提高治療的葡聚糖的製作方法

2023-05-02 18:30:01

專利名稱：提高治療的葡聚糖的製作方法
本申請是2003年7月16日提交的美國系列號No.10/621,027的部分繼續申請，其內容在此以其整體引入本申請中作為參考。
貫穿本申請，引用了各種參考文獻。這些出版物的公開內容在此以其整體引入本申請中作為參考，來更全面地描述本發明所屬的現有技術狀況。
背景技術：
該公開涉及將物質引入細胞的方法，該方法包括使含有口服給藥的β-葡聚糖的組合物接觸所述細胞。本發明的一方面提供了將物質引入患者的方法，包括將有效量的上述組合物給藥於患者。可以口服遞送的物質包括但不限於肽、蛋白質、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑和質粒。也可以使用其它小分子和化合物。本發明的另一方面是含有能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的β-葡聚糖的組合物。
源自酵母細胞壁的葡聚糖可以用於上述組合物中，酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或美國專利No.5,250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法來製備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法來製備適於口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。
在小鼠中測試β-葡聚糖用於腫瘤治療已有近40年了1，2。在日本臨床使用幾種形式的源自蘑菇的β-葡聚糖來治療癌症，包括PSK(來自雲芝(Coriolus versicolor))、香菇多糖和裂襉菌素。日本的隨機試驗中，PSK在一些癌症試驗中胃切除術3，4，結直腸手術5，6和食管切除7來除去原發性腫瘤後具有適度地，但顯著提高的存活率。在乳癌8，9和白血病10中的結果較少鼓舞人心。裂襉菌素對患有可行手術的胃癌11，不宜動手術的胃癌12，13和宮頸癌14的患者具有提高的存活率。此外，儘管組之間的存活差異是統計學上顯著性的，但是這些提高是適度的。雖然β-葡聚糖沒有得到西方腫瘤學家的廣泛使用，但含有β-葡聚糖的植物藥物如Reishi和maitake15是美國癌症患者廣泛使用的，來作為替換/輔助癌症治療。尋找β-葡聚糖治療作用的這些之前的研究，沒有將治療性單克隆抗體(MoAb)的共同給藥引入作為實驗方案的一部分。存在越來越多的證據抗體是沉積作為人腫瘤有效澱素的iC3b所必需的。當給藥β-葡聚糖而沒有共同給藥MoAb時，其腫瘤細胞毒性作用需要在患者中甚至在實驗小鼠中是非常可變的天然生成抗腫瘤抗體的存在。
之前描述了當結合癌症特異性抗體時的β-葡聚糖的抗腫瘤作用。之前的研究已經顯示了源自大麥或燕麥的口服β-葡聚糖在異種移植模型中可以極大地提高抗腫瘤單克隆抗體的抗腫瘤活性。參見Therapy-Enhancing Glucan，國際申請No.PCT/US02/01276，2002年1月15日申請。Cheung等，口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖與抗神經節苷脂GD2單克隆抗體3F8在成神經細胞瘤治療中的協同作用。ClinCancer Res.2002；81217-1223。Cheung NK等，口服給藥的β-葡聚糖提高單克隆抗體的抗腫瘤效果。Cancer Immunol Immunother.2002；51557-564。I期臨床試驗支持大麥β-葡聚糖可以提高抗體對轉移性癌症作用的預測。如前所述的，香菇多糖和昆布多糖，都為(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖，沒有和大麥葡聚糖一樣有效16。此外，在(1→3)，(1→4)-β-D葡聚糖中，小分子量製劑和地衣多糖也沒有效果。β-葡聚糖的分子大小和精細結構對針對腫瘤的抗體的協同作用具有實質性影響。
在歐洲和美國，尤其是來自麵包酵母的β-葡聚糖作為動物的飼料添加劑、作為人的膳食補充物17、在治療創傷中18和作為皮膚霜劑中的活性成分已經使用很長時間了。β-葡聚糖中的基本結構單位是β(1→3)連接的葡糖基單位。根據來源和分離的方法，β-葡聚糖具有各種程度的支化和側鏈中的連接。側鏈的出現率和鉸鏈結構決定了其免疫調節的效果。真菌和酵母來源的β-葡聚糖通常不溶於水中，但是可以通過酸水解或通過將帶電荷的基團如-磷酸鹽、-硫酸鹽、-胺、-羧甲基等等引入分子中的衍生作用來製得可溶性的β-葡聚糖19，20。
從麵包酵母、釀酒酵母中分離出具有以下分子結構的可溶性葡聚糖 其中(1→3)-β-D-葡聚糖單位形成主鏈，帶有由位於(1→6)-β-D-葡聚糖鉸鏈的(1→3)-β-D-葡聚糖單位構成的支鏈。獲得高分子量部分並在腫瘤模型中測試與單克隆抗體的協同作用。如下詳述的當結合人癌症特異性單克隆抗體時，發現可溶性酵母β-葡聚糖的抗腫瘤效果與可溶性大麥β-葡聚糖的抗腫瘤效果類似。

發明內容
本發明提供了將物質引入細胞的方法，該方法包括使含有口服給藥的β-葡聚糖的組合物接觸所述的細胞。
本發明的另一方面是將物質引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥於患者。可以口服遞送的物質包括但不限於肽、蛋白質、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑和質粒。還可以使用其它小分子和化合物。
本發明的再一個方面是含有能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的β-葡聚糖的組合物。


圖1.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療患者轉移性成神經細胞瘤。
在患有多次量化療難醫治的轉移性成神經細胞瘤的患者治療之前和之後進行MIBG掃描。患者接受靜脈內抗GD2抗體3F8(10mg/m2/天)，總共10天，在相同的時間段內加口服大麥β-葡聚糖。圖1A顯示了患者的基線MIBG掃描。在股骨、腓骨、骨盆、肋骨、左肩胛骨、右鎖骨、肱骨、顱骨和脊柱中可以看到大範圍的骨轉移。心臟、肝臟、胃和結腸吸收是生理性的。圖1B顯示了用3F8加葡聚糖單循環治療後的同一患者2個月後的MIBG掃描。轉移的面積得到顯著改善。
圖2.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療SCID小鼠中異種移植的皮下人淋巴瘤。
具有建立的皮下Daudi(n＝9)(圖2A)、Hs445(n＝5)(圖2B)、EBV-衍生的LCL(n＝9)(圖2C)和RPMI 6666(n＝10；數據未顯示)異種移植物的SCID小鼠，用200μg靜脈內美羅華每周兩次，共8劑(■)，每日通過胃內管飼口服給藥400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(△)或美羅華和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的組合(×)治療，或留下未治療(◆)。在y軸上標出腫瘤生長的百分比，治療後的天數開始於x軸上。誤差直方圖表示SEM並僅顯示了美羅華單獨和組合組。對於所有的異種移植物，只有組合治療與腫瘤生長的降低相關。與美羅華單獨相比較，除了美羅華以外接受β-葡聚糖的組中每天腫瘤生長降低，對Daudi是2.0％(95％CI 1.3-2.7％；p＜0.0005)，對EBV-衍生的LCL為0.8％(95％CI 0.4-1.2％；p＜＝0.01)，對Hs445為2.2％(95％C.I.1.2-3.2％；p＝0.0009)，對RPMI 6666為1.8％(95％CI 1.0-2.7％；p＜0.0002；數據未顯示)。
圖3.大麥(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖加抗體來治療SCID小鼠中異種移植的彌散性人淋巴瘤。
將100μl生理鹽水中的5×106個Daudi(圖3A)或Hs445(圖3B)細胞靜脈內注射(IV)進SCID小鼠中。腫瘤植入後10天開始，用200μg靜脈內美羅華每周兩次，共8劑(---)，每天通過胃內管飼口服給藥400μg(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖29天(…)或美羅華和(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖的組合(—)來治療小鼠，或留下未治療 腫瘤全身生長，當腫瘤細胞浸潤脊椎管時小鼠變得癱瘓，導致後腿癱瘓。在癱瘓發作時或當動物體重減輕10％時將小鼠處死。各組的Kaplan-Mailer存活曲線顯示於圖2A(Daudi)和2B(Hs445)中。與所有其它治療組(對於Daudi p＜0.0005，對於Hs445 p＝0.001)相比較時或與美羅華單獨相比較時(對於Daudi p＜0.0005，對於Hs445p＝0.01)，用(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖和美羅華組合治療的小鼠具有顯著提高的存活。沒有治療、美羅華單獨、BG和美羅華+BG組小鼠的中值存活天數對於Daudi異種移植物各自為27、71、43和124天，而對於Hs445異種移植物各自為12、16、31和243天。
圖4.在大麥β-葡聚糖存在下3G6(抗GD2 IgM抗體)在治療人成神經細胞瘤中的劑量反應。
將兩百萬LAN1成神經細胞瘤細胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5隻小鼠，在腫瘤植入2周後可見腫瘤達到0.7-0.8cm直徑時開始治療。3G6組(實心方塊)通過後眼眶叢用200μg靜脈內注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)。3G6+BG組用每周兩次200μgi.v.3G6加每日管飼400μg口服β-葡聚糖(BG)共治療14-18天。以3個不同的劑量給藥3G6(空心三角每劑8μg，空心方塊40μg，空心圓200μg)。BG組(實心圓)僅接受400μg口服β-葡聚糖。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標準誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然BG單獨和3G6單獨顯示出沒有抗腫瘤效果，但BG+200μg 3G6組顯示出高度顯著的3G6劑量依賴性的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖5.在酵母(1→3)，(1→6)-β-D-葡聚糖存在下使用3G6(抗GD2IgM抗體)治療人成神經細胞瘤。
將兩百萬LAN1成神經細胞瘤細胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5隻小鼠，腫瘤植入2周後可見腫瘤達到0.7-0.8cm直徑時開始治療。3G6組(實心方塊)通過後眼眶叢用200μg靜脈內注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)。微粒酵母葡聚糖組(實心三角)單獨接受400μg口服微粒酵母葡聚糖。3G6+整個酵母顆粒(空心菱形)用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg酵母顆粒共治療14-18天。3G6+可溶酵母葡聚糖組用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg可溶酵母葡聚糖共治療14-18天。3G6+顆粒酵母葡聚糖組用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg顆粒酵母葡聚糖共治療14-18天。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標準誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然葡聚糖單獨和3G6單獨顯示出沒有抗腫瘤效果，但可溶性和顆粒酵母葡聚糖與3G6結合時的組顯示出高度顯著的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖6.在大麥和酵母β-葡聚糖存在下使用3F8(抗GD2 IgG抗體)來治療人成神經細胞瘤。
將兩百萬LAN1成神經細胞瘤細胞皮下異種移植入無胸腺的Balb/c小鼠中。每組5隻小鼠，腫瘤植入2周後可見腫瘤達到0.7-0.8cm直徑時開始治療。3F8組(實心方塊)通過後眼眶叢用200μg靜脈內注射的3G6來治療，每周兩次(M和Th)，共5劑。大麥葡聚糖組(實心方塊)接受單獨的400μg大麥葡聚糖。3F8+大麥葡聚糖組(空心菱形)用每周兩次200μg i.v.3F8加每日管飼400μg大麥葡聚糖共治療14-18天。3F8+可溶酵母葡聚糖組(空心方塊)用每周兩次200μg i.v.3G6加每日管飼400μg可溶酵母葡聚糖共治療14-18天。從治療的第一天測量腫瘤大小，最大直徑的乘積表示為治療0天的大小百分比。直條表示標準誤差，為了清楚只描繪了4組。雖然葡聚糖單獨和3F8單獨顯示出沒有抗腫瘤效果，但可溶性和顆粒酵母葡聚糖與3G6結合時的組顯示出高度顯著的腫瘤縮減和抑制(p＜0.05)。
圖7.使用Rituxan和大麥或酵母β-葡聚糖來治療SCID小鼠中的彌散性人淋巴瘤。
將100μl生理鹽水中的5×106個Daudi細胞靜脈注射(IV)入SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當腫瘤細胞浸潤脊椎管時小鼠變得癱瘓，導致後腿癱瘓。在癱瘓發作時或當動物體重減輕10％時將小鼠處死。注射腫瘤細胞10天後開始治療。每周兩次靜脈注射40μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次，每日通過胃內管飼口服給藥400μg葡聚糖29天。每周稱重小鼠並至少每日一次臨床觀察。接受rituxan加大麥葡聚糖或rituxan加酵母可溶性葡聚糖的小鼠具有高度顯著延長的存活(p＜0.05)。
圖8說明了從BD Biosciences(Palo Alto，CA)購買的pEGP-C1載體。
圖9顯示了葡聚糖有助於基因轉移進單核細胞中。
圖10說明了較高分子量的β-葡聚糖和基因轉移。
圖11說明了循環單核細胞中GFP mRNA的存在。
發明詳述本發明提供了用於口服攝取物質的組合物，該組合物包括合適量的糖類。在一個實施方案中，所述糖類是葡聚糖。
當口服給藥時，葡聚糖通過巨噬細胞和單核細胞吸收，這些細胞攜帶這些糖類至骨髓和網狀內皮組織系統，從那以適當加工的形式釋放至包括嗜中性白細胞的骨髓細胞上和包括自然殺傷(NK)細胞的淋巴樣細胞上。該加工過的葡聚糖結合這些嗜中性白細胞和NK細胞上的CR3，在腫瘤特異性抗體存在下激活它們在腫瘤中的細胞毒性。
由於巨噬細胞和單核細胞從消化道攝取葡聚糖(不管是可溶的、凝膠還是顆粒)，因此葡聚糖是用於基因治療的潛在通道。與蛋白質不一樣，DNA和質粒是相對熱穩定的，且可以容易地摻入溫熱的可溶性大麥葡聚糖中，並當冷卻至室溫或體溫時形成凝膠。當給小鼠餵食這些DNA-葡聚糖複合物時，數天內在外周血單核細胞和巨噬細胞中可以檢測到報導基因。更重要的是在攝取這些DNA複合物數天後，這些報導基因在這些細胞中報導表達。這些發現具有潛在的生物學含義。葡聚糖和相似的糖類可以是DNA或質粒進入人體的通道。口服葡聚糖可以是用於改正巨噬細胞/單核細胞的遺傳缺陷或給藥遺傳疫苗的便捷載體。
同樣本領域技術人員可以容易地認識到，可以鑑定能夠和葡聚糖一樣起作用的其它糖類並以相似的方式來使用。使用葡聚糖作為陽性對照可以建立一種容易地篩選這樣的糖類的方法。
葡聚糖包括但不限於β(1-3)和β(1-4)混合鍵的葡聚糖，且葡聚糖具有高分子量。葡聚糖還可以具有β(1-3)和β(1-6)鍵。
本發明還提供了用於將物質引入細胞的方法，該方法包括使上述組合物接觸所述細胞。本領域技術人員可以使用報導基因或其它標記來測定所述引入的效率。報導基因或標記是分子生物學領域公知的。此外，本發明提供了用於將物質引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥於患者。
本發明提供了用於口服遞送一種和多種物質的組合物，該組合物包括有效量的口服給藥的β-葡聚糖和一種或多種化療劑。
在一個實施方案中，所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合鍵，或1，3-1，6和1，3-1，4混合鍵的混合物。在另一實施方案中，葡聚糖提高了化療劑或抗癌抗體的功效。
在進一步的實施方案中，所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麥、真菌、小麥或海藻。葡聚糖可以具有高分子量。葡聚糖的分子量可以至少為10,000道爾頓。
在進一步的實施方案中，所述物質是肽、蛋白質、RNA、DNA、質粒或化療劑。如在此所用的，化療劑包括抗擊動物體內疾病的化學藥品或用於治療各種形式癌症的藥物。
本發明提供將物質引入細胞的方法，該方法包括使上述組合物接觸所述細胞。
可以口服遞送的物質包括但不限於肽、蛋白質、RNA、DNA和質粒。也可以使用其它小分子和化合物。
本發明提供治療患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥於患者。在一個實施方案中，該方法進一步包括所述物質。
本發明提供了治療患有遺傳疾病患者的方法，該方法包括將治療有效量的上述組合物和能夠矯正所述遺傳疾病的物質給藥於患者。所述物質包括但不限於肽、蛋白質、RNA、DNA、質粒以及其它小分子和化合物。
本發明提供了含有有效量的能夠提高I gM抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發明提供了含有有效量的能夠提高抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。源自酵母細胞壁的葡聚糖可以用於上述組合物中，酵母如釀酒酵母或美國專利No.5,250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.5,233,491和4,810,646中描述的方法來製備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.4,810,646和5,519,009中描述的方法來製備適於口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。
在一個實施方案中，所述抗體是單克隆抗體，或針對癌症或腫瘤細胞的抗體，其包括但不限於抗CEA抗體、抗CD20抗體、抗CD25抗體、抗CD22抗體、抗HER2抗體、抗結合腕蛋白抗體、MoAb M195、Dacluzimab、抗TAG72抗體、R24、赫賽汀、美羅華、528、IgG、IgM、IgA、C225、依帕珠單抗和MoAb 3F8。在另一個實施方案中，所述抗體是腫瘤結合抗體。
此外，所述抗體能夠激活補體和/或激活抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。在另一個實施方案中，所述抗體調節T-細胞或B-細胞的功能。
在進一步的實施方案中，所述抗體瞄準表皮生長因子受體、神經節苷脂如GD3和GD2。
在進一步的實施方案中，所述抗體是有效對抗癌症的，癌症包括成神經細胞瘤、黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、愛潑斯坦-巴爾相關的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、成視網膜細胞瘤、小細胞肺癌、腦瘤、白血病、表皮樣癌、前列腺癌、腎細胞癌、移行細胞癌、乳癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、肝癌、胃癌或其它胃腸道癌。
在進一步的實施方案中，上述組合物是在藥物學上可接受載體中的。
本發明提供了治療患者的方法，該方法包括將上述組合物給藥於患者。
本發明提供了含有有效量的能夠提高疫苗功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。在一個實施方案中，所述疫苗是對抗癌症或傳染物的，如細菌、病毒、真菌或寄生蟲。
本發明提供了含有有效量的能夠提高天然抗體或傳染物功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發明提供了含有有效量的能夠提高宿主免疫力的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。
本發明提供了含有有效量的能夠提高藥劑預防組織排異作用的口服給藥的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖的組合物。在一個實施方案中，所述組織是移植的組織或移植的器官或如患有移植物抗宿主疾病的宿主。
在一個實施方案中，上述組合物的葡聚糖具有高分子量。葡聚糖的分子量至少為10,000道爾頓。在另一個實施方案中，所述葡聚糖源自大麥、燕麥、蘑菇、海藻、真菌、酵母、小麥或苔蘚。在進一步的實施方案中，所述葡聚糖是對熱處理穩定的。
在進一步的實施方案中，上述組合物在煮沸3小時後是穩定的。上述組合物的有效劑量是約＞＝25mg/kg/天，一周五天，共2-4周。
具體實施例方式
通過參考以下實驗詳述將更好地理解本發明，但是本領域技術人員將易於認識到詳述的具體實驗僅僅是說明性的，並不意味著限制在此所述的本發明，本發明是通過此後的權利要求來限定的。
實施例I大麥β-葡聚糖與抗GD2抗體聯用在4期成神經細胞瘤中的I期研究。
總共研究了24名患者。這些患者全部是兒童或青少年，患有轉移至骨、骨髓或遠端淋巴結的復發或難愈的4期成神經細胞瘤，一些帶有大的軟組織塊。β-葡聚糖具有很好的耐受性，無劑量限制毒性。記錄骨髓疾病(組織學、MIBG掃描)、軟組織腫瘤(CT)以及生化標記(尿VMA和HVA腫瘤標記)的抗腫瘤反應。腫瘤反應的一個實例顯示於圖1A和圖1B中131I-間碘苯甲基胍(MIBG)掃描顯示了3F8加β-葡聚糖的一個治療循環後，大範圍轉移接近完全的消退。這些反應在用3F8單獨或3F8結合細胞因子治療的患有難愈或復發轉移性4期NB的患者中是罕見的。迄今為止對3F8最好的反應率是II期試驗中3F8加GMCSF結合中33名兒童中的7名(21％)獲得了MIBG改善。相反，62％(21名中13名)可評價的患者對3F8+β-葡聚糖具有MIBG改善，接近3倍的反應率(通過χ2p＝0.008)。此外，患有骨髓疾病的15名患者中，5名獲得了完全的骨髓緩解(30％)，和8名骨髓疾病穩定。(參見圖1)。
實施例II美羅華激活了補體介導的和抗體依賴細胞介導的細胞毒性，且有效對抗B-細胞淋巴瘤。β-葡聚糖是結合CR3凝集素結構域的天然生成葡萄糖聚合物，CR3是在淋巴細胞中廣泛表達的受體，激發其來結合被抗體激活的iC3b。大麥衍生的(1→3)，(1→4)-β-D-葡聚糖(BG)，當口服給藥時(400μg每天×29天)，和低於治療劑量的靜脈內美羅華(200μg兩次/周×8劑)在治療CD20-陽性人淋巴瘤中具有強烈的協同作用。當與用美羅華或BG單獨治療的小鼠相比較時，異種移植入SCID小鼠中建立的皮下非霍金奇淋巴瘤(NHL)(Daudi和EBV-衍生的B-NHL)或霍金奇疾病(Hs445或RPMI6666)的生長得到了顯著抑制。患有彌散性淋巴瘤(Daudi和Hs445)小鼠的存活顯著提高。治療動物中沒有體重減輕或臨床毒性。該BG加美羅華的治療效果和無毒性支持進一步研究其臨床用途。
介紹在數量日益增加的疾病中有待評價嵌合抗CD20抗體美羅華。最初證明了對抗復發和難愈的濾泡/輕度非霍金奇淋巴瘤的臨床效果後1，已經報導了其它惡性和非惡性B-細胞疾病中對美羅華的反應2。已經提出了幾種作用機理，包括凋亡(apoptotic)途徑的激活3，細胞因子的詳細闡明4，宿主補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)的激發5。儘管許多患有B-細胞疾病的患者對美羅華作出反應，但緩解通常是暫時的6。美羅華治療後高於50％的淋巴瘤復發未能第二次作出反應7。對美羅華抗藥性的機理還不清楚，可能包括靶抗原的缺少或丟失8、各個患者之間藥物動力學的改變、FcR多態性9、對補體活性的抗藥性10，或淋巴瘤的內在基因表達11。
β-葡聚糖是葡萄糖的複合聚合物，帶有對白細胞上CR3受體的凝集素位點的親和性12。帶有結合的β-葡聚糖，通過補體激活抗體激發CR3(CD11b)結合沉積於細胞上的iC3b片段。該受體介導白細胞通過內皮的血細胞滲出並刺激吞噬作用、去粒和腫瘤細胞毒性。許多真菌在其細胞表面上呈現β-葡聚糖或β-葡聚糖樣CR3結合配體。因此，當發生iC3b沉積時，CD11b和凝集素位點都變成結合的，並激發了吞噬作用和呼吸爆發13。相反，腫瘤細胞缺少這樣的分子，甚至當被覆iC3b時，通常也不激活CR3且不能激活白細胞。可溶形式的β-葡聚糖結合凝集素位點並激發吞噬細胞和NK細胞兩者來殺滅iC3b被覆的腫瘤靶14。
(1→3)，(1→4)-D-β-葡聚糖(BG)，一種可溶的、源自大麥的β-葡聚糖比之前研究的(1→3)，(1→6)-β-葡聚糖有利，尤其是當口服給藥時的效果和良好的安全特徵15。BG和補體固定抗體3F8對抗人成神經細胞瘤異種移植物的體內協同作用15，16是最近證明的。BG和美羅華對抗淋巴瘤的協同作用是現在報導的。
研究設計細胞系從美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)購買人伯基特淋巴瘤細胞系，Daudi，以及霍金奇疾病(HD)細胞系Hs445和RPMI 6666。使用之前所述的方法建立人HBV-BLCL17。
小鼠在制度允許的準則和試驗方案下飼養Fox Chase ICR SCID小鼠(Taconic，White Plains，NY)。
腫瘤模型通過將懸浮於0.1ml Matrigel(Becton-Dickinson，FranklinLakes，NJ)中的5×106個細胞注射入小鼠的橫腹部中來建立皮下腫瘤。一周測量腫瘤尺寸兩到三次，並以兩個最大直徑的乘積來計算腫瘤大小。當最大腫瘤尺寸超過20mm時將小鼠處死。如之前所述的在SCID小鼠中建立彌散性腫瘤模型18。簡言之，將100μl生理鹽水中的5×106個Daudi或Hs445細胞靜脈內注射入SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當腫瘤細胞浸潤脊髓時小鼠變得癱瘓，導致後腿癱瘓。癱瘓發作時或當動物體重減輕10％時將小鼠處死。
治療方案對於具有皮下腫瘤的小鼠，腫瘤建立(7-8mm直徑)後開始治療。對於彌散性腫瘤模型，注射腫瘤細胞十天後開始治療。每個治療方案至少5隻小鼠一組，接受美羅華或BG，或兩者都不接受或兩者都接受。每周兩次靜脈內注射200μg美羅華(Genetech，San Francisco，CA)，共注射八次，每天通過胃內管飼口服給藥400μg BG(Sigma，St.Louis，MO)29天。動物每周稱重，且每天至少臨床觀察一次。
統計學分析
使每隻單獨小鼠的回歸斜率適於腫瘤大小的對數轉化值來計算腫瘤生長。使用之前所述的用於檢查觀察的方法使用t-測試來比較組之間的斜率19。使用Kaplan-Meier分析來比較患有彌散性疾病小鼠中的存活和通過Fisher’s精確的χ2測試來比較死亡的比例。使用STATA7來進行分析。
結果和討論所有皮下異種移植模型中，注意到美羅華和BG聯合治療的小鼠中腫瘤生長的顯著降低。用美羅華單獨治療的小鼠中顯示出腫瘤生長的普通降低，而用BG單獨治療的或留下未治療的小鼠具有未減輕的腫瘤生長(圖1A、1B、1C)。除了用聯合治療治療的小鼠之外，所有腫瘤生長都超過20mm大小，小鼠不得不被處死。甚至在停止治療後，聯合治療的小鼠具有持久穩固的腫瘤抑制。腫瘤生長率的多變量線性模型中，使用治療的啞變量，BG和美羅華之間的相互作用是正向的和顯著的，證明是協同作用。
對於彌散性異種移植，NHL和HD模型兩者的組合和對照組之間的存活存在顯著差異(p＜0.005，按照對數-等級)(圖2)。用結合BG和美羅華治療患有彌散性Daudi和Hs445腫瘤的小鼠各自有5/38和2/8小鼠在停止治療後存活＞12個月，表明了疾病的完全根除。相反，各自組中接受單獨美羅華的有0/29和0/8小鼠存活(15％對0％存活；χ2＝0.01)。沒有顯著體重減輕或其它明顯的臨床副作用。可以從下列事實推斷出BG被吸收通過免疫螢光可以在固定和滲透的外周血白細胞中細胞內檢測到BG(數據未顯示)。
這些研究中，BG和美羅華之間的協同作用是非常顯著的，與CD-20陽性淋巴瘤的類型無關。Daudi異種移植中與Hs445相比較提高的反應可以歸因於前者中較高的CD20表達(對於Daudi 241和對於Hs445184相比較的平均幾何螢光通道)。當通過單細胞懸浮液的免疫螢光研究或冰凍切片的間接免疫組織化學來檢查發展腫瘤的CD20表達時，沒有注意到用美羅華、BG單獨或美羅華+BG治療的組之間的顯著差異(數據未顯示)，表明了美羅華+BG的治療與CD20的丟失無關。
其它補體激活單克隆抗體和BG之間的協同作用15，16是之前證明的。現有的數據將該觀察擴展到美羅華。認為CDC對於美羅華細胞毒性是重要的機理。侵蝕性補體通過人補體調節蛋白質(mCRP)沒有得到有效抑制。因此，CDC在異種移植模型中是有效的抗腫瘤機理。然而在研究中，低於治療劑量的抗體，美羅華介導的ADCC和CDC對實現腫瘤細胞殺滅是不夠的。由於BG對ADCC沒有直接作用20，該協同作用是iC3b介導的腫瘤細胞毒性的最可能結果。淋巴瘤細胞表達mCRP包括CD46、CD55和CD5910，21。然而，iC3b介導的細胞毒性沒有受到CD59存在的影響，其僅影響了MAC介導的補體細胞毒性22。因此，人乳癌腫瘤中，儘管存在mCRP，已經證明了iC3b的沉積23，表明了與其對MAC的抑制作用不同，對iC3b介導的腫瘤細胞毒性的作用不是絕對的。
如果該協同作用在人中可以安全地再現，iC3b介導的細胞毒性可以是克服患有B-細胞惡性腫瘤患者中美羅華抗藥性的潛在策略。由於T或B細胞都不是這種協同作用所需要的，因此甚至在免疫缺失的淋巴瘤患者中BG也可能具有潛在的作用。此外，患有自體免疫疾病的患者中，可以用該非毒性口服治療來提高B-細胞耗竭。相反地，β-葡聚糖可以提高細胞因子如TNF-α和IL-6的釋放24，且因為美羅華的急性細胞毒性還與繼發於補體激活的細胞因子釋放相關25，所以當BG和美羅華聯合使用時，存在增加毒性的可能性。謹慎地設計I期研究是必要的，為了確定在B-細胞疾病治療中和其它癌症基於抗體的治療中開發BG作為美羅華治療輔劑的安全性和有效性。
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實施例III的參考文獻1.David K，Ollert MW，Juhl H，等通過健康人的天然IgM來阻止無胸腺大鼠中異種移植的實體人成神經細胞瘤的生長(Growtharrest of solid human neuroblastoma xenografts in nude rats bynatural IgM from healthy humans).Nat Med 2686-9，19962.Ollert MW，David K，Schmitt C，等正常人血清含有對人成神經細胞瘤細胞為細胞毒性的天然IgM抗體(Normal human serumcontains a natural IgM antibody cytotoxic for humanneuroblastoma cells).Proc Natl Acad Sci USA 934498-503，19963.Ollert MW，David K，Vollmert C，等人天然IgM體內抗成神經細胞瘤活性的機理(Mechanisms of in vivoanti-neuroblatoma activity of human natural IgM).Eur J Cancer331942-8，19974.Engler S，Thiel C，Forster K，等一種反應人成神經細胞瘤臨床表現的新的轉移性動物模型通過天然的、細胞毒性的人免疫球蛋白M抗體來阻止常位腫瘤的生長(A novel metastatic animalmodel reflecting the clinical appearance of human neuroblastomagrowth arrest of orthotopic tumors by natural，cytotoxic humanimmunoglobulin M antibodies).Cancer Res 612968-73，20015.Erttmann R，Schmitt C，Ollert MW，等健康人和NB患者中對抗成神經細胞瘤(NB)細胞的天然生成體液細胞毒性(Naturallyoccurring humoral cytotoxicity against neuroblastoma(NB)cells in healthy persons and NB patients).Pediatr Hematol Oncol13545-8，19966.Cheung N，Modak S成神經細胞瘤治療中口服(1-3)，(1-4)-β-葡聚糖與抗神經節苷脂GD2單克隆抗體3F8的協同作用(Oral(1-3)，(1-4)-beta-glucan syngergizes with anti-ganglioside GD2monoclonal antibody 3F8 in the therapy of neuroblastoma).ClinCancer Res 81217-1223，2002實施例IV源自麵包酵母(源自釀酒酵母)的(1→3)，(1→6)β-葡聚糖對提高癌症的抗體治療也是有效的皮下植入100μl Matrigel(Sigma)中的(2×106細胞)LAN-1腫瘤細胞。用遊標卡尺每周測量腫瘤尺寸兩到三次，以兩個最大的垂直直徑的乘積來計算腫瘤大小。每組4-5隻小鼠，當腫瘤直徑達到0.7-0.8cm時所有治療研究開始。小鼠接受抗體(3F8或3G6)治療(200μg每天)i.v.(通過尾靜脈注射)每周兩次×5劑，和每天胃內注射口服β-葡聚糖(400μg每天)共14-18天。(參見圖5和6)源自酵母細胞壁的葡聚糖可以用於上述組合物中，酵母如釀酒酵母或美國專利No.5.250,436中所述的突變酵母菌株，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.5,233,491和4,810,646中所述的方法來製備具有β(1-3)和β(1-6)鍵的葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。可以通過美國專利No.4,810,646和5,519,009中所述的方法來製備適於口服給藥的可溶性或含水葡聚糖，其所公開的內容在此以其整體引入作為參考。也可以使用β-葡聚糖如可溶性β-1，3/1，6葡聚糖或Biotec Pharmacon(Norway)製得的SBG。
在相似的實驗中研究了皮下淋巴瘤模型。在此將懸浮於0.1mlMatrigel(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中的5×106個細胞植入小鼠橫腹部中。一周測量腫瘤尺寸兩到三次，以兩個最大直徑的乘積來計算腫瘤大小。當最大的腫瘤尺寸超過20mm時小鼠死亡。每周靜脈內注射200μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)兩次，共注射八次，每天通過胃內管飼口服400μg葡聚糖29天。每周將小鼠稱重並每天至少臨床觀察一次。大麥葡聚糖和酵母葡聚糖的腫瘤響應率和獲得完全緩解的小鼠百分比是可比較的。這些系列的皮下腫瘤模型顯示了大分子量(＞10,000道爾頓)可溶性酵母(1→3)，(1→6)β-葡聚糖具有和大麥(1→3)，(1→4)β-葡聚糖同樣有效。此外，酵母葡聚糖的來源和物理形式可以形成顯著差異。
還研究了轉移性淋巴瘤模型。如之前所述的在SCID小鼠中建立彌散性腫瘤的模型。(1)簡言之，將100μl生理鹽水中的5×106個細胞靜脈內(i.v.)注射進SCID小鼠中。腫瘤全身生長，當腫瘤細胞浸潤脊髓時小鼠變得癱瘓，導致後腿癱瘓。在癱瘓發作時或當動物體重減輕10％時，將小鼠處死。腫瘤細胞注射後十天開始治療。每周兩次靜脈內注射40μg美羅華(Genentech，San Francisco，CA)，共注射八次。每日通過胃內管飼口服400μg葡聚糖29天。將小鼠每周稱重並至少每天臨床觀察一次。(參見圖7)此外，和美羅華聯合使用時，大麥葡聚糖和酵母葡聚糖兩者顯示出類似的作用。當單獨使用時，大麥葡聚糖和酵母葡聚糖對存活都沒有任何作用(數據未顯示)。
實施例IV的參考文獻1.Wei BR，Ghrtie MA，Vitetta ES聯合使用免疫毒素和放射性免疫綴合物來治療免疫缺陷小鼠中的彌散性人B-細胞淋巴瘤(Thecombined use of an immunotoxin and a radioimmunoconjugate totreat disseminated human B-cell lymphoma in immunodeficientmice).Clin Cancer Res 6631-642，2000實施例V口服給藥的β-葡聚糖與抗腫瘤單克隆抗體一同起作用來介導腫瘤退化的機理。(1)使用野生型(WT)C57B1/6小鼠對CR3-缺乏(CD11b-/-)或C3-缺乏(C3-/-)C57B1/6小鼠的同系腫瘤(GD2+RMA-S)，MoAb單獨沒有引起腫瘤退化，而結合i.v.抗GD2MoAb和口服大麥或酵母β-葡聚糖在WT中引起顯著退化，但在CR3-缺乏小鼠中沒有。此外，用i.v.MoAb和口服β-葡聚糖的聯合治療在WT小鼠中產生了60-100％的無腫瘤生存者，但是在CR3-缺乏小鼠中僅有0-20％存活。這些實驗證明了對於抗腫瘤效果對白細胞CR3接近絕對的需要，尤其當口服大麥β-葡聚糖和抗腫瘤MoAb一起給藥時。比較WT對C3-缺乏小鼠的實驗方案相似地顯示出口服β-葡聚糖需要血清C3。當用螢光素(BG-F和YG-F)標記大麥β-葡聚糖和酵母β-葡聚糖並通過胃內注射給藥於小鼠時，跟隨β-葡聚糖的運行。在BG-F或YG-F每日口服給藥的三天內，脾和淋巴結內的巨噬細胞含有螢光素標記的β-葡聚糖。4天後，還在骨髓的巨噬細胞中觀察到YG-F和BG-F。當比較WT對CR3缺乏小鼠攝取的YG-F和BG-F時，含有攝入的β-葡聚糖-F的巨噬細胞的百分比或每個細胞中β-葡聚糖-F的量沒有明顯差異。因此，通過胃腸道巨噬細胞攝取大麥和酵母β-葡聚糖不需要CR3，而可能是由Dectin-1介導的。(2)體外和骨髓中的巨噬細胞能夠將大分子的大麥或酵母β-葡聚糖降解成β-葡聚糖的較小生物活性片段，然後得到釋放。
為了測定巨噬細胞釋放的可溶性β-葡聚糖-F是否確實已經被骨髓粒細胞吸收，對已經給予了YG-F或BG-F10天的WT或CR3-缺乏小鼠組i.p.注射巰基乙酸鹽介質來得出骨髓粒細胞進入腹膜腔的有邊集合。只有WT粒細胞能夠獲得從巨噬細胞中釋放的YG-F和BG-F。這些數據表明胃腸道巨噬細胞連續攝取β-葡聚糖，並將β-葡聚糖短程運輸至骨髓，其中釋放可溶性降解片段並通過膜CR3被粒細胞吸收。當從已經給予了口服β-葡聚糖的WT和CR3-缺乏小鼠中分離出腹膜粒細胞時，在體外只有WT粒細胞能夠殺滅iC3b被覆的腫瘤細胞。這些實驗顯示了骨髓粒細胞和組織巨噬細胞從胃腸道巨噬細胞獲得膜CR3-結合的可溶性β-葡聚糖，且該結合的β-葡聚糖激發了粒細胞和巨噬細胞兩者的CR3，以致當它們補充至炎症部位時，它們能夠殺滅iC3b被覆的腫瘤細胞。
實施例V的參考文獻1.Hong F，Yan J，Baran JT，等口服給藥的β(1，3)-葡聚糖和抗腫瘤單克隆抗體一起作用來介導腫瘤退化和無腫瘤存活的機理(Mechanism by which orally administered beta(1，3)-glucansfunction with anti-tumor monoclonal antibodies to mediate tumorregression and tumor-free survival).J Exp Med，20042.Herre J，Gordon S，Brown GDDectin-1及其在通過巨噬細胞識別β-葡聚糖中的作用(Dectin-1 and its role in therecognition of beta-glucans by macrophages).Mol Immunol40869-76，2004實施例VI可溶性β-葡聚糖可以用作質粒的通道口服DNA、RNA和蛋白質遞送的主要障礙是胃的酸性和蛋白水解的環境，以及GALT對蛋白質有限的攝取。相信集合淋巴結和吞噬細胞中的M細胞是攝取微粒的主要載體。然而，納微顆粒還可以通過副細胞(paracellular)機理1，2和通過轉胞吞3進入GALT。任一種情況中，使用具有黏膜粘性特性的或對細胞上受體的親和性的顆粒可以提高觀察到的顆粒攝取。已經用於製造納微顆粒的許多聚合物是黏膜粘性的。其中是藻酸鹽、角叉膠和果膠。儘管這些材料通常用作納微顆粒中的核心聚合物，但沒有鑑定出這些聚合物的特異性受體，攝取效率仍然是次優的。目前已知Dectin-1是β-葡聚糖的通用受體，並發現於許多人組織包括單核細胞和吞噬細胞中。高分子量β-葡聚糖的凝膠特性使RNA、DNA和蛋白質得到包埋。由於糖對酸條件具有高度耐受性，因此在穿過胃腸道的過程中酶、蛋白質、RNA和DNA仍然得到了保護。通過β-葡聚糖的高親和性Dectin-1受體，可以將這些物質引入吞噬細胞作為到達身體其它部分的潛在載體。
從BD Biosciences(Palo Alto，CA)購買pEGF-C1載體(參見圖8)並根據製造商的說明來製備。pEGF-C1編碼野生型GFP(1-3)的紅色-移位變體，為了較亮的螢光和在哺乳動物細胞中較高的表達已經將其最佳化。(最大激發＝488nm；最大發射＝507nm)。只有當哺乳動物細胞表達SV40 T-抗原時，載體主鏈還含有用於在哺乳動物細胞中複製的SV40起點。該盒上遊的細菌啟動子在大腸桿菌中表達卡那黴素抗藥性。pEGF-C1主鏈還提供了用於在大腸桿菌中繁殖的pUC複製起點，和用於單鏈DNA產生的f1起點。
用混入100μl鹽水中的400μg β-葡聚糖(～200,000道爾頓)中的50μg pEGFP-c1質粒通過口服管飼來餵養小鼠，而對照小鼠僅給予質粒。口服餵養連續進行3天(第1天、第2天和第3天)。RBC裂解後，通過FCAS分析來分析從尾靜脈取出的50μl血液，記錄單核細胞群體中表達GFP細胞的％。葡聚糖中綠細胞％對無葡聚糖組(每組n＝4-9隻小鼠)的平均比率顯示於圖9中。貫穿實驗的14天，無葡聚糖組中的綠單核細胞％在背景水平下保持穩定。另一方面，口服管飼第1天後，存在一貫較高％的循環綠單核細胞，其在約第8天達到最高。由於通常在小鼠單核細胞中不發現GFP，所以在質粒進入血液中循環的單核細胞中之後，綠細胞的存在和GFP蛋白質表達相一致。
使用較高分子量(～350,000道爾頓)的具有較好膠凝特性的大麥β-葡聚糖重複實驗。圖10中，看到相似的動力學，從第8天至第11天持續的較高百分比的綠細胞(每組n＝4隻小鼠)。
使用定量逆轉錄PCR分析來測試GFP mRNA的存在。用混入100μl鹽水中的400μg高分子量(～350,000道爾頓)β-葡聚糖中的50μgpRGFP-c1通過口服管飼餵養小鼠，而對照小鼠只給予質粒。使用50μl外周血來提取總RNA，使用之前所述方法的改進進行逆轉錄的和定量的實時PCR4。保持基因小鼠GAPDH的小鼠用作內部對照。使用已知的GFP和GAPDH標準計算轉錄水平。分開計算GFP和GAPDH的轉錄單位並以GFP對GAPDH的比例作為結果。圖11中，平均RNA水平(GFP/GAPDH)表示為葡聚糖對非葡聚糖組(每組n＝4隻小鼠)的比例。到第10天檢測到GFP mRNA。
實施例VI的參考文獻
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權利要求
1.一種用於口服吸收物質的組合物，該組合物包含合適量的糖類。
2.一種用於口服遞送一種或多種物質的組合物，該組合物包含有效量的口服給藥的β-葡聚糖和一種或多種化療劑。
3.權利要求1或2任一項的組合物，其中所述糖類是葡聚糖。
4.權利要求3的組合物，其中所述葡聚糖含有1，3-1，6或1，3-1，4混合鍵，或者1，3-1，6和1，3-1，4混合鍵的混合物。
5.權利要求3的組合物，其中所述葡聚糖提高了化療劑或抗癌抗體的功效。
6.權利要求3的組合物，其中所述葡聚糖源自草、植物、蘑菇、酵母、大麥、真菌、小麥或海藻。
7.權利要求3的組合物，其中所述葡聚糖具有高分子量。
8.權利要求3的組合物，其中所述物質是肽、蛋白質、RNA、DNA或質粒。
9.權利要求3的組合物，其中所述物質是化療劑。
10.一種組合物，該組合物包含有效量的能夠提高IgM抗體功效的口服給藥的(1→3)，(1→6)或(1→3)，(1→4)β-葡聚糖。
11.權利要求10的組合物，其中所述抗體是對抗癌症的抗體。
12.權利要求11的組合物，其中所述抗體是結合腫瘤的抗體。
13.權利要求12的組合物，其中所述抗體能夠激活補體。
全文摘要
本發明提供了將物質引入細胞的方法，該方法包括使含有口服β－葡聚糖的組合物接觸所述細胞。本發明還提供了將物質引入患者的方法，該方法包括將有效量的上述組合物給藥於患者。可以口服遞送的物質包括但不限於肽、蛋白質、RNA、DNA、化療劑、生物活性劑、質粒以及其它小分子和化合物。最後，本發明提供了含有能夠提高IgM功效的口服β－葡聚糖的組合物，以及所述組合物的不同用途。
文檔編號A61K39/395GK1823092SQ200480020356
公開日2006年8月23日 申請日期2004年7月16日 優先權日2003年7月16日
發明者N－K·V·陳 申請人:斯隆-凱特林癌症研究院