黑素生成抑制劑及其製備和使用方法

2024-03-05 12:58:15

專利名稱：黑素生成抑制劑及其製備和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種黑素生成抑制劑，及其製備和使用的方法。更為具體地，該黑素生成抑制劑包含一種天然的蛋白質或其有效片段。它能降低酪氨酸酶活性、抑制色素細胞增殖，並對黑素瘤細胞有細胞毒性。
色素沉著過多症影響全世界許多人，常常使人極其窘迫或產生更壞後果。這類疾病包括諸如雀斑、日照著色斑(褐黃斑)、燒傷病人移植皮膚常見的顏色明顯變深，以及最為嚴重的黑素瘤。此外，許多人僅僅從美容角度也希望減輕他們的皮膚底色。
過去採用了不同的方法來降低色素沉著過多區域的色素沉著或減輕皮膚底色。雖然這些治療取得了種種結果，然而大部分會產生不希望得到的副作用。用於漂白皮膚或脫去色素的化合物包括氫醌及其衍生物。氯化氨基汞、抗壞血酸、巰基胺類、4-異丙基兒茶酚、以及過氧化物。然而沒有一種業已證明是完全可靠，沒有副作用的。
歐洲專利申請389，950揭示了一種促黑素細胞激素(MSH)抑制劑，據報導其對諸如預防或減輕褐黃斑或雀斑等症狀是有用的。該抑制劑包含由下列式子代表的胺基酸順序-His-Ser-Arg-Trp-;-Trp-Arg-Ser-His;或-Leu-Ala-Cys-Ala-Arg-。前面二種順序代表的肽類對黑素細胞表面包含的MSH受體具有親和力，由此拮抗MSH。第三種順序代表的肽類對MSH本身具有親和力，由此抑制MSH的作用。
在他們發明之後，申請人得知一篇新近的出版論文，其中揭示了一種蛋白質，可能與他們已經製備的有關，事實上可能是一樣的(Madsen，P.etal.，I.InvestDermatol99∶299-305(1992)。這種蛋白質據報導在牛皮癬角質細胞中受到高度的正調節，但是報導沒有提到與黑素生成的關係。
一種更為嚴重的皮膚色素沉著過多症是黑素瘤。它影響世界上數百萬人。雖然早期診斷的活，有時可以得到治療，但黑素瘤常常是致命的。目前已有的治療方法，如化學療法，常會引起嚴重的副作用，並且從不會對所有病人完全有效。
然而，迄今為止，沒有一種天然來源的組合物能夠可靠的抑制黑素生成，由此減少皮膚色素沉著，並對黑素瘤細胞有選擇性細胞毒性，而且沒有任何副作用。
下面描述本發明的一些重要特徵和目的，但不是全部的。
本發明的一個目的是提供一種天然來源的黑素生成抑制劑，用於減少皮膚色素沉著，有選擇地破壞黑素瘤細胞。
本發明的另一個目的是提供一種天然來源的黑素生成抑制劑，包含一種天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質或其有效片段。
本發明的另一個目的是提供一種製備黑素生成抑制因子蛋白質的方法。
本發明的另一個目的是提供一種利用天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質或其有效片段來控制皮膚和/或毛髮色素沉著。
本發明的另一個目的是提供一種利用天然來源的黑素生成抑制因子蛋白質或其有效片段來破壞黑素瘤細胞，而不影響正常的非色素細胞。
如本文所用，「黑素生成」是指由活細胞生成黑素;「抑制黑素生成」包括抑制各個細胞產生黑素的能力和/或減小能產生黑素的細胞群體。
按照本發明的一個方面，提供了一種在此之前未知的天然來源的蛋白質，它能夠抑制色素細胞的黑素生成，選擇性破壞黑素瘤細胞，而不傷害其他細胞。該黑素生成抑制因子(MI)蛋白質具有下列胺基酸順序(與其相應的密碼子一起列出，每個胺基酸下面的數字指MI順序中胺基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為了簡明起見,整個MI蛋白質的順序如下所示:
SEQIDNO.4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110
AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135按照本發明的另一個方面，提供了一種製備MI蛋白質的方法，包括下列步驟(a)將哺乳動物皮膚，較好是人皮膚，移植到活的裸鼠上;(b)讓此哺乳動物皮膚在裸鼠上保持預定的一段時間;(c)從裸鼠上移走此哺乳動物皮膚;以及(d)從此哺乳動物皮膚提取包含MI蛋白質的蛋白質部分。較好是讓哺乳動物植皮在裸鼠上保持至少6個星期。同樣，較好是提取步驟包括用生理鹽水從哺乳動物皮膚提取蛋白質，用離子交換色譜法分級分離皮膚蛋白質提取物，用雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離色譜法得到的適當的級分中的皮膚蛋白質提取物，以及用電洗脫法從電泳凝膠中分離MI蛋白質。
按照本發明的另一個方面，還提供了一種控制色素細胞(特別是皮膚和毛髮中的色素細胞)黑素生成的方法，其步驟包括形成一種有效量MI蛋白質和合適載體的混合物，然後將此混合物施用於欲控制的色素細胞。MI蛋白質或其活性片段可施用於例如皮膚，來治療某些色素沉著過多症或僅僅為了美容目的。MI蛋白質也可施用於美容方面的毛髮脫色或減色，例如使體毛(如陰毛，腋毛，胸毛，腿毛，臂毛，背毛)變得不那麼清晰可見。使用這種組合物可使刮順，脫毛或電針除毛不便之處較少見，比較好的是將混合物局部施用於色素細胞，並且最好是用MI蛋白質活性片段。或者M白質或其活性片段可以與適當的載體一起注射，以便將組合物施用於色素細胞。合適的載體可有無數種，其選擇依賴於施用的最終目的。這樣，MI蛋白質或最好是其活性片段，可以與皮膚修補劑結合使用，以減輕老年斑，同時也改善皮膚皺紋狀態。
按照本發明的另一個方面，提供了一種通過將有效劑量的MI蛋白質或其活性片段與合適載體混合，應用於黑素瘤細胞，從而選擇性破壞黑素瘤細胞的方法。同樣先多種載體可以使用，其選擇依賴於該組合物的應用方法。比較好的是將該組合物局部使用，並且利用MI蛋白質的活性片段。
A.MI蛋白質的開發研究移植到燒傷病人的皮膚色素過多沉著以前已有記載，並被認為是一種炎症後機制起作用的結果。也觀察到皮膚色素沉著增加與日照灼傷和其他皮炎過程的關係，並把這種增加歸結於功能性黑素細胞(「多巴陽性」黑素細胞)數量的增加和黑素細胞實際黑素合成的增加。
為了檢查移植皮膚的色素反應，將小塊人皮膚樣本植到先天性無胸腺小鼠(裸鼠)上。裸鼠經證明是一種用於研究正常和病理異種移植組織體內行為的優異宿主，因為它們不會排斥不同系統發生來源的移植物。裸鼠已經廣泛地用於人類皮膚的研究。移植到裸鼠上的人類皮膚仍保持其結構和免疫特性，以及一些主要的功能性質。
在這一討論和接下來的所有實施例中，存活的供體皮膚來自於高加索人種成人屍體。用植皮刀取皮膚，厚度為一吋的12-14/1000，並貯存於F-12組織培養基(自GibcoLaboratories，GrandIsland，NY)，4℃。將裸鼠先用Nembutol麻醉，從軀體合適部位除去皮膚，準備移植部位。將裂口厚度(12-14/1000吋)的供體皮膚置於小鼠合適部位並縫合得當。移植皮膚是在供體死亡48小時之內移植到小鼠上的。需要時，將小鼠用過量的Nembutol處死，通過消毒外科技術，取下異種移植物。
如所期望，這種異種移植物表現出與報導的燒傷病人中相同的色素過多沉著。在移植之前以及移植後不同時間，對異種移植物進行了各種組織學試驗和檢查，以研究這種觀察到的色素過多沉著。明顯的異種移植物顏色變深早在移植兩周後就出現了。而且，儘管存在觀察關異，所有的異種移植物都表現出色素過多沉著。然而，觀察到的色素過多沉著只局限於異種移植物，並不延伸到宿主皮膚。
異種移植物樣本的顯微鏡分析揭示出與移植前相比，異種移植物中多巴陽性黑素細數量有顯著的增加。多巴陽性細胞是指存在功能性酪氨酸酶的細胞，因而能產生色素。雖然增加的程度有些不同，但是多巴陽性黑素細胞數目的增加至少有3倍，而且所有的樣本在移植後6周左右都出現一個峰值。從這點開始，多巴陽性黑素的細胞數目逐步下降，但在某些異種移植物中，遲至移植30周，仍會維持在略有增加的程度。
作為黑素生成活性的一種指示，也測定了黑素細胞體的大小。在所有的情形中，黑素細胞的大小比移植前樣品中觀察的要大一倍以上，同時細胞大小變化也顯示出一個峰值，隨之逐步減小。此外，異種移植物中黑素細胞樹突也顯著增加。樹突的增加一般會導致皮膚色素沉著的增加，因為樹突負責運輸黑素至表皮。雖然色素過多沉著的程度並不總是與多巴陽性黑素細胞的數目相關，但的確傾向於與黑素細胞樹突相關。這似乎表明，觀察到的色素過多沉著與其說是黑素細胞實際數目增加的結果，不如說是黑素生成活性增加的結果。
為了確定低分子量和高分子量蛋白質區是否存在任何差別，對移植前和移植後的人皮膚提取液進行了SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。雖然在移植後不同時間取樣的樣品間，蛋白質電泳帶型沒有任何明顯的差異，但是，在移植後異種移植物樣品中，獨特地顯示出一條表觀分子量大約為13到14千道爾頓(KDa)的蛋白質帶，而在移植前皮膚中沒有發現此帶。在趣的是，在裸鼠皮膚提取物中也發現了一種具有類似分子量的蛋白質。該13到14KDa蛋白質帶早至移植後二周就出現，並持續出現到移植14周以後。
在下面的實施例中，不同的蛋白質級分和純化的蛋白質被用於幾種不同類型的細胞，以確定提取自移植前和移植後的皮膚中的蛋白質對色素作用的影響，如果有的話。移植前皮膚僅指正常人皮膚，而移植後皮膚指由裸鼠支持的活的異種移植物。這種試驗的最終結果就是從上面提到的13到14KDa帶中分離出單一的黑素生成抑制因子(MI)蛋白質。雖然申請人並不能確定MI蛋白質如何影響黑素生成和選擇性地殺滅黑素瘤細胞，但是沒有任何理由相信這些作用是通過MSH和/或其受體引起的。
實施例1採用的第一種細胞類型是克勞德曼(Cloudman)S91黑素瘤。這是一種中等程度鼠黑素沉著病細胞，已廣泛用於研究黑素生成和色素細胞生長。黑素瘤細胞以單層培養物形式保存於Ham F-10培養基(購自Gibco Laboratories，Grand Insland，NY)，其中補充有10%熱激活小鼠血清，2.5%熱激活胎牛血清，100單位/毫升青黴素，及100微克/毫升鏈黴素，置於37℃含5%CO2的溼潤溫育器中。細胞每周傳代培養，並保存在培養物中僅10代，以避免表型漂移。從液氮中冷凍保藏的細胞重新獲取單層備用培養物(參見Zalfa Abdel-Malek et al.，Cancer Research 47∶3141-6(1987))。
通過除去皮下脂肪，然後將皮膚樣品切成小片，從移植前和移植後(移植12至15周之後)的皮膚樣品中製備蛋白質提取物。用polytron勻漿器制皮膚勻漿，製備20-30%含1mM甲苯磺醯氟(PMSF)的磷酸鹽緩衝液(PBS)勻漿。2000×g離心20分鐘，取出粗抽提液，再於100，000×g離心1小時，獲得澄清可溶的上清部分。將上清液過濾滅菌，用Bio-Rad方法測定蛋白質含量。
然後，用含EDTA的Tyrodes溶液取代培養基，收穫Cloudman S91黑素瘤細胞。將細胞按大約0.2×106/25cm2密度接種於每個瓶中。對於每個實驗組，接種三瓶，並做對照瓶。24小時後，用含不同濃度的按上法製備的移植前或移植後上清液的新鮮培養基替換老的培養基，溫育24小時。最後，加入含3H-酪氨酸(1微居裡/毫升)和上清液(與前面所用濃度相同)的新鮮培養基，再溫育24小時。按照修改的Pomerantz活性炭吸附法(如Fuller，B.B.Viskochil，B.H.，Life Sci.24∶2405-2416(1979)所述)，原位測定酪氨酸酶的酪氨酸羥化酶活性。此檢測是通過測定由酪氨酸酶將3H-酪氨酸轉變為L-多巴後3H2O的釋放量來測定酪氨酸酶的活性，也是對黑素生成活性的一種顯著的指示，因為酪氨酸酶活性的降低將會導致相應的黑素生成活性的降低(例如皮膚色素沉著的減輕)。
與對照相比，用25微克/毫升移植後蛋白質提取物處理的黑素瘤細胞，其酪氨酸酶活性大約增加20%。濃度低於25微克/毫升不再會增加酪氨酸酶活性。然而，在較高濃度的移植後蛋白質提取物時，黑素瘤細胞的酪氨酸酶活性以劑量依賴性方式降低。濃度為50微克/毫升時，酪氨酸酶活性大約降低20%，75微克/毫升降低30%，100微克/毫升降低50%。與此對照，用移植前皮膚蛋白質提取物處理的黑素瘤細胞培養物，不顯示任何有統計學意義的酪氨酸酶活性的變化。因此，顯然當人皮膚移植到活的宿主上時會誘導產生出一種強有力的黑素生成抑制因子，這種抑制因子存在於移植後皮膚的蛋白質提取物中。
實施例2同樣，檢查了實施例1中的蛋白質提取物對正常人黑素細胞的影響。先除去新生兒背側包皮皮下組織，而獲得正常黑素細胞。然後將組織培養在0.25%胰蛋白酶中，4℃過夜。接著用後工將表皮從真皮撕開，兩者均置於培養基中劇烈旋轉。然後取出上清液，轉移到一25平方釐米的組織培養瓶(步驟詳見Zalfa Abdel-Malek et al.，Journal of Cellular Physiology，150∶416-25(1992))。用於上述兩種提取物和保存細胞的培養基包含Ham F-10培養基，10-4M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，5%熱失活胎牛血清，5%新生牛血清，5微克/毫升胰島素，2微克/毫升α-生育酚，2微克/毫升轉鐵蛋白，5納克/毫升TPA，20納克/毫升霍亂毒素，10，000單位/毫升青黴素，以及10，000微克/毫升鏈黴素。細胞仍於37℃保存在含5%CO2的溼潤的溫育器中。然後按0.15×106細胞/孔的密度將黑素細胞種於一起的6個孔中(表面積9.6平方釐米)。其餘步驟，包括移植前和移植後(12至15周)皮膚蛋白質抽提物的提取，同實施例1。
測定了不同濃度(25-100微克/毫升)蛋白質抽提物處理的正常黑素細胞中的酪氨酸酶活性。依然觀察到了移植後蛋白抽提物低濃度處理酪氨酸酶活性的增加和隨後的較高濃度處理酪氨酸酶活性劑量依賴性的下降。觀察到的每種濃度下酪氨酸酶活性的變化與實施例1中記錄的黑素瘤細胞的結果大致相同，培養在100微克/毫升移植後蛋白質抽提物中的細胞中酪氨酸酶活性下降50%。用移植前皮膚蛋白質抽提物處理的細胞不表現任何統計上有意義的酪氨酸酶活性的變化。由此，存在於移植後皮膚蛋白質抽提物中的黑素生成抑制因子對正常黑素細胞和黑素瘤細胞兩者具有同等的抑制作用。
實施例3為了檢測移植前和移植後皮膚蛋白質抽提物中所含的不同蛋白質，進行了單向0.1%SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。電泳使用15%丙烯醯胺凝膠，採用Laemmli所述的不連續緩衝系統(報導於Nature227∶680-5(1970))。用考馬斯亮蘭R-250染色顯示蛋白質帶。對移植前和移植後粗抽提物(2000×g)和上清液(100，000×g)(按實施例1所述方法製備)都進行了分析。此外，用TritonX-100抽提100，000×g離心後的沉澱物，以溶解任何顆粒部分，並同樣進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。
在移植前粗抽提物和上清液蛋白質電泳結果之間沒有觀察到明顯的差異。同樣，在移植後粗抽提物和上清液之間，也沒有明顯的差異。然而，在移植前和移植後蛋白質電泳結果之間，存在顯著的差異。最顯著地是在移植後皮膚樣品中獨有地出現一條13至14KDa的雙帶。而且，用TritonX-100抽提沉澱所得部分不包含這條蛋白質帶，表明這條帶含有可溶性蛋白質。同時，將移植後皮膚真皮和表皮撕開，重複上述步驟。兩種樣品中都存在13至14KDa蛋白質帶，但在表皮中顯示程度更強。
同樣，對在宿主上存在不同長短時間的移植後皮膚也進行了上述分析。該13至14KDa蛋白質帶早在移植後兩周就出現了，並且持續顯現超過移植後14周。在移植後2周和14周樣品之間，未記錄到蛋白質帶型的任何明顯的差異。
實施例4為了確定該13至14KDa蛋白質帶是否含多種蛋白質，對移植前後兩者皮膚上清液進行了雙向聚丙烯醯胺凝膠電泳。不過先用DEAE-纖維素柱(15釐米×1.5釐米)對移植後皮膚上清抽提物(如實施例1所述方法得到)進行離子交換色譜分析。將上清液(15毫升)加到色譜柱上，用磷酸鹽緩衝洗柱以洗脫未結合的蛋白質。每5分鐘收集5毫升級分，並對每一收集的級分測定280納米光吸收。用磷酸鹽緩衝液洗柱直至洗脫級分光吸收近於可忽略不計。此後，用0至1.0M的鹽梯度(Nacl於磷酸鹽緩衝液中)洗脫柱中結合的蛋白質。各級分光譜分析結果表明存在兩個分立的吸收峰(280納米處)。
接著，收集與兩吸收峰有關的級分，並對含0.02%疊氮鈉的重蒸餾水充分透析至少36小時。然後將透析峰樣品凍幹過夜以獲取乾粉。再將乾粉溶於蒸餾水。並測定蛋白質含量。然後將此兩峰級分分別進行雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。
為了進行雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，將含700-800微克蛋白質的兩峰級分小份樣品凍幹。然後將兩份樣品溶於9M尿素，其中含2%CHAPS去垢劑(購自SigmaChemicalCo.)、2%兩性電解質(pH3-10)和2%β-巰基乙醇，室溫下保溫2小時。14，000rpm離心15分鐘後，將樣品加樣於等電聚焦凝膠。用兩性電解質(pH3-10)進行等電聚焦電泳，700伏過夜(如Farrell，J.Biol.Chem.250∶4007-21，(1975)所述)。然後將凝膠用SDS-平衡緩衝液平衡至少15分鐘，再上樣至平板凝膠，用15%凝膠進行第二向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。凝膠用考馬斯亮蘭染色，以顯示不同的蛋白質斑點。
在移植後皮膚上清液樣品中，第一吸收峰級分中的13至14KDa蛋白質帶可分辨出四個蛋白質斑點，其等電點pI值在6.5至7.5之間。然而，第二個吸收峰級分在此分子量範圍內，沒有顯示任何蛋白質。同樣，當對移植前皮膚樣品重複上述步驟時，沒有顯現這些蛋白質。由此可看出，在移植後皮膚中發現的13至14KDa蛋白質帶實際上包含四種不同的蛋白質。
實施例5為了分離和試驗13至14KDa蛋白質帶中包含的四種蛋白質，採用了電洗膠。移植後皮膚上清液經實施例3步驟進行單向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳後，將未染色凝膠與染色凝膠(作為標記)並排放置，從未染色凝膠中切下該13至14KDa蛋白質帶。然後將凝膠切碎，轉移到SchleicherandSchuell電洗脫裝置的電洗脫槽中(購自S.S.Inc.，Keene，NH)。加入含20mMTris、150mM甘氨酸和.05%SDS的緩衝系統，150伏電洗脫過夜。然後收集電洗脫級分，用Centricon-3濃縮器濃縮、透析(得自AmiconCorp.，divisionofW.R.GraceCo.，Beverly，MA)，至體積約0.5毫升。最後，將此濃縮的13至14KDa蛋白質混合物過濾滅菌，並測定蛋白質含量。
按照實施例1的步驟，來檢測電洗脫蛋白質對黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性的影響。將從移植後皮膚上清液中獲得的13-14KDa蛋白質混合物加到細胞培養物中，濃度範圍從0.25到1.0微克/毫升。為了保證觀察到的效應的確是由於來自移植後皮膚的13-14Da帶中的蛋白質混合物所致，也用移植前皮膚上清液進行了同樣的步驟。
得自移植後皮膚的13-14KDa蛋白質混合物引起了黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性相當顯著的劑量依賴性下降。事實上，在蛋白質濃度為1.0微克/毫升時，幾乎下降90%。作為對照，用相應量的得自移植前皮膚上清液的溶液進行試驗，結果只引起酪氨酸酶活性輕微的，不顯著的下降。
當用正常人黑素細胞(按實施例2方法所得)重複同樣的試驗時，該13-14KDa蛋白質混合物同樣引起酪氨酸酶活性下降。濃度為0.25微克/毫升時，觀察到酪氨酸酶活性大約下降37%;0.5微克/毫升時，觀察到下降約為53%。當使用移植前皮膚抽提物時，觀察到酪氨酸酶活性下降非常小。這些結果表明，存在於移植後皮膚抽提取物中的黑素生成抑制因子包含在該13-14KDa蛋白質混合物中。
實施例6通過檢測3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入(此為細胞中DNA合成速率的量度)，測定了移植前和後皮膚抽提物對細胞增殖的影響。很明顯，黑素細胞增殖的降低將會引起受觀察皮膚色素沉著的相應降低，因為黑素細胞直接負責色素產生。將Cloudman黑素瘤細胞接種於一96孔平底培養板上，200微升/孔。使F-10生長培養基中的細胞附著，第二天用100微升新鮮培養基和選定量的皮膚蛋白質抽提物替換一半體積的培養基。每一實驗組包含6孔。經24小時處理後，再用新鮮培養基和皮膚蛋白質抽提物替一半培養基。在後一處理期間，將細胞用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(1微居裡/孔)脈衝標記。
培育24小時後，用半自動PHD細胞收穫器(購自CambridgeTechnology)將細胞收集到玻璃纖維濾膜上。濾膜於空氣中過夜乾燥，分別轉移到閃爍小瓶中，用450微升Protosol組織和凝膠溶解液處理。然後將小瓶置於烘箱中，66℃保溫75分鐘，再冷卻。接著，第一小瓶中加入100微升冰醋酸和9.5毫升EconoFluor-2(一種非水性閃爍液)。小瓶置於冷凍閃爍計數器中冷卻24小時，然後測定每分鐘計數。
在使用13-14KDa蛋白質混合物(如實施例5電洗脫)的樣品中，觀察到對黑素瘤細胞增殖劑量依賴性的抑制(與對照樣品比較)。蛋白質混合物濃度為0.25微克/毫升時，這種抑制超過30%;濃度為0.50微克/毫升時抑制幾乎為50%。作為對照，用移植前皮膚抽提物處理的黑素瘤細胞只表現出輕微的不顯著的抑制細胞增殖。當用正常人黑素細胞重複這些試驗時，13-14KDa蛋白質混合物對正常黑素細胞增殖抑制程度相同。同樣，移植前皮膚抽提物並不抑制正常黑素細胞的增殖。
為了研究其形態學，也用相差顯微鏡觀察了培養後的黑素瘤細胞。在沒有處理的細胞(對照)和用移植前皮膚抽提物處理的細胞樣品中，細胞看來是正常健康的，具有顯著延伸到細胞間並形成特徵網絡的樹突。作為對照，用13-14KDa蛋白質混合物處理的細胞是不健康的，有很多不附著的、漂浮的死細胞。事實上，僅有大約40%細胞存活，細胞密度下降很多。此外，從餘下的細胞中，很少有樹突延伸出來，實際上所有細胞形狀都是圓的。這清楚地表明，黑素生成抑制因子不但抑制色素細胞增殖，而且對黑素瘤細胞具有細胞毒性。
實施例7為了確定從移植後的皮膚中分離的13-14KDa蛋白質混合物是否只是一種一般代謝抑制劑，用正常人成纖維細胞重複了3H-胸腺嘧啶脫氧核苷細胞增殖試驗。正常人二倍體所生兒包皮成纖維細胞購自Clonetics Corporation，並在到貨後，在T-25瓶中，用加有10%胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培養基(DMEM)培養。37℃培育三天後，將成纖維細胞用胰蛋白酶處理，以每平方釐米3，000個細胞的密度接種到48孔微量滴定板上。然後37℃培育三天。接著，將培養基換成含0.2%血清的DMEM，細胞在這種環境保持四到五天，不加任何其他添加物。
進行了兩種類型的試驗激動劑和拮抗劑。在激動劑試驗中，將不同濃度的移植後皮膚蛋白質抽提液加入隨機選擇的孔中。用成纖難細胞生長因子(FGF)作為陽性對照。同時加入3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(以研究增殖)或3H-脯氨酸(以研究膠原產生)。細胞在此培養基中分別培養二天(增殖)和四天(膠原產生)。然後移去培養基，洗滌細胞，然後用SDS溶解細胞。將1毫升溶解物加到9毫升閃爍液中並計數。拮抗劑試驗採用同樣的步驟，只是還將FGF加到含蛋白質混合物的每個孔中，以確定是否混合物中的活性組分與FGF競爭並表現出3H-胸腺嘧啶脫氧核苷或3H-脯氨酸摻入的相應降低。在激動劑或拮抗劑試驗中，蛋白質抽提物對細胞增殖和膠原產生沒有顯示出任何效應，無論其濃度如何。因此，明顯地，13-14KDa蛋白質混合物的作用是對色素細胞特異的，而且該混合物中的黑素生成抑制劑也不僅僅是一種一般代謝抑制劑。
實施例8
實施例4所述的研究表明，起黑素生成抑制作用的13-14KDa蛋白質混合物實際上包含四種不同的蛋白質，因此，進行了試驗以確定其中哪種蛋白質與觀察到的效應有關。用如實施例4的DEAE-纖維素離子交換柱將移植後皮膚上清液分級分離。收集合併與第一個峰相應的級分(見實施例4)，再將此混合物透析、凍幹。然後進行雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(如實施例4所述)，以將此蛋白質混合物分成前面發現的四種不同的蛋白質。用考馬斯亮蘭將凝膠染色，分別從凝膠中切下四種蛋白質「斑點」。然後將四種蛋白質的每一種從凝膠中電洗脫下來(如前所述)並濃縮。再測定所得溶液的蛋白質含量。這樣，獲得四種純化的蛋白質(相互分離的)。
用前述的步驟研究Cloudman黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性和3-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入。這些試驗中採用蛋白質濃度大約1.0微克/毫升的每一種純化蛋白質，作為對照，實驗中包含了未處理的和α-MSH(10-7M)處理的細胞培養物。用與第三種蛋白質「斑點」對應的純化蛋白質處理的培養物，其酪氨酸酶活性大約下降40%。但是，用其餘三種蛋白質處理的培養物，未顯示酪氨酸酶活性的明顯下降。類似地，當對應於第三「斑點」的純化蛋白質存在時，細胞增殖受到顯著的抑制(約45%)，但其他蛋白質對細胞增殖沒有明顯影響。
根據這些試驗，顯然從第三種凝膠「斑點」電洗脫下來的蛋白質是與前面觀察到的黑素生成抑制作用和細胞增殖抑制作用有關的。前面的雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析表明，這種對應於第三「斑點」的黑素生成抑制因子(「MI」)蛋白質，其分子量約為14，000，等電點大約在7.2至7.5之間。
實施例9為了測定該13-14KDa蛋白質混合物中所含四種蛋白質的胺基酸順序，再對按前述方法分級分離的移植後皮膚抽提物進行雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析。將蛋白質印跡到ImmobilonPSQ(一種聚二氟乙烯膜)，用醯胺黑染色顯示。然後從印跡處切下四種「斑點」，與碘乙醯胺反應，再進行順序測定。蛋白質順序測定在AppliedBiosystems475A蛋白測序儀上按脈衝液相化學法進行(Speicher，D.W.，(1989)，TechniquesinProteinChemistry，(T.E.HugliEd.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.24-35)。
第一「斑點」部分N-端胺基酸順序分析表明，該蛋白質與小鼠transthyretin或前清蛋白相同。Transthyretin是一種血清蛋白質，分子量55KDa，但是它是由四種相同的亞基組成，亞基分子量約為14KDa。第二「斑點」順序分析表明，該蛋白質與血紅蛋白一條鏈有很高的同源性。第四「斑點」的順序與已知蛋白質只有很低或沒有同源性。
由於完整的MI蛋白質(第三「斑點」)的N-端胺基酸順序分析表明，該蛋白質N-端是封閉的，因此決定用蛋白酶將其消化成片段，然後對產生的肽段測序。將四個ImmobilonPSQ印跡點MI蛋白質切下，還原，用碘乙醯胺烷化，再用內切蛋白酶LysC消化(Stone，K.L.，M.B.LoPresti，J.M.Crawfrod，R.DeAngelisandK.R.Willims，(1989)，APracticalGuidetoProteinandPeptidePurificationforMicrosequencing，，(P.T.Matsudaira，Ed.)，AcademicPress，SanDiego，CA，pp.31047)。
MI蛋白質蛋白酶解後，對其中第二峰的順序測定更為成功，並得到下列胺基酸順序
SEQIDNO1ThrGlnThrValXaaAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHis151015GlnGluXaaXaaGlyLys20「Xaa」表示的位點是指尚未確證或根本就沒能測定的位點。將第5位暫定為Cys，第19位暫定為Asp。有趣的是，該蛋白質片段C-端12個胺基酸中有(個與小鼠脂肪酸結合蛋白(mFABP)的一個區域相對應，但是該片段N-端沒有發現任何明顯的同源性。
得自MI蛋白質的第三峰的順序測定如下SEQIDNO2LeuValValGluCysValMetAsnAsnValThrCysThrArgXaa151015TyrGluLys此外，將第15位暫定為Ile。此例中，該片段18個胺基酸的13個與mFABP一區域對應，在第12，15和18位胺基酸處僅有保守的改變。
在此序列測定的基礎上，顯然MI蛋白質與mFABP高度相關，雖然肯定不是相同的。小鼠脂肪酸結合蛋白屬於一個蛋白質家族，其中包括脂肪酸結合蛋白、視黃酸結合蛋白、脂肪細胞分化蛋白質和髓磷脂P2蛋白，而且，根據兩段已測定的順序，預計MI蛋白質也是該家族的一員。這樣，由於該家族中大部分蛋白質包含大約131個胺基酸，進一步可以預計MI蛋白質包含大約131個胺基酸。MI蛋白質與已知的蛋白質如mFABP有密切的同源性，這一事實也強有力地表明，如申請人的研究所示，它是一種生物學有關的分子。
實施例10為了測定MI蛋白質的全順序，製備了針對MI蛋白質的合適的寡核苷酸探針，如下所列5′-CAGCCCGCCCGCACC-3′5′-AAAAAAGAAAGAAACAGTATG-3′利用這些寡核苷酸對人皮膚RNA進行多聚酶鏈反應(PCR)，其中人皮膚是按前述方法移植到裸鼠後所得。PCR反應導致產生相當數量的編碼MI蛋白質的單一大小的DNA。然後將分離的DNA克隆到順序測定載體並按已知方法測定其順序。核酸序列如下所示(相應的MI蛋白質胺基酸順序與列於對應的密碼子之下，數目表示MI蛋白質中胺基酸的位置)SEQIDNO3ATGGCCACAGTTCAGCAGCTGGAAGGAAGATGGCGCCTGGTGMetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510GACAGCAAAGGCTTTGATGAATACATGAAGGAGCTAGGAGTGAspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025GGAATAGCTTTGCGAAAAATGGGCGCAATGGCCAAGCCAGATGlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540TGTATCATCACTTGTGATGGTAAAAACCTCACCATAAAAACTCysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055
GAGAGCACTTTGAAAACAACACAGTTTTCTTGTACCCTGGGAGluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GAGAAGTTTGAAGAAACCACAGCTGATGGCAGAAAAACTCAGGluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ACTGTCTGCAACTTTACAGATGGTGCATTGGTTCAGCATCAGThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GAGTGGGATGGGAAGGAAAGCACAATAACAAGAAAATTGAAAGluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110GATGGGAAATTAGTGGTGGAGTGTGTCATGAACAATGTCACCAspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125TGTACTCGGATCTATGAAAAAGTAGAATAACysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為簡明起見,整個MI蛋白質順序如下所示:
SEQIDNO:4:
MetAlaThrValGlnGlnLeuGluGlyArgTrpArgLeuVal1510AspSerLysGlyPheAspGluTyrMetLysGluLeuGlyVal152025
GlyIleAlaLeuArgLysMetGlyAlaMetAlaLysProAsp303540CysIleIleThrCysAspGlyLysAsnLeuThrIleLysThr455055GluSerThrLeuLysThrThrGlnPheSerCysThrLeuGLY606570GluLysPheGluGluThrThrAlaAspGlyArgLysThrGln7580ThrValCysAsnPheThrAspGlyAlaLeuValGlnHisGln859095GluTrpAspGlyLysGluSerThrIleThrArgLysLeuLys100105110AspGlyLysLeuValValGluCysValMetAsnAsnValThr115120125CysThrArgIleTyrGluLysValGlu130135為了證明SEQ ID NO4確實是MI蛋白質，按熟知的方法從SEQ ID NO4重組表達出一種蛋白質。然後通過檢測3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入速率(與實施列6方式類似)，測定該重組表達蛋白質對黑素細胞增殖的效應。結果觀察到顯著的對黑素細胞增殖的劑量依賴性抑制，這清楚表明，從SEQ ID NO4重組表達的蛋白質的確是MI蛋白質。因此，MI蛋白質的結構便如SEQ ID NO4所示。如熟悉本領域人員所能認識的，SEQ ID NO3也可用於熟知的方法，來證明根據申請人的的合成方法製備的任何產物的確是MI蛋白質。
實施例11為了檢測MI蛋白質對色素過多沉著的移植皮膚的體內影響，將包含MI的完整13-14KDa蛋白質混合物注射到按前述方法預先移植到裸鼠上的人皮膚中。在這些試驗中用了七隻小鼠，而且試驗前這些小鼠已經支持人皮膚移植物10至12個月。這些試驗的異種移植物中存在不同程度的色素過多沉著。
將用於試驗的小鼠進一步分成一個實驗組(5隻小鼠)和一個對照組(其餘2隻小鼠)。對照組小鼠不給予任何注射。實驗組中，按每周間隔，在人皮膚移植物左側進行皮下注射，共注射5周。每次注射劑量為50微升溶液，其中包含2微克蛋白質混合物，其餘為生理鹽水。作為一種內部對照，按同樣時間間隔在移植物右側注射50微升生理鹽水。在第一輪5次注射一周之後，重複進行整個試驗方案。但是，第二輪5次注射時，注射部位改變了。在此期間，蛋白質混合物注射到移植物背部區域，而生理鹽水(對照)注射到移植物腹部區域。
在一系列注射之前，第一輪5次注射之後一周(但在第二輪注射之前)以及最後注射之後分別對皮膚移植物進行了活組織檢查。活檢部位取自注射蛋白質級分和生理鹽水的位點附近。也對對照組進行了活組織檢查。
對每一活檢中多巴陽性黑素細胞進行了計數，試驗的總結果如下列於表1。多巴陽性黑素細胞數目是黑素細胞中酪氨酸酶活性的一種直接量度。示於表1的結果表明，含MI蛋白質的蛋白質混合物能降低酪氨酸酶活性。多巴陽性黑素細胞數目的減少從9.0%到32.3%。對照組或實驗組注射生理鹽水部位的活檢結果，表明沒有任何明顯的減少。
表1多巴陽性黑素細胞數目的減少(%)小鼠蛋白質混合物注射部位鹽水注射部位A32.32.5B29.01.3C24.60D9.00E10.12.0F-對照00G-對照00目視檢查小鼠表明，經過僅兩次蛋白質混合物注射之後，色素過多沉著明顯減少，特別是注射部位。在對照組或實驗組注射生理鹽水部位，沒有觀察到這種減少。
將幾個活檢切片還用蘇木精和曙紅染色，進行顯微鏡觀察，以檢查由於蛋白質混合物的注射引起的任何形態學變化。實驗組和對照組之間沒有什麼差別，兩組都沒有表現出任何表皮或真皮損傷或毒性的跡象。由此，MI蛋白質能夠減少色素過多沉著而不引起不希望產生的副作用。
實施例12為了檢測MI蛋白質在預防或延緩移植後通常立刻發生的皮膚移植物色素過多沉著中的作用，將實施例11中使用的蛋白質混合物也注射到剛剛支持人皮膚移植物2周的裸鼠上。採用實施例11中的方法，不過只進行第一輪5次注射。將蛋白質混合物注射到皮膚移植物背部，生理鹽水注射到腹部。在將要進行第一次注射前，對多巴陽性黑素細胞進行起始計數。
目視檢查小鼠揭示出在蛋白質混合物注射部位色素過多沉著有些減少。更為重要的是，如表2所示，從蛋白質混合物注射部位取樣活檢表明，多巴陽性黑素細胞數目又一次顯著減少。如所預料，作為對照，從對照組和實驗組生理鹽水注射部位取樣活檢，表明多巴陽性黑素細胞數目增加。增加範圍從190%到300%，而含MI的蛋白質混合物引起的減少範圍從8.3%到31.6%。注射蛋白質混合物的小鼠也無任何毒性跡象。這一結果證實，MI蛋白質能防止或逆轉色素過多沉著，很可能是通過改變酪氨酸酶活性，而不是通過影響細胞生活能力。
表2多巴陽性黑素細胞數目的減少(%)小鼠蛋白質混合物注射部位鹽水注射部位H-31.6+230I-17.5+300J-11.2+210K-27.5+190L-8.3+200M-對照+200+240N-對照+200+228實施例13另外也檢查了MI蛋白質對色素正常的小鼠(C57BL/6)的體內效應。這種特殊類型的小經證明對於研究色素沉著和毛髮生長是有用的，因為這種小鼠軀幹皮膚色素沉著起源於毛囊中而不是表皮中的黑素細胞。一旦將這些毛囊除去，下面的皮膚就由於黑素細胞的減少而變得色素減少。雖然毛囊除去後馬上又會長出來，但皮膚的色素沉著再發生要5到6天之後。這樣，這種小鼠是一種良好模型，用於檢查MI蛋白質在延緩色素重新沉著中的作用。
使用5隻C57BL/6小鼠，從背部左右兩邊小塊區域除去毛囊。將實施例11中所用的蛋白質混合物(體積50微升，含2微克蛋白質混合物)皮下注射到每隻小鼠左背部除去毛囊區域。作為對照，將獲自正常人皮膚(在任何移植之前)的電洗脫13至14KDa蛋白質級分注射到每隻小鼠右背部區域。該正常人皮膚蛋白質級分按前述相同方法獲得。每天注射1次，共5天。每天照相以監測皮膚顏色變化，並從每隻小鼠左右背部區域取樣活檢。
注射含MI蛋白質的蛋白質混合物的左背部區域，在僅注射2次之後，就表現出皮膚顏色減淡，而右背部區域未觀察到皮膚顏色明顯減淡。此外，與右邊(對照)相比，左背部區域新毛囊的出現也延遲了。
對左右背部區域兩邊取樣進行活檢，其蘇木精和曙紅染色圖象看來是正常的，兩者間也沒觀察到任何形態學差異。另外也沒有任何毒性跡象，但是注射了含MI蛋白質的蛋白質混合物的左背部區域的活檢結果顯示出毛囊中黑色素染色減少(如多巴染色所示)。B.藥用和化妝品組合物及方法如本文中所用，「局部施用」指直接敷於或塗布於皮膚外部;「皮膚注射」指通過皮下注射針將物質引入皮下或皮膚中;「包含」、「包括」(comprising)指可以加入不影響最終結果的其它步驟和其它成分。這最後一個術語就包含了「由…組成」和「基本由…組成」。
本發明還涉及到一種組合物，包含a)一種抑制色素細胞中黑素生成的足夠純的蛋白質，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質分子量約為14，000，等電點大約在7.2到7.5之間，以及具有SEQIDNO4的胺基酸順序;和b)一種化妝用或藥用可接受的載體。在本發明的一項實施方案中，該載體是一種可注射的載體。在本發明的另一項實施方案中，該載體是一種局部應用的載體。
本發明的組合物包括固體的，半固體的，或液體的在化妝品方面和/或生理學上可接受的載體，以使MI蛋白質，或其活性片段、衍生物或類似物能夠以合適的濃度釋放到所需靶部位。載體本身可以是惰性的或者可以具有生理的或藥用的價值。載體的性質將由所選擇的該組合物的用法所決定。安全有效的載體的量比較好的是佔組合物的約50%到約99.9999%，更好是約90%到約99.9%。這些載體配方的變化將會導致產生大量不同的產品，它們都在本發明的範圍之內。MI蛋白質或其活性片段、組合物的用法可以從體內給藥法如注射到局部外用法。
MI蛋白質或其活性片段較好的給藥法是通過皮膚注射。這種給藥法的輔助載體較好的是包括水或鹽溶液，理想的是等滲鹽溶液。
MI蛋白質或其活性片段更好的用法是局部施用。本發明的局部藥用組合物可以製成大量不同類型的產品。包括(但不局部於)洗劑、冷霜類、防曬油類、凝膠、粘劑、噴霧劑、軟膏、糊劑、摩絲和化妝品。這些產品種類可以包括幾種類型的載體系統，包括(但不局限於)溶液、乳劑、凝膠和固體。
本發明的局部藥用組合物還包含一種局部藥用可接受的潤膚劑，含量從約2%到約50%。如本文中所用，「潤膚劑」指用於預防或減輕皮膚乾燥及保護皮膚的物質。已知大量合適的潤膚劑可以用於此處。Sagarin，Cosmetics，ScienceandTechnology，2ndEdition，Vol.1，pp32-43(1972)(結合於此作為參考)包含大量合適物質的例子。特別有用的具有護膚作用的潤膚劑為甘油、己三醇、丁三醇、乳酸及其鹽、尿素、吡咯烷酮羧酸及其鹽、胺基酸類、胍、雙甘油和三甘油。
本發明進一步涉及一種抑制哺乳動物皮膚和/或毛髮中黑素生成的方法。該方法包括用安全有效量的MI蛋白質或其活性片段、衍生物或類似物處理皮膚和/或毛髮。根據受試者已經存在的色素沉著和/或黑素生成水平以及所希望的黑素生成抑制程度，所用的MI蛋白質或其活性片段的劑量和處理頻度將有廣泛變動。
較好的處理皮膚和/或毛髮的方法是經皮注射安全有效劑量的MI蛋白質或其活性片段來抑制哺乳動物皮膚和/或毛髮中的黑素生成。MI蛋白質或其活性片段注射所用的載體較好的是包括水或鹽溶液。根據個人需要，皮膚注射的MI蛋白質或其活性片段的量及注射頻度可有很大變動。作為皮膚注射處理的一個例子，建議將包含MI蛋白質或其活性片段的適於皮膚注射的組合物按每天一次到每六個月一次進行皮膚注射，較好的是從每周三次到第月一次，更好是每周一次到每月兩次。用於皮膚注射的組合物可包含約0.0001%到約10%，較好的是約0.001%到約5%，更好的是0.01%到1%的MI蛋白質。注射期可以為約一個月到約十年，較好的是約三個月到約兩年，更好是的約六個月到約一年，從而對哺乳動物皮膚和/或毛髮黑素生成產生抑制作用。
更好的一種處理皮膚和/或毛髮的方法是通過局部施用安全有效量的MI蛋白質或其活性片段來抑制哺乳動物皮膚和/或毛髮中的黑素生成。根據個人需要，MI蛋白質或其活性片段的量以及局部施用於皮膚和/或毛髮的頻度可變化很大，但作為一個例子，建議局部施用可從約每周一次到約每天十次，較好是約每周兩次到約每天四次，更好是每周三次到每天兩次，最好是約每天一次。局部施用組合物可包括約0.001到約20%、較好為約0.01%到約10%、更好為約0.1%到約5%的MI蛋白質或其活性片段、衍生物或類似物。局部施用期較好是從約一個月到約十年，更好為約三個月到約兩年、再好些為約六個月到約一年，從而對哺乳動物皮膚和/或毛髮中的黑素生成產生抑制作用。
下面的實施例進一步描述和論證本發明範圍內某些較好的具體實施方案。給予實施例僅為了說明起見，而不能認為是對本發明的限制，因為它們的很多變化是可能的，而不會違背本發明的精神實質和範圍。這些實施例僅僅用來證實可以怎樣使用本發明的黑素生成抑制劑。
實施例14利用常規混合技術，將下列組分合併製成一種水包油乳劑。
組分佔組合物的重量百分比去離子水足夠量甘油3羥苯甲酸甲酯0.2MI蛋白質0.1Steareth20(Brij78R)1單硬脂酸甘油酯和PEG1000.5(Arlacel165R)Carbopol940(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)99%三乙醇胺0.2十六烷醇1.0十八烷醇1.0羥苯甲酸丙酯0.1Diisiopropyldimerate2.0C12-C15醇苯甲酸酯 6.0咪唑烷醇尿素0.3該組合物局部施用抑制皮膚和/或毛髮中的黑素生成是有用的。使用組合物的量為足以使皮膚和/或毛囊沉積MI蛋白質約0.01毫克/平方釐米的量。該組合物每天施用一次，可終身使用。
實施例15利用常規混合技術合併下列組分製成一種透明凝膠。
組分佔組合物的重量百分比去離子水足夠量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.5Cleveland，OH)EDTA-2Na0.02SEQIDNO10.599%三乙醇胺0.5丙二醇3.0羥苯甲酸甲酯0.2該組合物局施用抑制皮膚和/或毛髮中的黑素生成是有用的。使用組合物的量為足以使皮膚和/或毛囊中沉積的MI蛋白質活性片段約0.01毫克/平方釐米的量。該組合物每天施用三次，使用六個月。
實施例16利用常規混和方法合併下列組分製成一種水包油聚合物乳劑。
組分佔組合物的重量百分比去離子水足夠量Carbopol980(B.F.Goodrich，0.2Cleveland，OH)PemulenTR-2(B.F.Goodrich，0.15Cleveland，OH)甘油3.0SEQIDNO20.7599%三乙醇胺0.35棕櫚酸鯨蠟酯2.0二氧代硬脂醯三甲基矽烷和1.0十八烷醇角鯊烷6.0羥苯甲酸丙酯0.1
羥苯甲酸甲酯0.2咪唑烷醇尿素0.3該組合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量為足以使皮膚和/或毛囊沉積的MI蛋白質活性片段達0.1毫克/平方釐米的量。該組合物每周施用一次，使用一年。
實施例17利用常規混合技術合併下列組分製成一種水包油微乳狀液。
組分佔組合物的重量百分比去離子水足夠量MI蛋白質1.0PEG4脫水山梨醇單月桂酸酯22.5PEG5脫水山梨醇單油酸酯2.5Cetearyl，octanoate25.0DMDM乙內醯脲和3-碘-2-0.2丙炔基丁基氨基甲酸酯(glydantplus)該組合物局部施用抑制黑素生成是有用的。用量為足以使皮膚和/或毛囊中沉積的MI蛋白質達0.4毫克/平方釐米的量。該組合物每周施用三次，使用五年。
可以理解，能進行修改而不違背本發明的精神實質。這樣，可以理解申請人的發明不僅包括完整MI蛋白質及其使用和製備的方法，而且包括MI蛋白質的活性片段。同樣，本領域技術人員能夠製備MI蛋白質的衍生物和類似物，例如對MI順序中一個或多個胺基酸進行保守改變。此外，非肽類模擬物也可以按照MI蛋白質的活性片段而模仿出來，這樣，這些模擬物並不違背本發明的精神實質。相應地，本發明的範圍應該按下列權利要求書考慮，而且可以理解，它並不局限於說明書中所顯示和描述的。
權利要求
1.一種產生抑制色素細胞黑素生成的蛋白質的方法，其特徵在於包括下列步驟(a)將哺乳動物皮膚移植到活的宿主上；(b)使所述哺乳動物皮膚在所述活的宿主上保持預定的一段時間；(c)從所述宿主移去所述哺乳動物皮膚；和(d)從所述皮膚中提取所述蛋白質。
2.按照權利要求1的方法，其特徵還在於，所述宿主是裸鼠。
3.按照權利要求2的方法，其特徵還在於，哺乳動物皮膚是人皮膚。
4.按照權利要求3的方法，其特徵還在於，使所述人皮膚在所述宿主上至少保持兩周。
5.按照權利要求4的方法，其特徵在於，所述蛋白質的所述提取包括下列步驟(a)用生理鹽水從所述皮膚提取一種皮膚蛋白質抽提物;(b)通過離子交換色譜法將所述皮膚蛋白質分級分離成至少兩種溶液，其中至少一種所述溶液包括所述蛋白質;(c)將包含所述蛋白質的一種所述溶液進行雙向SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，以在聚丙烯醯胺凝膠上將所述蛋白質分離成一個斑點;和(d)從所述斑點電洗脫所述蛋白質。
6.按照權利要求5的方法，其特徵還在於，所述蛋白質具有下列胺基酸順序SEQIDNO4。
7.一種抑制色素細胞黑素生成的足夠純化的蛋白質，其特徵在於所述蛋白質具有下列胺基酸順序SEQIDNO4，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物。
8.一種抑制色素細胞黑素生成的足夠純化的蛋白質，其特徵在於所述蛋白質具有下列胺基酸順序SEQIDNO4。
9.一種控制色素細胞黑素生成的方法，其特徵在於包括下列步驟(a)提供有效量的黑素生成抑制劑，它包括黑素生成抑制因子蛋白質，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質具有下列胺基酸順序SEQIDNO4;(b)將所述黑素生成抑制劑與合適的載體合併;和(c)將所述合併的黑素生成抑制劑施用於要控制的色素細胞。
10.按照權利要求9的方法，其特徵還在於，所述施用步驟是通過注射進行的。
11.按照權利要求9的方法，其特徵還在於，所述施用步驟是通過局部施用而進行的。
12.按照權利村注11的方法，其特徵還在於所述色素細胞是皮膚色素細胞。
13.根據權利要求11的方法，其特徵還在於，所述色素細胞是毛髮色素細胞。
14.根據權利要求10的方法，其特徵還在於，所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質。
15.根據權利要求11的方法，其特徵還在於，所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質。
16.一種選擇性消滅黑素瘤細胞的方法，其特徵在於，包括下列步驟(a)提供有效量的黑素生成抑制劑，它包括黑素生成抑制因子蛋白質，或其活性黑素生成抑制片段、衍生物或類似物，所述蛋白質具有下列胺基酸順序SEQIDNO4。(b)將所述黑素生成抑制劑與合適的載體合併;和(c)將所述合併的黑素生成抑制劑施用於要消滅的黑素瘤細胞。
17.按照權利要求16的方法，其特徵還在於所述黑素生成抑制劑是所述黑素生成抑制因子蛋白質。
18.按照權利要求17的方法，其特徵還在於，所述施用步驟是通過注射進行的。
19.按照權利要求17的方法，其特徵還在於，所述施用步驟是通過局部施用進行的。
全文摘要
一種純的天然黑素生成抑制因子蛋白質，能抑制色素細胞黑素生成，胺基酸順序為SEQIDNO:4。一種產生黑素生成抑制因子蛋白質的方法，包括將哺乳動物皮膚移植於活宿主，保持預定時間後移去此皮膚，並從中提取該蛋白質。控制色素細胞黑素生成或選擇性消滅黑素瘤細胞的方法，包括將有效量黑素生成抑制因子蛋白質或其活性片段、衍生物或類似物與合適載體混合，將此混合物施用於色素細胞或黑素瘤細胞。
文檔編號C07K14/47GK1092294SQ9311483
公開日1994年9月21日 申請日期1993年11月24日 優先權日1992年11月24日
發明者J·J·諾德倫德, J·Z·法魯奎 申請人:辛辛納提大學