可可茶提取物用於製備預防及改善肥胖及其臨床症狀的藥物及食品的應用的製作方法

2023-07-11 04:54:06 1

專利名稱：可可茶提取物用於製備預防及改善肥胖及其臨床症狀的藥物及食品的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及天然植物提取及應用領域，尤其是涉及可可茶提取物的應用。
背景技術：
近年來隨著物質生活的豐富，人們的脂肪消費水平也在逐年上升。這已被認為是導致肥胖、高血脂症、動脈硬化及糖尿病等生活習慣病增加的一個原因。肥胖儘管受遺傳因素、飲食因素、生活習慣因素、精神因素、中樞性因素、代謝性因素、運動不足等多種因素的影響，但對多數肥胖者來講還是由於營養攝取過度，致使過多的能量蓄積在體內造成的一種代謝不平衡狀態。根據流行病學調查證明，與正常人相比，多數肥胖者的體內組織脂肪蓄積異常。高血脂症已被證明是誘發糖尿病、動脈硬化及高血壓等生活習慣病的主要原因之一。因此，肥胖早已不是富裕的象徵。由肥胖導致的各種生活習慣病已成為人們十分關注的社會問題。已知食品成分中脂肪含有的熱量最高，過量攝取脂肪是導致肥胖的直接原因。脂肪的吸收需要通過胰臟分泌的脂肪酶的作用，分解成游離脂肪酸後經小腸吸收，在體內再合成中性脂肪被蓄積和利用。中性脂肪在肝臟中過量蓄積會誘發脂肪肝。中性脂肪酸在肝臟中轉換成超低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)進入血液，血液中過量的VLDL又稱高脂血症。高脂血症不僅是動脈硬化的主要病因，還會引起血栓症，又是誘發腦梗塞、心肌梗塞等循環系統疾患的原因之一。對於預防動脈硬化，一般認為通過限制脂肪吸收或促進體內脂肪代謝來減少血液脂質，特別是減少VLDL是非常有效的方法。因此可以說，過量攝取脂肪引起的肥胖是多種生活習慣病的主要成因並不過分。
近年來，人們已充分認識到肥胖可以引起多種生活習慣病。減肥也早已成為一個不陌生的話題。肥胖儘管受遺傳、飲食、生活習慣、運動不足等多種因素的影響，但多數肥胖症者還是起因於攝取過度或代謝的不平衡。人們發現運動可以減肥，但持續運動並非易事。因此，通過促進脂肪代謝或減少脂肪吸收達到減肥無疑是最基本的方法。
迄今為止，減肥劑的開發主要是基於對脂肪或糖在吸收、代謝等不同環節的調控。當然，抑制脂肪酶的活性可以阻止脂肪分解，減少脂肪吸收，無疑可以達到預防和治療肥胖及高脂血症的作用。現在，常用的減肥劑阿卡波糖(acarbose)是Bayer Pharma公司研製的α-葡萄糖苷酶抑制劑(alpha-glucosidaseinhibitors)，其減肥機制主要通過抑制糖的吸收。阿卡波糖同時也作為糖尿病治療劑用於臨床。此外，還有氯苯咪吲哚(mazindol)、苯丁胺(phentermine)等交感神經系統興奮劑(adrenergic agent)和dezfenfluramine、fluoxetine等5-羥色胺興奮劑通過抑制食慾來減肥。但這些減肥劑一般需要在醫生的指導下使用，而且多數藥品具有一定的副作用。在現代社會，防治肥胖往往並非通過藥物治療，而更多的是通過控制日常飲食、減少脂肪吸收，或通過運動促進脂肪燃燒。但是這些方法也很難長期堅持實行。因此，具有減肥作用或者對肥胖有預防效果的健康食品對於減肥消費者來講無疑是極為理想的，同時也是現在社會受人關注和急需解決的課題之一。
茶的故鄉在中國南部，其根據之一是中國南部自然分布生長著茶的多種變種及野生種。可可茶(Camellia ptilophylla Chang)是一種野生茶，在植物分類學上是傳統茶葉(Camellia sinensis)的近緣種植物，被人們發現後又稱為新種茶。根據近年的調查結果，野生可可茶主要自然分布在廣東省龍門地區的狹窄範圍，長期以來被當地人們通過殺青、半發酵、發酵等不同方法製成綠茶、烏龍茶及紅茶等茶葉日常飲用。可可茶是一種飲用安全的日常飲料，長期以來被當地人們用作健康茶飲用，迄今為止沒有發現任何副作用及不安全的現象。與傳統茶葉中的甲基黃嘌呤(methyxanthine)類物質代謝途徑不同，可可茶中不含有咖啡因(caffeine)，而含有可可豆鹼(theobromine)(為巧克力的原料-可可豆cacao的主要活性成分)，因此被稱為可可茶(cocoa tea)。與咖啡因的化學結構不同，可可豆鹼在咖啡因化學結構的1位上沒有甲基取代，因而表現出與咖啡因不同的生理作用，不僅不顯示咖啡因特有的中樞興奮作用，相反顯示出鎮靜等功能。因此，可可茶又被稱作睡前可以飲用的休息茶，適用於老年、孕婦、兒童、胃腸功能低下或心臟不健康等人的飲用。
近年來，人們非常關心天然物質生理活性的研究，對茶類所具有生物功能更是特別關注。茶和咖啡、可可被並稱為世界三大嗜好飲料，為世界絕大多數人所喜愛。人類飲茶已有數千年的歷史。茶葉對健康的種種調節功能自古以來早以為人們所知，例如茶葉的抗氧化作用(antioxidant)、抗菌作用、對血中膽固醇的調節作用等更是令人注目。傳統茶葉的提取物及所含主要活性成分多酚類(polyphenols)物質對糖的吸收抑制作用等已有報導。儘管可可茶是傳統茶葉的近緣種植物，但對於可可茶的生物活性及其中主要活性成分對脂肪吸收及脂肪酶的抑制活性尚無任何應用方面的探討。

發明內容
本發明的發明目的在於提供以可可茶(Camellia ptilophylla Chang)提取物及可可茶有效成分為原料，製備一種安全性高、無副作用的脂肪酶抑制藥物，以及通過抑制脂肪酶活性用於減少、改善或抑制肥胖、高血脂症、血脂代謝異常及上述疾患引起的各種臨床不良症狀的藥物，並可以預防因肥胖引起的多種生活習慣病的藥物的用途。所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學上可接受的載體。
本發明的另一發明目的在於提供以可可茶提取物及可可茶有效成分為原料，製備用於預防、改善肥胖、高血脂及血脂代謝異常，用於減肥、降低血脂，無副作用、安全性高的健康食品、食品及食品添加劑的用途。
本發明所述的可可茶提取物是採用熱水或水與甲醇、乙醇等低級醇類、丙酮等極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進行提取的。
因為可可茶中的生物鹼(alkaloid)及兒茶酚類(catechins)都屬於小分子化合物，一般用水提取即可，也可用不同濃度的低級醇類、丙酮等極性溶劑或任意混合溶劑來提取。在提取時，隨著醇的添加，可可茶中活性成分的回收率會有所增加。儘管用水提取效果不如用醇添加提取，但隨著水溫增加，以及提取時間的延長，也可以達到與醇提取法相當的結果。因此，對可可茶中活性成分的提取而言，上述提取方法及其任意組合都可得到本發明所述的提取物。
鑑於可可茶提取物是以藥劑或飲料作為最終產品開發，故從安全性角度考慮提取溶劑儘量選擇乙醇為宜。提取時可可茶與溶劑的比率沒有特定限制，但一般可可茶與溶劑的比例以5∶1～50範圍為宜。本發明對提取溫度沒有特定限制，從室溫到溶劑沸點範圍都可適用。當然室溫、常壓及在溶劑沸點範圍內提取最為理想。提取時間從10秒到24小時範圍都可以。在提取可可茶提取物時，根據需要也可以在溶劑中添加碳酸氫鈉、抗壞血酸鈉鹽(sodium ascorbate)等物質。這些提取方法不會影響可可茶本來具有的生物活性。
本發明提供的可可茶提取物固形劑使用量一般在0.1％至40％(W/W)，因為通常飲料添加濃度一般在0.1％至40％(W/W)範圍較為適宜。在這個濃度範圍內，可可茶提取物適於直接服用，容易被消費者接受。當然，作為添加物的可可茶提取物隨著加入量的增大，可能會出現苦澀感覺。其解決辦法可以根據市場需要及消費者的心理要求改換劑型，例如使用片劑、顆粒劑、膠囊劑等劑型。低濃度可可茶提取物溶液可以作為日常飲料提供給消費者。
本發明提供的可可茶及可可茶活性成分，可以用於各種口服劑型投放市場，提供以預防、改善或治療肥胖、高血脂症、動脈硬化症、血栓症、血脂代謝異常，及因上述疾患引起的各種臨床症狀為目的的醫藥品、健康食品、食品或食品添加劑。當然，可可茶提取物也可以與常用的賦形劑等醫藥用載體結合做成製劑。必要時，還可以加入一些防腐劑、抗氧化劑、色素、甜味劑等添加物用於各種製劑。
比較適宜的可可茶賦形劑，一般考慮有乳糖、白糖、D-甘露醇、澱粉、結晶纖維素等。潤滑劑一般應採用硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉等。溶劑通常使用精製水、乙醇、丙二醇等。防腐劑一般採用氯丁醇、苄醇、二羥基乙酸等。抗氧化劑通常以亞硫酸鹽、抗壞血酸等比較適宜。
本發明提供的可可茶提取物，可以其原型、提取物或粉末添加到製品中用於口服。可可茶提取物也可與其它飲料原料結合製成一定的飲料製品，如可可茶飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、運動飲料、豆乳等。可可茶提取物食品還可以考慮製成餅乾、巧克力類、糖果類、口香糖類、快餐點心類、果凍點心類、麵包、豆腐、酸奶酪等日常食品。
本發明提供的可可茶提取物及其所含活性成分可以作為醫藥品、健康食品、食品或食品添加劑，用於預防、改善或治療肥胖、高血脂症、動脈硬化症、血栓症、血脂代謝異常以及由之引起的各種臨床症狀。其在日常生活中的應用已經通過發明人的實驗予以證明。該可可茶提取物對高血脂症的預防、改善作用，包括降低空腹時的血脂含量、抑制進食後血脂含量的急劇上升以及對脂肪負荷的改善作用。其對血脂值的改善效果可以通過徹夜禁食後的血脂值測定得到確認，也可以通過對進食後血脂值的測定以及脂肪負荷試驗得以確認。本發明提供的可可茶提取物用量，可以根據使用者的相對健康狀態、年齡、性別及體重等條件適當選擇。成人平均體重以60公斤計算，一天口服可可茶提取物一般可以考慮在3g至10g範圍內，可以分次服用。當然10g以上也不存在副作用等問題。
本發明所述的可可茶提取物含有以下活性成分gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)，以及kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside(黃酮苷A)與kaempferol 3-rutinoside(黃酮苷B)。
每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg，黃酮苷A的含量至少為0.10mg，黃酮苷B的含量至少為0.20mg。
發明人首次從可可茶提取物中分離得到三個成分，經核磁共振(NMR)等波譜學方法測定化學結構，確認為以下三種已知化合物1)gallogatechin-gallate(GCG)2)1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)3)gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)上述三種成分在傳統茶葉品種中尚無報導，可能是含量很少或很難檢測出的。
可可茶提取物中還分離得到了A、B兩種黃酮苷類成分。通過鹽酸水解，採用HPLC分析方法(層析條件Shimpak-SPR-Pb柱，7.8mm×250mm，80℃；水用作流動相，流速1ml/min；示差檢測器simadzu RID-10A)檢測水解液中的糖類物質，與標準品對照確認該兩種黃酮苷類成分均含有葡萄糖(R.T.＝7.7m)及鼠李糖(R.T.＝8.8m)。此外，苷元部分檢出為山奈酚(Kaempferol)。質譜分析(m/z)苷A可見740[M+H]+，763[M+Na]+離子峰；苷B可見594[M+H]+以及180(葡萄糖)、164(鼠李糖)碎片。500MHz NMR譜的測定及解析確認該兩種黃酮苷類化合物為已知化合物，即kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside與kaempferol 3-rutinoside(Natural product Letters，14233-238，2000)。發明人將上述兩種結構近似的黃酮苷類化合物區分為黃酮苷A和黃酮苷B。
本發明以5ml/kg豬油(lard oil)脂肪負荷小鼠為實驗動物模型，評價可可茶提取物的降血脂效果。結果證明可可茶提取物對豬油脂肪負荷小鼠表現出有統計學意義的脂肪吸收抑制作用，對大鼠淋巴管脂肪吸收顯示有抑制作用。此外，本發明也確認可可茶提取物及其所含活性成分1，3，4，6-GA-glc、GC-3，5di-GA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside對脂肪酶的活性具有明顯的抑制效果。
通過抑制脂肪酶活性的測定實驗，結果表明可可茶活性成分1，3，4，6-GA-glc及C-3，5-diGA對脂肪酶顯示出很強的抑制活性。GCG及kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside也具有較強的脂肪酶抑制活性，kaempferol 3-rutinoside的作用不顯著，但加大用量也能產生相當於kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside的抑制效果。因此，本發明確認GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside是可可茶中抑制脂肪吸收，降高血脂症及抗肥胖的活性成分。
本發明提供和證明可可茶中含有的下列成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside具有顯著的抑制脂肪酶的活性。胰臟脂肪酶是體內消化系統中主要的消化酶。抑制脂肪酶的活性無疑可以減少攝取的脂肪在小腸內的消化、分解和吸收，從而可以改善高血脂症，降低血中膽固醇的含量，並達到減肥效果。對因上述疾患引起的動脈硬化症、血栓症等各種臨床症狀也有預防及改善作用。另外，可可茶中的有效成分1，3，4，6-GA-glc、及C-3，5-diGA對脂肪酶活性的抑制作用等於或者強於綠茶的有效成分EGEG。
發明人已通過實驗證明本發明所提供的可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside是安全性高、來自天然的一種通過抑制胰臟脂肪酶活性，從而達到抑制脂肪分解、減少脂肪從腸管吸收的抗肥胖劑。特別是攝取前後服用效果更好。可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside也可以有效的改善和抑制中性脂肪肝、脂肪蓄積症、高脂血症、血栓症、動脈硬化症，並可降低血中膽固醇的含量。當然，也還可用於預防、改善及治療由上述疾患引起的各種臨床症狀。可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside可以單獨作為改善肥胖、中性脂肪肝、脂肪蓄積症、高脂血症、血栓症、動脈硬化，降低血中膽固醇含量以及由之發生的併發症，也可配合其它治療藥物使用。由於本發明提供的脂肪吸收抑制物質可可茶是天然來源的物質，民間有長期作為飲料飲用的經驗，且不含有咖啡因等特點，不僅可適用於一般成年人，而且作為一種作用緩和的健康茶也適用於老年人、兒童及體力低下者。因此，可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside可以作為健康食品、食品添加劑、健康茶，供給消費者用於減肥、抗高血脂質症等的應用。儘管GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside是已知化合物，但是這些化合物對脂肪酶的抑制活性是通過本發明所初次證實的。


圖1為可可茶提取物的HPLC分析圖譜。
圖2為脂肪負荷實驗的血漿中性脂肪的測定的結果分析圖，圖中1為對照組，2為給藥可可茶250mg/kg，3為給藥可可茶125mg/只。
圖3為脂肪負荷實驗的血漿游離脂肪酸的測定的結果分析圖，圖中1為對照組，2為給藥可可茶250mg/只，3為給藥可可茶125mg/只。
圖4為胸淋巴管脂肪吸收抑制作用實驗的不同時間內淋巴液中性脂肪量的結果分析圖，圖中1為對照組，2為灌流可可茶100mg/只，3為灌流可可茶200mg/只。
圖5為胸淋巴管脂肪吸收抑制作用實驗的淋巴液中性脂肪積累量的結果分析圖，圖中1為對照組，2為灌流可可茶100mg/只，3為灌流可可茶200mg/只。
具體實施例方式
本發明可以通過以下實施例進行詳細說明，但並不僅僅局限於以下實施例。
實施例一可可茶提取物的製備取可可茶乾燥葉100g，加入90℃熱水2000ml浸提4分鐘。提取液經紗布濾過後，將濾液在1000rpm、5分鐘離心分離，回收上清液冷凍乾燥即成。可可茶葉的上述冷凍乾燥提取物用於本發明的下列實施例。
實施例二可可茶提取物的HPLC分析將上述可可茶提取物配製成1％水溶液後，經Sep-PaktC18 Cartridge(5ml，Waters制)吸附過濾，水洗淨後，用乙腈洗脫分離。隨後，將250mg所得分離組分在Develosil C30-UG-5(20mm×250mm，野村化學制)柱上，在0.05％三氟乙酸(TFA)存在條件下，用5-30％乙腈按線性梯度洗脫方式(5ml/mim，180分鐘，220nm紫外檢測)洗脫分離。回收得到的分離組分，再用YMC-PakODS(20×250mm、YMC制)柱，在0.1％TFA存在下，用20-25％乙腈按線性梯度洗脫方式(6ml/mim、60分鐘，280nm紫外檢測)洗脫精製。結果如圖1所示，從中分離得到與傳統茶葉不同的三個組分。
可可茶提取物的HPLC分析條件。層析柱資生堂capcell pak C18(φ4.6mm×150mm)，流動相A＝0.05％TFA/水；B＝90％CH3CN/0.05％TFA/水。B5→B35％(13分鐘)，B35％→B70％(7分鐘)，B70％(5分鐘)。檢測A280nm峰面積定量。PDA 220～500nm檢測。
從可可茶提取物中分離得到三個成分，經核磁共振(NMR)等波譜學方法測定化學結構，確認為以下三種在傳統茶葉品種中含量很少或很難檢測出的已知化合物gallogatechin-gallate(GCG)、1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)及gallogatechin-3，5-digallate(GC-35diGA)。

左側為EGCG的結構式 右側為gallogatechin-gallate(GCG)的結構式傳統茶主要含有EGCG。
1，3，4，6-tetragalloyl-glucose(1，3，4，6-GA-glc)的結構式 gallogatechin-3，5-digallate(GC-3，5-diGA)的結構式可可茶提取物中分離得到了A、B兩種黃酮苷類成分。通過鹽酸水解，採用HPLC分析方法(層析條件Shimpak-SPR-Pb柱，7.8mm×250mm，80℃；水用作流動相，流速1ml/分鐘；示差檢測器simadzu RID-10A)檢測水解液中的糖類物質，與標準品對照確認該兩種黃酮苷類成分均含有葡萄糖(R.T.＝7.7m)及鼠李糖(R.T.＝8.8m)。此外，苷元部分檢出為山奈酚(Kaempferol)。質譜分析(m/z)苷A可見740[M+H]+，763[M+Na]+離子峰；苷B可見594[M+H]+以及180(葡萄糖)、164(鼠李糖)碎片。500MHz NMR譜的測定及解析確認該兩種黃酮苷類化合物為已知化合物，即kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside與kaempferol 3-rutinoside(Natural productl 黃酮苷A 黃酮苷B(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)(kaempferol 3-rutinoside)實施例一所得到的可可茶提取物中各成分的含量如下Theobromine278.75EGC43.25(+)C 62.75EC 14.50EGCG 37.25GCG199.001，3，4，6-GA-glc 54.75GC-3，5-diGA 32.50Flavonol-A 0.173(kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside)
Flavonol-B0.208(kaempferol 3-rutinoside)由於用水提取、用醇提取、用其他極性溶劑提取，或者混合法提取，每克可可茶提取物中，上述活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量有或多或少的差別，但發明人的不同實驗多次表明，活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc及GC-3，5-diGA的含量至少為40mg、25mg及100mg，黃酮苷A的含量至少為0.10mg，黃酮苷B的含量至少為0.20mg。
實施例三脂肪負荷實驗使用動物為7周齡雄性ICR小鼠，由日本CLEA公司購入。
飼養條件飼養溫度23±1～2℃，溼度55±5％，換氣次數12～15次/小時，照明時間12小時/日(上午7點開燈，下午7點關燈)。
飼育條件固形飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。
經1周飼養後進行實驗。小鼠每組5隻，禁食一夜後，按250mg/kg或125mg/kg劑量口服給藥方式給與可可茶提取物水溶液(10ml/10g)。對照組給與等體積蒸餾水。小鼠在給藥前後1.5小時、3小時及4.5小時分別在乙醚麻醉下由心臟採血，測定血漿中中性脂肪(triacylgycerol；TG)及游離脂肪酸(feeefatty acid；FFA)的濃度。實驗結果以student t-test作統計學處理，結果如圖2和圖3所示。與蒸餾水對照組相比，給與可可茶提取物的小鼠的血漿游離脂肪酸含量在統計學上末能顯示有意義的上升趨勢，但血漿中性脂肪含量則明顯減少，並有統計學意義(*p＜0.05)。結果證明可可茶提取物可以抑制脂肪吸收，並有一定的量效相關性。
實施例四胸淋巴管脂肪吸收抑制作用的測定實驗動物為7周齡雄性SD(IGS)大鼠，由日本CLEA公司購入。
飼養條件室溫23±1～2℃，溼度55±5％，換氣次數12～15次/時，照明時間12小時/天(上午7點開燈，下午7點關燈)。
飼育條件固形飼料CE-2(CLEA公司)，自由飲水。
經1周飼養後進行試驗。將大鼠固定在專用的固定容器中，用戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)麻醉後，經胸淋巴管及胃作導管插入手術。隨後，經胃導管以3ml/hr速度連續灌流139mM glucose-85mM NaCl等滲溶液，同時將139mM glucose-85mM NaCl作為飲料水由大鼠自由攝取。經過一夜灌流，待淋巴管流量穩定後，首先收集2小時的淋巴液。然後將可可茶提取物與天然的甘油三油酸酯(triolein，200mg/只)經胃導管同時灌流，在24小時內定時採取淋巴液，用7070血液自動分析裝置(日立)測定不同時間淋巴液中的中性脂肪(TG)含量。結果如圖4和圖5所示，證明可可茶提取物對脂肪吸收有明顯的抑制作用，並呈劑量依存關係(***p＜0.0001，**p＜0.001，*p＜0.005 by student t-test)。
實施例五抑制脂肪酶活性的測定脂肪酶活性測定原理以4-methylumbelliferyl oleate(4-MU oleate，SigmaM2639)作為基質，經脂肪酶作用切斷上面的油酸鹽(oleate)部分，生成的螢光性物質4-methylumbelliferyl的含量可用以表示脂肪酶的活性。
試驗用的緩衝溶液為含有150mM NaCl及1.36mM CaCl2-2H2O的13mMTris-HCl溶液，基質溶液是用DMSO將4-MU oleate調整為0.1M濃度後，再用上述緩衝溶液稀釋1000倍至最終濃度為50μM即可。
脂肪酶溶液是將脂肪酶(lipase，Sigma L0382，100,000 units)用1ml PBS溶解，再用上述緩衝溶液稀釋至中濃度為100U/ml。
反應終止液為pH4.2的0.1M檸檬酸鈉溶液。
實驗前先將上述溶液預熱至室溫後，再將50μ 14-MU oleate溶液、25μ 10檢體水溶液及25μ lipase溶液加入到96孔板的穴中，室溫下反應30分鐘後，加入100μ 10.1M檸檬酸鈉溶液使反應終止。用螢光光度計(excitationwavelength 355nm、emission wavelength 460nm)測定反應生成的4-methylumbelliferyl螢光強度。以加入脂肪酶及不加入脂肪酶兩組的吸光度分別作為100％及0％，計算加入檢體溶液使抑制率達到50％時的濃度(IC50)。
實驗結果如表一表一 脂肪酶的抑制活性


從表一可以看出，可可茶活性成分1，3，4，6-GA-glc及C-3，5-diGA對脂肪酶顯示出很強的抑制活性。GCG及kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside也具有較強的脂肪酶抑制活性，kaempferol 3-rutinoside的作用不顯著，但加大用量也能產生相當於kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside的抑制效果。因此，本發明確認GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside是可可茶中抑制脂肪吸收，降高血脂症及抗肥胖的活性成分。
本發明提供和證明可可茶中含有的下列成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside具有顯著的抑制脂肪酶的活性。胰臟脂肪酶是體內消化系統中主要的消化酶。抑制脂肪酶的活性無疑可以減少攝取的脂肪在小腸內的消化、分解和吸收，從而可以改善高血脂症，降低血中膽固醇的含量，並達到減肥效果。對因上述疾患引起的動脈硬化症、血栓症等各種臨床症狀也有預防及改善作用。另外，可可茶中的有效成分1，3，4，6-GA-glc、及C-3，5-diGA對脂肪酶活性的抑制作用等於或者強於綠茶的有效成分EGEG。
根據上述實驗可以證明本發明提供可可茶及其活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol3-rutinoside是安全性高、來自天然的一種通過抑制胰臟脂肪酶活性，從而達到抑制脂肪分解、減少脂肪從腸管吸收的抗肥胖劑。特別是攝取前後服用效果更好。可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside也可以有效的改善和抑制中性脂肪肝、脂肪蓄積症、高脂血症、血栓症、動脈硬化症，並可降低血中膽固醇的含量。當然，也還可用於預防、改善及治療由上述疾患引起的各種臨床症狀。可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside可以單獨作為改善肥胖、中性脂肪肝、脂肪蓄積症、高脂血症、血栓症、動脈硬化，降低血中膽固醇含量以及由之發生的併發症，也可配合其它治療藥物使用。由於本發明提供的脂肪吸收抑制物質可可茶是天然來源的物質，民間有長期作為飲料飲用的經驗，且不含有咖啡因等特點，不僅可適用於一般成年人，而且作為一種作用緩和的健康茶也適用於老年人、兒童及體力低下者。因此，可可茶及其所含活性成分GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5-diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside及kaempferol 3-rutinoside可以作為健康食品、食品添加劑、健康茶，供給消費者用於減肥、抗高血脂質症等的應用。再有，儘管GCG、1，3，4，6-GA-glc、C-3，5diGA、kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside、及kaempferol 3-rutinoside是已知化合物，但是這些化合物對脂肪酶的抑制活性是通過本發明所首次證實的。
權利要求
1.可可茶提取物用於製備預防及改善肥胖及其臨床症狀的藥物的用途。
2.可可茶提取物用於製備預防及改善肥胖及其臨床症狀的食品的用途。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-gallate，即GCG，每克可可茶提取物中GCG的含量至少為40毫克。
4.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分1，3，4，6-tetragalloyl-glucose，即1，3，4，6-GA-glc，每克可可茶提取物中1，3，4，6-GA-glc的含量至少為25毫克。
5.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分gallogatechin-3，5-digallate，即GC-3，5-diGA，每克可可茶提取物中GC-3，5-diGA的含量至少為100毫克。
6.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分kaempferol 3-rhamnosyl-rutinoside，即黃酮苷A，每克可可茶提取物中黃酮苷A的含量至少為0.10毫克。
7.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物含有活性成分kaempferol 3-rutinoside，即黃酮苷B，每克可可茶提取物中黃酮苷B的含量至少為0.20毫克。
8.根據權利要求1或2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物是採用熱水或水與低級醇類、極性溶劑的一種或二種以上的任意混合溶劑進行提取的。
9.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於所述的藥物包括有效治療劑量的可可茶提取物，以及藥學上可接受的載體。
10.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於所述的可可茶提取物的固形劑使用量為0.1％至40％重量比。
全文摘要
本發明公開了可可茶提取物及其活性成分GCG、1，3，4，6－GA－glc、GC－3，5－diGA、kaempferol 3－rhamnosyl－rutinoside、及kaempferol 3－rutinoside用於製備預防及改善肥胖及其臨床症狀的藥物及食品的應用。本發明是基於可可茶提取物及可可茶有效成分可可鹼在小鼠自發運動實驗、睡眠實驗及懸垂實驗中顯示有意義的效果中得以確認和證明的。
文檔編號A23L1/30GK1562280SQ20041002672
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月1日 優先權日2004年4月1日
發明者慄原博, 姚新生, 葉創興 申請人:暨南大學