新型苦味受體t2r76的鑑定的製作方法

2023-05-24 16:00:26 1

專利名稱：新型苦味受體t2r76的鑑定的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及T2R76多肽和由其介導的味覺感受。更特別地，本發明提供了分離的編碼T2R76多肽的核酸、分離的功能性T2R76多肽、用於T2R76多肽的重組表達的異源表達系統、鑑定味覺調節劑尤其是引起苦味或阻斷苦味的化合物的方法及其用途。
相關技術描述人能夠識別的一種基本味覺模式是苦味。苦味化合物被認為是通過與細胞表面受體相互作用而產生了苦味。受體的活化引發細胞內的信號級聯放大，從而最終導致神經遞質的釋放。然後，來自腦神經節的傳入神經纖維轉送信號至將信號加工成味覺感受的皮層味覺中樞。這些受體屬於與細胞內G蛋白相互作用的7跨膜結構域受體家族，這種受體也稱為G蛋白偶聯受體(GPCR)。見Lindemann(2001)，Nature413(6852)219-25。
在人和齧齒動物中已經鑑定出了GPCR的一個新家族，稱為T2R(Adler等人，2000；Chandrashekar等人，2000；Matsunami，2000；PCT國際公布號WO 01/18050和WO 01/77676)。有幾條證據提出T2R可以介導苦味化合物的感受。首先，T2R基因在舌和顎上皮的味覺受體細胞的亞群中特異表達。第二，在小鼠和人中，T2R在基因上和與苦味感受相關的座位連鎖(Conneally等人，1976；Capeless等人，1992；Reed等人，1999；Adler等人，2000)。第三，體外研究中表明T2R可以激活吉特先(gustducin)，這是一種在味覺細胞中特異表達並與苦味刺激轉導相關的G蛋白(Wong等人，1996)，也表明T2R引起的吉特先(gustducin)活化選擇性地以對於施用苦味化合物作出響應而發生(Chandrashekar等人，2000)。基於這些數據，提出mT2R和hT2R受體家族分別在小鼠和人中介導了苦味反應。
苦味常常在食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品和藥物中是不希望的。苦味可以通過添加甜味化合物如糖來掩蓋；可是，添加增甜劑可能不希望地改變食品的風味和增加卡路裡的攝入。在藥物的情況下，已經形成了精心設計和昂貴的配製方法(例如包衣和膠囊)以減少口服攝取時的苦味。還沒有描述通過抑制味覺受體來直接阻斷苦味的方法。
因此，在本領域中有著長期存在的需求來鑑定和功能性地表徵苦味受體，從而將這些苦味受體作為用於開發苦味感受抑制劑的靶標。為了滿足該需要，本發明提供了新型T2R76核酸和多肽。本發明還提供了用於鑑定和使用T2R76的調節劑以改變味覺的方法。
發明概述本發明提供了分離的T2R76核酸和由該核酸編碼的T2R76多肽。該多肽和核酸可用於此處公開的檢測方法和測定法。
T2R76核酸可以包括(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；或(c)分離的基本上與SEQID NO1類似的核酸分子。
T2R76核酸也可以包括(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與SEQ ID NO1的核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件為具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；或(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。優選地，分離的T2R76核酸包括(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；或(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子。
分離的T2R76多肽可以包括(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。
T2R76也可以包括由選自下列的分離的核酸分子編碼的多肽(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在高嚴緊條件下與SEQ ID NO1的核酸雜交並編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。優選地，T2R76多肽包括SEQ ID NO2。
本發明進一步提供了檢測T2R76核酸的方法，該方法包括(a)獲得含有核酸材料的生物樣品；(b)在嚴緊雜交條件下將分離的T2R76核酸分子與(a)的生物樣品雜交，因此形成分離的T2R76核酸與生物樣品內的核酸之間的雙鏈結構；和(c)檢測(b)的雙鏈結構，由此檢測T2R76核酸分子。
本發明進一步提供了特異識別T2R76多肽的抗體，和生產該抗體的方法。該方法的一個代表性的實施方案包括(a)重組或合成生產T2R76多肽；(b)配製(a)的多肽，由此其成為有效的免疫原；(c)將(b)的配劑施用於動物，從而在動物中引起包括抗體產生在內的免疫反應，其中抗體存在於動物的血清中；和(d)從(c)的動物中收集合有特異識別T2R76多肽的抗體的血清。該所公開的方法可以進一步包括製備單克隆抗體。
還提供了檢測T2R76多肽水平的方法。在一個代表性的實施方案中，該方法包括(a)獲得含有肽材料的生物樣品；(b)通過使用本發明的抗體的免疫化學反應來檢測(a)的生物樣品中的T2R76多肽，由此測定樣品中T2R76多肽的數量。
還提供了用於T2R76多肽的重組表達的系統。重組表達系統可以包含(a)本發明的T2R76多肽(例如SEQ ID NO2提出的代表性實施方案)；和(b)表達T2R76多肽的異源宿主細胞。另外，重組表達系統可以包含編碼除T2R76之外的不同T2R多肽的核酸序列。特別地，重組表達系統可以包含任何在下列文獻中公開的T2R核酸序列於2003年5月6日頒發給Zuker等人的US專利號6,558,910；由Adler、JohnElliot於2002年7月18日公布的US公布申請20020094551；和由Zuker等人於2003年1月30日公布的US公布申請20030022278，所有這些文獻以其全文進行引用作為參考。應當注意到，如在此處引用作為參考的Zuker申請中所公開的，T2R多肽的另一個名字為SF或GR多肽。hT2R76可以與一種或多種其他T2R多肽一起表達以產生功能性雜合(heteromenic)味覺受體。其他的T2R多肽可以是另一種人T2R或另一物種如大鼠或小鼠的T2R。宿主細胞可以包括任何合適的細胞。優選的宿主細胞包括哺乳動物細胞，更優選地包括人細胞。也是優選地，宿主細胞包含能夠與T2R76多肽偶聯的G蛋白α亞基，例如混雜的G蛋白如Gα15、吉特先或轉導素。
使用公開的用於T2R76的重組表達的系統，本發明進一步提供了鑑定T2R76多肽的調節劑的方法。在本發明的一個優選實施方案中，該方法包括(a)提供重組表達系統，由此在異源宿主細胞中表達T2R76多肽；(b)向(a)的系統提供測試物質；(c)在存在測試物質的情況下測定T2R76功能的水平或質量；(d)將T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量與T2R76功能的對照水平或質量進行比較；和(e)當與T2R76功能的對照水平或質量進行比較時，通過確定T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量有顯著變化而鑑定測試物質為T2R76調節劑。測定可以包括測定GTPγS結合的數量。
在本發明的另一個實施方案中，鑑定T2R76多肽的調節劑的方法包括(a)對於一種或多種測試物質，表達T2R76多肽，和單獨或聯合一種或多種其他T2R多肽表達該多肽或多肽組合；(b)測定測試物質與分離的T2R76多肽或含有T2R76的多肽組合的結合；和(c)挑選出表明與T2R76多肽特異結合的候選物質。
還提供了調節劑，包括T2R76多肽的激動劑和抑制劑，其是用所公開的方法鑑定出的。調節劑可以包括蛋白質、肽、抗體、核酸、小分子或者其組合。優選地，調節劑進一步包括苦味感受的調節劑。
本發明進一步提供了在受試者中調節苦味感受的方法。受試者優選地為哺乳動物受試者，更優選地為人受試者。也是優選地，在受試者中改變的苦味感受包括T2R76功能。
在本發明的一個實施方案中，在受試者中調節苦味感受的方法包括(a)製備含有根據所公開的方法鑑定出的T2R76調節劑的組合物；和(b)向受試者施用有效劑量的該組合物，由此在受試者中改變苦味感受。
例如，本發明提供了通過向受試者共施用T2R76抑制劑和苦味化合物而減弱苦味化合物的苦味感受的方法。本發明還提供了通過共施用T2R76激動劑和化合物而增強該化合物的苦味感受的方法。共施用可以包括施用含有與其味道將進行調節的化合物混合的T2R76抑制劑的組合物。在本發明的優選實施方案中，該組合物可以包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品或藥物。
本發明還提供了通過共施用T2R76激動劑和其味道將進行調節的化合物而增強該化合物的苦味感受的方法。T2R76激動劑和該化合物可以混合為單一的組合物。
因此，本發明的一個目標為提供新型T2R76核酸和多肽，檢測T2R76核酸的方法，藉此可表達T2R76多肽的異源表達系統，使用異源T2R76表達系統的方法和測定法，和調節和檢測T2R76多肽的方法。通過本發明完全或部分地達到了該目標。
本發明的一個目標已經在上面進行了陳述，本發明的其他目標和優點在本領域熟練技術人員研究了下列本發明的描述和非限制性實施例之後將會變得是顯而易見的。
序列表中的序列的簡述SEQ ID1和2分別是人T2R76核苷酸和胺基酸序列。
發明詳述I.定義雖然相信下列術語會被本領域中普通的技術人員所理解，但是提出下列定義是為了易於解釋本發明。
術語「a」、「an」和「the」根據長期存在的慣例用於指一個或多個。
在此處使用時，術語「大約」當涉及可測量的值如序列同一性百分率(例如當如下所述比較核苷酸和胺基酸序列時)、核苷酸或蛋白質長度、結合的數量等等時，是表示包括偏離所指明的數量±20％或±10％的變化，更優選為±5％，更加優選為±1％，和更為優選為±0.1％，因為這種變化適合於施行所公開的方法或實施本發明。
II.T2R76核酸和多肽本發明提供了新型T2R76核酸和新型T2R76多肽，包括功能性T2R76多肽。代表性的本發明的T2R76核酸以SEQ ID NO1列出，其編碼以SEQ ID NO2列出的T2R76多肽。
術語「T2R76」和包含「T2R76」的術語(例如hT2R76)通常是指分離的T2R76核酸、分離的由T2R76核酸編碼的多肽及其活性。T2R76核酸和多肽可以源自任何生物。術語「T2R76」和包含「T2R76」的術語還指包括由苦味化合物激活的受體的多肽和編碼該多肽的核酸。T2R76受體可以包括其他T2R多肽，其可以為雜合(heteromenic)受體。
術語「分離的」在核酸或多肽的情況下使用時是表明，核酸或多肽脫離其天然環境而存在，並且不是天然產物。分離的核酸或多肽可以純化的形式存在，或者可以存在於非天然環境如轉基因宿主細胞中。
如下述所進一步公開的，本發明還提供了用於T2R76多肽的功能性表達的系統。該系統使用包括SEQ ID NO1的重組T2R76核酸，其可以與另一個T2R核酸聯合表達。
II.A.T2R76核酸術語「核酸分子」和「核酸」各指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及其單鏈、雙鏈或三鏈形式的多聚體。除非特別限定，該術語包括包含天然核苷酸的已知類似物的核酸，這些類似物具有與參考天然核酸類似的特性。術語「核酸分子」或「核酸」還可以用於代替「基因」、「cDNA」、「mRNA」或「cRNA」。核酸可以是合成的，或者可以源自任何生物來源，包括任何生物。用於克隆全長T2R76 cDNA的代表性的方法描述於實施例1中。
術語「T2R」或「SF」是指編碼味覺細胞特異性G蛋白＿＿受體家族成員的核酸。這些核酸和他們編碼的多肽稱為「T2R」、「SF」、「GF」或者G蛋白旋光味覺受體的TAS2R家族。該GPCR的神經系統相關家族包括味覺轉導p＿＿的組分。對於＿＿家族，該家族的成員參與了苦味的檢測。味覺受體的T2R或SF家族成員在下列文獻中進行了討論US專利6,558,910；由Zura等人公開的US專利20030022278，於2003年1月20日公布；和由Adler，Jon Elliot等人公開的US專利申請20020094502，於2002年7月18日公布。這樣的T2R的實例包括Gro1(SF01)；GR02(SF02)；GR02(SF03)；GR04(SF04)；GR05(SF05)；GR06(SF06)；GR07(SF07)；GR08(SF08)；GR09(SF09)；GR10(SF10)；GR11(SF11)；GR12(SF12)；GR13(SF13)；GR14(SF14)；GR15(SF15)；GR16(SF16)；GR17(SF17)；GR18(SF18)；GR19(SF19)；GR20(SF20)；GR21(SF21)；GR22(SF23)；GR24(SF24)；T2R51；T2R55；T2R33；T2R59；T2R61；T2R63；T2R64；T2R65；T2R75；GR25(SF25)；GR26(SF26)；GR27(SF27)；GR28(SF28)；GR29(SF29)；GR30(SF30)；GR31(SF31)；GR32(SF32)；GR(SF)；GR33(SF33)；GR34(SF24)；GR35(SF35)；GR36(SF36)；GR37(SF37)；GR38(SF38)；GR39(SF39)；GR40(SF40)；GR41(SF41)；GR42(SF42)；GR43(SF43)；GR44(SF44)；GR45(SF45)；GR46(SF46)；GR47(SF47)；GR48(SF48)；GR(SF)；GR49(SF49)；GR50(SF50)。
這些T2R、SF、TAS2R等或者他們可選擇地稱為的GR可以具有不同的物種來源，包括人、小鼠和大鼠，優選為人。還包括與之「基本上相同」或與之具有特定的序列同一性的T2R，或者與下文中定義的這些序列中的任何一個特異地雜交的T2R。
術語「T2R76」和包含「T2R76」的術語(例如hT2R76)在此處用於指編碼T2R76多肽的核酸。因此，術語「T2R76」是指本發明的分離的核酸，其包括(a)包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的核苷酸序列；或(b)與SEQ ID NO1基本上相同的核苷酸序列。
在此處用於描述核苷酸序列之間的類似程度的術語「基本上相同的」是指，當就最大對應進行比較和比對時，用下列序列比較算法或通過肉眼檢查測得具有至少大約60％，優選至少大約70％，更優選至少大約80％，更優選大約90％-大約99％，更加優選大約95％-大約99％，和最優選大約99％的核苷酸同一性的兩個或更多個序列。顯著的同一性優選地存在於至少大約100個殘基的核苷酸序列中，更優選地存在於至少大約150個殘基的核苷酸序列中，和最優選地存在於包含全長編碼序列的核苷酸序列中。如下文中進一步描述的，術語「全長」在此處用於指編碼功能性T2R76多肽的完整的可讀框。用於測定兩個多肽之間的同一性百分率的方法在下文中於標題「核苷酸和胺基酸序列比較」之下進行定義。
在一個方面，基本上相同的序列可以是多態序列。術語「多態」是指在群體中出現兩個或更多個遺傳決定的可選擇的序列或等位基因。等位基因的差異可以小至一個鹼基對。
在另一個方面，基本上相同的序列可以包含經誘變處理的序列，包括含有沉默突變的序列。突變可以包括一個或多個殘基改變、殘基的刪除或附加殘基的插入。
兩個核苷酸序列基本上相同的另一個指徵是兩個分子在嚴緊條件下相互特異地雜交或基本上雜交。在核酸雜交的情況下，可以將正進行比較的核酸序列標示為「探針」和「目標」。「探針」為參考核酸分子，「目標」為常常在核酸分子的異源群體中發現的測試核酸分子。「目標序列」與「測試序列」意思相同。
用於雜交研究或測定法的優選的核苷酸序列包括與本發明核酸分子的至少大約14-40核苷酸序列互補或者模擬本發明核酸分子的至少大約14-40核苷酸序列的探針序列。優選地，探針含有14-20個核苷酸，或者在需要時甚至更長，例如30、40、50、60、100、200、300或500個核苷酸，或者直至任何SEQ ID NO1的全長。這樣的片段可以容易地通過下列方法來製備，例如通過片段的化學合成，通過應用核酸擴增技術，或者通過將挑選出的序列引入重組載體中以進行重組表達。
短語「與...特異地雜交」是指，當一個核苷酸序列存在於複雜的核酸混合物(例如總細胞DNA或RNA)中時，一個分子在嚴緊條件下只與該特定的核苷酸序列結合、成雙鏈或雜交。
短語「與...基本上雜交」是指探針核酸分子和目標核酸分子之間的互補雜交，和包括可以通過減少雜交介質的嚴緊性而獲得補償的少量的錯配以達到所需雜交。
「嚴緊的雜交條件」和「嚴緊的雜交洗滌條件」在核酸雜交試驗如Southern和Northern印跡分析的情況下依賴於序列和環境。更長的序列在更高的溫度下特異地雜交。對於核酸雜交的詳盡指導可在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分第2章，Elsevier，New York，New York中找到。一般地，所選擇的高嚴緊雜交和洗滌條件為在指定的離子強度和pH下比特定序列的熱熔解點(Tm)低大約50℃。通常，在「嚴緊條件」下，探針會與其目標序列特異地雜交，但不會與其他序列雜交。
Tm是50％的目標序列與精確配對的探針雜交時的溫度(在指定的離子強度和pH下)。非常嚴緊的條件與特定探針的Tm相當。對於具有多於大約100個互補殘基的互補核酸的Southern或Northern印跡分析來說，嚴緊雜交條件的實例為在含有1mg肝素的50％甲醯胺中於42℃雜交過夜。高嚴緊洗滌條件的實例為15分鐘，0.1×SSC，和65℃。嚴緊洗滌條件的實例為15分鐘，0.2×SSC緩衝液，和65℃。關於SSC緩衝液的描述可見Sambrook等人(編者)(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York。在高嚴緊洗滌之前，常常進行低嚴緊洗滌以去除背景探針信號。對於多於大約100個核苷酸的雙鏈的中等嚴緊洗滌條件的實例為15分鐘，1×SSC緩衝液，和45℃。對於多於大約100個核苷酸的雙鏈的低嚴緊洗滌的實例為15分鐘，4×-6×SSC緩衝液，和40℃。對於短的探針(例如大約10-50個核苷酸)，嚴緊條件一般包括在pH7.0-8.3下，小於大約1M Na+離子濃度，通常大約0.01-1M Na+離子濃度(或其他鹽)的鹽濃度，溫度一般為至少大約30℃。嚴緊條件也可以通過添加去穩定劑如甲醯胺來獲得。一般地，在特定的雜交測定中信噪比比對於不相關的探針所觀察到的高2倍(或更高)則表明檢測到特異性雜交。
下面是可以用於鑑定與本發明的參考核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列的雜交和洗滌條件的實例探針核苷酸序列優選地與目標核苷酸序列在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中於50℃進行雜交，隨後在2×SSC、0.1％SDS中於50℃進行洗滌；更優選地，探針與目標序列在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中於50℃進行雜交，隨後在1×SSC、0.1％SDS中於50℃進行洗滌；更優選地，探針與目標序列在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中於50℃進行雜交，隨後在0.5×SSC、0.1％SDS中於50℃進行洗滌；更優選地，探針與目標序列在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中於50℃進行雜交，隨後在0.1×SSC、0.1％SDS中於50℃進行洗滌；更優選地，探針與目標序列在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中於50℃進行雜交，隨後在0.1×SSC、0.1％SDS中於65℃進行洗滌。
兩個核酸序列基本上相同的其他指徵是由這些核酸編碼的蛋白質基本上相同，共有整體的三維結構，或者為生物功能性等效物。這些術語在下文中於標題「T2R76多肽」之下進行進一步的定義。如果相應的蛋白質基本上相同，那麼在嚴緊條件下不相互雜交的核酸分子仍然是基本上相同的。例如當兩個核苷酸序列包含遺傳密碼所允許的保守替代的變體時，這就可能發生。
術語「保守替代的變體」是指具有簡併密碼子替代的核酸序列，其中一個或多個選擇出的(或全部)密碼子的第三個位置用混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基替代。見Batzer等人(1991)Nucleic Acids Res195081；Ohtsuka等人(1985)J Biol Chem 2602605-2608；和Rossolini等人(1994)Mol Cell Probes 891-98。
術語「T2R」也包括含有T2R核酸(優選為T2R76)的亞序列和延長序列的核酸，包括與T2R核酸互補的核酸、T2RRNA分子和與T2RRNA(cRNA)互補的核酸。
術語「亞序列」是指含有更長的核酸序列的一部分的核酸序列。範例性的亞序列為上述的探針或者引物。此處使用的術語「引物」是指含有選擇出的核酸分子的大約8個或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，優選10-20個核苷酸，和更優選20-30個核苷酸的連續序列。本發明的引物包括這樣的寡核苷酸，其具有足夠的長度和合適的序列從而提供在本發明的核酸分子上的聚合化的起始。
術語「延長序列」是指添加整合入核酸中的核苷酸(或其他類似分子)。例如，聚合酶(例如DNA聚合酶)可以在核酸分子的3′末端添加序列。另外，核苷酸序列可以和其他DNA序列組合，例如啟動子、啟動子區域、增強子、聚腺苷酸化信號、內含子序列、附加的限制性內切酶位點、多克隆位點和其他編碼片段。
在此處使用時，術語「互補序列」表示具有反平行核苷酸序列的兩個核苷酸序列，該反平行核苷酸序列能夠通過在鹼基對之間形成氫鍵而相互配對。在此處使用時，術語「互補序列」意指基本上互補的核苷酸序列，其可以通過下文中提及的相同核苷酸比較方法來評測，或者定義為能夠在相對嚴緊條件如此處所述的那些條件下與正在研究的核酸片段雜交。互補核酸片段的一個特定實例為反義寡核苷酸。
本發明還提供了含有公開的T2R76核酸和重組T2R76核酸的嵌合基因。因此，也包括含有可選地與其他T2R核酸聯合表達的T2R76核酸的構建體和載體。
術語「基因」在廣義上是指任何與生物功能相關的DNA片段。基因包括這樣的序列，即這樣的序列包括編碼序列、啟動子區域、順式調節序列、作為調節蛋白的特異識別序列的非表達DNA片段、對於基因表達起作用的非表達DNA片段、設計為具有所希望的參數的DNA片段或者其組合，但並不局限於此。基因可以通過多種方法獲得，包括從生物樣品中克隆、基於已知或預測的序列信息的合成和存在的序列的重組衍生。
在此處使用時，術語「嵌合基因」是指與T2R序列有效連接的啟動子區域，該T2R序列例如為T2R cDNA、編碼反義RNA分子的T2R核酸、編碼具有三級結構(例如髮夾結構)的RNA分子的T2R核酸或者編碼雙鏈RNA分子的T2R核酸。術語「嵌合基因」還指與異源序列有效連接的T2R啟動子區域。在實施例2中描述了本發明的嵌合基因的製備。T2R優選為T2R76。
在此處使用時，術語「有效連接」是指啟動子區域和核苷酸序列之間的功能性聯合，從而通過啟動子區域控制和調節該核苷酸序列的轉錄。用於將啟動子區域與核苷酸序列有效連接的技術在本領域中是已知的。
術語「重組體」一般是指在非天然環境中可複製的分離的核酸。因此，重組核酸可以包含與附加的核酸聯合的不可複製的核酸，該附加的核酸使得其能夠在宿主細胞中複製，例如載體核酸。
術語「載體」在此處用於指具有使得其能夠在宿主細胞中複製的核苷酸序列的核酸分子。載體還可以包括允許載體內的核苷酸序列連接的核苷酸序列，其中這種核苷酸序列也在宿主細胞中複製。代表性的載體包括質粒、粘粒和病毒載體。如下文中進一步描述的，載體還可以介導T2R76多肽的重組生產。
當術語「構建體」在此處用於描述一類包括表達構建體的構建體時，其是指進一步含有在載體中有效插入的核苷酸序列的載體，從而重組表達該核苷酸序列。
術語「重組表達」或「重組生產」可互換使用，其一般是指生產由重組核酸編碼的多肽的方法。
因此，重組T2R核酸即T2R76核酸優選地包含異源的核酸。術語「異源的核酸」是指來源自對於想要的宿主細胞來說是外源的序列，或者如果來自同一來源，那麼是從其原始形式經修飾的序列。宿主細胞中的異源核酸可以包括對於特定的宿主細胞來說是內源的但經過修飾的核酸，這種修飾例如通過誘變或通過與天然順式調節序列分離來進行。異源核酸還包括天然核苷酸序列的非天然存在的多個拷貝。異源核酸還可以包括這樣的核酸，即其在通常不會找到這種核酸的位置整合入宿主細胞的核酸中。
本發明的核酸可以是克隆的、合成的、改變的、誘變的或其組合。用於分離核酸的標準重組DNA和分子克隆技術在本領域中是已知的。用於形成鹼基對的改變、刪除或小插入的位點特異性誘變在本領域中也是已知的。見例如Sambrook等人(編者)(1989)Molecular CloningLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York；Silhavy等人(1984)Experiments withGene Fusion，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York；Glover Hames(1995)DNA CloningA PracticalApproach，第2版，IRL Press at Oxford University Press，Oxford/New York；Ausubel(編者)(1995)Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley，New York。
III.B.T2R76多肽本發明提供了新型T2R76多肽，其的一個代表性實施方案為SEQID NO2。優選地，本發明的分離的T2R76多肽包括重組表達的T2R76多肽。也是優選地，分離的T2R76多肽包括功能性T2R76多肽。這些T2R76多肽可以與一種或多種其他T2R多肽聯合表達。
因此，可用於本發明的方法的新型T2R76多肽包括(a)SEQ IDNO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。T2R76多肽還可以包括(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在嚴緊洗滌條件下與T2R76核酸序列雜交，該嚴緊洗滌條件表現為具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度，並且該分離的核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
在此處用於描述T2R和與其基本上相同的蛋白質之間的相似性水平的術語「基本上相同的」是指與其具有至少35％的同一性的蛋白質。例如，在T2R76和與該T2R76蛋白質基本上相同的蛋白質的情況下，這是指當在T2R76蛋白質的全長上進行比較時與SEQ ID NO2具有至少大約35％的同一性的序列。優選地，與T2R76蛋白質基本上相同的蛋白質包含這樣的胺基酸序列，即當在T2R76多肽的全長上進行比較時，該胺基酸序列與SEQ ID NO2具有至少大約35％-大約45％的同一性，更優選地與SEQ ID NO2具有至少大約45％-大約55％的同一性，更加優選地與SEQ ID NO2具有至少大約55％-大約65％的同一性，更為優選地與SEQ ID NO2具有至少大約65％-大約75％的同一性，更為優選地與SEQ ID NO2具有至少大約75％-大約85％的同一性，更為優選地與SEQ ID NO2具有至少大約85％-大約95％的同一性，和更為優選地與SEQ ID NO2具有至少大約95％-大約99％的同一性。術語「全長」是指下文中進一步描述的功能性T2R76多肽。用於測定兩個多肽之間的同一性百分率的方法也在下文中於標題「核苷酸和胺基酸序列比較」之下進行定義。
當用於描述多肽時，術語「基本上相同的」還包括共有保守三維結構的兩種或多種多肽。計算方法可以用於比較結構圖像，可以建立起結構模型，並可以容易地進行調整以鑑定圍繞重要的活性部位或配體結合部位的相似性。見Saqi等人(1999)Bioinformatics15521-522；Barton(1998)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr541139-1146；Henikoff等人(2000)Electrophoresis211700-1706；和Huang等人(2000)Pac Symp Biocomput230-241。
基本上相同的蛋白質還包括含有在功能上與SEQ ID NO2的胺基酸相當的胺基酸的蛋白質。在胺基酸的情況下，術語「在功能上相當」在本領域中是已知的，其基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性。見Henikoff Henikoff(2000)Adv Protein Chem 5473-97。要考慮的相關因素包括側鏈疏水性、親水性、電荷和大小。例如，精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸都具有相似的大小；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有整體類似的形狀。通過下文中進一步描述的該分析，將精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在此處定義為生物功能性等效物。
在進行生物功能性等效胺基酸替代中，可以考慮胺基酸的親水指數。基於他們的疏水性和電荷特性，已經確定了每個胺基酸的親水指數，這些親水指數為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；穀氨酸(-3.5)；穀氨醯胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)和精氨酸(4.5)。
在本領域中通常會理解親水胺基酸指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中的重要性(Kyte等人，1982)。已知某些胺基酸可以替代為其他具有類似的親水指數或分值的胺基酸，而仍然保持類似的生物活性。在基於親水指數進行改變時，親水指數在原始值的±2之內的胺基酸的替代是優選的，親水指數在原始值的±1之內的胺基酸的替代是特別優選的，和親水指數在原始值的±0.5之內的胺基酸的替代是更加特別優選的。
在本領域中也可理解，可以基於親水性而有效地進行類似胺基酸的替代。U.S.專利號4,554,101描述了，由其相鄰胺基酸的親水性所控制的蛋白質的最大局部平均親水性與其免疫原性和抗原性有關，例如與蛋白質的生物特性有關。可理解一個胺基酸可以替代為另一個具有類似的親水性值的胺基酸，而仍然獲得生物上等效的蛋白質。
如U.S.專利號4,554,101中所詳細描述的，已經確定胺基酸殘基具有下列親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；穀氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+3.0)；天冬醯胺(+0.2)；穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
在基於類似的親水性值進行改變時，親水性值在原始值的±2之內的胺基酸的替代是優選的，親水性值在原始值的±1之內的胺基酸的替代是特別優選的，和親水性值在原始值的±0.5之內的胺基酸的替代是更加特別優選的。
術語「基本上相同的」還包括作為T2R多肽例如T2R76多肽的生物功能性等效物的多肽。術語「功能性的」包括T2R76多肽的活性，例如激活細胞內信號傳導途徑(例如與吉特先偶聯)和介導味覺感受。優選地，這樣的激活在體內顯示出與相關的T2R多肽例如T2R76多肽基本上類似的量級和動力學。用於評測T2R76活性的代表性方法在下文中進行描述。
本發明還提供了T2R76多肽的功能性片段。這樣的功能性部分不需要包含全部的或基本上全部的天然T2R76基因產物的胺基酸序列。
本發明還包括比天然T2R多肽例如T2R76多肽更長的功能性多肽序列。例如，一個或多個胺基酸可以添加至T2R多肽例如T2R76多肽的N-末端或C-末端。這種附加的胺基酸可以用於多種應用，包括純化應用，但並不局限於此。用於製備延長的蛋白質的方法在本領域中是已知的。
II.C.核苷酸和胺基酸序列比較在兩個或更多個核苷酸或多肽序列的情況下，術語「相同的」或「同一性百分率」是指，當就最大對應進行比較和比對時，用此處公開的序列比較算法中的一種或通過肉眼檢查測得兩個或更多個序列或亞序列相同或者具有指定百分比的相同的胺基酸殘基或核苷酸。
關於核苷酸或多肽序列的術語「基本上相同的」表示特定的序列通過一個或多個刪除、替代或添加而產生相對於天然存在的序列的改變，其淨效果是保持T2R核酸或多肽例如T2R76核酸或T2R76多肽的生物功能。
為了比較兩個或更多個序列，通常一個序列作為參考序列，一個或多個測試序列與之比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入電腦程式中，如果需要，則標明亞序列坐標，並選擇序列算法程序參數。然後，序列比較算法基於所選擇的程序參數計算出所指定的測試序列相對於參考序列的序列同一性百分率，可以通過下列方法來實施用於比較的序列的最佳比對，例如Smith Waterman(1981)Adv Appl Math 2482-489的局部同源性算法，Needeleman Wunsch(1970)J Mol Biol 48443-453的同源性比對算法，Pearson Lipman(1988)Proc Natl Acad Sci USA852444-2448的相似性的搜索方法，這些算法的計算機化實施方法(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)，或者肉眼檢查。一般可見Ausubel(編者)(1995)Short Protocols inMolecular Biology，第三版，Wiley，New York。
用於測定序列同一性百分率和序列相似性的優選的算法為BLAST算法，其在Altschul等人(1990)J Mol Biol 215403-410中進行了描述。用於施行BLAST分析的軟體可以公開地通過國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。該算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度W的短字串而鑑定高得分序列對(HSP)，當與資料庫序列中的同樣長度的字串進行比對時，這些高得分序列對符合或滿足一些正值的閾值得分T。T被稱為相鄰字串得分閾值。這些初始的相鄰字串匹配值(hit)作為起始用於尋找含有它們的更長HSP的搜索的種子。然後，字串匹配值在沿著每個序列的兩個方向上進行延伸，前提是能夠增加累積的比對得分。對於核苷酸序列，使用參數M(對於配對殘基的獎分；總是＞0)和N(對於錯配殘基的罰分；總是＜0)計算累積得分。對於胺基酸序列，使用記分矩陣計算累積得分。當累積的比對得分從其最大獲得值下跌數量X時，累積得分由於一個或多個負得分殘基比對的積累而變成0或小於0，或者到達任一序列的末端時，停止在每個方向上的字串匹配值的延伸。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用字串長度W＝11、期望值E＝10、100的截點、M＝5、N＝-4和兩條鏈的比較作為默認值。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用3的字串長度(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62記分矩陣作為默認值。見Henikoff Henikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA 8910915-10919。
除了計算序列同一性百分率之外，BLAST算法還施行兩個序列之間的相似性的統計分析。見例如Karlin Altschul(1993)Proc NatlAcad Sci USA 905873-5877。由BLAST算法所提供的相似性的一個量度為最小概率和(P(N))，其提供了兩個核苷酸或胺基酸序列之間偶然出現的配對的可能性的指徵。例如，如果在測試核酸序列與參考核酸序列的比較中的最小概率和小於大約0.1，更優選地小於大約0.01，和最優選地小於大約0.001，那麼認為測試核酸序列與參考核酸序列相似。
III.檢測T2R76核酸的方法在本發明的另一個方面中，提供了用於檢測編碼T2R76多肽的核酸分子的方法。這樣的方法可以用於檢測T2R76基因變體或改變的基因表達。例如，檢測T2R76序列或表達中的變化可以用於診斷味覺中T2R76相關的差異。優選地，用於該方法的核酸包含SEQ ID NO1的序列。
用本發明的方法所檢測的序列可以使用任何通常用於檢測特定DNA序列的方法進行檢測、亞克隆、測序，和進一步用任何本領域中熟知的量度進行評估。因此，本發明的核酸可以用於克隆含有公開序列的基因和基因組DNA。可選擇地，本發明的核酸可以用於克隆相關序列的基因和基因組DNA。使用此處公開的核酸序列，這樣的方法對於本領域熟練技術人員來說是已知的。見例如Sambrook等人(編者)(1989)Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York。在實施例1-4中還公開了代表性的方法。
在本發明的一個實施方案中，例如使用RT-PCR測定法來測量T2R76核酸分子的水平。見Chiang(1998)J Chromatogr A806209-218，和其中引用的文獻。
在本發明的另一個實施方案中，基於本發明核酸分子的基因測定法可用於篩選基因變體，例如通過等位基因特異性寡核苷酸(ASO)探針分析(Conner等人，1983)、寡核苷酸連接測定法(OLA)(Nickerson等人，1990)、單鏈構象多態性(SSCP)分析(Orita等人，1989)、SSCP/異源雙鏈分析、酶錯配切割、擴增出的外顯子的直接序列分析(Kestila等人，1998；Yuan等人，1999)、等位基因特定性雜交(Stoneking等人，1991)和含有特定突變的擴增出的基因組DNA的限制性內切酶酶切分析來進行。也可以將自動方法應用於大規模的單核苷酸多態性的表徵(Wang等人，1998；Brookes，1999)。優選的檢測方法為非電泳的，包括例如TAQMAN TM等位基因判別測定法、PCR-OLA、分子燈塔(molecular beacon)、掛鎖探針(padlock probe)和孔螢光(well fluorescence)。見Landegren等人(1998)GenomeRes 8769-776和其中引用的文獻。
IV.用於T2R76多肽的重組表達的系統本發明進一步提供了用於表達本發明的重組T2R76多肽的系統。該T2R76多肽可以與一種或多種可以為人或非人T2R的其他T2R一起表達。這樣的系統可以用於T2R76多肽的隨後的純化和/或表徵。例如，經純化的T2R76多肽可以用作T2R76抗體生產的免疫原，這在下文中進行進一步的描述。
用於T2R76多肽的重組表達的系統還可以用於鑑定T2R76多肽的調節劑。可選擇地，當測定其他測試多肽的活化時，所公開的T2R76多肽可以用作對照多肽。這樣的測試多肽可以包括其他在味覺中涉及的T2R，例如在Adler等人(2000)Cell 100693-702和Matsunami等人(2000) Nature 601-603中公開的那些多肽中的任何一種。
術語「表達系統」是指含有異源核酸和由該異源核酸所編碼的多肽的宿主細胞。例如，異源表達系統可以包括用含有重組T2R76核酸的構建體轉染的宿主細胞、用T2R76 cRNA轉染的宿主細胞或者通過將異源核酸引入宿主細胞基因組中而製備得到的細胞系。應當注意，這些表達系統可以包含其他T2R核酸。
用於T2R76多肽的重組表達的系統可以包含(a)重組表達的T2R76多肽；和(b)含有重組表達的T2R76多肽的宿主細胞。例如，T2R76cRNA可以進行體外轉錄，然後引入宿主細胞中，由此表達出T2R76多肽。該系統可以進一步包含一種或多種附加的T2R多肽，以生產含有hT2R76和另一個T2R多肽的雜合(heteromenic)T2R受體。
用於T2R76多肽的重組表達的系統也可以包含(a)含有載體和與異源啟動子有效連接的編碼T2R76多肽的核酸分子的構建體；和(b)含有(a)的構建體的宿主細胞，由此宿主細胞表達T2R76多肽。該系統可以進一步包含編碼一種或多種附加的T2R多肽的構建體。此外，單個構建體本身可以編碼T2R76多肽和一種或多種附加的T2R多肽。
分離的多肽和重組生產的多肽可以用各種熟練技術人員已知的標準技術來純化和表徵。見例如Schrder Lübke(1965)The Peptides.Academic Press，New York；Schneider Eberle(1993)Peptides，1992Proceedings of the Twenty-Second European PeptideSymposium，September 13-19，1992，Interlaken，Switzerland.Escom，Leiden；Bodanszky(1993)Principles of Peptide Synthesis.第二版(修改)，Springer-Verlag，Berlin/New York；Ausubel(編者)(1995)Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley，New York。
優選地，重組表達的T2R76多肽包括功能性味覺受體，更優選地包括苦味受體。因此，重組表達的多肽優選地響應於苦味化合物而活化。也是優選地，重組T2R76多肽顯示出與天然T2R76多肽類似的活化響應。用於測定T2R76功能的代表性方法在下文中進行描述。
IV.A.表達構建體用於T2R76多肽的表達的構建體包含載體和T2R76核苷酸序列，其中T2R76核苷酸序列與啟動子序列有效地連接。用於T2R76的重組表達的構建體還可以含有轉錄終止信號和核苷酸序列的正確翻譯所需的序列。包括添加翻譯和終止信號序列在內的表達構建體的製備對於本領域熟練技術人員來說是已知的。
T2R多肽例如T2R76多肽的重組生產可以使用組成型啟動子或可誘導的啟動子來指導。根據本發明可以使用的代表性啟動子包括猿猴病毒40早期啟動子、來自逆轉錄病毒的長末端重複序列啟動子、肌動蛋白啟動子、熱激蛋白啟動子和金屬硫蛋白啟動子。
可用於表達T2R76多肽的合適的載體包括病毒如痘苗病毒或腺病毒、杆狀病毒載體、酵母載體、噬菌體載體(例如λ噬菌體)、質粒和粘粒DNA載體、轉座子介導的轉化載體及其衍生物，但並不局限於此。
用與所使用的載體相容的轉染方法將構建體引入宿主細胞中。標準的轉染方法包括電穿孔、DEAE-葡聚糖轉染、磷酸鈣沉澱、脂質體介導的轉染、轉座子介導的轉化、使用逆轉錄病毒的感染、粒子介導的基因轉移、高速基因轉移及其組合。
IV.B.宿主細胞在此處使用時，術語「宿主細胞」是指異源核酸分子可以引入其中的細胞。可以使用任何合適的宿主細胞，包括真核宿主如哺乳動物細胞(例如HEK-293細胞、HeLa細胞、CV-1細胞、COS細胞)、兩棲動物細胞(例如非洲爪蟾(Xenopus)卵母細胞)、昆蟲細胞(例如Sf9細胞)，以及原核宿主如大腸桿菌(E.coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，但並不局限於此。優選的宿主細胞基本上沒有T2R76多肽。
可以挑選調節重組序列的表達或者以所希望的特定方式修飾和加工基因產物的宿主細胞株系。例如，不同的宿主細胞具有特有的和特異的翻譯和翻譯後加工與修飾(例如蛋白質的糖基化、磷酸化)機制。可以選擇合適的細胞系或宿主系統以確保表達出的外源蛋白質的所希望的修飾和加工。例如，可以使用細菌系統中的表達來生產非糖基化的核心蛋白質產物，和在酵母中的表達將產生糖基化的產物。
本發明進一步包括T2R76多肽在穩定細胞系中的重組表達。用於在將異源構建體轉化入宿主細胞之後產生穩定細胞系的方法在本領域中是已知的。見例如Joyner(1993)Gene TarnetingA PracticalApproach.Oxford University Press，Oxford/New York。因此，經轉化的細胞、組織或非人生物可理解為不僅包括轉化過程的終產物，而且包括其轉基因後代或繁殖形式。
本發明進一步包括表達此處公開的重組T2R76多肽的細胞的深低溫保藏。因此，瞬時轉染的細胞和表達T2R76的穩定細胞系的細胞可以進行冷凍和貯存以備以後使用。冷凍的細胞可以容易地轉運，以便在遙遠的地點使用。
深低溫保藏培養基一般由基本培養基、冷凍保護劑(cryopreservative)和蛋白質源組成。冷凍保護劑和蛋白質保護細胞不受凍融過程的應力的損害。對於含有血清的培養基，一般的深低溫保藏培養基製備為含有10％甘油的完全培養基；含有10％DMSO(二甲亞碸)的完全培養基；或者具有含有10％甘油或10％DMSO的50％新鮮培養基的5.0％細胞條件培養基。對於無血清培養基，一般的深低溫保藏配劑包括具有含有7.5％DMSO的50％新鮮無血清培養基的50％細胞條件無血清培養基；或者含有7.5％DMSO和10％細胞培養級DMSO的新鮮無血清培養基。優選地，將含有大約106-大約107個細胞/ml的細胞懸浮液與深低溫保藏培養基混合。
將細胞與深低溫保藏培養基在小瓶或其他適合於冷凍貯存的容器中混合，例如NUNC@CRYOTUBESTM(可從Applied Scientific of SouthSan Francisco，California獲得)。細胞還可以等分成小份置於多孔平板的小孔中，例如設計用於高通量測定的96孔平板，並以平板形式進行冷凍。
細胞優選地以大約-1℃/分鐘的速率從室溫冷卻至貯存溫度。冷卻的速率可以進行控制，例如通過將含有細胞的小瓶置於絕熱的注滿水的具有大約1升液體容量的儲存器中，然後將這樣的立方體置於-70℃機械冷凍機中。可選擇地，細胞冷卻速率可以通過如下方法控制在大約-1℃/分鐘，即將小瓶浸入一定體積的液體冷凍劑如脂肪醇中，液體冷凍劑的體積比待冷凍的細胞培養物的總體積大15倍，然後將浸沒的培養瓶置於溫度為低於-70℃的常規冷凍機中。也可使用用於冷凍細胞的商業設備，例如Planer Mini-Freezer R202/20OR(Planer ProductsLtd.of Great Britain)和BF-5 Biological Freezer(Union CarbideCorporation of Danbury，Connecticut，United States of America)。優選地，經冷凍的細胞在大約-70℃-大約-80℃或低於該溫度處進行貯存，更優選地在大約-130℃或低於該溫度處進行貯存。
為了獲得儘可能的細胞存活，細胞的解凍必須儘可能快地進行。一旦小瓶或其他含有冷凍細胞的儲存器結束貯存，其應當直接置於37℃水浴中，並輕輕地搖動直至其完全解凍。如果細胞對於冷凍保護劑特別敏感，則在進一步生長之前將細胞離心以除去冷凍保護劑。
用於製備和操作冷凍細胞的其它方法可以在下列文獻中找到，即Freshney(1987)Culture of Animal CellsA Manual of BasicTechnique，第2版，A.R.Liss，New York；以及U.S.專利號6,176,089；6,140,123；5,629,145；和4,455,842等等。
V.轉基因動物本發明還提供了具有T2R76基因表達受到破壞和可選地具有另一個T2R破壞子(disruptor)的轉基因動物。改變的基因表達可以包括T2R76基因的經改變的水平或突變變體的表達。本發明提供了編碼T2R76的核酸，該核酸可用於製備用於產生轉基因動物的構建體。還提供了對於製備靶向T2R76座位的構建體有用的基因組定位數據。
在本發明的一個實施方案中，轉基因動物可以包括小鼠T2R76座位經靶向修飾的小鼠，和可以進一步包括在所有體細胞中具有T2R76基因的完全或部分功能失活的小鼠品系。
在一個可選擇的實施方案中，根據本發明的轉基因動物用由通用或組織特異性啟動子所驅動的反義或核酶T2R76構建體來製備，以降低T2R76基因在體細胞中的表達水平，因此獲得「擊倒(knock-down)」表型。本發明還提供了產生具有T2R76的條件型或可誘導型失活的鼠科動物品系。這樣的鼠科動物品系還可以包含附加的合成或天然存在的突變，例如在任何其他T2R基因中的突變。
本發明還提供了在T2R76基因中具有特異的「敲入(knocked-in)」修飾的小鼠品系，例如以形成過表達或顯性失活表型。因此，「敲入(knocked-in)」修飾包括編碼T2R76多肽的核酸的野生型和突變形式的表達。
用於製備轉基因動物的技術在本領域中是已知的。範例性的技術在下列文獻中進行了描述，即U.S.專利號5,489,742(轉基因大鼠)；U.S.專利號4,736,866、5,550,316、5,614,396、5,625,125和5,648,061(轉基因小鼠)；U.S.專利號5,573,933(轉基因豬)；5,162,215(轉基因鳥類物種)和U.S.專利號5,741,957(轉基因牛科物種)，在此引用這些文獻的全文作為參考。
例如，本發明的轉基因動物可以包括小鼠T2R76經靶向修飾的小鼠。使用鼠科動物胚胎幹細胞中位點特異性重組的標準技術可以形成在所有體細胞中具有T2R76基因的完全或部分功能失活的小鼠品系。見Capecchi(1989)Science 2441288-1292；Thomas Capecchi(1990)Nature 346847-850；和Delpire等人(1999)Nat Genet22192-195。
VI.T2R76抗體在本發明的另一個方面中，提供了用於生產與T2R76多肽特異地結合的抗體的方法。根據該方法，配製全長的重組T2R76多肽，從而其可用作有效的免疫原，並用於免疫接種動物以在動物中形成免疫反應。免疫反應的特徵在於產生能夠從動物血清中收集的抗體。本發明還提供了通過使用此處公開的新型T2R76多肽(包括SEQ ID NO2)的方法而生產出的抗體。
術語「抗體」是指免疫球蛋白或者其功能部分，包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、雜合抗體、單鏈抗體、經誘變的抗體、人源化抗體和含有抗原結合部位的抗體片段(例如Fab和Fv抗體片段)。在本發明的一個優選實施方案中，T2R76抗體包括單克隆抗體。因此，本發明還包括抗體和產生此處描述的單克隆抗體的細胞系。
當用於描述抗體與T2R76多肽的結合時，術語「特異地結合」是指在其他多肽的異質混合物中與T2R76多肽結合。
短語「基本上缺乏結合」或「基本上沒有結合」在此處用於描述抗體與對照多肽或樣品的結合，其是指包括非特異性或背景結合但不包括特異性結合的結合水平。
用於製備和表徵抗體的技術在本領域中是已知的。見例如Harlow Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；以及U.S.專利號4,196,265；4,946,778；5,091,513；5,132,405；5,260,203；5,677,427；5,892,019；5,985,279；和6,054,561。
如此處公開所製備的T2R76抗體可以用於本領域中已知的與T2R76多肽的定位和活性相關的方法，例如用於克隆編碼T2R76多肽的核酸、T2R76多肽的免疫純化、生物樣品中T2R76多肽的成像和測量合適的生物樣品中T2R76多肽的水平。為了施行這樣的方法，本發明的抗體可以進一步含有可檢測的標記，包括放射性標記、螢光標記、表位標記和能夠體內檢測的標記，但並不局限於此。用於選擇適合於特定檢測技術的標記的方法和用於將可檢測的標記與抗體綴合或連接的方法對於本領域熟練技術人員來說是已知的。
VIII.T2R76調節劑本發明進一步公開了用於鑑定T2R76活性的調節劑的測定法。測定法可以使用上文中公開的用於表達T2R76多肽的系統，或者在這樣的系統中產生的分離的T2R76多肽，其中這種T2R多肽可以與其他T2R多肽一起表達。本發明還提供了使用所公開的方法鑑定出的T2R76活性的調節劑。
術語「調節」表示T2R76多肽的任何或所有化學和生物活性或特性的增加、減少或其他改變。因此，用於鑑定調節劑的方法包括測定T2R76功能的水平或質量。
用於鑑定T2R76功能的調節劑的方法可以包括(a)提供重組表達系統，由此在宿主細胞中表達T2R76多肽，其中T2R76多肽包含T2R76多肽；(b)向(a)的系統提供測試物質；(c)在存在測試物質的情況下測定T2R76功能的水平或質量；(d)將T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量與T2R76功能的對照水平或質量進行比較；和(e)當與T2R76功能的對照水平或質量進行比較時，通過確定T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量有顯著變化而鑑定測試物質為T2R76調節劑。在一些實施方案中，表達系統還會提供T2R76與至少一種其他T2R共表達。
T2R76活性的對照水平或質量是指野生型T2R76活性的水平或質量。優選地，用於T2R76多肽的重組表達的系統包含SEQ ID NO2。當評測測試物質的調節能力時，T2R76活性的對照水平或質量包括在不存在測試物質的情況下的水平或質量。
術語「顯著改變」在此處用於指改變的T2R多肽例如T2R76多肽的水平或活性，和用於指可測量的質量的定量變化，該變化比測量技術的固有誤差的限度大，優選為相對於對照測量結果來說大約2倍或更大的增加或減少，更優選為大約5倍或更大的增加或減少，和最優選為大約10倍或更大的增加或減少。
在本發明的一個實施方案中，測定T2R76功能包括測定T2R76基因表達的水平。
在本發明的另一個實施方案中，測定T2R76功能包括測定重組表達的T2R76多肽的結合活性。例如，T2R76活性可以包括調節劑與T2R76多肽結合的數量或強度。
在本發明的另一個實施方案中，測定T2R76功能可以包括測定T2R76多肽的活性構象。
在本發明的一個優選實施方案中，測定T2R76功能包括測定對於配體或調節劑與T2R76多肽結合作出響應的細胞內信號傳導事件的活化。例如，可以通過測量[35S]GTPγS與T2R76多肽結合的數量來測定配體介導的對G蛋白交換活性的刺激，這將在下文和實施例3中進一步進行描述。
通過公開的方法所鑑定的調節劑可以包括激動劑和拮抗劑。在此處使用時，術語「激動劑」表示激活、增強或強化T2R76多肽的生物活性的物質。在此處使用時，術語「拮抗劑」是指阻斷或降低T2R76多肽的生物活性的物質。調節劑還可以包括與T2R76多肽特異地結合的配體或物質。用於確定T2R76調節劑的活性和結合測定法可以在體外或體內進行。
在本發明的一個實施方案中，這樣的測定法可用於鑑定T2R76調節劑，這種T2R76調節劑能夠開發成為用於改變口服使用的組合物的味道的添加劑，這些口服使用的組合物包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品和藥物，但並不局限於此，這將在下文中於標題「應用」下進行進一步的描述。例如，T2R76的抑制劑可以用於減少苦味。
在本發明的另一個實施方案中，這樣的測定法可用於鑑定T2R76調節劑，這種T2R76調節劑能夠開發成為用於改變可能但不希望口服使用的化合物的味道的添加劑，這些化合物例如為家用清潔劑、毒藥等等。因此，T2R76的激動劑可以用於引起或增加組合物的苦味，由此阻止其口服使用。
在本發明的另一個實施方案中，可以施行使用重組T2R76多肽的測定法以用於預篩選生物活性試劑的目的，其中該試劑和T2R76之間的相互作用是不希望的。例如，想要施用給受試者的藥物可以就能夠導致不希望的苦味的T2R76調節活性進行測試。
在本發明的另一個實施方案中，此處公開的測定法可以用於表徵突變的T2R76多肽，例如與苦味感受的差異相關的突變多肽。突變的T2R76多肽的重組表達將會進一步允許疾病相關的T2R76多肽的分析。
本發明還提供了依賴於此處描述的方法的快速和高通量篩選方法。該篩選方法包括分別將T2R76多肽與大量測試物質接觸。在這樣的篩選方法中，目標物質的數量優選地包含多於大約104個樣品，或更優選地包含多於大約105個樣品，和更加優選地包含多於大約106個樣品。
本發明的體外和細胞測定法可以包括溶解的測定物，或者可以進一步包括固相基質以固定該測定系統的一種或多種組分。例如，T2R76多肽或表達T2R76多肽的細胞，和可選地另一種T2R多肽可以通過共價或非共價連接而直接與固態組分結合。此外，可選地，結合可以包括介導T2R76多肽與基質的間接結合的連接體分子或標記物。
代表性的連接體包括已知的結合對(例如生物素和抗生物素蛋白)、識別已知抗原的抗體、合成的多聚體(例如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚醯胺、聚乙烯亞胺、聚芳撐硫化物、聚矽氧烷、聚醯亞胺和聚乙酸酯)、肽、醚。連接體可以可選地包括柔性連接體，例如聚(乙二醇)連接體(可從Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，Alabama，United States of America獲得)。可選地，連接體可以進一步包括醯胺、巰基或雜官能結合位點。
連接體可以用各種現行方法中的任何一種附著於固體基質上，包括基質的衍生，由此其通過使用熱或紫外線交聯的非化學方法與連接體反應。例如，可在下列文獻中找到代表性的方案，即Merrifield(1963)J Am Chem Soc 852149-2154(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等人(1987)J Immun Meth 102259-274(描述了在針上的固相組分的合成)；Frank boring(1988)Tetrahedron 446031-6040(描述了在纖維素盤上的各種肽序列的合成)；Fodor等人(1991)Science 251767-777；和Kozal等人(1996)Nat Med 2(7)753-759(描述了固定於固體基質的生物多聚體的陣列)，Merrifield(1963)J Am Chem Soc 852149-2154(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等人(1987)J Immun Meth 102259-274(描述了在針上的固相組分的合成)；Frank Doring(1988)Tetrahedron 446031-6040(描述了在纖維素盤上的各種肽序列的合成)；Fodor等人(1991)Science251767-777；和Kozal等人(1996)Nat Med 2(7)753-759(描述了固定於固體基質的生物多聚體的陣列)等等。
VII.A.測試物質使用本發明的方法測定的潛在調節劑包括候選物質。在此處使用時，術語「候選物質」和「測試物質」可互換使用，它們每一個都是指被懷疑與T2R76多肽相互作用的物質，包括任何合成的、重組的或天然的產物或組合物。被懷疑與多肽相互作用的測試物質可以用此處公開的方法就這種相互作用進行評測。
代表性的測試物質包括肽、寡聚體、核酸(例如適配子(aptamer))、小分子(例如化學化合物)、抗體或其片段、核酸-蛋白質融合物、任何其他的親和試劑及其組合，但並不局限於此。測試物質另外可以包括糖、維生素或其衍生物、激素、神經遞質、病毒或其受體結合結構域、視蛋白(ops)或視紫紅質、增味劑、信息素、毒素、生長因子、血小板活化因子、神經活性肽或者神經激素。優選地，候選物質引起苦味感受。待測試的候選物質可以為純化的分子、同質的樣品或者分子或化合物的混合物。
術語「小分子」在此處用於指這樣的化合物，例如有機化合物，其分子量小於大約1,000道爾頓，更優選地小於大約750道爾頓，更加優選地小於大約600道爾頓，和更為優選地小於大約500道爾頓。小分子的計算出的辛醇-水分配係數的log值優選地位於大約-4至大約+14的範圍內，更優選地位於大約-2至大約+7.5的範圍內。
測試物質可以作為文庫而獲得或製備。在此處使用時，術語「文庫」表示分子的集合。文庫可以含有少量或大量的不同的分子，其數量從大約十個分子至幾十億個分子或更多。分子可以包括天然存在的分子、重組分子或合成的分子。文庫中的大量的測試物質可以同時進行測定。可選地，可以匯集來自不同文庫的測試物質以用於同時評測。
代表性的文庫包括肽文庫(U.S.專利號6,156,511、6,107,059、5,922,545和5,223,409)、寡聚體文庫(U.S.專利號5,650,489和5,858,670)、適配子文庫(U.S.專利號6,180,348和5,756,291)、小分子文庫(U.S.專利號6,168,912和5,738,996)、抗體或抗體片段文庫(U.S.專利號6,174,708、6,057,098、5,922,254、5,840,479、5,780,225、5,702,892和5,667,988)、核酸-蛋白質融合物文庫(U.S.專利號6,214,553)和能夠潛在地與T2R76多肽結合的任何其他親和性試劑的文庫(例如U.S.專利號5,948,635、5,747,334和5,498,538)，但並不局限於此。
文庫可以包括分子的隨機集合。可選擇地，文庫可以包括對於特定序列、結構或構象具有偏好的分子的集合。見例如U.S.專利號5,264,563和5,824,483。用於製備含有各種類型分子的不同類群的文庫的方法在本領域中是已知的，例如這些方法在上面引用的U.S.專利中進行了描述。許多的文庫還是商購可得的。
VII.B.結合測定法在本發明的另一個實施方案中，用於鑑定T2R76調節劑的方法包括測定測試物質與T2R76多肽或者與含有T2R76多肽和一種或多種其它T2R多肽的雜合(heteromenic)受體的特異性結合。術語「結合」是指兩個分子之間的親和性。優選地，特異性結合還包括相互作用的質量或狀態，從而一種蛋白質或化合物對於另一種蛋白質的活性是抑制的(在抑制劑或拮抗劑的情況下)或增強的(在激活劑或激動劑的情況下)。
當指候選調節劑的結合能力時，短語「特異(或選擇性)地結合」是指在蛋白質或其他生物材料的異質群體中由蛋白質的存在所決定的結合反應。如果結合親和性為大約1×104M-1-大約1×106M-1或更高，則可以認為調節劑與T2R76多肽的結合是特異的。短語「特異地結合」還指飽和結合。為了證明測試物質與T2R76多肽的可飽和結合，可以例如依照Mak等人，(1989)J Biol Chem 26421613-21618的描述進行Scatchard分析。
短語「基本上缺乏結合」或「基本上沒有結合」在此處用於描述調節劑與對照多肽或樣品的結合，其是指包括非特異性或背景結合但不包括特異性結合的結合水平。
可以使用幾項技術來檢測T2R76多肽和測試物質之間的相互作用，而不使用已知的競爭性調節劑。代表性的方法包括螢光相關光譜學、表面增強雷射解吸/電離飛行時間光譜學和Biacore技術，每項技術都在下文中描述，但並不局限於此。這些方法都可適應於自動的、高通量的篩選。
螢光相關光譜學(FCS)測量小樣品體積中的螢光分子的平均擴散率(Tallgren，1980)。樣品大小可以低至103個螢光分子，樣品體積可以低至單個細菌的細胞質。擴散率是分子質量的函數，並隨著質量的增加而減少。因此，FCS可應用於多肽-配體相互作用分析，這是通過測量在結合時分子質量的變化和因此分子擴散率的變化而進行的。在通常的試驗中，待分析的目標(例如T2R76多肽)表達為具有序列標籤如多組氨酸序列的重組多肽，該序列標籤插入在N-末端或C-末端。在宿主細胞如大腸桿菌、酵母、爪蟾卵母細胞或哺乳動物細胞中介導表達。用層析方法純化多肽。例如，多組氨酸標籤可以用於將表達的多肽與金屬螯合物柱如螯合在亞氨基二乙酸瓊脂糖上的Ni2+結合。然後用螢光標籤如羧基四甲基羅丹明或BODIPYTm反應物(可從Molecular Probes of Eugene，Oregon獲得)標記多肽。然後將多肽在溶液中暴露於潛在配體，並通過使用可從Carl Zeiss，Inc.(Thornwood，New York)獲得的儀器的FCS來測定其擴散率。配體結合通過多肽的擴散率的變化來測定。
表面增強雷射解吸/電離(SELDI)是由Hutchens Yip(1993)Rapid Commun Mass Spectrom 7576-580開發出的。當與飛行時間質譜儀(TOF)偶聯時，SELDI提供了用於快速分析保持在晶片上的分子的技術。其可通過將目標蛋白質或其部分共價結合在晶片上並通過質譜儀分析與該蛋白質結合的小分子而應用於配體-蛋白質相互作用分析(Worrall等人，1998)。在一個典型的試驗中，重組表達目標多肽(例如T2R76多肽)並進行純化。目標多肽通過使用多組氨酸標籤或者通過其他相互作用如離子交換或疏水相互作用而與SELDI晶片結合。然後將如此製備的晶片例如通過能夠以順次的方式吸取配體的遞送系統(自動取樣器)暴露於潛在的配體。然後將晶片在逐漸增加嚴緊性的緩衝溶液中洗滌，例如一系列使用含有逐漸增加的離子強度的緩衝溶液的洗滌。在每次洗滌之後，通過將晶片進行SELDI-TOF而分析結合的材料。與目標多肽特異地結合的配體通過洗脫他們所需的洗滌嚴緊性來進行鑑定。
Biacore依賴於當配體與固定在層上的目標多肽(例如T2R76多肽)結合時表面層的折射率的變化。在該系統中，將小配體的集合順次注射入2-5微升小室中，其中目標多肽固定在小室內。結合採用通過記錄雷射從表面的折射的表面等離子體共振(SPR)(surfaceplasmon resonance)來檢測。通常，對於質量濃度的給定變化，在表面層上的折射率的變化實際上對於所有的蛋白質和肽是同樣的，這就提供了可對於任何蛋白質應用的簡單方法(Liedberg等人，1983)。在一個典型的試驗中，重組表達目標蛋白質，純化，並結合到Biacore晶片上。可以通過使用多組氨酸標籤或者通過其他相互作用如離子交換*或疏水相互作用來促進結合。然後將如此製備的晶片通過整合入Biacore(Uppsala，Sweden)所售儀器中而以順次的方式吸取配體的遞送系統(自動取樣器)暴露於一種或多種潛在的配體。記錄晶片上的SPR信號，折射率的變化表明固定的目標和配體之間的相互作用。結合速率(on rate)和解離速率(off rate)的信號動力學分析使得能夠區分非特異性和特異性相互作用。還可見Homola等人(1999)Sensors and Actuators 543-15和其中的參考文獻。
VII.C.構象測定法本發明還提供了用於鑑定T2R76調節劑的方法，該方法依賴於單獨表達或與其它T2R多肽聯合表達的T2R76多肽在與T2R76調節劑結合或相互作用時的構象變化。
對於大分子溶液應用圓二色性揭示了這些大分子的構象狀態。該技術能夠區分隨機捲曲、α-螺旋和β-鏈構象狀態。
為了鑑定T2R76多肽的調節劑，可以使用重組表達的T2R76多肽來施行圓二色性分析。例如通過離子交換層析和大小排阻層析純化T2R76多肽，並與測試物質混合。將混合物進行圓二色性分析。將T2R76多肽在存在測試物質時的構象與T2R76多肽在不存在測試物質時的構象進行比較。因此，T2R76多肽在存在測試物質時的構象狀態的變化可以用於鑑定T2R76調節劑。代表性的方法描述於U.S.專利號5,776,859和5,780,242。T2R76多肽可以包含在含有其它T2R多肽的雜合(heteromenic)受體中。
VII.D.受體活化分析在本發明的一個優選實施方案中，用於鑑定T2R76調節劑的方法使用了功能性T2R76多肽。此處公開的新型T2R76多肽包括SEQ IDNO2。用於測定T2R76功能的代表性方法包括測定配體介導的細胞內信號傳導事件的活化，這在下文中進行描述。
測試物質對於T2R76功能的影響可以包括測定T2R76活性所引起的任何生理變化，包括T2R76多肽的磷酸化、G蛋白與T2R76多肽的結合、表達T2R76多肽的細胞中的離子流量、基因轉錄的變化、細胞代謝的變化(例如細胞生長)、細胞內第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP、cAMP)的變化和遞質或激素釋放的變化，但並不局限於此。GPCR信號轉導和用於測定GPCR信號轉導的方法描述於Methods and Enzymology237和238卷(1994)。還可見Berridge Irvine(1984)Nature312315-321；Bourne等人(1991)Nature 10349117-27；Bourne等人(1990)Nature 348125-32；Felley-Bosco等人(1994)Am JResp Cell and Mol Biol 11159-164；Mistili Spector(1997)NatBiotech 15961-964；Offermanns Simon(1995)J Biol Chem27015175-15180；Pitcher等人(1998)Annu Rev Biochem67653-92；和U.S.專利號4,115,538；5,436,128；6,004,808；6,403,305和6,255,059。
在本發明的一個優選實施方案中，測定T2R76功能包括測定單獨或與其它T2R多肽聯合重組表達的T2R76多肽與吉特先或者混雜的G蛋白如Gq或轉導素的偶聯。因此，T2R76活性的代表性水平可以包括如實施例3中所述的吉特先上GDP與GTPγS的交換數量。T2R76活性的代表性質量例如可以包括G蛋白亞基的選擇性活化。
根據該方法，可以試劑盒的形式提供表達T2R76的細胞，該試劑盒可用於施行T2R76功能的測定。因此，細胞可以如上所述進行冷凍，並在保持冷凍狀態的同時運送至其他施行測定的地方。例如，在本發明的一個實施方案中，提供一個測試試劑盒以檢測T2R76調節劑，該試劑盒包含(a)用編碼全長T2R76多肽的DNA轉染的冷凍細胞；和(b)用於生長細胞的培養基。
優選地，在這樣的測定法中所使用的細胞包括基本上沒有天然T2R76和與T2R76基本上類似的多肽的細胞。優選的細胞包括真核細胞，例如HEK-293細胞。
此處用於描述宿主細胞或對照細胞的術語「基本上沒有」是指具有下列水平的質量，即天然T2R76水平、與T2R76基本上類似的多肽的水平或者其活性水平，包括背景水平。術語「背景水平」包括通常在沒有T2R76和沒有與T2R76多肽基本上類似的多肽的細胞中所檢測到的表達或活性的非特異性測量值。
在本發明的測定法中所使用的細胞優選地含有能夠將T2R76受體與細胞內信號傳導途徑偶聯的功能性G蛋白。在本發明的一個實施方案中，功能性G蛋白可以含有顯示出混雜偶聯的G蛋白，例如Gα15和Gα16。見Wilkie等人(1991)Proc Nad Acad Sci USA8810049-10053和U.S.專利號6,004,808。
也是優選地，所有使用表達重組T2R76的細胞的測定法另外還使用基本上沒有天然T2R76和與T2R76多肽基本上類似的多肽的對照細胞。當使用瞬時轉染的細胞時，對照細胞例如可以包括未轉染的宿主細胞。當使用表達T2R76多肽的穩定細胞系時，對照細胞例如可以包括用於衍生出表達T2R76的細胞系的親本細胞系。
使用瞬時轉染的細胞的T2R76活性的測定法優選地包括區分轉染的細胞與未轉染的細胞的標記。術語「標記」是指任何可用於區分重組表達T2R76的細胞與不重組表達T2R76多肽的細胞的可檢測分子。優選地，標記由用於T2R76表達的構建體編碼或者與之相聯合，從而同時用編碼T2R76和標記的核酸分子轉染細胞。代表性的可用作標記的可檢測分子包括異源核酸、由轉染的構建體編碼的多肽(例如酶或螢光多肽)、結合蛋白和抗原，但並不局限於此。例如，標記可以包括視紫紅質標籤，其可以如實施例2所述通過免疫學進行檢測。
可用作標記的酶的實例包括磷酸酶(例如酸性或鹼性磷酸酶)、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶、碳酸酐酶、乙醯膽鹼酯酶、葡糖澱粉酶、馬來酸脫氫酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、β-葡糖苷酶、蛋白酶、丙酮酸脫羧酶、酯酶、螢光素酶、醇脫氫酶或過氧化物酶(例如辣根過氧化物酶)。
包含酶的標記可以基於酶的活性而進行檢測。因此，加入底物以催化反應，該反應的終產物例如可用分光光度計、發光計或螢光計檢測。用於上述酶的反應並產生可檢測的反應產物的底物對於本領域熟練技術人員來說是已知的。
優選的標記包括在不存在添加的底物的情況下可檢測的所編碼的多肽。可以直接檢測的代表性的多肽包括GFP和EGFP。已經開發出普通的研究設備以施行螢光例如GFP和EGFP螢光的高通量檢測，包括來自GSI Lumonics(Watertown，Massachusetts，United States ofAmerica)、Amersharn Pharmacia Biotech/Molecular Dynamics(Sunnyvale，California，United States of America)、AppliedPrecision Inc.(Issauah，Washington，United States of America)和Genomic Solutions Inc.(Ann Arbor，Michigan，United Statesof America)的設備。這些商業系統中的大多數使用某種形式的具有光電倍增管檢測的掃描技術。
VII.E.合理設計天然T2R76多肽的結構的知識提供了用於合理設計調節劑和診斷劑的方法。簡短地說就是，T2R76多肽的結構可以通過X-射線晶體學和/或通過產生三維圖像的計算算法而確定。見Saqi等人(1999)Bioinformatics 15521-522；Huang等人(2000)Pac Symp Biocomput230-241；和PCT國際公開號WO 99/26966。可選擇地，T2R76多肽結構的工作模型可以通過同源模擬而衍生出來(Maalouf等人，1998)。計算機模型能夠進一步預測蛋白質結構與各種底物分子的結合，可以合成這些底物分子，並用上述測定法進行測試。另外的化合物設計技術描述於U.S.專利號5,834,228和5,872,011。
一般地，T2R76多肽是膜蛋白，和能夠通過使用去汙劑或其他合適的兩親性分子而以溶解的形式純化出來。結果所得的T2R76多肽具有足夠的純度和濃度以用於結晶。經純化的T2R76多肽優選地在還原或非還原的聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)中跑出單一的條帶。經純化的T2R76多肽可以在至少一種下列條件的變化條件下結晶pH、緩衝液類型、緩衝液濃度、鹽類型、聚合物類型、聚合物濃度、其他沉澱性配體和經純化的T2R76的濃度。用於產生結晶多肽的方法在本領域中是已知的，和相當適合於測定此處公開的T2R76多肽。見例如Deisenhofer等人(1984)J Mol Biol 180385-398；Weiss等人(1990)FEBS Lett 267268-272；或者在商業試劑盒如CRYSTAL SCREENTM試劑盒(可從Hampton Research of Riverside，California，UnitedStates of America獲得)中所提供的方法。
結晶的T2R76多肽可以就功能活性進行測試，並且不同大小和形狀的晶體進一步就在X-射線衍射中的適宜性進行測試。一般地，較大的晶體比較小的晶體提供了更好的晶體學，較厚的晶體比較薄的晶體提供了更好的晶體學。優選地，T2R76晶體的大小在0.1-1.5mm內變化。這些晶體衍射X-射線至少具有10解析度，例如1.5-10.0或其中任何的值範圍，如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5或3，其中對於最高的解析度來說3.5或更小是優選的。
VIII.檢測T2R76多肽的方法本發明進一步提供了用於檢測T2R76多肽的方法。所公開的方法可以用於測定T2R76表達的改變的水平，該表達水平是與味覺中的T2R76相關差異相聯繫的。
在本發明的一個實施方案中，該方法包括用特異識別T2R76多肽的抗體施行免疫化學反應，其中根據本發明用於產生這樣的抗體的方法來製備抗體。因此，該方法包括(a)獲得含有肽材料的生物樣品；(b)將生物樣品與抗體接觸，該抗體特異地結合T2R76多肽，並是根據公開的所述方法進行生產的，其中該抗體含有可檢測的標記；和(c)檢測可檢測的標記，由此檢測樣品中的T2R76多肽。
用於檢測這樣的抗體-抗原綴合物或複合物的技術在本領域中是已知的，其包括離心、親和層析和其他免疫化學方法，但並不局限於此。見例如Manson(1992)Immunochemical Protocols.Humana Press，Totowa，New Jersey，Unites States of America；Ishi kawa(1999)Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay.Elsevier，Amsterdam/New York，Unites States of America；Law(1996)ImmunoassayPractical Guide.Taylor Francis，London/Bristol，Pennsylvania，Unites States of America；Chan(1996)ImmunoassayAutomationAn Updated Guide to Sys tems.Academic Press，SanDiego；Liddell Weeks(1995)Antibody Technology.BiosScientific Publishers，Oxford，United Kingdom；Masseyeff等人(1993)Methods of Immunological Ana lysis.VCHVerlagsgesellschaft/VCH Publishers，Weinheim，FederalRepublic of Germany/New York，Unites States of America；Walker Rapley(1993)Molecular and Antibody Probes in Diagnosis.Wiley，Chichester，New York；Wyckoff等人(1985)DiffractionMethods for Biological Macromolecules.Academic Press.Orlando，Florida，Unites States of America；和其中引用的文獻。
在本發明的另一個實施方案中，顯示出與T2R76多肽特異地結合的調節劑用於檢測T2R76多肽。與使用抗體檢測T2R76多肽類似，該方法包括(a)獲得含有肽材料的生物樣品；(b)將生物樣品與T2R76多肽的調節劑接觸，其中該調節劑含有可檢測的標記；和(c)檢測可檢測的標記，由此檢測樣品中的T2R76多肽。可以使用任何合適的可檢測的標記，例如螢光團或表位標記。
IX.應用本發明提供了用於鑑定T2R76多肽的調節劑的方法。本發明的調節劑可用於改變苦味感受，例如抑制或增強苦味感受。
IX.A.受試者在此處使用時，術語「受試者」包括任何脊椎動物物種，優選為溫血脊椎動物如哺乳動物和鳥類。更特定地，本發明的方法計劃在哺乳動物如人以及下列那些哺乳動物中治療腫瘤，即由於瀕臨滅絕而具有重要性的哺乳動物(如西伯利亞虎)，對人具有經濟重要性的哺乳動物(飼養在農場中用於人類消費的動物)和/或對人具有社會重要性的哺乳動物(作為寵物或在動物園中飼養的動物)，例如除人之外的食肉動物(如貓和狗)、豬科動物(家豬、公豬和野豬)、反芻動物和家畜(如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝)以及馬。還計劃用於治療鳥類，包括那些瀕臨滅絕或在動物園中飼養的鳥類，以及禽鳥，更特定地為經馴養的禽鳥或家禽，如火雞、雞、鴨、鵝、珍珠雞等等，他們對人也具有經濟上的重要性。
IX.B.組合物根據本發明的方法，用於施用以便在受試者中改變味覺的組合物含有有效量的T2R76調節劑。T2R76調節劑可以包括任何類型的上述測試物質。如此處所公開的而鑑定出的T2R76調節劑可用於製備用於口服使用的組合物，包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品和藥物，但並不局限於此，例如下文中列出的那些化合物中的任何一種。T2R76調節劑還可用作改變可能但不希望口服使用的化合物的味道的添加劑，這些化合物例如為家用清潔劑、毒藥等等。
具有不希望的味道或苦味的代表性食品包括柑橘類水果如柚子、橙和檸檬；蔬菜如西紅柿、多香果、芹菜、甜瓜、胡蘿蔔、馬鈴薯和蘆筍；調味品或調味料如香料、沙司、醬油和辣椒；源自大豆的食品；乳狀食品如奶油、敷料、蛋黃醬和人造奶油；經加工的海洋產品如魚肉、底棲魚肉和魚卵；堅果如花生；發酵的食品如發酵的大豆；肉和經加工的肉；醃菜；麵條；湯，包括粉狀湯；奶製品如乾酪；麵包和蛋糕；甜食如糖果、口香糖和巧克力；以及對於健康專門製備的食品，但並不局限於此。
引起苦味的代表性化妝品(例如皮膚洗液、乳膏、面霜、口紅、粉底、剃鬚製劑、剃鬚後洗液、清潔泡沫和清潔凝膠)包括但不限於那些這樣的組合物，即他們含有表面活性劑如烷基硫酸鈉和單烷基磷酸鈉；香氣物質如甲醇、裡哪醇、苯乙醇、丙酸乙酯、香葉醇、乙酸裡哪酯和乙酸苄酯；抗微生物劑如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯；溼潤劑如乳酸和乳酸鈉；醇變性劑如蔗糖八乙酸酯和番木鱉儉；以及收斂劑如乳酸鋁。
具有苦味的代表性藥物包括對乙醯氨基酚、特費定、愈創甘油醚、甲氧苄啶、潑尼松龍、布洛芬、潑尼松龍磷酸鈉、乙醯甲膽鹼、新斯的明、腎上腺素、沙丁胺醇、鹽酸偽麻黃鹼、苯海拉明、馬來酸氯苯那敏、吩噻嗪、氯丙嗪、氯氮、阿米替林、巴比妥酸鹽、苯妥英、咖啡因、嗎啡、地美露、可待因、複方苯乙哌啶片劑、利多卡因、水楊酸、磺胺類藥、氯喹、維生素製劑、礦物質和青黴素。
調節劑也可以作為所製備的食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品或藥物的一部分進行施用。為了製備用於施用給受試者的組合物，可以這樣的數量將T2R76調節劑與味道將被調節的化合物混合，該數量包括大約0.001wt％-大約10wt％，優選為大約0.01wt％-大約8wt％，更優選為大約0.1wt％-大約5wt％，和最優選為大約0.5wt％-大約2wt％。
合適的配劑包括溶液、提取物、酏劑、醑劑、糖漿、懸浮液、粉劑、粒劑、膠囊、丸劑、片劑和氣霧劑。可選地，配劑可以包含藥物上可接受的載體、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑、防腐劑、調味劑、著色劑、增甜劑、香料或者其組合。T2R76調節劑和組合物可以存在於單劑量或多劑量密封容器中，例如安瓿瓶和小瓶。
IX.C.施用T2R76調節劑可以直接施用給受試者以調節味覺。優選地，口服施用或鼻部施用本發明的調節劑。
根據本發明的方法，將有效量的T2R76調節劑施用給受試者。術語「有效量」是指足夠用於調節T2R76活化和/或調節苦味感受的組合物的數量。
可以改變有效量，從而施用可有效地獲得所希望的味覺感受的數量的T2R76調節劑。所選擇的劑量水平將依賴於各種因素，包括T2R76調節劑的活性、配劑、與其他組合物(例如食品、藥物等等)的聯合、所希望的用途(例如作為食品添加劑、牙膏等等)以及待治療的受試者的身體狀態和以前的醫療史。
有效量或劑量可以用味覺的體內測定法容易地確定，這在本領域中是已知的。用於測定味覺的代表性方法描述於實施例4中。
實施例已經包括了下列的實施例來舉例說明本發明的模式。下列實施例的某些方面依照本發明共同發明人所發現和認為能夠在本發明實踐中良好運作的技術和程序進行描述。這些實施例舉例說明了共同發明人的標準實驗室操作。按照本公開內容和本領域熟練技術人員的一般水平，那些熟練技術人員會意識到下列實施例僅是範例性的，並可以使用許多的變化、修改和改變而不背離本發明的範圍。
實施例1.人T2R76的克隆。
在人基因組序列資料庫中鑑定編碼人苦味受體的新型基因。新型hT2R成員即hT2R76位於人7號染色體上。通過篩選California大學(Santa Cruz，California)基因組學網站而確定T2R76DNA序列的染色體定位。該分析顯示出T2R76位於7號染色體的144062692-144063648區域內。某些化合物如phenylthiocarbarnate的苦味在遺傳上與5和7號染色體(Guo等人(2001)Ann Hum Biol28111-42)連鎖。因此，預測T2R76參與了某些苦味劑的結合和識別。
首先，通過用前述的hT2R序列進行DNA序列資料庫的重複序列搜索來鑑定人T2R76。然後通過基因組DNA的PCR擴增而分離出編碼hT2R76的全長可讀框。hT2R76的胺基酸序列通過相應可讀框的概念翻譯而推導出來。hT2R76核苷酸和胺基酸序列分別以SEQ ID NO1和SEQID NO2而列出。
hT2R76的無內含子的可讀框編碼長度為318個胺基酸殘基的推定的受體蛋白。用BLASTP算法將hT2R76蛋白質序列與公共序列資料庫中的所有已知蛋白質進行比較，該比較揭示出其與哺乳動物苦味受體家族具有很強的同源性。
實施例2.rhod-hT2R76的構建。
橋疊PCR延伸技術用於產生rhod-hT2R76嵌合體，其含有與人T2R76編碼序列按讀碼框連接的牛視紫紅質的前38個胺基酸，這在Chandrashekar等人(2000)Cell 100703-711中進行了描述。然後將嵌合的rhod-hT2R76基因克隆進pFastBac-1載體中，並用Bac-to-Bac系統(Invitrogen Corporation of Carls bad，Cali fornia，United States of America)來生產包含具有視紫紅質標籤的hT2R76的杆狀病毒。通過使用抗視紫紅質標籤抗體(136-30)的免疫印跡來確認hT2R76的表達。用編碼hT2R76的杆狀病毒感染的Sf9細胞產生具有所期望的分子量(-35kDa)的蛋白質。
實施例3.T2R76的體外G蛋白偶聯。
如實施例2所述製備編碼rhod-hT2R76的感染性杆粒(bacmid)。如Ryba Trindelli(1995)J Biol Chem 2706757-6767所述，昆蟲幼蟲細胞用重組杆粒感染60小時，並製備膜。通過用5M尿素處理而去除外周蛋白質，並將膜重懸在10mM HEPES pH7.5、1mM EDTA和1mM DTT中。通過使用單克隆抗體B6-30的Western印跡法來評測rhod-hT2R76的表達。
例如Hoon等人(1995)Cell96629-636和Ryba Trindelli(1995)J Biol Chem 2706757-6767所述分離G蛋白。在存在10nMrhod-hT2R76、100μtM GDP和20μM Gβ1γ8的情況下，測量吉特先上的受體催化的GDP與GTPγS的交換。如U.S.專利申請系列號60/372089所述進行在混雜的G蛋白(例如Gα5或轉導素)上的GDP-GTPγS交換。在大約15-60分鐘時間點上所進行的測量反映了GTPγS結合的起始速率。
實施例4.味覺研究。
用包含用此處公開的方法而鑑定的T2R76調節劑的測試組合物進行味道接受研究。還使用沒有T2R76調節劑的對照組合物，但是其它組分與測試組合物基本上類似或相同。該研究採用雙向交叉設計，其中所有的受試者評測以一個或多個相同的數量或劑量進行施用的這兩種組合物。在單個研究日內評測測試和對照組合物。用於施用測試和對照組合物的順序在受試者中是隨機化的。
所有參與的受試者完成研究方案的所有方面。受試者用依次的味覺評分(例如1＝非常苦，2＝苦，3＝中等苦，4＝稍苦，5＝根本不苦)對每個測試和對照組合物作出響應。記錄下不利的事件。通過測量當與對照組合物比較時的測試組合物的味道的顯著差異而確定T2R76調節劑的效果。
實施例5.hT2R76對於苦味化合物的響應。
用表達hT2R76的哺乳動物細胞系(HEK293)和表達不同的hT2R(hT2R64)的對照細胞系進行GTPγS結合測定。將這些細胞系與在0.5-2mM的範圍內變化的不同濃度的下列化合物接觸6-正丙基硫尿嘧啶(PROP)、蔗糖八乙酸酯、棉子糖十一乙酸酯(RUA)、甘氨酸銅、地那銨和奎寧。該測定的結果用於證實hT2R76為被已知的苦味刺激物特異地激活的苦味受體。在該GTPγS結合測定中，在存在或不存在特定濃度的已知苦味化合物的情況下測定活性。
實施例6.高通量篩選測定。
使用GTPγS結合測定來篩選超過15,000種化合物的庫，以鑑定特異地激活hT2R76的其他化合物。比較在該測定中激活hT2R76的特定化合物的結構，以便預測具有類似的結構並潛在地將會激活hT2R76的化合物。然後，在同樣的GTPγS結合測定中以不同的濃度來評測具有這些類似結構的化合物的文庫，以鑑定激活hT2R76的其他化合物。
實施例7.人味覺測試。
在GTPγS結合測定中激活hT2R76的化合物在人味覺測試中進行評測。這些人味覺測試在知情同意的成人中進行，這些成人以體外激活hT2R76的濃度口服施用了經鑑定的化合物。在這些味覺測試中，將經鑑定的化合物(其激活hT2R76)溶解在水中以獲得在體外GTPγS結合測定中激活hT2R76的化合物濃度。
在該味覺測試中，至少5人的樣本品嘗一系列含有苦味化合物的水溶液。(在優選的實施例中，苦味化合物為T2R76激動劑)。每個人以在0-100(0為「幾乎不能檢測」，100為「所能想像的最強烈的苦」)內變化的經標記的程度等級來將苦味程度進行分級。隨後，每個人品嘗一系列含有苦味化合物和T2R76抑制劑的水溶液，並對於每個樣品將苦味程度進行分級。通過苦味程度的減少來測量T2R76抑制劑的效果。作為一種比較的手段，每個受試者也測試和評價已知的苦味化合物(硫酸奎寧)。味覺測試的結果以所有受試者的平均等級表示。
實施例8.hT2R76對於已知的苦味化合物的響應。
該測定的結果用於鑑定激活hT2R76的苦味化合物。基於此，可以形成用於鑑定阻斷這些苦味化合物所引起的hT2R76的活化的化合物。
結論這些測定的結果將會提供GTPγS結合測定可用於鑑定苦味化合物和hT2R76作為人苦味受體起作用的證明。經鑑定的化合物可用於向食品和飲料提供苦味。可選擇地，這些化合物可以在用於鑑定苦味阻斷劑和調節劑以及其他苦味化合物的測定中用作激動劑。
參考文獻下列的文獻以及說明書中所引用的所有文獻在此處進行引用作為參考，以便對於此處使用的方法學、技術和/或組合物進行補充、解釋、提供背景信息或者教導此處使用的方法學、技術和/或組合物。
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將會理解可以改變本發明的各種細節而不背離本發明的範圍。此外，前面的描述只是用於舉例說明的目的，而不是用於限制由附加的權利要求所定義的本發明的目的。
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Adler，Jon ElliotTang，HuixianPronin，Alexey120新型苦味受體T2R76的鑑定13078003-2929361602170PatentIn version 3.12101211957212DNA213智人220
221CDS222(1)..(957)223
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221misc_feature222(930)..(930)223y是c或t4001atg aat gga gac cac atg gtt cta gga tct tcg gtg act gac aag aag48Met Asn Gly Asp His Met Val Leu Gly Ser Ser Val Thr Asp Lys Lys1 510 15gcc atc atc ttg gtt acc att tta ctc ctt tta cgc ctg gta gca ata96Ala Ile Ile Leu Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Arg Leu Val Ala Ile20 25 30gca ggc aat ggc ttc atc act gct gct ctg ggc gtg gag tgg gtg cta144Ala Gly Asn Gly Phe Ile Thr Ala Ala Leu Gly Val Glu Trp Val Leu35 40 45cgg aga atg ttg ttg cct tgt gat aag tta ttg gtt agc cta ggg gcc192Arg Arg Met Leu Leu Pro Cys Asp Lys Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala50 55 60tct cgc ttc tgt ctg cag tca gtg gta atg ggt aag acc att tat gtt240Ser Arg Phe Cys Leu Gln Ser Val Val Met Gly Lys Thr Ile Tyr Val65 70 75 80ttc ttg cat ccg atg gcc ttc cca tac aac cct gta ctg cag ttt cta288Phe Leu His Pro Met Ala Phe Pro Tyr Asn Pro Val Leu Gln Phe Leu85 90 95gct ttc cag tgg gac ttc ctg aat gct gcc acc tta tgg tcc tct acc336Ala Phe Gln Trp Asp Phe Leu Asn Ala Ala Thr Leu Trp Ser Ser Thr100 105 110
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Ile Ser Tyr Phe Leu Ser Leu Val Phe Ser Ala Ala Gly Ile Phe Pro260 265 270Pro Leu Asp Phe Lys Phe Trp Val Trp Glu Ser Val Ile Tyr Leu Cys275 280 285Ala Ala Val His Pro Ile Ile Leu Leu Phe Ser Asn Cys Arg Leu Arg290 295 300Ala Val Leu Lys Ser Arg Arg Ser Ser Arg Cys Gly Thr Pro305 310 31權利要求
1.分離的T2R76核酸分子，其包含(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；或(c)分離的基本上與SEQ ID NO1類似的核酸分子。
2.權利要求1的分離的T2R76核酸分子，其選自(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與SEQ ID NO1的核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件由具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度來代表，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
3.權利要求1的分離的T2R76核酸分子，其包含(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；或(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子。
4.檢測T2R76核酸分子的方法，該方法包括(a)獲得含有核酸材料的生物樣品；(b)在嚴緊雜交條件下將分離的T2R76核酸分子與(a)的生物樣品雜交，因此形成分離的T2R76核酸與生物樣品內的核酸之間的雙鏈結構；和(c)檢測(b)的雙鏈結構，由此檢測生物樣品中的T2R76核酸分子。
5.分離的T2R76多肽，其包含(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。
6.權利要求5的分離的T2R76多肽，其進一步包含由選自下列的核酸分子編碼的多肽(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與T2R76核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件由具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度來代表，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
7.權利要求5的分離的T2R76多肽，其包含SEQ ID NO2。
8.根據權利要求5的分離的T2R多肽，其與至少一種其他T2R多肽聯合。
9.權利要求8的分離的T2R多肽，其中所述其他T2R多肽為其它人T2R。
10.權利要求9的分離的T2R多肽，其中所述其它人T2R選自人T2R51、T2R54、T2R55、T2461、T2R63、T2R64、T2R65、T2R67、T2R71、T2R75、T2R59和T2R33。
11.製備特異地識別T2R76多肽的抗體的方法，該T2R76多肽由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子所編碼。
12.權利要求10的方法，其中所述分離的T2R76多肽包含SEQ IDNO2。
13.權利要求8的方法，其進一步包括製備單克隆抗體。
14.通過權利要求11的方法所製備的抗體。
15.檢測T2R76多肽水平的方法，該方法包括(a)獲得含有肽材料的生物樣品；(b)通過使用權利要求14的抗體的免疫化學反應來檢測(a)的生物樣品中的T2R76多肽，由此測定樣品中T2R76多肽的數量。
16.用於異源表達T2R76多肽的系統，其包含(a)T2R76多肽；和(b)表達T2R76多肽的異源宿主細胞。
17.權利要求16的系統，其中T2R76多肽包含(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。
18.權利要求17的系統，其中T2R76多肽進一步包括由選自下列的核酸分子編碼的多肽(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與T2R76核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件由具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度來代表，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
19.權利要求18的系統，其中所述分離的T2R76多肽包括SEQ IDNO2。
20.權利要求18的系統，其進一步包含編碼其它T2R的核酸。
21.權利要求16的系統，其中宿主細胞包括哺乳動物細胞。
22.權利要求21的系統，其中哺乳動物細胞包括人細胞。
23.權利要求16的系統，其中宿主細胞進一步包含能夠與T2R76多肽偶聯的G蛋白α亞基。
24.權利要求23的系統，其中G蛋白α亞基包括混雜的G蛋白。
25.權利要求24的系統，其中混雜的G蛋白包括Gα15。
26.權利要求24的系統，其中混雜的G蛋白包括轉導素或吉特先。
27.用於鑑定T2R76多肽的調節劑的方法，該方法包括(a)提供重組表達系統，由此在異源宿主細胞中單獨或聯合至少一種其他T2R多肽表達T2R76多肽；(b)向(a)的系統提供測試物質；(c)在存在測試物質的情況下測定T2R76功能的水平或質量；(d)將T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量與T2R76功能的對照水平或質量進行比較；和(e)當與T2R76功能的對照水平或質量進行比較時，通過確定T2R76功能在存在測試物質的情況下的水平或質量有顯著變化而鑑定測試物質為T2R76調節劑。
28.權利要求27的方法，其中T2R76多肽包括(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。
29.權利要求28的方法，其中T2R76多肽進一步包括由選自下列的核酸分子編碼的多肽(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與T2R76核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件由具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度來代表，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
30.權利要求29的方法，其中分離的T2R76多肽包括SEQ IDNO2。
31.權利要求27的方法，其中宿主細胞包括哺乳動物細胞。
32.權利要求31的方法，其中哺乳動物細胞包括人細胞。
33.權利要求27的方法，其中宿主細胞進一步包含能夠與T2R76多肽偶聯的G蛋白α亞基。
34.權利要求33的方法，其中G蛋白α亞基包括混雜的G蛋白。
35.權利要求34的方法，其中混雜的G蛋白包括Gα15。
36.權利要求34的方法，其中混雜的G蛋白包括轉導素。
37.權利要求27的方法，其中所述測定包括測定GTPγS結合的數量。
38.通過權利要求27的方法鑑定的T2R76調節劑。
39.權利要求38的T2R76調節劑，其進一步包括選自蛋白質、肽、抗體、核酸和小分子的調節劑。
40.用於在受試者中調節苦味感受的方法，該方法包括(a)製備含有權利要求38的調節劑的組合物；(b)向受試者施用有效劑量的該組合物，由此在受試者中改變苦味感受。
41.權利要求40的方法，其中組合物進一步包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品或藥物。
42.權利要求40的方法，其進一步包括共施用含有調節劑的組合物和選自食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品和藥物的組合物。
43.權利要求40的方法，其中受試者為哺乳動物。
44.權利要求43的方法，其中哺乳動物為人。
45.用於鑑定T2R76多肽的調節劑的方法，該方法包括(a)將T2R76多肽單獨地或者將與至少一種其他T2R多肽聯合表達的T2R76多肽暴露于于一種或多種測試物質；(b)測定測試物質與分離的T2R76多肽或T2R76多肽組合的結合；和(c)挑選出表明與T2R76多肽特異結合的候選物質。
46.權利要求45的方法，其中T2R76多肽包括(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)基本上與SEQ ID NO2相同的多肽；(c)由SEQ ID NO1的核酸分子編碼的多肽；或(d)由基本上與SEQ ID NO1相同的核酸分子編碼的多肽。
47.權利要求46的方法，其中T2R76多肽進一步包括由選自下列的核酸分子編碼的多肽(a)分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸分子；(b)分離的SEQ ID NO1的核酸分子；(c)分離的核酸分子，其在洗滌嚴緊條件下與T2R76核酸序列雜交，該洗滌嚴緊條件由具有小於大約200mM鹽濃度的洗滌溶液和高於大約45℃的洗滌溫度來代表，並且所述核酸分子編碼T2R76多肽；和(d)分離的核酸分子，其由於遺傳密碼的簡併性而在核酸序列上與上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸分子相差至少一個功能上相當的密碼子，並編碼由上述(a)、(b)和(c)中之一的分離的核酸所編碼的T2R76多肽。
48.權利要求47的方法，其中分離的T2R76多肽包括SEQ IDNO2。
49.通過權利要求48的方法鑑定的T2R76調節劑。
50.權利要求49的T2R76調節劑，其進一步包括選自蛋白質、肽、抗體、核酸和小分子的調節劑。
51.用於在受試者中調節苦味感受的方法，該方法包括(a)製備含有權利要求49的調節劑的組合物；(b)向受試者施用有效劑量的該組合物，由此在受試者中改變苦味感受。
52.權利要求51的方法，其中組合物進一步包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品或藥物。
53.權利要求51的方法，其進一步包括共施用含有調節劑的組合物和選自食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品和藥物的組合物。
54.權利要求51的方法，其中T2R76調節劑選自蛋白質、肽、抗體、核酸和小分子。
55.權利要求51的方法，其中受試者為哺乳動物。
56.權利要求55的方法，其中哺乳動物為人。
57.用於減弱苦味化合物的苦味感受的方法，該方法包括向受試者共施用T2R76抑制劑和該苦味化合物。
58.權利要求57的方法，其中所述共施用包括施用含有與該苦味化合物混合的T2R76抑制劑的組合物。
59.權利要求57的方法，其中T2R76抑制劑進一步包括選自蛋白質、肽、抗體、核酸和小分子的調節劑。
60.權利要求57的方法，其中該苦味化合物包括食品、飲料、口腔洗劑、牙膏、化妝品或藥物。
61.權利要求57的方法，其中受試者為哺乳動物。
62.權利要求61的方法，其中哺乳動物為人。
63.用於增強化合物的苦味感受的方法，該方法包括向受試者共施用T2R76激動劑和該化合物。
64.權利要求63的方法，其中所述共施用包括施用含有與該化合物混合的T2R76激動劑的組合物。
65.權利要求63的方法，其中T2R76激動劑進一步包括選自蛋白質、肽、抗體、核酸和小分子的調節劑。
66.權利要求63的方法，其中受試者為哺乳動物。
67.權利要求66的方法，其中哺乳動物為人。
全文摘要
分離的編碼T2R76多肽的核酸、重組表達的T2R76多肽、用於T2R76多肽的重組表達的異源表達系統、使用該多肽的測定方法和通過施用T2R76－調節劑而改變味覺感受的方法。這些T2R76多肽可以單獨表達或者與另一個T2R多肽共表達，優選地與不同的人T2R多肽共表達。
文檔編號C07K14/705GK1984919SQ03818097
公開日2007年6月20日 申請日期2003年7月29日 優先權日2002年7月29日
發明者J·E·阿德勒, 湯輝仙, A·普羅涅, M·佐勒 申請人:塞諾米克斯公司