一種用於圓錐掘氏梅裡黴的培養基和培養方法
2023-05-07 20:43:26
一種用於圓錐掘氏梅裡黴的培養基和培養方法
【專利摘要】一種快速提高線蟲生防真菌-圓錐掘氏梅裡黴生物量及縮短產孢周期的培養方法，採用培養皿固體培養基在室溫條件下培養圓錐掘氏梅裡黴，通過在固體培養基中加入動物的腎臟和/或肝臟，提高了該真菌的生物量，並縮短培養產孢周期。
【專利說明】一種用於圓錐掘氏梅裡黴的培養基和培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物【技術領域】，涉及一種真菌的培養基和培養方法，特別是涉及一 種快速提高線蟲生防真菌一一圓錐掘氏梅裡黴的生物量及縮短產孢周期的培養基和培養 方法。
【背景技術】
[0002] 植物寄生線蟲在許多農業及園藝經濟作物造成嚴重的損失。其中根結線蟲或胞囊 線蟲等內寄生線蟲可以導致農作物產量損失在10% -50%。據統計，由於植物內寄生線蟲 造成的全世界作物損失已經達到每年超過1000億美元。
[0003] 圓維掘氏梅裡黴[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]是一種非常重要的線蟲 內寄生生防真菌，是內寄生型食線蟲真菌。
[0004] 圓錐掘氏梅裡黴隸屬於真菌界、子囊菌門、糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科的掘氏 梅裡黴屬。國內外文獻報導該菌具有生物防治植物寄生線蟲潛力的線蟲內寄生真菌。被許 多科學家用作研宄真菌與線蟲識別機制的好材料。
[0005] 但是，提高圓錐掘氏梅裡黴培養的生物量和縮短培養周期是目前需 要研宄的技術問題。文獻報導，利用現有的培養基對該真菌菌株進行培養， 如 PDA(potato-dextrose-agar)培養基、CMA(corn-meal-agar)培養基和 SDAY(dextrose-neopeptone-yeast extract-agar)培養基，真菌的產量低（生物量低），且 產孢周期長（約為8-10周）。這嚴重限制了圓錐掘氏梅裡黴大規模生產培養，也影響了其 使用。
[0006] 本發明針對圓錐掘氏梅裡黴產量及應用受到培養條件嚴重限制的前提下，嘗試改 善的培養方法，並最終克服了該真菌實驗室培養周期長，產量低的缺點。
【發明內容】
[0007] 本發明的最終目的是提供一種圓錐掘氏梅裡黴[Drechmeria coniospora ARSEF 6962]的新的培養方法，提高生物量，縮短培養周期，便於其大規模生產。
[0008] 本發明的直接目的是找到培養圓錐掘氏梅裡黴的培養皿固體培養基中提高生物 量的新的成分。
[0009] 本發明人通過大量實驗研宄工作，首次發現，在培養基中加入動物的肝和/或腎， 能夠達到上述發明目的。
[0010] 特別是，發明人對本發明固體培養中重要成分-動物肝臟和腎臟的含量和組成比 例與培養菌株的菌體生長周期進行了以下相關性分析：
[0011] 1)動物肝臟和/或腎臟的合適用量；
[0012] 2)動物肝臟與腎臟的用量比；
[0013] 3)所用肝臟與腎臟的動物種類。
[0014] 從上述實驗結果，本發明得到的解決方案是：
[0015] -種圓錐掘氏梅裡黴的培養方法，採用培養皿固體培養基在室溫條件下培養圓錐 掘氏梅裡黴，其特徵是所述培養基中含有動物的肝臟和/或腎臟，且所述動物肝臟和腎臟 在培養基中的含量是：每l〇〇mL培養基中，含動物肝臟lg?50g，動物腎臟lg?50g。
[0016] 優選含量範圍是：每100mL培養基中，含動物肝臟7g?12g、動物腎臟7g?12g。 動物肝臟與腎臟成分能夠有效地提高該真菌生物量，縮短培養產孢周期。
[0017] 所述的培養皿固體培養基中的其它成分是NaCl、瓊脂及無菌水。
[0018] 上述配製的培養基為液體，經過121°C滅菌後轉變為固體，用於培養圓錐掘氏梅裡 黴。
[0019] 在本發明一個實施例中，培養基成分如下：每100mL培養基中，含動物肝臟10g、動 物腎臟10g、NaCl 0. 5g、瓊脂1. 5g、加入無菌水定容。
[0020] 所述動物肝臟和腎臟優選新鮮或冷凍保存的組織材料。
[0021] 所述動物是哺乳動物，優選豬、牛、羊的肝和腎。
[0022] 所述培養基的配製方法是：
[0023] 1)稱取動物肝臟與動物腎臟，切成小塊，用勻漿機將肝臟與腎臟組織打碎；
[0024] 2)在上述所得組織勻漿中加入NaCl和瓊脂粉，隨後加入蒸餾水定容；
[0025] 3) 121°C 滅菌 15min。
[0026] 用上述培養基對圓錐掘氏梅裡黴進行培養的方法是：將保存的圓錐掘氏梅裡黴分 生孢子塗布在培養基表面。利用封口膜對培養皿進行密封，保持培養基中水分含量。將塗 有菌株的培養皿放置於培養箱中進行培養。培養溫度25±2°C，培養周期為7-8天。
[0027] 本發明的有益效果為
[0028] 經實驗證明，本發明首次採用含動物肝臟和/或腎臟製備的固體培養基培養獲得 的圓錐掘氏梅裡黴，生物量明顯提高，產孢周期8-16天，顯著縮短。相對於目前文獻報導的 採用PDA培養基、CMA培養基對該真菌培養產量低，產孢周期為8-10周相比，具有工藝簡單、 設備要求低，且圓錐掘氏梅裡黴生物量顯著提高，培養周期縮短85%以上（詳見實施例）。
[0029] 用本發明培養方法培養出來的圓錐掘氏梅裡黴孢子進行線蟲侵染實驗。檢測結果 顯示，分生孢子具有的極強的侵染並殺死線蟲的效果，能夠滿足生物防治植物寄生線蟲及 相關領域科學研宄的相應要求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 圖1是不同肝腎比例培養基中圓錐掘氏梅裡黴生長周期分析。圖中，縱座標表示 培養基中菌株的生長時間；橫座標表不不同肝腎含量和比例的培養基。
[0031] 圖2是單獨添加肝臟或腎臟製備的培養基對圓錐掘氏梅裡黴的促生功能分析。圖 中，縱座標表不培養基中菌株的生長時間；橫座標表不不同肝腎含量的培養基。
[0032] 圖3是不同培養條件下獲得的圓錐掘氏梅裡黴對秀麗隱杆線蟲的侵染能力進行 比對分析。圖中，縱座標表示菌株對線蟲的侵染效率；橫座標表示侵染時間。圖中，LK，本發 明固體培養基中培養獲得圓錐掘氏梅裡黴；SDAY，SDAY固體培養基中培養獲得圓錐掘氏梅 裡黴；PDA，PDA固體培養基中培養獲得圓錐掘氏梅裡黴；CMA，CMA固體培養基中培養獲得圓 錐掘氏梅裡黴。
【具體實施方式】
[0033] 說明
[0034] 1、以下實施例中，各固體培養基的配製方法是：
[0035] 1)稱取動物肝臟與動物腎臟，切成小塊，用勻漿機將肝臟與腎臟組織打碎；
[0036] 2)在上述所得組織勻漿中加入稱取的NaCl和瓊脂粉，隨後加入蒸餾水定容；
[0037] 3) 121°C 滅菌 15min。
[0038] 2、培養方法為：
[0039] 將塗布有圓錐掘氏梅裡黴菌株的培養基培養皿封口，並放置於培養箱中。培養溫 度25 °C，定期觀察培養皿中菌株生長狀態。
[0040] 3、判斷圓錐掘氏梅裡黴的生長情況的方式為：
[0041] 在光學顯微鏡下觀察，對培養菌株的生長時期進行鑑定。圓錐掘氏梅裡黴的生長 周期主要可以分為三個階段：
[0042] 階段1 (菌絲體時期），培養基上能夠觀察到絲狀菌絲體形態；
[0043] 階段2 (產孢子時期），菌絲體上產生分生孢子梗，在孢子梗頂端或旁側產孢細胞 產生瓶梗，在瓶梗頂端產孢墊上產生圓錐狀分生孢子；
[0044] 階段3 (孢子成熟期），成熟的分生孢子從分生孢子梗上脫落，並在其頂端會長出 微小的芽體。
[0045] 實施例1動物肝臟與腎臟的用量研宄
[0046] 配製動物肝臟與腎臟含量不同的固體培養基（見表1)，對培養基中接種的圓錐掘 氏梅裡黴菌株生長周期進行了測定。
[0047] 各培養基中的其它成分是NaCl、及無菌水，在每100mL培養基中，含NaCl 0. 5g，瓊 脂1. 5g，其餘是無菌水。
[0048] 表 1
[0049]
【權利要求】
1. 一種培養圓錐掘氏梅裡黴的方法，其特徵是，所使用的每lOOmL培養基中，含動物肝 髒lg?50g和/或動物腎臟lg?50g，所述動物是哺乳動物。
2. 權利要求1所述的方法，每lOOmL培養基中，含動物肝臟7g?12g和/或動物腎臟 7g ?12g〇
3. 權利要求1或2所述的方法，培養方式是：將圓錐掘氏梅裡黴分生孢子塗布在培養 基表面；用封口膜將培養皿密封后放置於培養箱中進行培養。
4. 權利要求3所述的方法，培養溫度25 ±2 °C，培養周期為7-8天。
5. 動物肝臟和/或動物腎臟在圓錐掘氏梅裡黴培養中的應用。
6. -種培養基，其特徵是，每lOOmL培養基中，含動物肝臟lg?50g和/或動物腎臟 lg?50g，所述動物是哺乳動物。
7. 權利要求6所述的培養基，由NaCl、瓊脂及無菌水以及動物肝臟和/或動物腎臟組 成。
8. 權利要求7所述的培養基，所述動物選自豬、牛或羊。
9. 權利要求8所述的培養基，成分如下：每lOOmL培養基中，含動物肝臟10g、動物腎臟 10g、NaCl 0. 5g、瓊脂1. 5g，其餘是無菌水。
10. 權利要求7所述的培養基的製備方法，步驟為： 1) 將動物肝臟和/或動物腎臟切成小塊，用勻漿機將組織打碎，得組織勻漿； 2) 在所得組織勻漿中加入NaCl和瓊脂粉，隨後加入蒸餾水定容； 3) 121°C 滅菌 15min。
【文檔編號】C12N1/14GK104450538SQ201410691108
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】張維, 周正富, 郭倩楠, 徐玉泉, 陳明, 林敏
申請人:中國農業科學院生物技術研究所