生產莫納甜和莫納甜前體的製作方法

2023-05-22 16:48:51 2

生產莫納甜和莫納甜前體的製作方法
【專利摘要】本發明提供了可用於從葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸製造莫納甜或其鹽的方法和組合物。也公開了生產吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中間體的方法。所提供的組合物包括核酸分子、多肽、化學結構和細胞。方法包括體外和體內方法，體外方法包括化學反應。
【專利說明】生產莫納甜和莫納甜前體[0001]本申請是國際申請號為PCT/US2004/034558、國際申請日為2004年10月21日，進入中國國家階段的申請號為200480034841.9，名稱為「生產莫納甜和莫納甜前體」的發明專利申請的分案申請。
[0002]本申請要求2003年10月21日提交的美國臨時專利申請號60/513，406的優先權，該申請被全文納入作為參考。
【技術領域】
[0003]本公開提供了用於生產吲哚3-丙酮酸、2-羥基2_(吲哚-3基甲基)-4_酮戊二酸和/或莫納甜(monatin)的方法和材料。
【背景技術】
[0004]吲哚-3-丙酮酸是一種強效抗氧化劑，相信它抵消了氧氣濃度高的組織中的氧化應激(Politi 等色氨酸研究的最近進展」(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini 等編，Plenum Press, New York, 1996,第 291-8 頁)。吲哚丙酮酸也是作為主要的植物生長激素生長素(可擴散的生長促進因子)的吲哚-乙酸(IAA)的產生途徑中的中間物。在生理過程包括頂端優勢、向性、紙條伸長、誘導形成層細胞分裂和生根中，亞微克量的IAA是有活性的。園藝中用合成生長素誘導生根並促進果實形成和發育。參見例如美國專利號5，843，782和5，952，231。在高濃度時，合成生長素是有效的闊葉植物除草劑。可認為，通過發酵生產的天然生長素比化學生產的除草劑對環境更友好。1999年生長調節劑的全球銷售額為4億英鎊(14億美元)。除了植物相關用途以外，吲哚乙酸還用於藥物應用。例如，美國專利號5，173，497提出，用這些化合物治療記憶損傷，如伴隨阿爾茨海默病和老年性痴呆的記憶損傷。美國專利號5，173，497中提出的機制是這些化合物抑制乙醯膽鹼酯酶並提高大腦中的乙醯膽鹼水平。
[0005]通過過氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸產生吲哚-3-甲醇，且可容易地轉化成二吲哚甲烷。據報導，兩種化合物能夠消除毒素並促進產生有益於女性健康的激素。氯化D-色氨酸被鑑定為非營養性甜味劑，對探索其它衍生物的興趣持續增加。
[0006]莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3基甲基)-4_氨基戊二酸)是天然存在的，類似於胺基酸色氨酸成分的甜味劑。它可提取自南非灌木似冬青葉硬木朔(Sclerochitonilicifolius)的根皮，作為高強度甜味劑在食品和飲料工業中有前途。關於莫納甜的專利的一些例子包括:美國專利號 5，994，559 ;4，975，298 ;5，128，164 和 5，128，482。

【發明內容】

[0007]本發明涉及莫納甜(2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸一也稱為4-氨基-2-羥基-(IH-吲哚-3-基甲基)-戊二酸，或者根據另一種編號系統，稱為4-羥基-4-(3-吲哚基甲基)穀氨酸)，該化合物具有下式:
[0008]NH2
IOH I
o> °




LJ


n
[0009]莫納甜也有以下化學名稱:3-(1-氨基-1，3- 二羧基-3-羥基-丁 -4-基)-吲哚；
4-(吲哚-3-基甲基)-4-羥基-穀氨酸和3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羥基丁烷-4-基)-吲哚。
[0010]莫納甜是一種天然存在的高強度甜味劑。莫納甜有四種立體異構形式:2R, 4R( 「R，R立體異構體」或「R，R莫納甜」)；2S, 4S( 「S，S立體異構體」或「S，S莫納甜」)；2R，4S( 「R，S立體異構體」或「R，S莫納甜」)以及2S，4R( 「S，R立體異構體」或「S，R莫納甜」)。本文中，除非另有說明，「莫納甜」7是指莫納甜的所有四種立體異構體，以及莫納甜立體異構體任意組合的任何混合物(例如莫納甜的R，R和S，S立體異構體的混合物)。
[0011]本發明部分基於確定從葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸，和/或通過中間體如吲哚-3-丙酮酸和2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(莫納甜前體，MP,莫納甜的α-酮形式)來產生莫納甜的幾種生物合成途徑。公開了可用於製造莫納甜、吲哚-3-丙酮酸和MP的多肽和核酸序列。因為莫納甜的有機合成需要拆分異構體，所以可利用便宜的原料並可僅產生一種異構體的生化途徑在經濟上更有利。
[0012]可通過吲哚-3-丙酮酸、ΜΡ、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖來產生莫納甜(圖1)。產生或製造莫納甜或其中間體的方法見圖1-3和11-13，包括將底物轉化為第一種產物，然後將第一種產物轉化為第二種產物，等等，直到產生所需終產物。
[0013]圖1-3和11-13以框顯示了可能的中間產物和終產物。例如，可用本文提供的方法和材料進行一種產物到另一種產物的轉化，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到ΜΡ、ΜΡ到莫納甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化學方法或生物學方法促進這些轉化。術語「轉化」指在將一種產物(如第一種中間體)轉變成另一產物(如第二種中間體)的反應中使用化學方法或多肽。術語「化學轉化」指不由多肽主動促進的反應。術語「生物轉化」指由多肽主動促進的反應。轉化可在體內或體外發生。當使用生物轉化時，多肽和/或細胞能固定於支持物如化學附著於聚合物支持物上。可用本領域普通技術人員已知的任何反應器，例如在分批或連續反應器中完成轉化。
[0014]也提供了方法，包括使第一種多肽接觸底物，製造第一種產物，然後使產生的第一種產物接觸第二種多肽，產生第二種產物，然後使產生的第二種產物接觸第三種多肽，產生第三種產物，例如莫納甜。所用多肽和所產生的產物見圖1-3和11-13。
[0015]公開了可用於進行圖1-3和11-13中所示轉化的多肽及其編碼序列。在一些實施例中，具有一個或多個改變多肽的底物特異性和/或活性的點突變的多肽可用來製造莫納甜。
[0016]公開了產生莫納甜的分離和重組細胞。這些細胞可以是任何細胞，如植物、動物、細菌、酵母、藻類、古菌或真菌細胞。
[0017]在具體實施例中，公開的細胞包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:色氨酸轉氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無 EC 號，Hadar 等，J.Bacteriol 125:1096-1104,1976 和 Furuya 等，Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93，2000)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2._)、D-色氨酸轉氨酶(Kohiba和Mito，《第8屆國際維生素B6和擬基催化討論會會議錄》(Proceedings of 8th International Symposium onVitamin B6and Carbonyl Catalysis)，日本大阪，1990)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)和/ 或穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
[0018]在另一實施例中，細胞包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2、1.4.1.3、
1.4.1.4)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-色氨酸轉氨酶和/或D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)。
[0019]此外，公開的細胞可包括一種或多種(如兩種或多種、三種或多種、四種或多種，或者五種或多種)以下活性:色氨酸轉氨酶出02.6.1.27)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(EC2.6.1.5)、多底物轉氨酶(EC2.6.1.-)、天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)、L-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(無EC編號)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、D-胺基酸氧化酶(EC1.4.3.3)、D-丙氨酸轉氨酶(EC2.6.1.21)、吲哚乳酸脫氫酶(EC1.1.1.110)、R-4-羥苯基乳酸脫氫酶(EC1.1.1.222)、3-(4)_羥基苯丙酮酸還原酶(EC1.1.1.237)、乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27,1.1.1.28,1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(EC1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3._)、合酶/裂合酶(EC4.1.3.-)如4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)或4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)和/或D-色氨酸轉氨酶。
[0020]能生成莫納甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接觸第一種多肽，其中第一種多肽將色氨 酸和/或吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物轉化成吲哚-3-丙酮酸；本領域技術人員理解選擇用於此步驟的多肽理想地表現出適當特異性)，所得吲哚-3-丙酮酸接觸第2種多肽，其中第2種多肽將叼丨哚-3-丙酮酸轉化成MP，MP接觸第3種多肽，其中第3種多肽將MP轉化成莫納甜。能用於這些轉化的示範多肽示於圖2和3。
[0021]本發明另一方面提供了組合物如MP，含有至少一種外源性核酸序列(如至少兩種、三種、四種、五種或多種外源性核酸序列)上編碼的至少兩種多肽，或有時至少三種或至少四種多肽的細胞。
[0022]本文提供的方法和材料可用於製造產物如莫納甜、MP、莫納甜中間體和莫納甜衍生物。莫納甜和本文所述的一些莫納甜中間體可用作甜味劑或合成莫納甜衍生物的中間體。
[0023]另一方面，本發明的特徵是產生莫納甜的方法。在某些實施方式中，產生莫納甜或其鹽的方法包括:(a)在培養基中培養微生物，該微生物含有至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉氨酶多肽的核酸；和(b)從培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。在某些實施方式中，醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它實施方式中，該微生物選自苜猜中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosterone)、稻草假單胞菌(Pseudomonas straminea)、穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和大腸桿菌(E.coli)。或者，該微生物可選自棒桿菌屬(Corynebacterium)和短桿菌屬(brevibacterium)。
[0024]在其它實施方式中，培養基含有非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物(如氨苄青黴素)或其組合。非離子去汙劑包括吐溫、Triton X-100或十二烷基乙酸銨。在一個實施方式中，培養基含有濃度小於5 μ g/L的生物素。在另一實施方式中，在培養微生物之前，培養基的PH約為pH7-pH8。此外，培養基可包括糖蜜、玉米漿或其組合。
[0025]在一些實施方式中，該微生物是大腸桿菌，培養基是Trp-1+葡萄糖培養基。在其它實施方式中，該微生物的生長需要苯丙氨酸和酪氨酸，培養基含有苯丙氨酸和酪氨酸。該微生物也可含有aspC和proA基因。此外`，該微生物可以是產生和分泌穀氨酸的穀氨酸棒桿菌。在一些實施方式中，該微生物(如穀氨酸棒桿菌)分泌莫納甜或其鹽。在另一實施方式中，在發酵罐中培養微生物。
[0026]在一些實施方式中，培養基含有色氨酸、丙酮酸，非離子去汙劑(如吐溫)，青黴素，青黴素衍生物或其組合。在其它實施方式中，轉氨酶多肽選自色氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
[0027]此外，本發明的特徵是產生莫納甜或其鹽的方法，包括:(a)在培養基中培養穀氨酸棒桿菌(ATCC13058);和(b)從培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，培養基含有吐溫、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
[0028]本發明的特徵還有具有至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合，其中所述微生物產生莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶，EC4.1.3.16)。在其它實施方式中，轉氨酶多肽選自色氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.21)。微生物可包括過量產生丙酮酸的微生物，和/或是硫胺營養缺陷型，苯丙氨酸和酪氨酸營養缺陷型或硫辛酸營養缺陷型。
[0029]在一些實施方式中，微生物選自光滑假絲酵母(Candida glabrata)、皮狀絲抱酵母(Trichosporon cutaneum)、脂解假絲酵母(Candida lipolytica)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它實施方式中，該微生物含有aspC基因和proA基因。在某些實施方式中，該微生物含有aspC基因和proA基因和至少一個色氨酸操縱子基因。在其它實施方式中，該微生物是大腸桿菌。在其它實施方式中，該微生物含有缺陷的F1_ATP酶基因，破壞的內源性IipA基因，破壞的pheA基因，破壞的內源性色氨酸酶(tna)基因和/或一種或多種色氨酸生物合成基因的兩個或多個拷貝。在一些實施方式中，該微生物過量產生色氨酸。在其它實施方式中，該微生物過表達ppsA基因,相對於相應的對照微生物,3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖 7_ 憐酸(3-deoxy-D-arabino-hapatulosonic 7-phosphate acid)(DAHP)合酶活性提高，它包括編碼具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，該核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合和/或tkt基因。在其它實施方式中，該微生物是大腸桿菌或穀氨酸棒桿菌。
[0030]在一些實施方式中，該微生物還含有編碼具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。在其它實施方式中，該微生物分泌莫納甜或其鹽和/或是脂肪酸營養缺陷型。在其它實施方式中，該微生物是含有表達醛縮酶的核酸的細菌菌株，其中由該核酸表達的醛縮酶能夠產生富含立體異構體的莫納甜混合物。在一些實施方式中，富含立體異構體的莫納甜混合物主要是S，S莫納甜或其鹽。或者，富含立體異構體的莫納甜混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。在一個實施方式中，該微生物過表達至少一種編碼色氨酸攝取多肽的核酸。
[0031]在另一方面，本發明的特徵是產生莫納甜或其鹽的方法，該方法包括:(a)在產生莫納甜或其鹽的條件下在培養基中培養產生莫納甜或其鹽的微生物，和(b)從培養基或培養的微生物中獲得莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，該微生物分泌莫納甜或其鹽和/或是脂肪酸營養缺陷型。
[0032]此外，本發明也包括`鑑定能夠合成莫納甜或其鹽的細胞的方法，該方法包括:(a)在選自莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽、莫納甜或其鹽的類似物、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽的類似物，及其組合的碳/能源的存在下培養細胞；和(b)測試細胞生長，其中細胞生長說明細胞將碳源/能源轉化成丙酮酸，從而說明該細胞能夠合成莫納甜或其鹽。在一個實施方式中，細胞是丙酮酸營養缺陷型，在細胞中通過代謝碳/能源產生丙酮酸。在其它實施方式中，該細胞含有破壞的PykA和pykF基因。
[0033]而且，本發明的特徵是鑑定能夠由色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸或其鹽或其組合的細胞的方法，該方法包括:(a)在不存在色氨酸而存在莫納甜或其鹽、2-羥基2 (吲哚-3-基甲基)4-酮戊二酸或其鹽或其組合的情況下培養色氨酸營養缺陷型細胞；和(b)測試色氨酸營養缺陷型細胞的生長，其中細胞生長說明該細胞能夠從莫納甜或其鹽，2-羥基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合合成色氨酸，從而說明該細胞能夠由色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合。
[0034]本發明的特徵還有產生莫納甜或其鹽的方法，該方法包括:(a)在培養基中培養微生物，其中該微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌和穀氨酸棒桿菌；和(b)從培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。在一些實施方式中，該微生物未經遺傳修飾。在其它實施方式中，培養基是PHB培養基。培養基也可包括色氨酸、丙酮酸、非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物或其組合。在一些實施方式中，該微生物是苜蓿中華根瘤菌或睪丸酮叢毛單胞菌。在其它實施方式中，該微生物是睪丸酮叢毛單胞菌，和/或培養基還含有色氨酸和丙酮酸。在其它實施方式中，培養基是TY培養基。培養基也可包含色氨酸、丙酮酸或其組合。
[0035]除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語的涵義與本發明所涉及【技術領域】的普通技術人員所通常理解的相同。雖然在實踐本發明的過程中可採用與本文所述內容相似或相同的方法和材料，但下面描述了合適的方法和材料。本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻都被全文納入作為參考。在衝突情況下，本說明書，包括定義將控制(本發明範圍)。此外，材料、方法和實施例僅為示範性，不旨在限制。
[0036]通過以下詳述和所附權利要求書將明白本發明的其它特徵和優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1顯示用於生成莫納甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑。一種途徑通過色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一種通過吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。隨後通過MP中間體生成莫納甜。
[0038]框中所示化合物是底物和生物合成途徑中生成的產物。
[0039]與箭頭相鄰的組合物是輔因子或可在底物轉化成產物期間使用的反應物。所用輔因子或反應物取決於生物合成途徑的特定步驟使用的多肽。輔因子PLP(批哆醛5'-磷酸)能催化不依賴於多肽的反應，因此僅提供PLP可從底物進行到產物。
[0040]圖2是使用MP中間體的生物合成途徑的更詳細圖。框中顯示了途徑中各步驟的底物。便於底物間轉化的多肽列於底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。
[0041]圖3顯示將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途徑的更詳細圖。框中顯示了底物，和便於底物間轉化的多肽列於底物間的箭頭附近。各多肽通過其常用名稱和酶分類(EC)號描述。
[0042]圖4顯示一種經化學方法產生MP的可能反應。
[0043]圖5A和5B是色譜圖，顯示酶法生成的莫納甜的LC/MS鑑定。
[0044]圖6是酶法合成的莫納甜的電噴射質譜。
[0045]圖7A和7B是酶混合物中生成的莫納甜的LC/MS/MS子離子分析色譜圖。
[0046]圖8是色譜圖，顯示酶法生成莫納甜的高分辨質譜測量。
[0047]圖9A-9C是色譜圖，顯示(A) R-色氨酸、⑶S-色氨酸和(C)酶法生成莫納甜的手性分離。
[0048]圖10是柱狀圖，顯示IPTG誘導後細菌細胞中生成的莫納甜的相對量。(_)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
[0049]圖11-12是示意圖，顯示用於增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0050]圖13是示意圖，顯示能用於增加莫納甜產量的途徑，莫納甜產生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
[0051]圖14是描述遺傳修飾的大腸桿菌7692和BW25113細胞中丙酮酸產量增加的圖。
[0052]圖15是描述在過量產生丙酮酸的培養基中生長的遺傳修飾的大腸桿菌7692和BW25113細胞中丙酮酸產量增加的圖。
[0053]圖16是從睪丸酮叢毛單胞菌(ATCC49249)中克隆的proA基因的核酸序列。
[0054]圖17是由來自睪丸酮叢毛單胞菌(ATCC49249)的基因編碼的ProA醛縮酶多肽的胺基酸序列。
[0055]序列表
[0056]所附序列表中列出的核酸和胺基酸序列是用標準字母縮寫(核酸鹼基)和三字母編碼(胺基酸)表示的。只顯示各核酸序列的一條鏈，但參照所示鏈應理解包括互補鏈。
[0057]SEQ ID NO:1和2分別列出來自苜蓿中華根瘤菌的轉氨酶(tatA基因，在文獻中稱為酪氨酸轉氨酶或芳族轉氨酶)的核酸和胺基酸序列。
[0058]SEQ ID NO:3和4分別列出來自類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的釀氛酸轉氨酶(2.4.1)(與tatA (SEQ ID NO:1和2)同源)的核酸和胺基酸序列。
[0059]SEQ ID NO:5和6分別列出來自類球紅細菌(35053)(新穎，根據2.4.1序列SEQID NO:3和4克隆)的轉氨酶的核酸和胺基酸序列。
[0060]SEQ ID NO:7和8分別列出來自碩大利什曼原蟲(Leishmania major)的廣譜底物轉氨酶(bsat)的核酸和氨基`酸序列。
[0061]SEQ ID NO:9和10分別列出來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的芳族轉氨酶(araT)的核酸和胺基酸序列。
[0062]SEQ ID NO: 11 和 12分別列出來自食澱粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族轉氨酶(araT)(通過同源性鑑定為芳族轉氨酶)的新核酸和胺基酸序列。
[0063]SEQ ID NO:13和14分別列出來自類球紅細菌(35053)的多底物轉氨酶(msa)(通過與登錄號AAAE01000093.1，bpl4743_16155和登錄號ZP00005082.1同源鑑定為多底物轉氨酶)的核酸和胺基酸序列。
[0064]SEQ ID NO:15和16列出用於克隆枯草芽孢桿菌D-丙氨酸轉氨酶(dat)基因序列的引物的核酸序列。
[0065]SEQ ID NO:17和18列出用於克隆苜蓿中華根瘤菌tatA序列的引物的核酸序列。
[0066]SEQ ID NO:19和20列出用於克隆枯草芽孢桿菌araT轉氨酶序列的引物的核酸序列。
[0067]SEQ ID NO:21和22列出用於克隆類球紅細菌(2.4.1和35053)多底物轉氨酶序列的引物的核酸序列。
[0068]SEQ ID NO:23和24列出用於克隆碩大利什曼原蟲bsat序列的引物的核酸序列。
[0069]SEQ ID NO:25和26列出用於克隆食澱粉乳桿菌araT序列的引物的核酸序列。
[0070]SEQ ID NO:27和28列出用於克隆類球紅細菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物的核酸序列。
[0071]SEQ ID NO:29和30列出用於克隆大腸桿菌aspC序列(基因序列Genbank登錄號:ΑΕ000195.1，蛋白質序列Genbank登錄號:AAC74014.1)的引物的核酸序列。
[0072]SEQ ID NO:31和32分別列出來自大腸桿菌的芳族轉氨酶(tyrB)的核酸和胺基酸序列。
[0073]SEQ ID NO:33和34列出用於克隆大腸桿菌tyrB序列的引物的核酸序列。
[0074]SEQ ID NO: 35-40列出用於克隆具有4_羥基_2_氧戊二酸醛縮酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0075]SEQ ID NO:41和42列出來自大腸桿菌的色氨酸酶(tna)基因和來自弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)的酪氨酸-酹裂合酶(tpl)基因的核酸序列，它們分別編碼蛋白質 P00913 (G1:401195)和 P31013 (G1:401201)。
[0076]SEQ ID NO:43_46列出用於克隆色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物的核酸序列。
[0077]SEQ ID NO:47_54列出用於使色氨酸酶多肽和β -酪氨酸酶多肽突變的引物的核酸序列。
[0078]SEQ ID NO:55_64列出用於克隆具有4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物的核酸序列。
[0079]SEQ ID NO:65和66列出來自睪丸酮叢毛單胞菌的4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(ProA)的核酸和胺基酸序列。
[0080]SEQ ID NO:67-68列出用於在pET30Xa/LIC中具有大腸桿菌aspC的操縱子中克隆睪丸酮叢毛單胞菌4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(ρι.οΑ)的引物的核酸序列。
[0081]SEQ ID NO:69-72列出用於在pESC-his中克隆大腸桿菌aspC和睪丸酮叢毛單胞菌proA的引物的核酸序列。
[0082]SEQ ID NO:73_74列出加`到用於克隆本文所公開基因的引物5'端的核酸序列。
[0083]SEQ ID NO:75和76列出用於縮短aspC和proA基因之間的間插序列的引物的核酸序列。
[0084]SEQ ID NO:77和78列出用於在pPRONco中克隆大腸桿菌tnaA的引物的核酸序列。
[0085]SEQ ID NO:79和80列出用於在pPRONco中克隆大腸桿菌色氨酸操縱子(trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因)的引物的核酸序列。
[0086]SEQ ID NO:81和82分別列出質粒pGX50 (來自5_甲基色氨酸抗性細胞)的trpE基因的核酸和胺基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:83和84列出用於將含有睪丸酮叢毛單胞菌4_羥基_4_甲基_2_氧戊二酸醛縮酶(ProA)和大腸桿菌aspC的操縱子克隆到棒桿菌/大腸桿菌穿梭載體pEKEX-2中的引物的核酸序列。
[0088]SEQ ID NO:85和86列出用於在大腸桿菌中產生pykA敲除的引物的核酸序列。
[0089]SEQ ID NO:87和88列出用於在大腸桿菌中產生pykF敲除的引物的核酸序列。
[0090]SEQ ID NO:89列出來自食澱粉乳桿菌的芳族轉氨酶(araT)的前十個胺基酸(SEQID NO:12)。
【具體實施方式】
[0091]提供下列術語和方法的解釋以更好地描述本說明書並指導本領域普通技術人員實踐本發明。如本文所用，「含有」指「包括」。此外，單數形式也指複數，除非上下文另有明確規定。例如，提到「含有一種蛋白」包括一種或多種這樣的蛋白，提高「含有細胞」包括一種或多種細胞和本領域技術人員已知的它的等價物，等等。術語「約」包括發生於任何測定中的實驗誤差的範圍。除非另有說明，假定所有的測定數字前面都有「約」字，即使沒有明顯地使用「約」字。
[0092]cDNA(互補DNA):缺少內部非編碼節段(內含子)和決定轉錄的調節序列的一段DNA。可在實驗室中通過提取自細胞的信使RNA逆轉錄合成cDNA。
[0093]保守取代:生化特性相似的胺基酸殘基中的一個或多個胺基酸取代(如2、5或10個殘基)。保守取代一般對得到的多肽的活性影響小或無影響。例如，包含一個或多個保守取代的色氨酸轉氨酶多肽理想地保持色氨酸轉氨酶活性。可通過用，例如標準方法如定位誘變或PCR來操作編碼該多肽的核苷酸序列來產生含有一個或多個保守取代的多肽。
[0094]取代變體是胺基酸序列中至少一個殘基被去除，並在其位置中插入了一個不同殘基的變體。可用來取代蛋白質中原始胺基酸的並認為是保守取代的胺基酸的例子包括:用絲氨酸或蘇氨酸取代丙氨酸；用谷胺醯胺、組氨酸或賴氨酸取代精氨酸；用穀氨酸、谷胺醯胺、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸取代天冬醯胺；用天冬醯胺、穀氨酸或谷胺醯胺取代天冬氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；用天冬醯胺、穀氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷胺醯胺；用天冬氨酸、谷胺醯胺、賴氨酸或精氨酸取代穀氨酸；用脯氨酸取代甘氨酸；用天冬醯胺、賴氨酸、谷胺醯胺、精氨酸、酪氨酸取代組氨酸；用亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代異亮氨酸；用異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；用天冬醯胺、穀氨酸、谷胺醯胺、組氨酸、精氨酸取代賴氨酸；用異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；用蘇氨酸、丙氨酸取代絲氨酸；用絲氨酸或丙氨酸取代蘇氨酸；用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；用組氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；用甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸取代纈氨酸。參見 Ben-Bassat 等(J.Bacteriol.169:751-7，1987)，O，Regan 等(Gene77:237-51，1989)，Sahin-Toth 等(Protein Sc1.3:240-7，1994), Hochuli 等(Bio/Technology6:1321-5,1988)，W000/67796 (Curd等)或遺傳學和分子生物學的標準教科書，以了解關於保守取代的更多信息。`
[0095]外源性:在提到核酸和特定細胞時本文所用術語「外源性」指在天然情況下不是源自該特定細胞的任何核酸。因此，認為在引入細胞時，非天然存在的核酸對細胞來說是外源性的。對於特定細胞而言，天然存在的核酸也可以是外源性的。例如，當將分離自人X的細胞的整個染色體引入人Y的細胞時，它對Y的細胞來說是外源性核酸。在細胞中外源性核酸表達產生「外源性」蛋白。
[0096]功能等效:具有等效功能。在酶中，功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通過酶序列中的序列改變來提供功能等效物，其中具有一個或多個序列改變的多肽保持了未改變多肽的功能(如酶活性)。在具體實施例中，色氨酸轉氨酶功能等效物保持了將色氨酸轉變成吲哚-3-丙酮酸的能力。
[0097]序列改變的例子包括但不限於:保守取代、缺失、突變、移碼和插入。在一個實施例中，給定多肽與抗體結合，功能等效物是與相同抗體結合的多肽。因此，功能等效物包括結合特異性與多肽相同的肽，可用作代替該多肽的試劑。在一個實施例中，功能等效物包括結合序列不連續、抗體與線性表位結合的多肽。因此，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO:12的胺基酸1-10) (SEQ ID NO:89)，功能等效物包括不連續的表位，可以是(**=任何數量的間插胺基酸):NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L_COOH。在這個例子中，如果該多肽的三維結構使其可以結合能結合SEQ ID NO:12的胺基酸1-10的單克隆抗體，那麼該多肽與SEQ ID NO:12的胺基酸1_10功能等效。
[0098]雜交:本文所用術語「雜交」指根據互補的單鏈DNA和/或RNA形成雙鏈體分子的能力來測試兩個核酸分子的核苷酸序列的互補性的方法。在本發明範圍內，核酸雜交技術可用於獲得分離的核酸。簡要說，與SEQ ID NO:11所列序列或其部分有同源性的任何核酸可用作在中等至高度嚴謹條件下雜交鑑定相似核酸的探針。鑑定後，可純化、測序並分析該核酸，以確定它是否在本發明範圍內。
[0099]可通過Southern或Northern分析進行雜交來分別鑑定與探針雜交的DNA或RNA序列。可用生物素、洋地黃毒苷、多肽或放射性同位素如32P來標記探針。可以在瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離待分析的DNA或RNA，轉移到硝酸纖維素膜、尼龍膜或其它合適的膜上，用本領域熟知的標準技術用探針雜交，如Samtoook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY 的第7.39-7.52節所述。探針的長度一般至少約20個核苷酸。例如，對應於SEQ ID NO:11所列20個毗連核苷酸序列的探針可用於鑑定相同或相似的核酸。此外，可採用長於或短於20個核苷酸的探針。
[0100]本公開也提供了長度至少約為12個鹼基(如，長度至少約13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000個鹼基)並
且在雜交條件下與具有SEQ ID NO:11所列核酸序列的正義或反義鏈雜交的分離核酸序列。雜交條件可以是中等或高度嚴謹的雜交條件。就本公開目的而言，中等嚴謹的雜交條件意味著在約 42°C 下在含有 25mM KPO4 (pH7.4)、5X SSC、5X Denhart 溶液、50 μ g/mL 經超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲醯胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探針(約5xl07cpm/ μ g)的雜交溶液中進行雜交，而在約50°C下用含有2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進行洗漆。
`[0101]高度嚴謹的雜交條件意味著在約42°C下在含有25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5XDenhart溶液、50 μ g/mL經超聲處理的變性鮭精DNA、50%甲醯胺、10%葡聚糖硫酸酯和l-15ng/mL探針(約5xl07cpm/μ g)的雜交溶液中進行雜交，而在約65°C下用含有0.2X SSC和0.1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進行洗滌。
[0102]分離:在提及核酸時，本文所用術語「分離」指不與來源於天然存在的生物體基因組中直接毗連(一個在5'端，一個在3'端)的序列直接毗連的天然存在的核酸。例如，分離的核酸可以是，但不限於:在天然存在的基因組中，通常發現重組DNA分子側翼的一個核酸序列被去除或不存在的任何長度的重組DNA分子。因此，分離的核酸包括但不限於:以獨立於其它序列的分離分子(如用PCR或限制性內切核酸酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA以及摻入載體、自主複製的質粒、病毒(如逆轉錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA的重組DNA。此外，分離的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的重組DNA分子。當提及核酸時，本文所用術語「分離」也包括任何非天然存在的核酸，因為在自然中未發現非天然存在的核酸序列，且在天然存在的基因組中非天然存在的核酸序列不具有直接毗連的序列。例如，非天然存在的核酸如工程改造的核酸被認為是分離核酸。可用普通的分子克隆技術或化學核酸合成技術來製造工程改造的核酸。分離的非天然存在的核酸可以獨立於其它序列，或摻入載體、自主複製的質粒、病毒(如逆轉錄病毒載體、腺病毒或皰疹病毒)或原核生物或真核生物的基因組DNA。此外，非天然存在的核酸可包括作為雜交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
[0103]在例如，cDNA或基因組文庫、或含有基因組DNA限制性消化物的凝膠片中，認為存在於幾百至幾百萬其它核酸分子中的核酸不是分離核酸。
[0104]當提及多肽時，本文所用術語「分離」指以一些方式，例如從細胞中或從以前的環境中分離的多肽。分離多肽也可指以一些方式純化的多肽。
[0105]核酸:本文所用術語「核酸」包括RNA和DNA，DNA包括但不限於cDNA、基因組DNA和合成(如化學合成)DNA。核酸可以是雙鏈或單鏈核酸。其中單鏈核酸可以是正義鏈或反義鏈。此外，核酸可以是環形或線狀。一個或多個核酸可存在於較大的核酸內。例如，編碼醛縮酶多肽的核酸和編碼轉氨酶多肽的核酸可存在於較大的單一核酸內，如基因組DNA或質粒載體。或者，編碼醛縮酶多肽的核酸和編碼轉氨酶多肽的核酸可存在於兩個不同核酸，如兩個不同質粒載體中。[0106]操作性連接:當第一核酸序列與第二核酸序列發生功能性關係時，第一核酸序列「操作性連接」於第二核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄，將啟動子操作性連接於編碼序列。通常，操作性連接的DNA序列是毗連的，當需要時可將兩個多肽編碼區連接在相同的閱讀框中。
[0107]過度表達:如果在細胞和/或微生物中產生的由特定核酸或基因編碼的多肽的濃度高於相應的野生型或天然細胞和/或微生物中所產生的濃度，則細胞「過度表達」該特定核酸或基因。細胞可過度表達細胞中的外源性、重組或天然存在的(即天然)核酸或基因。例如，可通過在細胞中過度表達天然存在的核酸而在細胞中產生更高濃度的多肽，其中未遺傳修飾編碼多肽本身的核酸，但修飾或加入了指導核酸序列轉錄的啟動子。術語「過度表達」也可涉及過度表達的蛋白質，即以高於相應野生型或天然細胞和/或微生物的濃度存在於細胞和/或微生物中的蛋白質。
[0108]多肽:多肽指與翻譯後修飾無關的胺基酸鏈。
[0109]多肽修飾:本公開包括酶，及其合成實施方式。此外，本文所述方法可採用具有所需酶活性的類似物(非肽有機分子)、衍生物(用所公開的多肽序列為起點獲得的化學功能化的多肽分子)和變體(同源物)。本文所公開的多肽包括可以是L-胺基酸和/或D-胺基酸，天然存在或非天然存在的胺基酸序列。
[0110]可通過各種化學技術修飾多肽，產生活性與未修飾多肽基本相同，並任選地具有其它所需特性的衍生物。例如，可以藥學上可接受的陽離子鹽，或酯化形成C1-C16酯，或轉化成式NR1R2的醯胺的形式提供多肽的羧酸基團(羧基端或側鏈)，其中R1和R2各自獨立地為H或C1-C16烷基或者結合形成雜環如5-元環或6-元環。多肽的氨基(氨基端或側鏈)可以是藥學上可接受的酸加成鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、甲苯磺酸鹽、順丁烯二酸鹽、酒石酸鹽和其它有機鹽形式，或可被修飾為C1-C16烷基或二烷基氨基或進一步轉化為醯胺的形式。
[0111]可用熟知技術將胺基酸側鏈的羥基轉化為C1-C16烷氧基或轉化為C1-C16酯。可用一個或多個滷原子如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或這種羧酸的醯胺來取代胺基酸側鏈的苯基或酚環。胺基酸側鏈的亞甲基可以延伸到同源的C2-C4亞烷基中。可用許多良好公認的保護基團中的任何一個，如乙醯胺基團來保護硫醇。本領域技術人員也將認識到將環結構引入本公開多肽中以選擇和提供對結構的構象約束，導致穩定性提高。例如，可以向多肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸，以致當氧化時，該多肽將含有二硫鍵，產生環狀多肽。其它多肽環化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端醯胺和酯。
[0112]肽模擬物和有機模擬物實施方式也是在本公開範圍之內，這種肽模擬物和有機模擬物的化學組成的三維排列模擬肽骨架和成分胺基酸側鏈的三維排列，導致此公開多肽的肽模擬物和有機模擬物具有可檢測的酶活性。對於計算機建模應用而言，使藥效團理想化，生物活性的結構要求的三維定義。用當前的計算機建模軟體(用計算機輔助藥物設計或CADD)，可設計適合各藥效團的肽模擬物和有機模擬物。參見例如Walters，《藥物的計算機輔助建模》(Computer-Assisted Modeling of Drugs),刊於 Klegerman 和 Groves (編),《製藥生物技術》(Pharmaceutical Biotechnology), 1993, Interpharm Press:BuffaloGrove, IL,第 165_74 頁和第 IO2 章，Munson (編),《藥理學原理》(Principles ofPharmacology), 1995, Chapman和Hall,用於CADD技術的說明。用這些技術製備的模擬物也包括在本發明範圍內。在一個實施例中，模擬物模擬酶或其變體、片段或融合所產生的酶活性。
[0113]探針和引物:可根據本文提供的胺基酸序列和核酸序列容易地製備核酸探針和引物。「探針」包括含有可檢測標記或報導分子的分離核酸。示範性標記包括但不限於:放射性同位素、配體、化學發光劑和多肽(如酶)。例如，SambiOOk等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual))第2版,第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,和 Ausubel等(編)《新編分子生物學實驗指南》(Current Protocols in Molecular Biology) ,GreenePublishing and ffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 中討論了標記方法和適合各種目的的標記的選擇指南 。
[0114]「引物」一般是具有10個或更多個核苷酸的核酸分子(如具有約10-100個核苷酸的核酸分子)。引物可通過核酸雜交退火到互補靶核酸鏈上，在引物和靶核酸鏈之間形成雜交體，然後通過例如，DNA聚合酶多肽沿靶核酸鏈延伸。可通過例如，聚合酶鏈反應(PCR)或本領域已知的其它核酸擴增方法將引物對用於擴增核酸序列。
[0115]例如，在參考文獻如Sambrook等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ；Ausubel 等(編)，《新編分子生物學實驗指 南》(Current Protocols in Molecular Biology), Greene Publishing andffiley-1nterscience, New York(定期更新)，1987 ;和 Innis 等(編)，((PCR 方法:方法和應用指南》(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications), Academic Press:San Diego，1990中描述了探針和引物的製備和使用方法。例如，可通過用於此目的的電腦程式如 Primer (0.5 版，? 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)從已知序列獲得PCR引物對。本領域技術人員將理解，具體的探針或引物的特異性隨長度而提高，但探針或引物的尺寸範圍是序列全長到短至五個連續核苷酸的序列。因此，例如，20個連續核苷酸的引物可退火到具有特異性高於僅15個核苷酸的相應引物的靶上。因此，為了獲得更大的特異性，探針和引物可選自例如:10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050，3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450 或更多個連續核苷酸。
[0116]啟動子:指導核酸序列轉錄的核酸控制序列。啟動子包括在轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型啟動子的情況下的TATA元件。啟動子可包括可位於距轉錄起始位點多達幾千鹼基對的遠端增強子或阻抑元件。
[0117]純化的:本文所用術語「純化的」不要求絕對純淨；而打算作為相對術語。因此，例如，純化的多肽或核酸製劑可以是主題多肽或核酸各自比在生物體的天然環境中的多肽或核酸的濃度高的多肽或核酸製劑。例如，如果製劑中多肽含量至少佔總可溶性蛋白質含量的50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%，那麼可認為該多肽製劑是純化的。
[0118]重組:「重組」核酸是一種具有(I)在表達它的生物體中不天然存在的序列或(2)由兩種分離的、較短的序列人工組合而成的序列。常常用化學合成，更常見的是如用遺傳工程技術人工操作核酸的分離節段來完成此人工組合。「重組」也用於描述已人工操作的，但含有與發現於分離出該核酸的生物體的調節序列和編碼區相同的核酸分子。「重組」多肽是由重組核酸表達的多肽。
[0119]序列同一性:用序列之間的相似性，或稱為序列同一性來表示胺基酸序列之間的相似性。常常通過同一性百分數(或相似性或同源性)來量度序列同一性；此百分數越高，兩個序列越相似。當用標準方法比`對時，多肽的同源物或變體，如SEQ ID N0:12具有相對較高的序列同一性。
[0120]用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。各種程序和比對算法見=Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981 ;Needleman和 Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970 ;Pearson 和 Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.85:2444-8,1988 ;Higgins和Sharp, Gene73:237-44，1988 ；Higgins 和 Sharp, CAB10S5:151-3，1989 ；Corpet 等，NucleicAcids Researchl6:10881-90,1988;和 Altschul 等，Nature Genet.6:119-29,1994。
[0121]可從幾種來源獲得NCBI局部序列比對基本檢索工具(BLAST?) (Altschul等，J.Mol.Biol.215:403-10，1990)，包括國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和Internet,與序列分析軟體 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx 聯合使用。
[0122]多肽變體一般的特徵是經缺口 blastp設置為默認參數的NCBI Blast 2.0進行胺基酸序列全長比對計算具有至少50%序列同一性。對於比較大於約30個胺基酸的胺基酸序列而言，採用Blast2序列函數，用設置為默認參數的默認BL0SUM62矩陣，(存在缺口損失11，每殘基缺口損失I)。當比對短多肽(少於約30個胺基酸)時，用Blast2序列函數，用設置為默認參數的PAM30矩陣(開放缺口 9，延伸缺口罰分I)進行比對。當用此方法評價時，與參比序列相似性更大的多肽顯示出同一性百分數提高，如序列同一性為至少80%、至少90%、至少95%、至少98%，甚至至少99%。當比較少於完整序列的序列同一性時，在10-20個胺基酸的短窗口中同源物和變體的序列同一性一般至少為80%，且序列同一性可以為至少85%、至少90%、至少95%或98%，這取決於它們與參比序列的相似性。在此短窗口中確定序列同一'I"生的方法見Bethesda,Maryland的國家生物技術信息中心維護的網站。本領域技術人員將理解，提供這些序列同一性的範圍僅是為了指導；完全可能獲得在所提供範圍之外的非常有效的同源物。
[0123]類似的方法可用於確定核酸序列的序列同一性百分數。在具體實施例中，比對同源序列與天然序列，通過計算兩個序列中存在的相同核苷酸或胺基酸殘基的位置的數量來確定匹配數量。通過將匹配數量除以鑑定序列(如SEQ ID N0:11)中所列序列長度，或除以分節長度(如來自鑑定序列中所列序列的100個連續核苷酸或胺基酸殘基)，然後將得到的值乘以100來確定序列同一性百分數。例如，與SEQ ID NO:11所列序列比對時具有882個匹配的核酸序列與SEQ ID NO:11所列序列的同一性為75.0%(即(882+1176) *100=75.0)。應注意，序列同一性百分數值四捨五入到最接近的十分之一。例如，75.11,75.12,75.13和75.14四捨五入到75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19四捨五入到75.2。也應注意，長度值總是整數。
[0124]特異性結合物:能夠特異性結合於本文所述任何多肽的物質。例子包括但不限於:多克隆抗體、單克隆抗體(包括人源單克隆抗體)和單克隆抗體的片段如？&13、？(&13』)2和Fv片段以及能夠特異性結合於這種多肽的表位的任何其它物質。
[0125]本文所提供的多肽的抗體可用於純化或鑑定這種多肽。本文所提供的胺基酸和核酸序列可用於生產識別本文所述多肽的基於特異性抗體的結合物。
[0126]可生產多肽、部分多肽或其變體的單克隆或多克隆抗體。多肽抗原上產生抗一個或多個表位的抗體宜特異性檢測該多肽。即，產生抗特定多肽的抗體將識別和結合該特定多肽，基本不會識別和結合其它多肽。通過許多標準免疫測定方法中的任何一種，如Western印跡(參見例如，Sa`mbrook等(編)，《分子克隆:實驗室手冊》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第 2 版，第 1-3 卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)來確定抗體與特定多肽特異性結合。
[0127]為通過Western印跡測定給定抗體製劑(如在小鼠中產生的抗具有SEQ ID NO:12所列胺基酸序列的多肽的製劑)特異性檢測合適的多肽(如具有SEQ ID N0:12所列胺基酸序列的多肽)，從細胞中抽提細胞總蛋白，用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離。
[0128]然後，可將分離的細胞總蛋白轉移到膜(如硝酸纖維素)上，用抗體製劑孵育該膜。洗滌膜去除非特異性結合的抗體後，可用合適的偶聯於多肽如鹼性磷酸酶的第二抗體(如抗鼠抗體)檢測存在的特異性結合的抗體，因為通過免疫定位的鹼性磷酸酶應用
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基藍四唑鎗導致產生深藍色化合物。
[0129]適合用作免疫原的基本純的多肽可獲自轉染細胞、轉化細胞或野生型細胞。通過，例如Amicon過濾裝置濃縮將最終製劑中多肽濃度調整到幾微克/微升的水平。此外，大小範圍是全長多肽至少達9個胺基酸殘基的多肽可用作免疫原。這種多肽可在細胞培養物中產生、可用標準方法化學合成或可通過將大多肽切割成可純化的較小多肽而獲得。在主要組織相容性複合體(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情況下，當呈遞給免疫系統時，長度少達9個胺基酸殘基的多肽可具有免疫原性。因此，具有本文所公開的任何胺基酸序列的至少 9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、I100、1150、1200、1250、1300、1350或更多個連續胺基酸殘基可用作生產抗體的免疫原。
[0130]可根據Kohler和Milstein的經典方法(Nature 256:495-7,1975)或其衍生方法從鼠雜交瘤製備本文所公開的任何多肽的單克隆抗體。
[0131]可通過用多肽(或其片段)免疫合適的動物來製備含有本文所公開任何多肽的異源表位的抗體的多克隆抗血清，該多肽可以是未修飾或經修飾提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可參見 Vaitukaitis 等(J.Clin.Endocrinol.Metab.33:988-91，1971)。
[0132]可用抗體片段代替整個抗體，並可在原核宿主細胞中容易地表達抗體片段。製造和使用單克隆抗體的免疫有效部分，也稱為「抗體片段」的方法是熟知的，包括 Better 和 Horowitz (Methods Enzymol.178:476-96，1989)、Glockshuber 等(Biochemistry29:1362-7, 1990)、美國專利號5，648，237 ( 「功能性抗體片段的表達」(Expression of Functional Antibody Fragments))、美國專利號 4，946，778 ( 「單多妝鏈結合分子」(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美國專利號5，455，030 ( 「採用單鏈多肽結合分子的免疫療法」(Immunotherapy Using Single ChainPolypeptide Binding Molecules))和其中引用的參考文獻中描述的方法。
[0133]轉化:「轉化」細胞是通過例如分子生物學技術引入了核酸分子的細胞。轉化包括可將核酸分子引入細胞的所有 技術，包括但不限於:用病毒載體轉染、接合、用質粒載體轉化和通過電穿孔引入裸DNA、脂質轉染和基因槍加速。
[0134]變體、片段或融合多肽:所公開的多肽包括其變體、片段和融合物。經工程改造，編碼多肽(例如SEQ ID NO:12)、融合多肽或多肽片段或變體的DNA序列(例如SEQ ID NO:
11)可在真核細胞、細菌、昆蟲和/或植物中表達該多肽。為了獲得表達，可改變DNA序列，且操作性連接於其它調節序列。將含有調節序列和多肽編碼序列的最終產物稱為載體。可將該載體引入真核細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和/或植物細胞。引入細胞後，該載體可產生所述多肽。
[0135]融合多肽可包括連接於不抑制所需多肽活性(例如，將色氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸的能力)的其它胺基酸序列的多肽，如芳族轉氨酶(例如，SEQ ID N0:12)。在一個實施例中，所述其它胺基酸序列的長度不超過約10、12、15、20、25、30或50個胺基酸。
[0136]本領域普通技術人員將理解，可用不影響編碼多肽生物活性的許多方式改變DNA序列。例如，可用PCR在編碼多肽的DNA序列中產生變異。這種變體可以是用於表達該多肽的宿主細胞中密碼子偏好優化的變體，或促進表達的其它序列改變。
[0137]載體:將核酸分子引入細胞，產生轉化細胞。載體可包括允許它在細胞中複製，如含有複製起點的核酸序列。載體也可包括一個或多個可選擇標記基因和本領域已知的其它遺傳元件。
[0138]生物合成途徑概述
[0139]如圖1-3和11-13所示，可用許多生物合成途徑產生莫納甜或其中間體如吲哚-3-丙酮酸或MP。對各底物(如葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各產物(如色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫納甜)的轉化，可採用幾種不同多肽。而且，可在體內、體外、或通過體內反應和體外反應的組合，如包括無酶化學反應的體外反應來進行這些反應。因此，圖1-3和11-13是示範，顯示可用於獲得所需產物的多種不同途徑。
[0140]葡萄糖到色氨酸
[0141]許多生物體能從葡萄糖合成色氨酸。含從葡萄糖和/或色氨酸生成莫納甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的構建物可克隆入這種生物體中。本文顯示色氨酸可轉化成吳納甜。
[0142]在其它例子中，用已知多肽改造生物體可產生色氨酸或過量產生色氨酸。例如，美國專利號4，371，614描述了用含野生型色氨酸操縱子的質粒轉化大腸桿菌菌株。色氨酸操縱子基因包括編碼多肽鄰氨基苯甲酸合酶組分I (EC4.1.3.27)、鄰氨基苯甲酸合酶組分IKEC4.1.3.27)、N-(5'-磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構酶(EC5.3.1.24)/吲哚-3-甘油磷酸合酶(EC4.1.1.48)、色氨酸合酶、α亞基(EC4.2.1.20)和色氨酸合酶、β亞基(EC4.2.1.20)的色氨酸生物合成基因，它們都參與從分支酸產生色氨酸。
[0143]美國專利號4，371，614所述色氨酸的最大效價約為230ppm。類似地，W08701130描述遺傳改造大腸桿菌菌株以生成色氨酸並討論增加發酵生產的L-色氨酸。本領域技術人員認識到能從葡萄糖生成色氨酸的生物體也能利用其它可轉化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，結果類似。示範性碳源和能源包括但不限於蔗糖、果糖、澱粉、纖維素或甘油。
[0144]提高色氨酸產量
[0145]在大多數生物體中色氨酸產量受到調節。一個機制是通過途徑中某些酶的反饋抑制。例如，提高色氨酸的水平可導致色氨酸產率降低。因此，當採用工程改造的宿主細胞通過色氨酸中間體生產莫納甜時，可用對色氨酸濃度不敏感的生物體。例如，可通過重複接觸高濃度的5-甲基色氨酸來選擇耐各種色氨酸類似物的生長抑制的長春花(Catharanthusroseus)植株，如下列文獻所述(Schallenberg 和 Berlin, Z.Naturforsch, 34:541-5，1979)。所得植株的色氨酸合酶活性受由於基因突變產生的產物抑制的影響小。
[0146]可用類似方法選擇抗反饋的株。例如，可以通過在苯丙氨酸類似物、β -2-噻吩基丙氨酸、間_氟_D, L-苯丙氨酸和對-氟-D, L-苯丙氨酸上培養大腸桿菌菌株#7692 (來自E.Coli Genetic Stock Center,W3110tnaA2trpEfbrl9(Yanofsky 等，J.Bacteriol.,158:1018-1024，1984;和Doolittle和 Yanofsky，J.Bacteriol.，95:1253，1968))來選擇抗反饋的aroG DAHP (3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸)合酶的突變體。此大腸桿菌菌株#7692可產生可測量量的色氨酸，可用作引入外源性核酸如編碼醛縮酶和轉氨酶的核酸的起始宿主。另一大腸桿菌菌株E971(ATCC15491)是顯示DAHP合酶水平升高以及吲哚和色氨酸水平比親本菌株高的原養型菌株(Lim和Mateles, 1964J.Bacteriol., 87: 1051-1055) ?該菌株可用於獲得用生長培養基中的5-甲基色氨酸類似物降低了抗反饋的鄰氨基苯甲酸合酶(EC5.3.1.24)突變體。此菌株也可用作引入編碼醛縮酶和轉氨酶的外源性核酸的宿主。
[0147]可通過定向進化產生對產物抑制較不敏感的多肽來優化色氨酸產量。例如，可在培養基中不含色氨酸，但含有高濃度的不可代謝的色氨酸類似物的平板上進行篩選。美國專利號5，756，345,4, 742，007和4，371，614描述了在發酵生物中提高色氨酸產量的方法。色氨酸生物合成的最後一步是將絲氨酸加在吲哚上。因此，提高絲氨酸的有效性來增加色氨酸產量。[0148]色氨酸生物合成的控制點是DAHP合酶。此多肽的三種同工酶由以下基因編碼:ar0F、ar0G和aroH，它們分別可被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸反饋抑制。L-酪氨酸反饋抑制的DAHP合酶約佔總酶活性的20%，L-苯丙氨酸反饋抑制的DAHP合酶約佔總酶活性的80%，L-色氨酸抑制的DAHP合酶對總酶活性的貢獻很小。得到的酶抗反饋的突變體可提供該控制點失調的株。通常，主要的抗反饋靶是aroG和aroF。
[0149]一種分離抗反饋突變體的方法是用化學誘變或紫外線誘變並選擇在胺基酸類似物上可生長的生物體。可用類似物β-2-噻吩基丙氨酸獲得對反饋不敏感的aroG (Duda和Sasvar1-Szekely, (1973) Acta.Biochim.Biophys.Acad.Sc1.Hung.8 (2): 81-90)。也可用類似物間-氟-D，L-苯丙氨酸(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem.，54 (3): 707-713)以及對氟苯丙氨酸(Hagino 和 Nakayama, (1974) Agr.Biol.Chem., 38 (I): 157-161)產生對反饋不敏感的aroG。
[0150]一種獲得抗反饋的DAHP合酶的方法是用胺基酸類似物並產生天然基因已突變的株。另一方法是克隆編碼抗反饋的酶的基因，它能提供更大彈性，並且用不同啟動子可降低轉錄調節的可能性(Ito 等，(1990) Agric.Biol.Chem., 54 (3): 707-713)。
[0151]色氨酸生物合成中另一調節點是分支點酶鄰氨基苯甲酸合酶，在大腸桿菌中它是trpE和trpD編碼的雙組分蛋白。可用胺基酸類似物5-氟色氨酸和5-甲基色氨酸獲得不受色氨酸反饋抑制的突變體(Shiio 等，(1975)Agr.Biol.Chem., 39 (3):627-635)。
[0152]此外,在乳發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)中可能出現色氨酸反饋抑制鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉移酶和色氨酸合酶。然而，可使這些酶對抑制不敏感(Matsui等，(1987) J.Bacteriol.，169:5330-5332)。這種突變體可顯示色氨酸水平升高，因此，預計它能提高莫納甜水平。
[0153]細胞所用控制其合成色氨酸水平的其它方法包括在轉錄水平上調節。在穀氨酸棒桿菌中，酪氨酸在轉錄水平上調節DAHP合酶，通過操縱5，調節區來減輕此種調節可提高色氨酸生物合成(Shiio, 1986,《胺基酸生產的生物技術》(Biotechnology of AminoAcids Production), Aida, K.、Chibita, L.、Nakayama, K.、Takinami, K.和 Yamada, H.編.Elsevier).在大腸桿菌中，通過阻抑和弱化在轉錄水平上調節色氨酸(trp)操縱子，阻抑產生80倍變異和弱化產生6-8倍變異。阻抑蛋白的TrpR多肽的失活可提高trp操縱子mRNA的水平。前導肽形成mRNA二級結構，它響應於帶電荷tRNAtap水平。5'-調節弱化區的缺失可幫助克服此額外水平的調節(Yanofsky等，J.Bacteriol.，158:1018-1024，1984)。在枯草芽孢桿菌中也觀察到色氨酸-RNA-結合弱化蛋白(TRAP)的弱化機制，通過下調或缺失編碼它的基因減輕弱化可提高此宿主生物體中的色氨酸合成(Babitzke和Gollnick，2001，J.Bacteriol.，183:5795-5802)。或者，可上調抗-TRAP 多肽的表達。
[0154]可通過在色氨酸途徑中過度表達多肽來提高色氨酸產量，這可提高莫納甜水平。例如，過度表達編碼轉酮酶的核酸、aroFfbr和aroL(編碼莽草酸激酶)可提高色氨酸產量。然而，過度表達這些序列可引起對細胞的代謝負擔，在極限培養基中，細胞可分泌出各種中間體。可用更富有營養的培養基來提高色氨酸水平(Kim等，2000，J.Microbiol.Biotechnol.，10 (6):789-796)。此外，含有失調的DAHP合酶表達、失調的鄰氨基苯甲酸合酶表達和編碼磷酸核糖基轉移酶的多拷貝質粒的穀氨酸棒桿菌細胞的色氨酸產量可增加到 43g/L(Katsumata 和 Ikeda, (1993)Bio/Technology,11:921-9250)。[0155]芳族胺基酸途徑中受反饋和/或轉錄控制的其它酶包括莽草酸脫氫酶(由aroE編碼)和莽草酸激酶I/II (由aroK、aroL編碼)。誘變aroE基因可提供抗反饋的酶。AroK和aroL受酪氨酸的負轉錄控制。遺傳操縱啟動子區或缺失調苄基因(trpR和tyrR)可減輕酪氨酸的控制。
[0156]苯丙氨酸和酪氨酸是芳族胺基酸，它們的生物合成可從色氨酸上轉移碳，因為分支酸是所有三種芳族胺基酸的共同前體，並且是色氨酸代謝和苯丙氨酸/酪氨酸代謝之間的分支點。可去除或中斷苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成途徑，以降低分支酸消耗，這可通過遺傳敲除編碼分支酸變位酶/預苯酸(prephanate)脫氫酶的pheA或tyrA基因來完成。分支酸變位酶與鄰氨基苯甲酸合酶(trpD和trpE基因產物)競爭可用的分支酸。中斷或去除競爭性芳族胺基酸途徑的示範性菌株包括大腸桿菌NRRL B12262(參見實施例15)、大腸桿菌 NRRL B12258、大腸桿菌 SR250(Rothman 和 Kirsch，J Mol Biol.(2003)327，593-603)、穀氨酸棒桿菌ATCC21847 (參見實施例17)、穀氨酸棒桿菌ATCC21850、穀氨酸棒桿菌ATCC21851。或者，除去除苯丙氨酸和酪氨酸途徑和需要將胺基酸加入培養基外，可克隆trpE基因(或整個色氨酸操縱子)並用異源啟動子過度表達trpE基因，因為鄰氨基苯甲酸合酶與分支酸的親和力高於pheA或tyrA(Dopheide等，(1972) J.Biol.Chem., 247:4447-4452)。降低碳流到苯丙氨酸和酪氨酸的另一方法是修飾它們的轉錄控制。還有，催化色氨酸轉化為吲哚和丙酮酸的色氨酸酶多肽的表達降低可幫助防止色氨酸喪失(Aiba等，Appl.Environ.Microbiol.,1982,43:289-297)。
[0157]在一個實施方式中，可以改造中心機制，以提高莫納甜產量。如本文所述，為獲得足夠的莫納甜產量，選擇或得到的生物體應具有高於野生型生物體的速率生產色氨酸的能力。因為色氨酸不是最終產物，而是到莫納甜途徑中的中間體，所以開發不僅具有累積更高濃度的色氨酸能力，而且具有流量提高的菌株是至關重要的。可用多種方法來改造中心碳機制，以將碳轉移到莽草酸和分支酸途徑中，使得可以產生高水平的莫納甜。
[0158]芳族化合物如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中第一步是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)和赤蘚糖4-磷酸(E4P)縮合`形成DAHP。可用各種方法提高各前體的有效性，並提高此第一反應的性能。以下五種方法是用於提高PEP有效性的可能的例子。
[0159]第一，可消除通過磷酸轉移酶系統(PTS)攝取葡萄糖對PEP的消耗。葡萄糖轉運系統的失活可產生葡萄糖負突變體。已分離PTS_葡萄糖+突變體。它們中一些通過半乳糖透性酶、葡糖激酶和ATP轉運和磷酸化葡萄糖,不消耗PEP (Flores等，(1996) Nat.Biotechnol.,14:620-623;和 Chen 等，(1997)Biotechnol.Prog.，13:768-775)。葡萄糖透性酶系統需要較大量的ATP來磷酸化葡萄糖。可通過加入編碼葡萄糖易化子(facilitator)(由glf編碼)、葡萄糖脫氫酶(由gdhIV編碼)和葡糖酸激酶(由glk編碼)的基因引入不同的葡萄糖轉運和磷酸化系統，它們也可導致PEP水平升高(W099/55877)。此機制可產生葡糖酸6-磷酸，它是戊糖磷酸途徑中的中間體，因此可提高此途徑中的碳流並導致E4P水平升高。
[0160]第二，PEP消耗酶、PEP羧化酶(Ppc)和丙酮酸激酶(如PykA和PykB)的失活可增加可用的 PEP 庫(Bongaerts 等，(2001)Met.Eng., 3, 289-300)。
[0161]第三，可通過提高PEP合酶(Pps)的表達將通過PTS或丙酮酸激酶形成的丙酮酸再循環回 PEP 中(Patnaik 等，(1995)Biotechnol.Bioeng.,46:361-370;和 Yi 等，(2002)Biotechnol.Prog.，18:1141-1148)。[0162]第四，可通過破壞csrA基因改變糖異生調節(碳貯存調節器)，這可增加糖異生，影響參與PEP代謝、降低糖酵解和提高PEP水平的幾種酶的調節(Tatarko等，(2001)Current Microbiol.,43(I):26-32)。
[0163]第五，可通過供給糖如不像葡萄糖，繞過PTS系統轉運入細胞的木糖來減少PEP消耗。
[0164]為了提高E4P的有效性，可過度表達編碼轉酮酶的tktA基因和/或編碼轉醛酶的talB基因。在將碳流導入芳族途徑中表達轉酮酶更有效(Liao等，(1996)Biotechnol.Bioeng.,52:129-140)。例如，具有修飾的戊糖磷酸途徑的穀氨酸棒桿菌菌株可用來產生色氨酸(攜帶 pKW9901 的 KY9218 ；Ikeda 和 Katsumata, Appl.Environ.Microbiol.，1999，65(6):2497-502)。
[0165]可採用這些方法的任何組合。例如，可將這些修飾中的幾種組合起來應用於大腸桿菌菌株。在過度表達tktA的PTS_葡萄糖+、pykA、pykB菌株中，到芳族途徑的碳流幾乎提高了 20 倍(Gosset 等，(1996) J.1nd.Microbiol.，17:47-52)。此外，可將這些方法可與其它修飾聯用，以降低色氨酸生物合成途徑中後來發生的瓶頸(如芳族途徑的色氨酸分支中過度表達基因，缺失PheA和tyrA基因以避免分支酸消耗，過表達trpE和trpD以提高鄰氨基苯甲酸的合成)，從而增加色氨酸產量。所產生的色氨酸不需要在細胞中累積，因為它可進一步轉化為產物如莫納甜。
[0166]產生色氨酸，以及後來產生莫納甜，可得益於引起絲氨酸生產途徑中的改變。在生產色氨酸的最後一步中需要絲氨酸，最後一步包括絲氨酸與吲哚-3-甘油磷酸酯的反應。此反應由色氨酸合酶多肽催化。通過色氨酸途徑的碳流增加可導致一些反應不平衡，出現新瓶頸。由於通過另一途徑產生絲氨酸，所以其產率可成為色氨酸生產中的限制因素。可通過過度表達途徑中的第一個 基因來增加通過絲氨酸途徑的碳流，該基因編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶(PDG;Ikeda 等，(1994) Biosc1.Biotech.Biochem.，58 (4): 674-678)。
[0167]提高丙酮酸產量
[0168]可通過增加宿主生物產生的丙酮酸量來提高由生物體產生的莫納甜量。一種產生莫納甜的途徑基於吲哚-3-丙酮酸與丙酮酸反應形成莫納甜的4-酮酸衍生物。為了將此反應向前推進，能夠將大量碳轉移到丙酮酸的生物體用作生產莫納甜的宿主。選擇丙酮酸超產菌，它們不需要耐受高濃度的酸，但它們的代謝途徑應失調，以使更多的碳轉移到丙酮酸。某些酵母，如皮狀絲孢酵母(Wang 等，Lett.Appl.Microbiol.，35:338-42，2002)、脂解假絲酵母、釀酒酵母和光滑假絲酵母(以前稱為光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)(Li 等，Appl.Microbiol.Biotechnol., 57:451-9, 2001)從葡萄糖過量產生丙酮酸(高達50g/L)，可用於產生本文所述產物。
[0169]這些不同菌株的硫胺營養缺陷型在硫胺有限的條件下累積丙酮酸，因為硫胺依賴性丙酮酸脫氫酶(TOH)的活性降低損害了丙酮酸的氧化脫羧。硫辛酸是PDH的輔因子。同樣，硫辛酸營養缺陷型，如大腸桿菌菌株W14851ip2(ATCC25645 ；Kawasaki等，J.Ferment.Bioeng.,82:604-6,1996)可將丙酮酸累積到顯著的程度(>25g/L) (Yokota 等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，41:638-643，1994)。將 Fl-ATP 酶缺陷基因引入 W14851ip2 菌株可進一步提高丙酮酸生產的速率和量。此突變導致細胞的能量產生有缺陷，此缺陷趨向於由提高通過糖酵解的碳流來補償，因此產生更大量的丙酮酸(Yokota等，J.Ferment.Bioeng.,83:132-138,1997) 0雙突變菌株可用於產生過量產生幾種胺基酸包括色氨酸(Kawasaki等，1996上述)、亮氨酸和纈氨酸(美國專利號5，888，783和6，214，591)的宿主菌株。
[0170]除了丙酮酸脫氫酶複合物中的突變以外，可通過去除或降低丙酮酸脫羧酶、丙酮酸鐵氧還蛋白-氧化還原酶、丙酮酸黃素氧還蛋白氧化還原酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶和/或丙酮酸氧化酶的表達獲得丙酮酸產量的進一步提高。參見例如，W003/000913。
[0171]過量產生丙酮酸的菌株中過度表達色氨酸酶基因可用於從吲哚產生色氨酸(Kawasaki等，1996，上述)。過量產生丙酮酸可提高色氨酸產量，也使形成莫納甜前體的底物(丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸)水平提高。或者，當採用色氨酸酶基因時，在存在過量銨的情況下可同時供給丙酮酸和吲哚。可用去汙劑提高吲哚的溶解性，或者可連續供給吲哚以使毒性和沉澱減至最低程度。
[0172]色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
[0173]可用一些多肽將色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。示範性多肽包括但不限於酶種類(EC) 2.6.1.27,1.4.1.19,1.4.99.1,2.6.1.28,1.4.3.2,1.4.3.3,2.6.1.5,2.6.1.-、
2.6.1.1和2.6.1.21。這些種類包括但不限於稱為色氨酸轉氨酶的多肽(也稱為L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸轉氨酶、色氨酸轉氨酶、5-羥基色氨酸-酮戊二酸轉氨酶、羥基色氨酸轉氨酶、L-色氨酸氨基轉移酶、L-色氨酸轉氨酶、和L-色氨酸:2-氧戊二酸轉氨酶),它將L-色氨酸和2-氧戊二酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和L-穀氨醯胺；D-色氨酸轉氨酶，它將D-色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸；色氨酸脫氫酶(也稱為NAD (P) -L-色氨酸脫氫酶、L-色氨酸脫氫酶、L-Trp-脫氫酶、TDH和L-色氨酸:NAD(P)氧化還原酶(脫氨))，它將L-色氨酸和NAD (P)轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD (P) H ；D-胺基酸脫氫酶，它使D-胺基酸和FAD轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2 ;色氨酸-苯基丙酮酸轉氨酶(也稱為L-色氨酸-α-酮異已酸轉氨酶和L-色氨酸:苯基丙酮酸轉氨酶)，它將L-色氨酸和苯基丙酮酸轉化成吲哚-3-丙酮`酸和L-苯丙氨酸；L-胺基酸氧化酶(也稱為蛇胺基酸氧化酶和L-胺基酸:氧氧化還原酶(脫氨))，它使L-胺基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ；D-胺基酸氧化酶(也稱為蛇胺基酸氧化酶和D-胺基酸:氧氧化還原酶(脫氨))，它將D-胺基酸和H2O和O2轉化成2-含氧酸和NH3以及H2O2 ;色氨酸氧化酶,它使L-色氨酸和H2O和O2轉化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H202。這些種類也含有酪氨酸(芳族)轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、D-胺基酸(或D-丙氨酸)轉氨酶和有多種轉氨酶活性的廣(多底物)轉氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸轉化成吲哚-3-丙酮酸和胺基酸。
[0174]轉氨酶種類中有這種活性的11個成員描述於下面的實施例1，包括SEQ ID N0:11和12所示的新轉氨酶。因此，本發明提供分離的核酸和胺基酸序列，與分別在SEQ ID NO: 11和12中所示序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少99%的序列同一性。本發明也涵蓋SEQ ID NO: 11和12中所示片段和融合體，它們保持轉氨酶活性或編碼具有轉氨酶活性的多肽。示範性片段包括但不限於至少10、12、15、20、25、50、100、200、500 或 1000 個 SEQ ID NO: 11 的毗連核苷酸或至少 6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350個SEQ ID NO: 12的毗連胺基酸。所示序列(和其變體、片段和融合體)可以是載體的一部分。載體能用於轉化宿主細胞，從而生成重組細胞，重組細胞可從色氨酸產生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能進一步產生MP和/或莫納甜。
[0175]L-胺基酸氧化酶(1.4.3.2)已知，序列可分離自一些不同來源，如地中海蝰(Vipera lebetine) (sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah) (sp P81383)、紅口峻(Agkistrodon rhodostonma) (sp P81382)、西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox) (spP56742)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepaica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄桿菌(Caulobacter cresentus)、萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假單胞菌(P.Syringae)和紅球菌屬(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述於文獻且可分離自例如鬼傘屬(Coprinus) SF-1、有根腫病的大白菜、擬南芥和哺乳動物的肝。
[0176]色氨酸脫氫酶已知，並可分離自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黃花牧豆樹(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆樹、小麥、玉米、番爺、菸草、紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)和乳桿菌(Lactobacilli)。許多D-氛基酸脫氧酶基因序列已知。
[0177]如圖11-13所示，如果用胺基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸轉化成吲哚-3-丙酮酸，能加入過氧化氫酶以減少或甚至去除過氧化氫的存在。
[0178]吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
[0179]將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸的反應可通過各種多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或 1.1.1.111 多肽類的成員。1.1.1.11 0多肽類包括吲哚乳酸脫氫酶(也稱為吲哚乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.27,1.1.1.28和1.1.2.3類包括乳酸脫氫酶(也稱為乳酸脫氫酶、乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.1.222類包含(R) -4-羥苯基乳酸脫氫酶(也稱為D-芳族乳酸脫氫酶、R-芳族乳酸脫氫酶和R-3-(4-羥苯基)乳酸:NAD (P)+2-氧化還原酶)且1.1.1.237類包含3-(4-羥苯基丙酮酸)還原酶(也稱為羥苯基丙酮酸還原酶和4-羥苯基乳酸:NAD+氧化還原酶)。1.1.3.-類包含乳酸氧化酶，1.1.1.111類包含(3-咪唑-5-基)乳酸脫氫酶(也稱為(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸:NAD(P) +氧化還原酶)。可能這些種類中的一些多肽能從吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。
[0180]化學反應也可用於將吲哚-3-乳酸轉化成吲哚-3-丙酮酸。這種化學反應包括能用一些方法完成的氧化步驟，例如:使用B2催化劑的空氣氧化(China ChemicalReporter, 13卷，28期，18頁(I)，2002)，金屬催化劑存在時稀釋高錳酸鹽和高氯酸鹽或過
氧化氫。
[0181]吲哚-3-丙酮酸到2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4_酮戊二酸(MP)
[0182]一些已知多肽能用於使吲哚-3-丙酮酸加一種三碳源(如丙酮酸)轉化成MP。示範多肽種類包括4.1.3.-、4.1.3.16,4.1.3.17和4.1.2._。這些種類包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2種羧酸底物縮合的醛縮酶。肽類EC4.1.3.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作為親電體，而EC4.1.2.-是形成碳-碳鍵的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作為親電體。
[0183]例如，EP1045-029中所述多肽(EC4.1.3.16,4-羥基_2_氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也稱為4-羥基-2-氧戊二酸醛縮酶、2-氧-4-羥基戊二酸醛縮酶或KHG醛縮酶)將乙醛酸和丙酮酸轉化成4-羥基-2-酮戊二酸，多肽4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶(EC4.1.3.17，也稱為4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛縮酶)縮合2種酮酸如2個丙酮酸到4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用這些裂合酶的反應。
[0184]圖1-2和11-13顯示這些反應的示意圖，其中3_碳(C3)分子結合吲哚_3_丙酮酸。EC4.1.2.-和4.1.3.-的許多成員，特別是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是胺基酸如絲氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇縮合需要此途徑的3個碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作為C3碳源且可轉化成丙酮酸。可通過許多利用PLP的轉氨酶來轉氨以產生丙酮酸，包括許多上述的轉氨酶。可通過β消除反應(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)獲得丙酮酸和氨，反應用於L-絲氨酸、L-半胱氨酸、有足夠離去基團的絲氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-絲氨酸、O-苄基-L-絲氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-醯基-L-絲氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介導的β -裂合酶反應中用作丙酮酸的來源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC4.1.99.2，也稱為酪氨酸-酚裂合酶)催化的反應。通過在(4.1.99.1-2)多肽上進行定點誘變可增加β-裂合酶反應速率，如Mouratou等(J.Biol.Chem274:1320-5,1999)和實施例5所述。這些修飾使多肽接受二羧基胺基酸底物。乳酸鹽也能用作丙酮酸的來源，且通過加入乳酸脫氫酶和氧化輔因子或乳酸氧化酶和氧來氧化成丙酮酸。這些反應的例子在下文描述。例如，如圖2和圖11-13所示，當丙酮酸用作C3分子時，ProA醛縮酶能接觸吲哚_3_丙酮酸。
[0185]MP到莫納甜
[0186]MP到莫納甜的轉化可由下列I個或多個催化:色氨酸轉氨酶(EC2.6.1.27)、色氨酸脫氫酶(EC1.4.1.19)、D-胺基酸脫氫酶(EC1.4.99.1)、穀氨酸脫氫酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脫氫酶(EC1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸轉氨酶(EC2.6.1.28)或更多轉氨酶家族(2.6.1.-)的一般成員如天冬氨酸轉氨酶(EC2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)轉氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸轉氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)轉氨酶(圖2)。轉氨酶類的11個成員在下文描述(實施例1)，包括SEQ ID NO: 11和12所示新的種類成員，實施例4提供證明轉氨酶和脫氫酶活性的反應。
[0187]此反應也能用化學反應進行。酮酸(MP)胺化通過還原性胺化用氨和氰基硼氫化鈉進行。
[0188]圖11-13顯示另外的多肽，它們能用於使MP轉化成莫納甜，以及提供增加來自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫納甜產量的方法。例如，如果天冬氨酸用作氨基供體，天冬氨酸轉氨酶能用於使天冬氨酸轉化成草醯乙酸(圖11)。草醯乙酸通過脫羧酶(如草醯乙酸脫羧酶)轉化成丙酮酸和二氧化碳(圖11)。此外，如果賴氨酸用作氨基供體，賴氨酸ε轉氨酶可用於使賴氨酸轉化成ε -醛基賴氨酸(圖12)。ε -醛基賴氨酸自發轉化成1-哌啶
6-羧酸鹽(圖12)。如果能催化還原性胺化反應的多肽(如穀氨酸脫氫酶)用於將MP轉化成莫納甜，可使用能再循環NAD⑵H和/或產生揮發性產物的多肽，如甲酸脫氫酶。
[0189]提高莫納甜產量的其它方法
[0190]可用於提高莫納甜產量的具有遺傳修飾的菌株的其它例子包括:
[0191]I)大腸桿菌 AGX1757，可分離自 W3110 (具有質粒 pSC101+trpI 的 trpAEl、trpR、tnaA)。可進行NTG誘變，選擇6-氟色氨酸或5-甲基色氨酸抗性。可通過加入普朗尼克(Pluronic) L-61使色氨酸或莫納甜在培養基中結晶以提高產率。
[0192]2)穀氨酸棒桿菌KY9225衍生自Ρχ_115_97，顯示苯丙氨酸和酪氨酸雙營養缺陷型，並含有耐色氨酸抑制的鄰氨基苯甲酸合酶。
[0193]3)誘變乳發酵短桿菌1041trpE，使其對色氨酸反饋抑制脫敏感。發現該基因具有被精氨酸所取代的絲氨酸殘基。發現推定弱化子內終止子結構中鳥嘌呤突變成腺嘌啉也減輕轉錄調節(Matsui 等,(1987) J.Bacteriology, 16:5330-5332)。
[0194]可用於使前體的有效性最優化和使莫納甜產量最大化的其它修飾包括但不限於:(I)缺失編碼有助於莫納甜攝取的多肽的基因，(2)缺失或下調編碼參與競爭途徑的多肽的基因，(3)上調醛縮酶和轉氨酶多肽表達，(4)缺失編碼產生莫納甜的不正確形式的轉氨酶多肽的基因，和(5)提高PLP有效性。編碼有助於莫納甜攝取的多肽的基因可包括枯草芽孢桿菌天冬氨酸攝取轉運蛋白(YveA ;Lorca 等，2003, J.Bacteriol., 185 (10): 3218-22),Glt-1L-穀氨酸/L-天冬氨酸/D-天冬氨酸攝取多肽(協同轉運子)和穀氨酸棒桿菌gluA、B、C、D穀氨酸攝取基因。編碼參與競爭途徑的多肽的基因可以是tnaA基因(編碼色氨酸酶多肽)，除非吲哚用作產生色氨酸的底物。[0195]設計生物合成途徑中的另外考慮
[0196]取決於哪種多肽用於產生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜，能提供輔因子、底物和/或另外多肽給生產細胞以增強產物形成。此外，可設計遺傳修飾來提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜等產物的產量。類似地，使用宿主細胞可使莫納甜生產最優化。
[0197]如本文所述，任何生物如大腸桿菌和其它腸桿菌科(如克氏桿菌屬、泛菌屬和歐文氏菌屬菌株)、穀氨酸棒桿菌、短桿菌菌株、桿菌菌株和酵母菌株可用於產生產物如吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫納甜。例如，可對經改造從鄰氨基苯甲酸過量產生色氨酸(導致許多有疑問的副產物)的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌進行修飾，以有效生成產物。此外，產生穀氨酸的野生型黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)和穀氨酸棒桿菌菌株經修飾能有效產生其它胺基酸如賴氨酸。T.0ka，「胺基酸，生產工藝」(Amino Acids, Production Processes),刊於《生物工藝技術百科全書:發酵、生物催化和生物分離》(Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis, and Bioseparation), M.C.Flickinger 和 S.W.Drew 編，John Wiley 和Sons, Inc.New York,第89-100頁。此外,可選擇或設計本文所述生物體,使其(I)具有有利的生長動力學，使它們可以在低成本基質上生長，(2)分泌產物如莫納甜，和/或(3)使莫納甜的前體如色氨酸和丙酮酸的水平提高。可用易獲得的遺傳學工具從良好表徵的物種產生這種生物體，和/或這種生物體具有安全地用於產生食品成分的歷史。
[0198]1.去除過氧化氫
[0199]過氧化氫(H2O2)是一種產物，如果產生，可對生產細胞有毒、並可損害多肽或產生的產物(如中間體)。上述L-胺基酸氧化酶產生H2O2作為產物。因此，如果使用L-胺基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平減少以降低對細胞或產物的潛在損傷。
[0200]過氧化氫酶能用於降低細胞中的H2O2水平(圖11-13)。生產細胞可表達編碼過氧化氫酶(EC1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化過氧化氫分解成水和氧氣。例如，過氧化氫酶可從轉染入生產細胞的載體中表達。能使用的過氧化氫酶例子包括但不限於:tr I Q9EV50 (木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr | Q9KBE8 (耐鹽桿菌)、tr I Q9URJ7 (白色念珠菌)、tr | P77948 (天蘭色鏈黴菌)、tr | Q9RBJ5 (野油菜黃單胞菌)(SwissProt登錄號)。使用L-胺基酸氧化酶、D-胺基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反應器也能包含過氧化氫酶多肽。
[0201]2.吡哆醛Y -磷酸(PLP)有效性的調節
[0202]如圖1所示，PLP可用於本文所述I個或多個生物合成步驟。能補充PLP濃度，從而PLP不成為對反應總效率的限制。
[0203]已充分研究大腸桿菌中維生素B6 (PLP的前體)的生物合成途徑且已結晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，449:45-8，1999)。其它代謝途徑中需要2個基因(印d或gapB和serC),而3個基因(pdxA、pdxB和pdxj)是吡B多醒磷酸生物合成獨有的。大腸桿菌途徑中的起始物質之一是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。從共同的2和3碳中心代謝物合成此前體是由多肽1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前體是從4-碳糖，D-赤蘚糖4-磷酸形成的蘇氨酸衍生物。轉化到磷酸-4-羥基-L蘇氨酸(HTP)所需的基因是^cUpdxB和serC。形成PLP的最後一個反應是DXP與HTP間的複雜分子內縮合和閉環反應，由pdxA和pdxj的基因產物催化。
[0204]如果PLP成為發酵生產莫納甜期間的限制營養物，可增加I個或多個途徑中的基因在生產宿主細胞中的表達來提高莫納甜產量。宿主生物體可包含多拷貝的天然途徑基因，或非天然途徑基因的拷貝可摻入生物體的基因組中。另外，可在宿主生物體內克隆入多拷貝的拯救途徑基因中。
[0205]在所有生物體中保守的I個拯救途徑使各種維生素B6的衍生物再循環成活性PLP形式。參與此途徑的多肽是PdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。過量表達I個或多個這些基因可增加PLP有效性。
[0206]可通過去除或阻抑宿`主生物體中天然生物合成途徑基因的代謝調節提高維生素B6水平。PLP阻抑參與黃桿菌屬(Flavobacterium)菌株238-7中前體蘇氨酸衍生物的生物合成的多肽。此細菌菌株無代謝控制，過量產生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以類似方式遺傳操作產生莫納甜的宿主生物體可增加PLP生成而不過度表達生物合成途徑基因。
[0207]3.銨利用
[0208]通過製備更能利用的氨或去除水能驅動色氨酸酶反應趨向合成方向(從吲哚生成色氨酸)。還原性胺化反應如由穀氨酸氫化酶催化的反應，也能通過銨過量來驅動。
[0209]氨可作為碳酸或磷酸緩衝系統中的碳酸銨或磷酸銨鹽而得到。氨也能作為丙酮酸銨或甲酸銨提供。另外，如果反應偶聯產生氨的反應如穀氨酸脫氫酶或色氨酸脫氫酶，可提供氨。加入EC4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能產生氨，底物會水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通過酶水解其優選底物也能使增加的合成產物的產量超過正常平衡量。
[0210]4.除去產物和副產物
[0211 ] 色氨酸經色氨酸轉氨酶轉化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影響吲哚-3-丙酮酸的產率，因為反應生成穀氨醯胺並需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。穀氨醯胺可引起轉氨酶的抑制，反應會消耗大量共底物。此外，高穀氨酸濃度對下遊分離過程有害。
[0212]多肽穀氨酸脫氫酶(GLDH)將穀氨酸轉化成2_氧戊二酸，從而在反應中再循環共底物，反應由色氨酸轉氨酶催化。GLDH也產生還原性等效物(NADH或NADPH)，能用於在需氧條件下產生細胞所用能量(ATP)。通過GLDH利用穀氨酸也減少副產物形成。另外，反應產生氨，它能用作細胞的氮源或作為圖1所示最後步驟中還原性胺化的底物。因此，過度表達GLDH多肽的生產細胞能用於增加產量和降低培養基和/或分離方法的成本。
[0213]在色氨酸到莫納甜的途徑中，如果使用來自適當酶類的轉氨酶，步驟3的氨基供體(如穀氨酸或天冬氨酸)可反轉化成步驟I所需的氨基受體(如2-氧戊二酸或草醯乙酸)。使用此途徑的2種獨立的轉氨酶能提高此途徑的效率，其中I種轉氨酶的底物非競爭性抑制其它轉氨酶的活性。
[0214]所述途徑中的許多反應是可逆的，因此可達到底物和產物間的平衡。可通過從多肽中連續取出產物來增加途徑的產量。例如，用通透酶或其它轉運蛋白使莫納甜分泌入發酵液，或者從生物催化反應器流中選擇性結晶莫納甜並伴隨底物再循環會提高反應產量。
[0215]另一種增加反應產量的方法是通過另外的酶反應或通過氨基供體基團的取代來去除副產物。例如，可產生不能在反方向中反應的副產品，或通過相變(例如終產物的沉澱)或通過自發轉化成揮發性終產物如二氧化碳實現。
[0216]5.底物庫的調節
[0217]可通過增加色氨酸前體生成和/或改變包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代謝途徑調節吲哚庫。例如，可通過宿主細胞中編碼EC4.1.1.74的基因功能性缺失來減少或去除從吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通過功能性缺失宿主細胞中編碼EC4.1.99.1的基因減少或去除從色氨酸生成吲哚。另外，過量吲哚能用作體外或體內過程中的底物，結合增加量的編碼EC4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.,82:604-6，1996)。
[0218]此外，可進行遺傳修飾以增加中間體，如D-赤蘚糖4-磷酸和分支酸的水平。
[0219]6.控制手性
[0220]通過控制立體化學(手性)能改變莫納甜的品嘗描繪。例如，不同食物系統的濃度不同的混合物中需要不同的莫納甜異構體。手性可通過pH和多肽的組合控制。
【權利要求】
1.一種生產莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養基中培養微生物，其中所述微生物包含至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉氨酶多肽的核酸；和 (b)從所述培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌、穀氨酸棒桿菌和大腸桿菌。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物選自棒桿菌屬和短桿菌屬。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述微生物是穀氨酸棒桿菌。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述非離子去汙劑選自吐溫、TritonX-1OO和十二烷基乙酸銨。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述培養基所含生物素的濃度小於5μ g/L。
9.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述青黴素衍生物是氨苄青黴素。
10.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，在步驟(a)中，培養微生物前所述培養基的pH 約為 pH7 — pH8。`
11.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含糖蜜、玉米漿或其組合。
12.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述微生物是大腸桿菌，其中所述培養基包含Trp-1+葡萄糖培養基。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物的生長需要苯丙氨酸和酪氨酸，其中所述培養基包含苯丙氨酸和酪氨酸。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物含有aspC和proA基因。
15.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述穀氨酸棒桿菌是產生和分泌穀氨酸的穀氨酸棒桿菌菌株。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
17.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，由所述穀氨酸棒桿菌分泌莫納甜或其鹽。
18.—種生產莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養基中培養穀氨酸棒桿菌(ATCC13058);和 (b)從所述培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含吐溫、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
20.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含色氨酸、丙酮酸、非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述非離子去汙劑是吐溫。
22.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含丙酮酸、吐溫和青黴素衍生物。
23.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述轉氨酶多肽選自色氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
24.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
25.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在發酵罐中培養所述微生物。
26.一種包含至少一種編碼醛縮酶多肽的核酸和至少一種編碼轉氨酶多肽的核酸的微生物，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合，其中所述微生物產生莫納甜或其鹽。
27.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述醛縮酶多肽選自ProA醛縮酶(4-羥基-4-甲基-2-氧戊二酸醛縮酶，EC4.1.3.17)和KHG醛縮酶(4-羥基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，EC4.1.3.16)。
28.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述轉氨酶多肽選自色氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.1)、芳族轉氨酶多肽(EC2.6.1.5)和D-丙氨酸轉氨酶多肽(EC2.6.1.21)。
29.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物過量產生丙酮酸。
30.如權利要求29所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是硫胺營養缺陷型。
31.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是苯丙氨酸和酪氨酸營養缺陷型。
32.如權利要求29所述的微生物，其特徵在於，所述微生物選自光滑假絲酵母、皮狀絲孢酵母、脂解假絲酵母和釀酒酵母。
33.如權利要求29所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是硫辛酸營養缺陷型。
34.如權利要求33所述的微生物,其特徵在於,所述微生物包含aspC和proA基因。
35.如權利要求33所述的微生物，其特徵在於，所述微生物包含aspC和proA基因和至少一個色氨酸操縱子基因。
36.如權利要求33所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是大腸桿菌。
37.如權利要求29所述的微生物，其特徵在於，所述微生物包含缺陷的Fl— ATP酶基因。
38.如權利要求33所述的微生物，其特徵在於，所述微生物的內源性IipA基因中有破壞。
39.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物過量產生色氨酸。
40.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物包含一種或多種色氨酸生物合成基因的兩個或多個拷貝。
41.如權利要求39所述的微生物，其特徵在於，所述微生物包含被破壞的pheA基因。
42.如權利要求39所述的微生物，其特徵在於，所述微生物包含被破壞的內源性色氨酸酶(tna)基因。
43.如權利要求39所述的微生物，其特徵在於，所述微生物過度表達ppsA基因。
44.如權利要求39所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是大腸桿菌或穀氨酸棒桿菌。
45.如權利要求44所述的微生物，其特徵在於，相對於對應的對照微生物，所述微生物提高了 3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖7-磷酸(DAHP)合酶活性量。
46.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還包含編碼具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸，其中所述核酸選自外源性核酸、重組核酸及其組合。
47.如權利要求46所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還包含tkt基因。
48.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物還包含編碼具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。
49.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
50.如權利要求49所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是脂肪酸營養缺陷型。
51.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物是含有表達醛縮酶的核酸的細菌菌株，其中由所述核酸表達的醛縮酶能夠產生富含立體異構體的莫納甜混合物。
52.如權利要求51所述的微生物，其特徵在於，所述富含立體異構體的莫納甜混合物主要是S，S莫納甜或其鹽。
53.如權利要求51所述的微生物，其特徵在於，所述富含立體異構體的莫納甜混合物主要是R，R莫納甜或其鹽。
54.如權利要求26所述的微生物，其特徵在於，所述微生物過度表達編碼色氨酸攝取多肽的至少一種核酸。
55.一種生產莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在生產莫納甜或其鹽的條件下在培養基中培養產生莫納甜或其鹽的微生物，和 (b)從所述培養基或培養的微生物中獲得莫納甜或其鹽。
56.如權利要求55所述的方法，其特徵在於，所述微生物分泌莫納甜或其鹽。
57.如權利要求55所述的方法，其特徵在於，所述微生物是脂肪酸營養缺陷型。
58.一種鑑定能夠合成莫納甜或其鹽的細胞的方法，所述方法包括: (a)在選自以下的碳源/能源存在下培養細胞:莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽、莫納甜或其鹽的類似物、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽的類似物及其組合；和 (b)測試細胞生長，其中細胞生長說明該細胞將所述碳源/能源轉化為丙酮酸，從而說明該細胞能夠合成莫納甜或其鹽。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述細胞是丙酮酸營養缺陷型，在所述細胞中通過代謝碳源/能源產生丙酮酸。
60.如權利要求59所述的方法,其特徵在於,所述細胞包含被破壞的pykA和pykF基因。
61.一種鑑定能夠從色氨酸合成莫納甜或其鹽或者2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戍二酸或其鹽或者其組合的細胞的方法,所述方法包括: (a)在不存在色氨酸和存在莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合的條件下培養色氨酸營養缺陷型細胞；和 (b)測試色氨酸營養缺陷型細胞的生長，其中細胞生長說明該細胞從莫納甜或其鹽、2-羥基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合合成色氨酸，從而說明該細胞能夠從色氨酸合成莫納甜或其鹽或2-羥基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其鹽或其組合。
62.一種生產莫納甜或其鹽的方法，所述方法包括: (a)在培養基中培養微生物，所述微生物選自苜蓿中華根瘤菌、睪丸酮叢毛單胞菌、稻草假單胞菌和穀氨酸棒桿菌；和 (b)從培養基或培養的微生物中提取莫納甜或其鹽。
63.如權利要求62所述的方法,其特徵在於,所述微生物未經遺傳修飾。
64.如權利要求62所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含PHB培養基。
65.如權利要求62所述的方法，其特徵在於，所述培養基還包含色氨酸、丙酮酸、非離子去汙劑、青黴素、青黴素衍生物或其組合。
66.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述微生物是苜蓿中華根瘤菌或睪丸酮叢毛單胞菌。
67.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述微生物是睪丸酮叢毛單胞菌，所述培養基還包含色氨酸和丙酮酸。
68.如權利要求62所述的方法，其特徵在於，所述培養基包含TY培養基。
69.如權利要求68所述的方法，其特徵在於，所述培養基還包含色氨酸、丙酮酸或其組合。
【文檔編號】C12N9/10GK103555782SQ201310188490
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2004年10月21日 優先權日:2003年10月21日
【發明者】S·C·麥克法蘭, P·M·西克斯, M·J·齊德韋克, F·A·桑切斯－裡埃, D·C·卡梅隆, M·L·德蘇扎, J·羅薩扎, S·J·格特, T·W·阿布拉罕 申請人:嘉吉有限公司