醇的方法，該方法包含的步驟有，將[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，生產該酶或蛋白的微生物，或微生物加工產物與外消旋醇反應以優先氧化任一光學異構體，並得到保留的光學活性醇。
[22]或[23]的方法，該方法另外進一步包含將還原型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸轉換成其氧化型。
本發明提供具有下列(1)和(2)的物化性質的酶(1)作用i)該酶通過氧化醇生產酮，其以氧化型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為輔酶，且ii)該酶通過還原酮生產醇，其以還原型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為輔酶，且(2)底物特異性i)該酶優先氧化2-辛醇兩種光學異構體中的(R)-2-辛醇，且ii)該酶通過還原4-滷乙醯乙酸酯生產(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯。
優選地，本發明的酶進一步具有下列(3)和(4)的酶性質(3)最佳pH氧化反應的最佳pH為8.0-11.0，還原反應的為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現出更高的活性，且ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現出顯著更高的活性。
此外，本發明優選的(R)-2-辛醇脫氫酶具有下列(5)到(8)的物化性質和酶性質(5)最佳作用溫度範圍(R)-2-辛醇的氧化反應最佳作用溫度範圍為45-55℃。乙基4-氯乙醯乙酸酯的還原反應範圍為55-60℃。
(6)穩定pH範圍該酶在pH8-9穩定。
(7)抑制該酶受到氯化汞和螯合劑乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA 2Na)的輕微抑制。
(8)穩定性N-乙基馬來醯亞胺，o-菲咯啉，氯化鎂，氯化鈣，和氯化錳可以穩定該酶。
(9)純化方法本發明的酶可採用通常的純化方法從生產該酶的微生物中進行純化。例如，可通過破壞真菌菌體後進行硫酸魚精蛋白沉澱，用硫酸銨鹽析出離心上清液，再進一步組合陰離子交換層析，疏水層析，親和層析，凝膠過濾等方法純化蛋白。
在此所用術語「脫氫酶」指可以催化脫氫反應的酶，所述脫氫反應指從含有氫的化合物上移去氫的氧化反應。此外，該酶具有對酮的還原活性，且在還原條件下能催化氧化反應的逆反應。因此，本發明中的「脫氫酶」具有催化還原反應的活性，所述還原反應為氧化反應的逆反應，且其中加入了氫原子。通常，當具有相同活性時，稱為「脫氫酶」「氧化還原酶」「氧化酶」「還原酶」，或類似名稱的酶都包括在本發明的脫氫酶中。
在本發明中，對4-氯乙醯乙酸酯的還原活性如下檢測。30℃下孵育反應混合物，其中含有磷酸鉀緩衝液(pH6.5，100mM)，0.2mM NADH，20mM乙基4-氯乙醯乙酸酯以及該酶，檢測隨著NADH的減少在340nm處吸收度的降低可以確定其活性。1U定義為1分鐘時催化NADH減少1μmol的酶量。可使用蛋白質檢測試劑盒(BIORAD)通過染料結合方法進行蛋白的定量。
在另一方面，對(R)-2-辛醇的氧化活性可如下測定。30℃下孵育反應混合物，其中含有Tris-HCl緩衝液(pH8.5，50mM)，2.5mM NAD+，5mM(R)-2-辛醇以及該酶，檢測隨著NADH的產生在340nm處吸收度的升高可以確定其活性。1U定義為1分鐘時催化生成1μmol NADH的酶量。
本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶具有對(R)-2-辛醇的高氧化活性。此外，該酶對(R)-2-辛醇的高氧化活性顯著高於對2-丙醇的活性。在此，以(R)-2-辛醇為底物，在NAD+的參與下，隨著NADH的增加或減少每單位時間在340nm處吸收度的變化速度(相對活性)要2倍或更多倍，優選5倍或更多倍於以2-丙醇為底物的速度(作為1)，可以說該脫氫酶活性顯著較高。
在本發明中，(R)-2-辛醇脫氫酶優先氧化(R)-2-辛醇是指當(R)-2-辛醇脫氫酶對R型的酶活性作為100時，對S型的活性是50或更少，優選20或更少，且更優選10或更少。
有著如上所述物化性質的(R)-2-辛醇脫氫酶可從生成此酶的微生物培養液中得到。例如，生產本發明酶的菌株可以在畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中找到。特別是，畢赤氏酵母屬的Pichia finlandica和Pichiajadinii，假絲酵母屬的產朊假絲酵母，和Ogataea屬的Ogataea wickerhamii具有較強的產生本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的能力。可以得到本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株的例子有(i)Pichia finlandicaDSM 70280，DSM 1380(ii)Pichia jadiniiDSM 2361，DSM 70167，IFO 0987(iii)產朊假絲酵母IFO 0988，IFO 0626(iv)Ogataea wickerhamiiIFO 1706對於Pichia finlandica產生的仲醇脫氫酶，有報導採用無細胞提取物表現出2-丙醇脫氫酶活性(Biochimica et Biophysica Acta，716，298-307，1982)。但是，按照本發明人的附加實驗，在此菌株的無細胞提取液中包含多重2-丙醇脫氫酶。另一方面，本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶是次要成分，2-丙醇脫氫酶活性很微弱。因此，本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶與此文獻所述的酶截然不同。
上述的微生物培養在用於培養真菌的普通培養基如，YM培養基中。以葡萄糖，甘油或甲醇之任一作為碳源，可從Pichia finlandica中得到所要的酶。特定地，以甲醇為碳源可從產朊假絲酵母中得到所要的酶。充分增生後，回收真菌菌體，在加入了還原劑如2-巰基乙醇等和蛋白酶抑制劑如苯甲基磺醯氟PMFS的緩衝液中破碎，製成無細胞提取液。通過根據酶蛋白的溶解性進行的分級分離和多種層析等可從無細胞提取液純化得到該酶。作為基於溶解性分級蛋白的方法，可以使用例如用有機溶劑如丙酮或二甲亞碸的沉降，用硫酸銨鹽析，或類似方法。另一方面已知的層析方法有陽離子交換層析，陰離子交換層析，凝膠過濾，疏水層析，以及使用螯合劑，色素，抗體等的多種親和層析。更特定地，通過使用苯基-Toyopearl的疏水層析，使用DEAE-Sepharose的陰離子交換層析，使用丁基-Toyopearl的疏水層析，使用Blue-Sepharose親和層析，Superdex 200的凝膠過濾等等，可以將酶純化為電泳中的幾乎一條帶。
本發明涉及編碼(R)-2-辛醇脫氫酶及同系物的多核苷酸。在本發明中，多核苷酸可以是自然存在的多核苷酸如DNA或RNA，也可以是包含人工合成的核苷酸衍生物的多核苷酸。
編碼本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的多核苷酸包含，例如SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼包含胺基酸序列SEQ ID NO2的多肽。包含此胺基酸序列的多肽構成本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的優選實例。
本發明的多核苷酸包括編碼具有上述(1)和(2)的物化性質，及含有SEQID NO2的胺基酸序列的多肽，所述序列有一個或多個胺基酸取代，缺失，插入，和或添加。本領域技術人員可以通過定點誘變正確地將取代，缺失，插入，和或添加突變引入含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA中(核酸研究(Nucleic Acid Res.)10頁，6487(1982)，酶學方法(Methods inEnzymol.)100，448頁(1983)；分子克隆(Molecular cloning)第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)，PCR實用方法(PCRA Practical Approach)，IRL出版社，200頁(1991))。
另外，本發明的多核苷酸包括與含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，以及編碼有著上述物化性質(1)和(2)的蛋白的DNA在嚴謹條件下雜交的多核苷酸。「在嚴謹條件下雜交的多核苷酸」指與核苷酸探針採用，例如，ECL直接核酸標記和檢測系統(Amersham-Pharmacia Biotech)按所附說明書的建議條件(用含有0.5×SSC的初級衝洗緩衝液在42℃下洗滌)雜交的多核苷酸，該探針有一個或多個含至少20個連續核苷酸的片段，所述片段優選至少30個連續核苷酸，例如40，60，或100個連續的核苷酸，它從核苷酸序列SEQ ID NO1中任意挑選。
與含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA在嚴謹條件下雜交的多核苷酸包括含有與SEQ ID NO1相似的核苷酸序列的那些。很可能這樣的多核苷酸編碼與含有SEQ ID NO2胺基酸序列的蛋白功能等價的蛋白。
此外，本發明的多核苷酸包括編碼下述蛋白的多核苷酸，該蛋白與SEQID NO2胺基酸序列相比有至少70％，優選至少80％或90％，更優選95％或更高同一性。可以容易地進行蛋白的同源性檢索，例如，在國際網際網路上，例如在涉及蛋白的胺基酸序列的資料庫，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的資料庫，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基於DNA序列的推導的胺基酸序列的資料庫；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等進行檢索。作為使用BLAST程序和SEQ ID NO2的胺基酸序列在DDBJ中同源性檢索的結果，在已知蛋白中表現出最高同源性的蛋白是枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶，其表現出43％的同一性和61％的陽性。本發明中不少於70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得陽性樣本的同源性值。
本發明中，編碼具有上述物化性質(1)和(2)的蛋白的多核苷酸被特別稱為含SEQ ID NO1核苷酸序列的多核苷酸的「同系物」。同系物可根據SEQID NO1的核苷酸序列從其它微生物經PCR克隆和雜交分離得到，還可以引入突變而得到。例如，SEQ ID NO1的核苷酸序列是分離自Pichiafinlandica的基因的序列。此外，編碼具有上述物化性質(1)和(2)的蛋白的多核苷酸以及那些可從例如，Pichia jadinii，假絲酵母屬的產朊假絲酵母，Ogataea屬的Ogataea wickerhamii，等等微生物得到的那些都包括在本發明中。
本發明的多核苷酸可用於本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的基因工程生產。備選地，具有可用於生產酮和醇的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的微生物能利用本發明的多核苷酸通過基因工程的方法生產。
本發明包含有著SEQ ID NO2的胺基酸序列並具有上述物化性質(1)和(2)的(R)-2-辛醇脫氫酶，以及其同系物。包含SEQ ID NO2的胺基酸序列的蛋白組成本發明優選實施方案的(R)-2-辛醇脫氫酶。
本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶同系物包含SEQ ID NO2的胺基酸序列，且其中有一個或多個胺基酸的缺失，取代，插入，和/或添加。本領域的技術人員可以通過定點誘變(核酸研究，10，6487(1982)，酶學方法，100，448(1983)；分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)，PCR實用方法，IRL出版社，200(1991))或類似的方法正確地將取代，缺失，插入，和/或添加突變引入至包含SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，從而容易地得到編碼所述(R)-2-辛醇脫氫酶同系物的DNA。可通過將編碼(R)-2-辛醇脫氫酶同系物的DNA引入宿主並在宿主中表達，而得到具有SEQ ID NO2的(R)-2-辛醇脫氫酶的同系物。
此外，本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的同系物包括表現出與SEQ ID NO2胺基酸序列至少70％，優選至少80％或90％，更優選95％或更多同一性的蛋白。可以容易地進行蛋白的同源性檢索，例如，在國際網際網路，例如在涉及蛋白的胺基酸序列的資料庫，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的資料庫，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基於DNA序列的推導的胺基酸序列的資料庫；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等檢索。作為使用BLAST程序和SEQ ID NO2的胺基酸序列在DDBJ中同源性檢索的結果，在已知蛋白中表現出最高同源性的蛋白是枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶，其表現出43％的同一性和61％的陽性。本發明中不少於70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得陽性樣本的同源性值。
編碼本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA可通過，例如下列步驟進行分離。
在純化本發明的酶後，通過分析N-端胺基酸序列，再利用酶如賴氨醯內肽酶，V8蛋白酶等等切割蛋白，通過反相液體層析等方法純化肽段，用蛋白測序儀分析胺基酸序列來確定多重胺基酸序列。
如果清楚了部分胺基酸序列，可以推出編碼這些胺基酸序列的核苷酸序列。本發明的DNA片段可基於推出的核苷酸序列或SEQ ID NO1的核苷酸序列設計PCR引物，採用此酶生產菌株的染色體DNA或cDNA文庫作為模板通過PCR得到。
此外，用所得DNA片段作為探針，通過菌落或噬菌斑雜交可得到本發明DNA，其中採用的文庫是通過將此酶生產菌株的染色體DNA的限制酶切產物引入噬菌體或質粒，然後用該噬菌體或質粒轉化大腸桿菌得到的或採用cDNA文庫。
另外，得到本發明DNA的步驟如下，分析PCR得到的DNA片段的核苷酸序列，基於已得到的序列設計PCR引物向外擴展該DNA，採用適合的限制酶消化目的酶生產菌株的染色體DNA，採用自我連接的環狀DNA作模板進行反向PCR(遺傳學120，621-623(1988))；或備選地通過RACE方法(cDNA末端的快速擴增；「PCR實驗手冊」pp.25-33，HBJ出版社)。
本發明的DNA不僅包括由上述方法克隆的基因組DNA和cDNA，還包括化學合成的DNA。
將如此分離得到的編碼本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA插入到已知的表達載體以提供(R)-2-辛醇脫氫酶的表達載體。此外，通過培養用此表達載體轉化的細胞，可從已轉化的細胞中得到本發明的(R)2-辛醇脫氫酶。
在本發明中，對為表達(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)而進行轉化的微生物沒有限制，只要此生物體能用含有編碼(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)活性多肽的DNA的載體轉化，並能表達(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)活性。可能的微生物是具有宿主-載體系統的那些，例如包括細菌如埃希氏菌屬，芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，沙雷氏菌屬，短桿菌屬，棒桿菌屬，鏈球菌屬，乳桿菌屬；放線菌如紅球菌屬和鏈黴菌屬；酵母如糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，裂殖糖酵母屬，接合糖酵母屬，Yarrowia屬，絲孢酵母屬，紅冬孢屬，畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬；及真菌如鏈孢黴屬，麴黴屬，頭孢屬，木黴屬；等。
可運用在分子生物學，生物工程，和基因工程領域的一般方法(例如，參見Sambrook等，「分子克隆」，冷泉港實驗室)進行轉化體製備和構建適於宿主的重組載體。為在微生物中表達編碼本發明(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)的基因，必須將DNA引入該微生物中穩定的質粒載體或噬菌體載體上，並使遺傳信息得以轉錄和翻譯。為此，將啟動子(一種調節轉錄和翻譯的單位)置於DNA 5』端的上遊，並且優選將一個終止子放置於該DNA 3』端的下遊。在被用作宿主的微生物內，所述啟動子和終止子應該是有效的。可用於上述各種微生物的載體，啟動子，和終止子都詳述於「微生物學基本課程(8)基因工程」，Kyoritsu Shuppan，酵母專輯，見「高等生物化學工程(Adv.Biochem.Eng.)43，75-102(1990)」和「酵母8，423-488(1992)」。
例如，對於埃希氏菌屬，特別是對於大腸桿菌，有效質粒包括pBR系列和pUC系列的質粒；有效啟動子包括得自lac(得自β-半乳糖苷酶基因)，trp(得自色氨酸操縱子)，tac和trc(為lac和trp的嵌合體)的啟動子，λ噬菌體的PL和PR，等。有效終止子得自trpA，噬菌體，rrnB核糖體RNA，等。
對於芽孢桿菌，有效載體是pUB110系列和pC194系列的質粒；所述載體可以整合入宿主染色體。有效啟動子和終止子得自apr(鹼性蛋白酶)，npr(中性蛋白酶)，amy(α-澱粉酶)，等。
對於假單孢菌，有為惡臭假單孢菌(P.putida)和蔥頭假單孢菌(P.cepacia)開發的宿主載體系統。基於與甲苯化合物分解有關的TOL質粒的寬宿主範圍載體，pKT240，(包含RSF1010衍生的自我複製所需的基因)也有效；得自脂酶基因的啟動子和終止子(JP-A No.Hei 5-284973)也有效。
對於短桿菌屬，特別是對於乳發酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)，有效質粒載體包括pAJ43(基因39，281(1985))。用於大腸桿菌的啟動子和終止子可以不經任何修飾而用於短桿菌屬。
對於棒桿菌屬，特別是對於穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicam)，可使用質粒載體例如pCS11(JP-A Sho 57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Gennet.196，175(1984))。
對於鏈球菌屬，可以使用質粒載體如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985)和pGK1(應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)，50，94(1985))。
對於乳桿菌屬，可利用為鏈球菌屬開發的質粒載體pAMβ1(細菌學雜誌(J.Bacteriol.)137，614(1979))；也可利用用於大腸桿菌的啟動子。
對於紅球菌屬，可使用分離自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)的質粒載體(普通微生物學雜誌(J.Gen.Microbiol.)138，1003(1992))。
對於鏈黴菌屬，可按照在Hopwood等的「鏈黴菌的遺傳操作實驗室手冊(Genetic Manipulation of StreptomycesA Laboratory Manual)」(冷泉港實驗室(1985))中所述方法構建質粒。特別是對於青紫鏈黴菌(Streptomyceslividans)，可利用pIJ486(分子普通遺傳學203，468-478，1986)，pKC1064(基因，103，97-99(1991))，和pUWL-KS(基因165，149-150(1995))同樣的質粒也可用於維吉尼亞鏈黴菌(Streptomyces virginiae)。
對於糖酵母屬，特別是對於釀酒酵母，YRp系列，YEp系列，YCp系列，YIp系列的質粒均有效；整合型載體(參見EP 537456，等)，通過與多拷貝核糖體基因同源重組而整合進入染色體，允許引入多個拷貝的目的基因且整合的基因可以穩定保持在微生物體內；因此，這些類型的載體也高度有效。有效啟動子和終止子來自編碼ADH(乙醇脫氫酶)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，PHO(酸性磷酸酶)，GAL(β-半乳糖苷酶)，PGK(磷酸甘油酸激酶)，ENO(烯醇化酶)，等的基因。
對於克魯維氏酵母屬，特別是對於乳克魯維氏酵母，可用的質粒如得自釀酒酵母的2-μm質粒，pKD1系列質粒(細菌學雜誌145，382-390(1981))，得自pGK11且參與放毒活性的質粒，KARS(克魯維氏酵母自主複製序列)質粒，和可以通過與核糖體DNA進行同源重組被整合進入染色體的質粒(參見EP 537456，等)。可使用得自ADH，PGK等的啟動子和終止子。
對於裂殖糖酵母屬，可使用包含得自粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的ARS(自主複製序列)以及得自釀酒酵母的營養缺陷型互補選擇標記(分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)6，80(1986))的質粒載體。可使用如得自粟酒裂殖糖酵母的ADH啟動子(EMBO J.6，729(1987))。特定地，pAUR224可向TaKaRa Shuzo公司購買。
對於接合糖酵母屬，可用的質粒如得自Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(核酸研究13，4267(1985))；可使用如得自釀酒酵母的PHO5啟動子和得自Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子(農業和生物化學(Agri.Biol.Chem.)54，2521(1990))。
對於畢赤氏酵母屬，已開發出源自畢赤氏酵母的自主複製序列(PARS1，PARS2)的宿主-載體系統(分子細胞生物學5，3376(1985))，也可以運用高效的啟動子如甲醇誘導型AOX啟動子，其可用於高細胞密度培養(核酸研究，15，3859(1987))。已開發出用於Pichia angusta(以前稱為多形漢遜氏酵母)的宿主載體系統。儘管得自Pichia angusta的自主複製序列(HARS1，HARS2)可用作載體，但它們是相當不穩定的。因此，染色體的多拷貝整合對於它們是有效的(酵母7，431-443(1991))。另外，可使用由甲醇等誘導的AOX(乙醇氧化酶)和FDH(甲酸脫氫酶)啟動子。
對於假絲酵母屬，已開發了用於麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)，白色假絲酵母(C.albicans)，熱帶假絲酵母(C.tropicalis)，產朊假絲酵母，等的宿主-載體系統。源自麥芽糖假絲酵母的自主複製序列(農業和生物化學(Agri.Biol.Chem.)51，51，(1987))已被克隆，並已針對麥芽糖假絲酵母開發了利用此序列的載體。此外，已開發用於產朊假絲酵母的帶有高效啟動子單元的染色體整合載體(JP-A Hei 08-173170)。
對於麴黴屬，其中的黑麴黴和米麴黴已得到深入研究，發現了有效的質粒載體和染色體整合載體以及得自胞外蛋白酶基因和澱粉酶基因的啟動子(生物技術趨勢(Trends in Biotechnology)7，283-287(1989))。
對於木黴屬，已開發出針對Tricholderma reesei的宿主載體系統，還有諸如得自胞外纖維素酶基因的啟動子(生物技術7，596-603(1989))。
已開發出用於對除微生物以外的植物和動物的多種宿主-載體系統；特別是，那些對昆蟲，如蠶的系統(自然315，592-594(1985))，以及對植物如油菜籽，玉米，土豆等的系統。優選運用這些系統表達大量外源蛋白。
具有生產本發明中所用4-滷乙醯乙酸酯還原酶能力的微生物包括能生產NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的屬於畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬，Ogataea屬的所有菌株，突變體，變異體和轉化體，所述轉化體通過基因工程構建並獲得生產本發明酶的能力。
另外，由上述方法得到的表達本發明(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株可用於生產本發明的酶以及下述的仲醇和酮。
這樣，本發明涉及上述的通過用(R)-2-辛醇脫氫酶還原酮生成仲醇的方法。本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶可以使用NADH作為輔酶，它比NADPH更便宜更穩定，因此更有利於工業應用。所要的氧化反應可如下進行，將本發明的酶，含有酶的培養液，或其加工產物與反應液接觸。
酶與反應液接觸的方式並不受限於這些實施例。在反應液中，底物和NADH(酶反應所必需的輔酶)溶解在合適的溶劑中，得到酶活性表達所需的環境條件。包括本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的微生物加工產物，特別包括那些細胞膜通透性可以通過有機溶劑如去汙劑，甲苯等處理而改變的微生物；通過用玻璃珠或通過酶處理破碎真菌菌體得到的無細胞提取物；其部分純化的提取物等。
在本發明方法中可用於生產仲醇的酮，可以有苯乙酮，2-辛酮，4-滷乙醯乙酸酯衍生物，可由通式1表示的丙酮氧苯衍生物通式1 (其中x1和x2表示滷原子)，溴甲基環丙酮，2-乙醯丁內酯，5-氯-2-戊酮。本發明的4-滷乙醯乙酸酯衍生物是用任意滷原子取代乙醯乙酸酯的位置4得到的化合物。組成上述乙醯乙酸酯的醇可以是任意的醇。4-滷乙醯乙酸酯衍生物的滷素可以是溴，氯，和碘，特別優選氯。酯可以是含有直鏈，支鏈，和芳香取代基的醇的酯，如甲酯，乙酯，丙酯，異丙酯，丁酯，辛酯，苯酯，等，最優選甲酯。4-滷乙醯乙酸衍生物包括下述衍生物，其含有在位置2帶有直鏈或支鏈的烷基，或含有滷素，如氯，溴，碘等。丙酮氧苯衍生物的滷素包括溴，氯，碘，和氟，特別優選氟。特別是，可用2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯，它生成的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯是合成抗細菌藥物氧氟沙星的中間體。
本發明還涉及用上述(R)-2-辛醇脫氫酶氧化仲醇生成酮的方法。酮是反應產物，可通過將本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶，生產該酶的微生物，或其加工產物與仲醇反應得到。在本發明中可以作為底物使用的仲醇有這樣的烷基醇，其帶有滷素或芳香取代基等，如2-丙醇，2-丁醇，2-辛醇，1-苯乙醇等。
此外，以外消旋醇作底物，利用(R)-2-辛醇脫氫酶的不對稱氧化能力，可用本發明的酶，生產此酶的微生物，或其加工產物生產光學活性醇。也就是說，通過用本發明的酶優選氧化任一光學異構體以及通過得到殘餘的光活性醇可以生產具有光學活性的醇。更特定地，本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶在NAD+的參與下與外消旋物反應，所述外消旋物中混合了2-辛醇或1-苯乙醇的(S)和(R)型。本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶(其在立體選擇性上極佳)特異性作用於(R)型，將其氧化產生酮。但是，因為它不作用於該醇的(S)型，(S)型的比例逐漸變大。如果對這樣積累的(S)型進行分離，可最終從外消旋物中回收該醇的(S)型。以此方法，可從(RS)-2-辛醇得到(S)-2-辛醇，從(RS)-苯乙醇得到(S)-苯乙醇。
在此所用術語「光學活性醇」指所含某一光學異構體比其它光學異構體更多的醇，或所含對映異構體過量，優選過量50％或更多，更優選過量90％或更多，進一步更優選過量95％或更多的醇。而且，本發明的「光學異構體」一般可以稱為「光學活性物質」或「對映異構體」。
本發明上述生產酮的方法可與NADH的再生系統組合。NADH從NAD+產生，其伴隨著由(R)-2-辛醇脫氫酶催化的氧化反應。NAD+從NADH的再生可使用微生物中所含能從NADH再生NAD+的酶(系統)來實現，或通過在反應系統中加入能從NADH生成NAD+的微生物或酶，例如穀氨酸脫氫酶，NADH氧化酶，NADH脫氫酶，等類似的酶來實現。此外，利用本發明酶的底物特異性，可將還原反應的底物，如2-辛酮，苯乙酮等，加入到反應體系中，通過酶自身的作用共同促使NAD+從NADH的再生。
同樣，生產醇的方法可與NAD+的再生系統組合。NAD+從NADH產生並伴隨著還原反應。微生物的NAD+還原能力(如糖酵解)可用於從NAD+再生NADH。在反應體系中加入葡萄糖或乙醇可以加強此能力。備選地，能從NAD+產生NADH的微生物，或其處理產物或酶可以加入到反應體系中。NADH的再生可用含有甲酸脫氫酶，葡萄糖脫氫酶，麥芽糖脫氫酶，甘油脫氫酶，乙醇脫氫酶，或類似酶的微生物，或其處理產物或其純化的酶來進行。例如，在上述葡萄糖脫氫酶的情況下，可利用葡萄糖向δ-葡萄糖酸內酯的轉化進行NADH的再生。利用本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的性質，NADH可通過將氧化反應的底物，如2-辛醇加入到反應體系而利用酶自身進行再生。
NADH再生反應必需的反應物可以以它們通常的形式或它們的固定化產物加入到生成本發明醇的反應體系中。反應物也可以通過一種能進行NADH交換的膜與反應體系接觸。
當用含有本發明DNA的重組載體所轉化的微生物以活性狀態生產上述醇時，用於NADH再生的附加反應系統可以省略。即，通過使用具有高NADH再生活性的微生物，可利用轉化體進行有效的還原反應，而不添加用於NADH再生的酶。而且，通過在宿主中引入可用於NADH再生的葡萄糖脫氫酶，甲酸脫氫酶，乙醇脫氫酶，胺基酸脫氫酶，有機酸脫氫酶(例如，蘋果酸脫氫酶，等)，等基因，以及同時引入編碼本發明NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA，可以進行NADH再生酶以及NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的更有效表達和還原反應。將這兩個或多個基因引入宿主的方法有，用多個重組載體轉化宿主的方法，將兩個基因都引入一個單獨載體的方法，和將兩個基因引入染色體的方法，其中所述多個載體可通過為避免不相容而分別將基因引入具有不同複製起點的多個載體而獲得。
本發明中可用於NADH再生的葡萄糖脫氫酶的例子包括得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶。另外，甲酸脫氫酶的例子包括得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶。編碼這些酶的基因已經克隆。備選地，這樣的基因可通過基於已知的核苷酸序列的PCR或雜交篩選從微生物中得到。
當將多個基因引入一個載體時，每個基因都連接到涉及表達調節的區域，例如啟動子或終止子。多個基因也可以以包括多個順反子的操縱子象乳糖操縱子的形式表達。
使用本發明酶的氧化或還原反應可在水中，或不溶於水的有機溶劑如乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲苯，氯仿，正己烷，等，或在所述有機溶劑與水介質如乙醇，丙酮等的兩相系統中進行。
使用固定化酶，膜反應器等可以完成本發明的反應。
本發明的用(R)-2-辛醇脫氫酶進行的酶反應可在下列條件下進行●反應溫度4-60℃，優選10-37℃●pH3-11，優選5-10，更優選6.0-9.0●底物濃度0.01-90％，優選0.1-30％必要的話，可在反應體系中加入0.001-100mM或優選0.01-10mM輔酶NAD+或NADH。儘管底物可以在反應開始時馬上加入，優選連續或不連續加入，這樣可以使反應混合液中底物濃度不至於太高。
要加入到再生NADH反應體系的化合物，包括，例如，使用葡萄糖脫氫酶的情況下是葡萄糖，使用甲酸脫氫酶的情況下是甲酸，使用乙醇脫氫酶的情況下是乙醇或2-丙醇，加入時對底物酮的摩爾比是0.1∶20，優選比底物酮過量0.5-5倍。加入的再生NADH的酶，如葡萄糖脫氫酶，甲酸脫氫酶，或乙醇脫氫酶可以是0.1-100倍，優選0.5-20倍於本發明NAD+-依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的酶活性。
本發明中，通過還原酮產生的醇和不對稱氧化外消旋醇產生的醇可通過適當組合對微生物細胞和蛋白的離心，經過膜處理等的分離，溶劑萃取，蒸餾等方法而純化。
例如，對於4-滷-3-羥基丁酸酯，在用離心從包含微生物細胞體的反應混合物中除去微生物細胞後，可在上清液中加入溶劑如乙酸乙酯，甲苯等，將4-滷-3-羥基丁酸酯萃取到溶劑層。在相分離後蒸餾可以純化得到高濃度的4-滷-3-羥基丁酸酯。
用於所述各種合成反應的本發明的酶並不限於純化的酶，還包括部分純化的酶，含此酶的微生物細胞，及其加工產物。在此所用術語「已加工的產物」總起來說是指微生物細胞，純化的酶，部分純化的酶，或由各種方法產生(fix)的類似物。構成本發明酶反應的酶可以以固定化的形式使用。酶固定化的方法並不特別受限制。例如，使用戊二醛，丙烯醯胺，κ-角叉菜聚糖，藻酸鈣，離子交換樹脂，硅藻土及其它來固定酶的方法是已知的。本發明的反應可利用膜反應器等進行。組成膜反應器的膜例如超濾膜，疏水膜，陽離子膜，納米濾膜(J.Ferment.Bioeng.83，54-58(1997))等。
所有在此的引用都作為參考文獻引入。
附圖簡述

圖1表示pH變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響。縱軸表示以(R)-2-辛醇脫氫酶最大活性為100時的相對活性。
圖2表示pH變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙醯乙酸酯還原活性的影響。縱軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖3表示溫度變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響。縱軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖4表示溫度變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙醯乙酸酯還原活性的影響。縱軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖5表示純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的殘餘活性。縱軸表示殘餘活性，其以未經處理的酶活性為100。
圖6表示質粒(pSE-PFO1)的構建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因已引入其中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO1中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶。
圖7表示質粒(pSE-PFO2)的構建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因已引入其中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO2中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶。
圖8表示質粒(pSE-BSG3)的構建，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因已引入其中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。
圖9表示質粒(pSG-PFO1)的構建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因已引入該質粒中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖10表示質粒(pSG-PFO2)的構建，其中引入了得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖11表示質粒(pSE-MCF15)的構建，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因已引入其中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因。
圖12表示質粒(pSF-PFO2)的構建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因已引入其中。在此質粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現出氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶基因；ori，質粒的複製起點；rop，ROP-蛋白基因；1aqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖13表示pH變化對純化自產朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響。縱軸表示相對活性，其中以最大活性為100。
圖14表示pH變化對純化自產朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙醯乙酸酯還原活性的影響。縱軸表示相對活性，其中以最大活性為100。
實施本發明的最佳模式本發明參照下面的實施例進行詳細說明，但並不限於此。實施例1(R)-2-辛醇脫氫酶的篩選酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶通過電泳後的活性染色方法來篩選，底物為(R)-或(S)-2-辛醇底物，反應混合物包括NAD+，吩嗪硫酸二甲酯(PMS)，氮藍四唑(NBT)。反應混合物的組成如下5mM(R)-或(S)-2-辛醇1.3mM NAD+0.13mM PMS0.48m MNBT結果，當底物是(S)-2-辛醇時沒有被染色，但當底物是(R)-2-辛醇時優先被染色的酶在以下酵母菌株中發現。這些有著(R)-2-辛醇脫氫酶活性的酶也具有通過還原4-氯乙醯乙酸乙酯生產(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的活性。
●Pichia finlandicaDSM 70280，DSM 1380●Pichia jadiniiDSM 2361，DSM 70167，IFO 0987●產朊假絲酵母IFO 0988，IFO 0626●Ogataea wickerhamiiIFO 1706實施例2生產(R)-2-辛醇脫氫酶的培養條件實施例1的生產(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株由2％葡萄糖改變為2％甘油或1％甲醇的碳源中培養。結果是，Pichia finlandica可以在所有培養液中誘導此酶。當甲醇作碳源時，產朊假絲酵母可以強烈誘導該酶。實施例3純化得自於Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶Pichia finlandica DSM 70280菌株培養在4.8L培養基A中，離心製備微生物細胞。得到的微生物細胞懸浮在100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA2·Na)，0.02％2-巰基乙醇，和2mM苯甲烷磺醯氟(PMSF)中，用玻璃珠攪拌器(Biospec)勻漿。然後，離心除去微生物細胞碎片，得到無細胞提取液。加入硫酸魚精蛋白，離心除去核酸得到上清液。將硫酸銨加入上清液中，在40-75％飽和度得到沉澱的級分。將含有30％飽和度的硫酸銨的標準緩衝液加入到沉澱級分中，得到含有40％(終濃度)飽和的硫酸銨的酶液。離心該酶液得到上清液。將該上清液上樣到以含有30％飽和的硫酸銨的標準緩衝液平衡的Phenyl-Toyopearl650M(5.0cm×25cm)，以30％-0％飽和的硫酸銨梯度洗脫。培養基A和標準緩衝液的組成如下培養基A10g/L酵母提取物20g/L蛋白腖20g/L葡萄糖pH6.0標準緩衝液10mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)0.01％2-巰基乙醇10％甘油(R)-2-辛醇脫氫酶活性可以在梯度洗脫的級分中觀測到。回收該峰值部分並通過超濾濃縮。
濃縮的酶液用標準緩衝液透析後，離心得到上清液。將上清液上樣到Blue-Sepharose CL-6B(5cm×10cm)，以標準緩衝液洗柱，用0-1.5M氯化鈉進行濃度梯度洗脫。當(R)-2-辛醇脫氫酶活性已洗脫在梯度洗脫部分中時，回收和濃縮該級分。用標準緩衝液(pH8.5)透析濃縮的酶液後，上樣到DEAE-Sepharose FF(1.6cm×10cm)，以標準緩衝液衝洗，用0-1M氯化鈉進行濃度梯度洗脫。當(R)-2-辛醇脫氫酶活性已洗脫至流過級分和梯度洗脫部分中時，回收和濃縮這些活性級分。對得自流過級分的酶液進行凝膠過濾，其使用Superdex 200(0.32cm×30cm，SMART系統，Amersham PharmaciaBiotech)，並使用含0.3M氯化鈉的標準緩衝液。將凝膠過濾的活性級分濃縮得到酶。
所純化的酶的最高比活性是約91U/mg-蛋白，其是氧化(R)-2-辛醇的活性。純化概述如下表
表1

實施例4(R)-2-辛醇脫氫酶分子量的測定SDS-PAGE結果顯示實施例3中得自Pichia finlandica的酶的分子量約為30,000Da。當使用Superdex200柱凝膠過濾時，分子量約為83,000Da。實施例5(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳pH使用磷酸緩衝液(KPB)，Tris-HCl緩衝液，甘氨酸緩衝液改變pH，觀察實施例3所得酶的(R)-2-辛醇脫氫酶活性。圖1顯示了相對活性，其以最大活性為100。實驗結果為，此酶的最佳pH範圍為8.0-11.0。
接著，使用磷酸緩衝液(KPB)，Tris-HCl緩衝液，甘氨酸緩衝液改變pH，觀察實施例3所得酶的4-氯乙醯乙酸乙酯還原酶活性。圖2顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結果為，此酶的最佳pH範圍為5.0-6.5。實施例6(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳溫度在標準反應條件下只改變溫度觀察得自實施例3的酶的(R)-2-辛醇氧化活性。圖3顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結果為，此酶的最佳溫度範圍為45-55℃。
在標準反應條件下只改變溫度觀察得自實施例3的酶的4-氯乙醯乙酸乙酯還原酶活性。圖4顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結果為，此酶的最佳溫度範圍為55-60℃。實施例7酶穩定的pH範圍實施例3的酶在Britten-Robinson緩衝液pH3-12，30℃下孵育30分鐘，測定殘餘活性。圖5顯示了殘餘活性，其以未處理的酶活性為100。pH8.0-9.0之間酶最穩定。實施例8(R)-2-辛醇脫氫酶的底物特異性使(R)-2-辛醇脫氫酶與各種醇反應，測定其氧化活性。表2表示了相對活性，其以(R)-2-辛醇在NAD+為輔酶時的氧化活性為100。
表2底物(氧化反應)(R)-2-辛醇100(S)-2-辛醇4.732-丙醇6.791-辛醇1.72乙基(R)-4-氯-3-羥基丁酸酯 0.172乙基(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯 2.24(R)-1-苯乙醇 255(S)-1-苯乙醇 1.81乙基(R)-3-羥基丁酸酯 41.1乙基(S)-3-羥基丁酸酯 1.03乙醇 0.668(R)-2-丁醇49.3(S)-2-丁醇7.31環己醇0.172(R)-1-苯基-1，3-丙二醇0.344(S)-1-苯基-1，3-丙二醇0.2582-己醇54.1(R)-1，3-丁二醇 1.29(S)-1，3-丁二醇 0.5162-辛醇77.81-苯氧基-2-丙醇 15.5結果是，對(S)-2-辛醇的相對活性為4.7％，對2-丙醇為6.8％，對(R)-1-苯乙醇為255％。
使實施例3的酶與各種酮反應，測定其還原活性。表3顯示了以NADH為輔酶的4-氯乙醯乙酸乙酯還原活性為100時的相對活性。
表3底物(還原反應)乙基4-氯乙醯乙酸酯 1002-辛酮 31.2苯乙酮 45.3乙醯乙酸乙酯1061-苯氧基-2-丙酮 54.2丙醛18.44-羥基-2-丁酮 0.691丙酮1.822-丁酮 7.99實驗結果為，對2-辛酮的相對活性為31.2％，對苯乙酮為45％。實施例9(R)-2-辛醇脫氫酶對試劑的行為(R)-2-辛醇脫氫酶用各種試劑30℃下處理30分鐘，測定(R)-2-辛醇脫氫酶活性。表4顯示了所得殘餘活性，其以未加試劑而在30℃處理了30分鐘的酶的活性為100。本發明(R)-2-辛醇脫氫酶受氯化汞和乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)的輕微抑制。用N-乙基馬來醯亞胺，o-菲咯啉，氯化鎂，氯化鈣，和氯化錳穩定該酶。
表4試劑 濃度 殘餘活性(mM) (％)對照- 100苯甲基磺醯氟1 111對氯苯甲酸汞0.05 118N-乙基馬來醯亞胺1 147EDTA·2Na 1 81O-菲咯啉1 162二硫蘇糖醇 1 123NH2OH·HCl 0.01 99五羥黃酮0.1 99KCl 1 106MgCl2·6H2O 1 185CaCl2·2H2O 1 174MnCl2·4H2O 1 185FeCl21 93CoCl2·6H2O 1 99NiCl2·6H2O 1 103ZnCl21 96BaCl2·2H2O 1 102CuSO41 100HgCl20.01 62實施例10試劑對(R)-2-辛醇脫氫酶的活化作用測定在各種試劑中(R)-2-辛醇脫氫酶的活化作用。表5顯示了得到的活性，其以沒有試劑時的活性為100。本發明(R)-2-辛醇脫氫酶被鎂，錳和鋅離子活化。陰離子中，硫酸離子可活化此酶活性。
表5試劑 濃度 相對活性(mM) (％)對照 - 100MgCl2·6H2O 1 122MgSO41 125MnCl2·4H2O 1 114MnSO4·4-5H2O1 121ZnCl21 105ZnSO4·7H2O 1 110實施例11(R)-2-辛醇脫氫酶的部分胺基酸序列採用實施例3的，但N端胺基酸已被封閉的酶通過蛋白測序儀分析N端胺基酸序列。然後，SDS-PAGE分離所純化的酶，切下含有(R)-2-辛醇脫氫酶的凝膠。將含有胰蛋白酶的Tris緩衝液加入該凝膠中，35℃下處理20小時。然後，用反相HPLC處理樣品溶液，分離肽段。用蛋白測序儀分析肽段。結果得到三種胺基酸序列。肽A，B，C的胺基酸序列分別表示在SEQID NO3，4，5中。
SEQ ID NO3肽AVal-Ala-Val-Val-Thr-Gly-Ala-Leu-Ser-GlySEQ ID NO4肽BLeu-Ile-Ser-Glu-Thr-Leu-Ala-Thr-Phe-Gly-Gly-LeuSEQ ID NO5肽CLeu-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Val-Ala-Asp-Ala實施例12從Pichia finlandica製備染色體DNA通過Cryer方法(細胞生物學方法(Meth.Cell Biol.)12，39-44(1975))，從Pfchia finlandica純化染色體DNA。實施例13對(R)-2-辛醇脫氫酶基因的核心區域的PCR克隆合成對應於肽A的有義引物和對應於肽C的反義引物。將BamHI限制酶切位點(GTCGGATCC)加入到每一引物的5』端。每一引物的核苷酸序列表示在SEQ ID NO6(引物A)和SEQ ID NO7(引物C)中。
SEQ ID NO6引物A
GTCGGATCCGTBGCHGTBGTBACHGGHGCSEQ ID NO7引物CGTCGGATCCGCRTCNGCNACYTCYTCNGG用50μL反應液進行PCR，其中含有引物A和C各50pmol，10nmoldNTP，100ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用於ExTaq的緩衝液(Takara)，和ExTaq 2U(Takara)。PCR條件為94℃變性30秒，37℃下退火30秒，70℃下延伸1分鐘的30個循環。結果為特異性PCR產物得到了擴增。實施例14對(R)-2-辛醇脫氫酶基因核心區域的PCR片段的亞克隆PCR擴增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，經乙醇沉澱回收，BamHI限制酶消化。2％瓊脂糖凝膠電泳後，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區帶，回收。
使用Takara連接試劑盒第2版將得到的每一DNA片段與BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)連接。然後，大腸桿菌(E.coli)菌株JM109用其轉化。轉化菌株在平板上孵育，該平板上含有50μg/mL氨苄青黴素，50μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷和20μg/mL異丙基硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)和LB培養基(1％細菌用蛋白腖，0.5％細菌用酵母提取物，1％氯化鈉)。一些白色的菌落在含氨苄青黴素的液體LB培養基中培養，採用Flex-Prep(Pharmacia)純化含有DNA片段的質粒。
利用此質粒，分析插入的DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(Applied Biosystems)進行PCR，採用PRISM 310基因分析試劑盒(Applied Biosystems)分析DNA的核苷酸序列。測定的核心區核苷酸序列表示在SEQ ID NO8PF-CORE中。實施例15(R)-2-辛醇脫氫酶基因核心區附近的DNA的亞克隆用BstYI，NspI，PstI限制性酶消化來自Pichia finlandica的染色體DNA。每一片段用T4連接酶16℃過夜使之自我連接而環化。將BamHI酶切位點(GTCGGATCC)加入到引物PfOD-c5u(SEQ ID NO9)和PfOD-c3d(SEQ IDNO10)的5』末端。PCR在含上述引物各50pmol，10nmol dNTP，125ng自連接的DNA，用於ExTaq的緩衝液(Takara)，ExTaq 1U(Takara)的反應液中進行。PCR條件為94℃變性30秒，55℃下退火30秒，70℃下延伸7分鐘的30個循環，採用的是GeneAmp PCR系統2400(Perkin Elmer)。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測到約為3500bp，2000bp，4000bp的DNA片段，它們分別對應於模板DNA用BstYI，NspI，和PstI酶消化得到的DNA片段。
SEQ ID9PfOD-c5uGTCGGATCCTCAGAGATCGTTACTTTGGCSEQ ID10PfOD-c3dGTCGGATCCCGACTCCTTTGATAGATGAGPCR擴增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，經乙醇沉澱回收，並用BamHI限制酶消化。瓊脂糖凝膠電泳後，用Sephaglas(Pharmacia)切下有著適當寬度的區帶，並回收。
使用Takara連接試劑盒第2版，將得到的每一DNA片段連接到用BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)。然後用其轉化大腸桿菌菌株JM109。轉化菌株在含有LB培養基(1％細菌用蛋白腖，0.5％細菌用酵母提取物，1％氯化鈉)的平板上孵育，培養基中有50μg/ml氨苄青黴素，50μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷，和20μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。取一些白色菌落培養在含氨苄青黴素的液體培養基中，用Flex-Prep(Parmacia)純化含DNA片段的質粒。得到的質粒是pPF-Bst，pPF-Nsp，和pPF-Pst，其分別對應於用於製備的限制酶BstYI，NspI，和PstI。
從所純化質粒分析所插入DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(Applied Biosystems)進行PCR。DNA的核苷酸序列用PRISM310基因分析試劑盒(Applied Biosystems)分析。將分析過的，pPF-BST，pPF-Nsp，和pPF-Pst中所插入DNA的核苷酸序列分到核心區的5』上遊區域和3』下遊區域並表示為PF-5U(SEQ ID NO11)和PF-3D(SEQ ID NO12)。
合成PF-5U，PF-3D，和PF-CORE的核苷酸序列，通過開放讀碼框(ORF)檢索確定(R)-2-辛醇脫氫酶的序列。所確定的核苷酸序列表示在SEQ IDNO1中，核苷酸序列編碼的胺基酸序列表示為SEQ ID NO2。這些合成和ORF檢索用軟體Genetyx-ATSQ/WIN和Genetyx-WIN(SoftwareDeveloping Company)進行。實施例16(R)-2-辛醇脫氫酶的克隆-1基於(R)-2-辛醇脫氫酶結構基因的核苷酸序列合成用於構建表達載體的引物PFO-ATG1(SEQ ID No13)和PFO-TAA1(SEQ ID NO14)。用含上述引物各50pmol，10nmoldNTP，50ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用於Pfu-DNA聚合酶的緩衝液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)的50μL反應液進行PCR。PCR條件為95℃變性30秒，55℃下退火1分鐘，70℃下延伸1.5分鐘的30個循環，採用的是GeneAmpPCR系統2400(PerkinElmer)。
SEQ ID NO13 PFO-ATG1TCGACATGTCTTATAATTTCCATAACAAGSEQ ID NO14 PFO-TAA1GCAGAATTCCTCTAGATTACTGGGCTGTGTACCCPCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳，可以檢測到特異性區帶。
得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，經乙醇沉澱回收。用AflIII和EcoRI限制酶消化所述DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳後，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區帶，回收。
將得到的DNA片段用Takara連接試劑盒連接到用NcoI和EcoRI限制酶消化的質粒pSE420D(Invitrogen)，但帶有修飾的多克隆位點的變體(JP-A2000-189170)上。然後，用其轉化大腸桿菌JM109菌株。
將轉化菌株在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板上培養。從一些菌落中純化質粒，分析插入片段的核苷酸序列。將含有本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的質粒命名為pSE-PF01。圖6表示了構建該質粒的過程。實施例17(R)-2-辛醇脫氫酶的克隆-2用於構建表達載體的引物PFO-ATG2(SEQ ID NO15)和PFO-TAA2(SEQ ID NO16)根據(R)-2-辛醇脫氫酶結構基因的核苷酸序列合成。用50μL反應液進行PCR，其中包括上述引物各10pmol，10nmol dNTP，50ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用於Pfu-DNA聚合酶的緩衝液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)。PCR條件為95℃變性30秒，50℃下退火60秒，70℃下延伸1.5分鐘的30個循環，採用的是GeneAmp PCR系統2400(PerkinElmer)。
SEQ ID NO15 PFO-ATG2CACGAATTCTAAAATGTCTTATAATTTCCATAACAAGSEQ ID NO16 PFO-TAA2AGTACTAGTATTACTGGGCTGTGTACCC
PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳，可以檢測到特異性區帶。
得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，經乙醇沉澱回收，然後用EcoRI和SpeI限制酶消化。瓊脂糖凝膠電泳後，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區帶。
將得到的DNA片段藉助Takara連接試劑盒連接到SpeI和EcoRI限制酶消化的質粒pSE420D上。然後，用其轉化大腸桿菌JM109菌株。
將轉化菌株在含有50μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板上培養。從一些菌落純化質粒，分析插入片段的核苷酸序列。有著本發明的(R)-2-辛醇脫氫酶的質粒命名為pSE-PF02。圖7表示了構建該質粒的過程。實施例18由大腸桿菌生產重組(R)-2-辛醇脫氫酶將用(R)-2-辛醇脫氫酶基因的表達質粒pSE-PF01和pSE-PF02轉化的JM109菌株，在含氨苄青黴素的液體培養基中30℃培養過夜，加入0.1mMIPTG，再培養4小時。
離心收集微生物細胞後，用含有0.02％ 2-巰基乙醇和1mM硫酸鎂的100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.5)懸浮菌體，用密閉超生破碎儀UCD-200TM(CosmoBio)破碎處理4分鐘。上清作為提取液回收。實施例19重組(R)-2-辛醇脫氫酶活性測定實施例18的重組(R)-2-辛醇脫氫酶對(R)-2-辛醇的活性，並與沒有質粒的無細胞提取液的活性相比。結果顯示於表6中。
表6

實施例20通過各種大腸桿菌菌株生產重組(R)-2-辛醇脫氫酶用表達(R)-2-辛醇脫氫酶基因的質粒pSE-PF01轉化菌株HB101，TG1(大腸桿菌DSM6056)，和MG1665(大腸桿菌ATCC 47076)。
將每種重組大腸桿菌在LB液體培養基中30℃培養過夜，添加0.1mMIPTG，再培養4小時。收集得到的兩種大腸桿菌，測定它們的酶活性。實施例21用質粒pSE-PF01轉化的各種大腸桿菌菌株的活性實施例20的轉化的大腸桿菌(對應於2mL培養液)由實施例18的方法破碎。製備提取液，測定酶活。活性顯示於表7。

實施例22枯草芽孢桿菌DNA的純化枯草芽孢桿菌BGSC 1A1菌株培養在LB培養基中。使用QiagenGenomic Tip(Qiagen)，遵循所附手冊描述的方法從該菌株提取染色體DNA。實施例23枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的克隆為再生還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，對文獻(JP-A 2000-189170)所述的枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因克隆。按照該參考中的方法得到pSE-BSG1。合成引物BSG-ATG3(SEQ ID NO19)和BSG-TAA3(SEQ IDNO20)，基於結構基因5』末端和3』末端的序列構建新的質粒。使用pSE-BSG1作模板進行PCR，條件為95℃變性30秒，50℃下退火60秒，75℃下延伸3分15秒的30個循環。然後，獲得特異性區帶。
SEQ ID NO17BSG-ATG3AGACCATGGATCCAATGTATCCAGATTTAAAGGAASEQ ID NO18BSG-TAA3GAATCTAGATTAACCGCGGCCTGCCTG得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。質粒載體也用NcoI和XbaI限制酶消化。PCR擴增後用兩種酶消化的DNA片段用T4 DNA連接酶連接到上述質粒中，得到pSE-BSG3。圖8表示了構建該質粒的過程。實施例24共表達Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的質粒pSG-PF01的構建通過用兩種限制性酶，MluI和EcoRI消化實施例15中構建的pSE-PF01製備出含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。
實施例23中構建的質粒pSE-BSG1包含得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因，用兩種限制性酶，MluI和EcoRI消化該質粒，製備含有得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因的DNA片段。用T4連接酶將該片段連接到含有Pichia finlandica的，用酶從pSE-PF01剪切得到的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段上，得到質粒pSG-PF01，其可同時表達葡萄糖脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶。圖9表示了該質粒的構建過程。實施例25共表達Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的質粒pSG-PF02的構建用兩種限制性酶，EcoRI和SpeI消化在實施例16中構建的pSE-PF02，從而製備含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。
實施例23構建的質粒pSE-BSG3含有得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因，用用兩種限制性酶，EcoRI和SpeI消化該質粒。用T4 DNA連接酶將此片段連接到下述DNA片段，該DNA片段包含用酶從pSE-PF02剪切得到的來自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因，這樣就得到了質粒pSG-PF02，其可同時表達葡萄糖脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶。圖10表示了該質粒的構建過程。實施例26枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶在大腸桿菌中的同時表達用共表達枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶的質粒pSG-PF01或pSG-PF02轉化大腸桿菌菌株JM109。
將每種重組大腸桿菌菌株接種至LB液體培養基中，30℃下培養過夜。然後，加入IPTG 0.1mM，再培養大腸桿菌4小時。收集得到的兩種大腸桿菌，測定酶活。實施例27用pSG-PF01或pSG-PF02轉化的大腸桿菌的酶活性實施例26中轉化的大腸桿菌(相當於2mL培養液)用實施例17的方法破碎以製備提取物。此提取物用於酶活的測定。在含100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)，2.5mM NAD+，100mM D-葡萄糖，和葡萄糖脫氫酶的反應液中30℃下進行酶活性的測定。1U為在上述條件下1分鐘催化生產1μmol NADH的酶量。兩者活性列於表8中。
表8


實施例28母牛分枝桿菌甲酸脫氫酶的亞克隆從參考文獻(Appl.Microbiol.Biotechnol.44，479-483(1995))所描述的母牛分枝桿菌中克隆甲酸脫氫酶基因以再生還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
基於該參考文獻中結構基因的5』端和3』核苷酸序列合成引物MCF-ATG2(SEQ ID NO19)和MCF-TAA3(SEQ ID NO20)，以便只克隆甲酸脫氫酶的開放讀碼框。採用質粒pSFR415(Seimeikenjouki登記號7391(FERMBP-7391))為模板進行PCR，95℃下45秒，50℃下1分鐘，75℃下7分鐘共30個循環。然後得到特定的區帶。得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。質粒pSE420D也用NcoI和XbaI限制酶消化。將用同樣的酶消化的DNA片段用T4 DNA連接酶連接到載體上，得到pSE-MCF15。圖11顯示了構建該質粒的方法。
插入的DNA片段的核苷酸序列分析結果顯示，此DNA編碼的蛋白與所述文獻中的胺基酸序列相同。
SEQ ID NO19MCF-ATG2CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTCSEQ ID NO20MCF-TAA3CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG用pSFR415轉化的大腸桿菌菌株JM109的國際保藏(a)保藏機構名稱和地址名稱國立生命科學和人體技術研究所，產業技術綜合研究所，經濟通產省(原名通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所)地址日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號305-8566(b)保藏日期2000年11月10日(c)保藏號碼FERM BP-7391實施例29既表達Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶又表達分枝桿菌的甲酸脫氫酶的質粒pSF-PF02的構建實施例16的pSE-PF02用EcoRI和SpeI消化，製備含Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA片段。
實施例28的質粒pSF-MCF15用EcoRI和SpeI消化，製備含分枝桿菌甲酸脫氫酶基因的DNA片段。使用T4連接酶將該DNA連接至含有用上述酶從pSE-PF01剪切得到的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。於是，得到了可同時表達甲酸脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶的質粒pSF-PF02。圖12顯示了構建該質粒的方法。實施例30在大腸桿菌中同時表達Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶和分枝桿菌的甲酸脫氫酶用質粒pSF-PF02轉化大腸桿菌菌株JM109，該質粒可共表達Pichiafinlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶和分枝桿菌的甲酸脫氫酶。
將此重組大腸桿菌接種至LB液體培養基中，30℃下培養過夜。然後，加入IPTG 0.1mM，再培養大腸桿菌4小時。收集得到的大腸桿菌，測定酶活。實施例31用pSF-PF02轉化的大腸桿菌的酶活性實施例30中製備的用pSF-PF02轉化的大腸桿菌(相當於2mL培養液)按照實施例17的方法進行破碎以製備提取液。提取液用於測定酶活。在30℃下進行葡萄糖脫氫酶活性的測定，反應液中含有100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)，2.5mM NAD+，100mM甲酸，及所述酶。1U表示為在上述條件下1分鐘內催化生產1μmol NADH的酶量。由重組大腸桿菌得到的粗製酶液的(R)-2-辛醇脫氫酶活性為8.99U/mg-蛋白，甲酸脫氫酶活性為0.653U/mg-蛋白。實施例32用Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)，139.8mg NADH，1.75U實施例3的Pichiafinlandica(R)-2-辛醇脫氫酶，和0.5％4-氯乙醯乙酸乙酯30℃下反應過夜。生產的(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯的光純度按照下列方法確定。從反應液中用乙酸乙酯萃取出(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯，除去溶劑，使用光學離析柱進行液相色譜分析。液相色譜採用Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCELOD.(4.6mm×25cm)和洗脫液(正己烷∶2-丙醇＝93∶7)以流速1mL/min進行，並進行RI檢測。結果顯示，本發明生產的4-氯-3-羥基丁酸乙酯中S型超過99％。實施例33用Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯將含有1％2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯的1mL甲苯加入1mL反應液中，該反應液含有200mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)，86mM葡萄糖，1mM NAD+，1mM硫酸鎂，1U的實施例3的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶，25℃下攪拌反應15小時。
最終反應物的分析結果顯示，產生了1.0g/L的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，其光學純度為100％。
通過HPLC分析水相和有機相中得到的產物來定量2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，所述HPLC在室溫下，洗脫液(水/乙腈＝1/1)以流速0.5mL/min進行洗脫。260nm下進行UV檢測。
使用光學離析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通過HPLC進行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的光學純度的檢測，所述HPLC在40℃下用洗脫液(己烷∶2-丙醇＝9/1)以流速1mL/min進行洗脫。260nm下進行UV檢測。實施例34使用pSF-PF02合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯收集實施例30的用pSF-PF02轉化的大腸桿菌(相當於5mL培養液)。將500mg 2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯加入到5.22mL反應液中，該反應液含有500mM HEPES/NaOH緩衝液(pH6.5)，829mM甲酸鈉，1mM硫酸鎂，30℃下攪拌反應18小時。
最終反應液的分析結果顯示，產生了486mg 2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，其光學純度為約100％。
2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的定量測定按照下面方法進行添加甲苯到反應液中以便萃取出產物，通過氣相色譜分析水相和有機相中的產物。得到該合成子(synthon)的產量。氣相色譜條件是OV-21020％Chromosorb W(AW-DMCS)60/80目(G-L Science，3.2mm×200cm)，柱溫170℃。使用火焰離子化檢測器(FID)進行檢測。
使用光學離析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通過HPLC進行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的光學純度的檢測，所述HPLC是在40℃用洗脫液(己烷/乙醇＝9/1)以流速1mL/min進行洗脫。260nm下進行UV檢測。實施例35純化產朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶產朊假絲酵母IFO0988菌株培養在3.6L培養基B中，離心製備微生物細胞。得到的微生物細胞懸在100mM磷酸鉀緩衝液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)，0.01％2-巰基乙醇，和2mM苯甲烷磺醯氟(PMSF)中，用玻璃珠(Biospec)勻漿。然後，離心除去微生物細胞碎片，得到了無細胞提取液。將硫酸魚精蛋白加入到此無細胞提取液中，離心除去核酸得到上清液。將硫酸銨加入到上清液中，得到的上清液是粗製酶液，為30％飽和度。用含30％飽和銨的標準緩衝液透析該溶液，上樣到phenyl-Sepharose HP柱(2.6cm×10cm)，用相同緩衝液平衡。用30％到0％飽和度硫酸銨進行梯度洗脫。回收提取的級分中具有(R)-2-辛醇選擇性的級分並通過超濾濃縮。
培養基B組成如下Medium B10g/L酵母提取物20g/L蛋白腖1％甲醇pH6.0已濃縮的酶液用標準緩衝液透析後，上樣到Blue-Sepharose HP(1.6cm×2.5cm)，用該緩衝液洗柱。用0到1.5M氯化鈉進行濃度梯度洗脫。回收具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的級分並濃縮。將此酶液上樣到已用標準緩衝液平衡的Mono Q HR 5/5(0.5cm×5cm)柱，進行0到1M氯化鈉的濃度梯度洗脫。回收具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的級分並濃縮。此濃縮酶液使用Superdex200(0.32cm×30cm)，以含0.3M氯化鈉的標準緩衝液進行凝膠過濾。濃縮活性級分得到該酶。
該酶的比活是3.33U/mg，這是氧化(R)-2-辛醇的活性。純化細節總結於表9中表9步驟蛋白量(mg) 總活性(U) 比活(U/mg)無細胞提取物1,220 6.58 0.00539去除的核酸 396 2.30.0058130％硫酸銨 471 1.14 0.00242Phenyl-Sepharose17.70.757 0.0429Blue-Sepharose 10.20.745 0.0727MonoQ 0.776 0.386 0.497Superdex 2000.0131 0.0434 3.33實施例36(R)-2-辛醇脫氫酶分子量的測定來自實施例35的產朊假絲酵母的酶經Superdex200凝膠柱測定的分子量大約是150,000Da。實施例37(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳pH我們使用Tris-HCl緩衝液和甘氨酸緩衝液改變pH，以觀察得自實施例35的酶的(R)-2-辛醇脫氫酶活性。圖13表示了以最大活性為100時的相對活性。結果顯示，此酶的最佳pH是8.5-11.0。
我們還使用磷酸緩衝液(KPB)，乙酸鈉(NaOAc)改變pH，以觀察得自實施例35的酶的4-氯乙醯乙酸乙酯還原酶活性。圖14表示了以最大活性為100時的相對活性。結果顯示，此酶的最佳pH是5.0-6.5。實施例38(R)-2-辛醇脫氫酶的底物特異性使(R)-2-辛醇脫氫酶與多種醇反應，測定其氧化活性。表10表示了相對活性，其以使用NAD+為輔酶對(R)-2-辛醇的氧化活性為100。結果顯示，對(S)-2-辛醇的相對活性為6.7％，對2-丙醇為8.3％，對(R)-1-苯乙醇為86％。
表10底物(氧化反應)(R)-2-辛醇 100(S)-2-辛醇 6.72-丙醇 8.3(R)-1-苯乙醇 86.7(S)-1-苯乙醇 6.7實施例35的酶也與多種酮反應，測定其還原活性。表11表示了相對活性，其以使用NADH為輔酶時的4-氯乙醯乙酸乙酯還原活性為100。結果顯示，對2-辛酮的相對活性為26.6％，對苯乙酮為25.3％。
表11

實施例39採用來自產朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯
100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5)，139.8mg NADH，0.06U來自產朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶，0.5％ 4-氯乙醯乙酸乙酯30℃下反應過夜。產生的4-氯-3-羥基丁酸乙酯按照實施例32所述方法測定其光學純度。結果顯示，本發明生產的4-氯-3-羥基丁酸乙酯中S型超過97％ee。
工業應用本發明提供有利於工業生產的NADH-依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶。使用此酶使有效生產光學活性醇如(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯成為可能。特別是，使用4-滷乙醯乙酸酯為底物經本發明的酶反應得到的(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯是合成藥物和殺蟲劑，如HMG-CoA還原酶抑制劑，D-肉毒鹼等的中間體。因此，本發明在工業上特別有用。
綜上所述，JP-A Hei 02-732中所述的(R)-丙氧苯衍生物作為中間體是特別有用的化合物，如氧氟沙星((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧-2，3-二氫-7H-吡啶並[1，2，3-脫][1，4]苯噁嗪-6-羧酸(JP-A Sho 62-252790，其為合成性抗細菌藥物)的光學活性物質。已經確定，氧氟沙星的特定光學異構體具有高抗細菌活性。本發明可以得到具有高光學純度的氧氟沙星合成中間體，這樣就可以合成出氧氟沙星的光學異構體。
序列表110大賽璐化學工業株式會社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)120(R)-2-辛醇脫氫酶，產生此酶的方法，編碼此酶的DNA，以及使用此酶生產醇類的方法130D1-A0001Y1P140141150JP 2000-435061512000-02-16150JP 2000-3745931512000-12-0816020170PatentIn Ver.2.12101211765212DNA213Pichia finlandica220221CDS222(1)..(765)4001atg tct tat aac ttc cat aac aag gtt gca gtt gtt act gga gct cta 48Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu1 5 10 15tca gga atc ggc tta agc gtc gca aaa aag ttc ctt cag ctc ggc gcc 96Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala20 25 30aaa gta acg atc tct gat gtc agt gga gag aaa aaa tat cac gag act 144Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr35 40 45gtt gtt gct ctg aaa gcc caa aat ctc aac act gac aac ctc cat tat 192Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr50 55 60gta cag gca gat tcc agc aaa gaa gaa gat aac aag aaa ttg att tcg 240Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser65 70 75 80gaa act ctg gca acc ttt ggg ggc ctg gat att gtt tgt gct aat gca 288Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala85 90 95gga att gga aag ttc gct ccc acc cat gaa aca ccc ttc gac gta tgg 336Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp100 105 110aag aag gtg att gct gtg aat ttg aat gga gta ttc tta ctg gat aag 384Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys115 120 125cta gcc atc aat tac tgg cta gag aaa agc aaa ccc ggc gta att gtc 432Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val130 135 140aac atg gga tca gtc cac tct ttt gta gca gct cct ggc ctt gcg cat 480Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His145 150 155 160tat gga gct gca aaa ggc ggt gtc aaa ctg tta aca caa aca ttg gct 528Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala165 170 175cta gag tac gca tct cat ggt att aga gta aat tct gtc aat ccg ggg 576Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly180 185 190tac att tcg act cct ttg ata gat gag gtt ccg aaa gag cgg ttg gat 624Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp195 200 205aaa ctt gta agc ttg cac cct att ggg aga cta ggt cgt cca gag gaa 672Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu210 215 220gtt gct gat gca gtc gca ttt ctg tgt tcc cag gag gcc act ttc atc 720Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile225 230 235 240aac ggc gtt tct ttg ccg gtt gac ggg ggg tac aca gcc cag taa 765Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250 2552102211254212PRT213Pichia finlandica4002Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu1 5 10 15Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala20 25 30Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr35 40 45Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr50 55 60Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser65 70 75 80Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala85 90 95Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp100 105 110Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys115 120 125Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val130 135 140Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His145 150 155 160Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala165 170 175Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly180 185 190Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp195 200 205Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu210 215 220Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile225 230 235 240Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250210321110212PRT213Pichia finlandica4003Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu Ser Gly1 5 10210421112212PRT213Pichia finlandica4004Leu Ile Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu1 5 10210521110212PRT213Pichia finlandica4005Leu Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Asp Ala1 5 10210621129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列220221misc feature222(1)..(9)223BamHI位點4006gtcggatccg tbgchgtbgt bachgghgc 29210721129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列220221misc_feature222(1)..(9)223BamHI位點220221222(15)223Na，c，t或g220221222(18)223Na，c，t或g220221222(27)223Na，c，t或g4007gtcggatccg crtcngcnac ytcytcngg 292108211623212DNA213Pichia finlandica4008gctctatcag gaatcggctt aagcgtcgca aaaaagttcc ttcagctcgg cgccaaagta 60acgatctctg atgtcagtgg agagaaaaaa tatcacgaga ctgttgttgc tctgaaagcc 120caaaatctca acactgacaa cctccattat gtacaggcag attccagcaa agaagaagat 180aacaagaaat tgatttcgga aactctggca acctttgggg gcctggatat tgtttgtgct 240aatgcaggaa ttggaaagtt cgctcccacc catgaaacac ccttcgacgt atggaagaag 300gtgattgctg tgaatttgaa tggagtattc ttactggata agctagccat caattactgg 360ctagagaaaa gcaaacccgg cgtaattgtc aacatgggat cagtccactc ttttgtagca 420gctcctggcc ttgcgcatta tggagctgca aaaggcggtg tcaaactgtt aacacaaaca 480ttggctctag agtacgcatc tcatggtatt agagtaaatt ctgtcaatcc ggggtacatt 540tcgactcctt tgatagatga ggttccgaaa gagcggttgg ataaacttgt aagcttgcac 600cctattggga gactaggtcg tcc 623210921129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列220221misc_feature222(1)..(9)223BamHI位點4009gtcggatcct cagagatcgt tactttggc 292101021129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列220221misc_feature222(1)..(9)223BamHI位點40010gtcggatccc gactcctttg atagatgag 2921011211599212DNA213Pichia finlandica40011tgggctgaac ctggctgtgc tactgggcag agcaaaatca gatagaagag cttgtgtttt 60tgtagcaccc ctcttttttt ttgaaattct ctacagctca attacctgtt cacattcaat 120acagagtact atcttttcga tttcttatca gataagcaat tgacaatatt agtagcacct 180gatgcacttt tcgagaacac acctgagtac aaaacaatat atatcattat attagaacag 240tgacattgag aacaattttc cagcatataa tgtaattagg tgcatcaaca accaggaaaa 300acacctgatt aaaaaatccg gatattaaga atcatgaaac aaaattcaat gttaccctac 360ccattccttc tcggaacctc ctgatgactt attaatagtg aggttgttcc gataaaaatc 420gcgaatttct ccattccata aattctccta taacttggct tactatacac acacactatt 480atcgatatgt cttataactt ccataacaag gttgcagttg ttactggagc tctatcagga 540atcggcttaa gcgtcgcaaa aaagttcctt cagctcggcg ccaaagtaac gatctctga 59921012211581212DNA213Pichia finlandica40012cgactccttt gatagatgag gttccgaaag agcggttgga taaacttgta agcttgcacc 60ctattgggag actaggtcgt ccagaggaag ttgctgatgc agtcgcattt ctgtgttccc 120aggaggccac tttcatcaac ggcgtttctt tgccggttga cggggggtac acagcccagt 180aaattggaca ctttttgctc tttattatct tccccgcgtt tcaccaatta tccggtgtac 240gtaggttgca gtgactttct ggtttctgca cttgaatgaa actctctttt accccacaaa 300atcagctcag taaattatct tgtgtatata taaataagac agaaaccctg tggactccta 360gtatggtgtt ctactttcat taaggcagtc acaaaagcaa tggcgaaatc aactgatgga 420aagatagtta cactggagga gcaggcctac aatggcccac ccgcacggat cataggagaa 480gctatcgcca ttaaagcgaa gctggctgcc aatcggacac tcccagttaa gtttgaaaga 540aagcgtggtc ttcaaccacc accagggatg tctagacaag a 5812101321129212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40013tcgacatgtc ttataatttc cataacaag 292101421134212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40014gcagaattcc tctagattac tgggctgtgt accc 342101521137212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40015cacgaattct aaaatgtctt ataatttcca taacaag 372101621128212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40016agtactagta ttactgggct gtgtaccc282101721136212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40017agaccatgga tccaatgtat ccagatttaa aaggaa 362101821127212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40018gaatctagat taaccgcggc ctgcctg 272101921142212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40019ctttctagag gaattcaacc atggcaaaag ttctgtgtgt tc422102021134212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列40020cagtctagat tagaccgctt ttttgaattt ggcg 3權利要求
1.一種(R)-2-辛醇脫氫酶，其具有下列(1)和(2)的物化性質(1)作用i)此酶以氧化型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶通過氧化醇而生產酮，且ii)此酶以還原型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶通過還原酮而生產醇，且(2)底物特異性i)此酶優先氧化2-辛醇的兩種光學異構體中的(R)-2-辛醇，且ii)此酶通過還原4-滷乙醯乙酸酯生產(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯。
2.權利要求1中的(R)-2-辛醇脫氫酶，其有著下列(3)和(4)的物化性質(3)最佳pH用於氧化反應的最佳pH範圍為8.0-11.0，還原反應的最佳pH範圍為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現出更高的活性，且ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現出顯著更高的活性。
3.權利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中此(R)-2-辛醇脫氫酶由選自畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬的微生物衍生。
4.權利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於畢赤酵母屬的微生物是Pichia finlandica。
5.權利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於畢赤酵母屬的微生物是Pichia jadinii。
6.權利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於假絲酵母屬的微生物是產朊假絲酵母。
7.權利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬於Ogataea屬的微生物是Ogataea wickerhamii。
8.權利要求1或2的用於生產(R)-2-辛醇脫氫酶的方法，此方法包括培養從畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中挑選的微生物，該微生物生產權利要求1或2的酶。
9.下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸編碼了具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的蛋白(a)一種多核苷酸，其含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，(b)一種多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2的胺基酸序列的蛋白，(c)一種多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2的胺基酸序列的蛋白，在此胺基酸序列中有一個或多個胺基酸的取代，缺失，插入和/或添加，(d)一種多核苷酸，其在嚴謹條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交，且(e)編碼與SEQ ID NO2的胺基酸序列有著不少於70％同源性的胺基酸序列的多核苷酸。
10.由權利要求9的多核苷酸編碼的蛋白。
11.重組載體，其中插入了權利要求9的多核苷酸。
12.權利要求11的重組載體，其中進一步插入一種多核苷酸，其編碼以β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶並能催化氧化還原反應的脫氫酶。
13.以可表達的方式含有權利要求9中多核苷酸或權利要求11中載體的轉化體。
14.生產權利要求10中蛋白的方法，此方法包括培養權利要求13中的轉化體。
15.生產醇的方法，此方法包括將權利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權利要求10的蛋白，可生產所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產物與酮反應以使該酮還原。
16.權利要求15的方法，其中的微生物是權利要求13的轉化體。
17.權利要求15的方法，其中的酮是4-滷乙醯乙酸酯的衍生物並且其中的醇是(S)-4-滷-3-羥基丁酸酯衍生物。
18.權利要求17的方法，其中4-滷乙醯乙酸酯的衍生物是4-氯乙醯乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
19.權利要求15的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示通式1 其中x1和x2表示滷原子；且其中的醇是由通式2表示的丙氧苯衍生物通式2
20.權利要求19的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯。
21.權利要求15的方法，該方法還包括將氧化型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸轉換成其還原型。
22.用於生產酮的方法，此方法包括使權利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權利要求10的蛋白，可生產所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產物與醇反應以使該醇氧化。
23.生產光學活性醇的方法，該方法包含的步驟有，將權利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權利要求10的蛋白，生產所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產物與外消旋醇反應以優先氧化任一光學異構體，並得到保留的光學活性醇。
24.權利要求22或23的方法，該方法另外進一步包含將還原型β-煙醯胺腺嘌呤二核苷酸轉換成其氧化型。
全文摘要
以NAD
文檔編號C12N15/53GK1366550SQ01800758
公開日2002年8月28日 申請日期2001年2月15日 優先權日2000年2月16日
發明者工藤真丈, 山本浩明 申請人:大賽璐化學工業株式會社