光誘導表達Gacab啟動子及不同區段的表達功能的製作方法
2023-12-01 11:38:56
專利名稱：光誘導表達Gacab啟動子及不同區段的表達功能的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域。更具體地說，本發明涉及來自金華中棉Gacab基因5′上遊的啟動子及其不同區段的表達調控序列，由其構建的植物表達載體及其驅動外源基因在植物中的瞬時表達。本發明還涉及用該植物表達載體轉化的宿主細胞或愈傷組織以及由其製備的轉基因植物。
背景技術：
光是影響植物生長發育的重要因子之一，光照條件在很大程度上影響著高等植物的形態建成、細胞和亞細胞分化及基因表達。如擬南芥能夠根據不同的光照條件，將環境和內源信號結合調控基因的表達，通過兩條顯著不同的發育途徑即暗形態建成(skotomorphogenesis)和光形態建成(Photomorphogenesis)，表現出不同的基因表達模式和多態性，從而達到最佳生長狀態(von Arnim Deng.Rev.Plant Physiol.Plant Mol Biol.1996，47215-243)。
植物光形態建成同時需要大量結構、代謝和調控基因的表達。其中一部分基因在光下生長的幼苗中表達很高，但在暗中生長的幼苗中表達很低甚至不表達，稱之為光誘導基因(light-inducible gene)。由於光質、光量、光周期和光的方向等因素的變化，光誘導基因的表達水平會有很大差異。這些基因的表達同時具有組織特異性，一般在葉中的表達很高，在根中檢測不到。光誘導基因的轉錄調控是光調控植物生長發育的重要機制之一(Millar Kay.Proc Natl Acad Sci USA.1996，9315491-15496；Terzaghi Cashmore.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.1995，46445-474；Tobin Kehoe.Semin Cell Biol.1994，5335-346)，因此研究植物體中特異表達的光誘導基因調控序列及其所包含的光應答元件(light responsive element，LREs)，有助於揭示光如何調控植物生長發育的機理。
植物捕光葉綠素a/b蛋白複合體(chlorophyll a/b binding protein，CAB)基因是一類典型的光誘導型基因。cab的轉錄可以被遠紅光激活，參與轉錄調控的光信號主要由光敏色素家族的紅光受體傳導。Millar和Kay(Millar Kay.Proc Natl Acad Sci USA.1996，9315491-15496)研究擬南芥(Arabidopsis thaliana)cab表達證明，除了光受體傳導的光信號，擬南芥cab的準確表達還受晝夜節律和來自發育系統信號的協同調控。業已證明小麥(Triticum aestivum)、矮牽牛(Petunia hybrida)及擬南芥等植物的cab基因的啟動子表現為光依賴性和組織特異性，並對啟動子中包含的順式元件進行了分離和功能研究(Cecillia，et al.Plant J.1993，3509-518；Gidoni，et al.Mol Gen Genet.1989，215337-344；Ha An.Proc Natl Acad Sci USA.1988，858017-8021；Degenhardt Tobin.Plant Cell.1996，831-41；Yadav，et al.Plant J.2002，31741-753)。在擬南芥cab1基因5』上遊1396bp的序列中，至少存在三個光依賴性的順式作用元件，其中兩個位於-253～-158 bp和-1396～-766bp，是啟動子光誘導和組織特異性必須的，-321～-253 bp則具有增強子的作用(Ha An.Proc Natl Acad Sci USA.1988，858017-8021)。Cecillia等(Cecillia，et al.Plant J.1993，3509-518)發現小麥cab1啟動子中268bp DNA片段(-357～-89bp)是一個光反應和組織特異性的增強子，由三個序列截然不同的元件組成。
在未來植物基因工程研究中，為了更經濟有效的發揮外源基因的作用，或避免基因產物對受體生物及環境產生副作用，需要外源基因只在特定的組織或器官中定時、定量地表達，研究組織特異表達和誘導型啟動子已成為現代分子生物學研究的熱點之一。
發明內容
本發明從金華中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)(中國農業科學院國家種質庫，#00008200)中分離獲得了1009bp的中棉Gacab基因5』上遊的表達調控序列，用其構建植物表達載體並轉入植物，證明來自中棉Gacab基因的啟動子具有光誘導和葉片特異性表達的功能。
因此，本發明克隆了金華中棉(下文中除非特別說明，「中棉」和「金華中棉」都指金華中棉)光誘導基因cab的啟動子，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明涉及來自中棉Gacab基因的啟動子的光誘導和葉片特異性表達及不同區段驅動β-葡糖醛酸苷酶(GUS)報告基因在植物中瞬時表達的特性，它有望為植物基因工程提供更佳的啟動元件。
根據本發明的一個方面，本發明根據已知的陸地棉(Gossypium hirstum)cab基因編碼區序列(GenBank登錄號X54090)，利用加接頭法，通過PCR從中棉基因組中擴增出中棉Gacab基因5』上遊的表達調控序列，並將其不同長度的片斷克隆到植物表達載體上，以農桿菌介導的葉盤法轉化菸草品種NC89，獲得轉基因植株。通過檢測GUS基因的表達，發現來自中棉Gacab基因的啟動子驅動GUS基因在轉基因菸草中具有光誘導和葉片特異性表達的功能。
在根據本發明此方面的一個優選實施方案中，其中所說的中棉Gacab基因啟動子指金華中棉光誘導基因cab全長啟動子，具有如SEQ ID NO1的核苷酸序列或其功能等同物或變異體，其中所述的功能等同物或變異體包含相應於SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進行的置換、加入、重複或缺失。對本發明提供的核苷酸序列進行缺失、添加和/或取代一個或幾個核苷酸，定義為功能性衍生物，這種功能性衍生物可通過本領域內熟知的技術如定點突變、人工合成等方法產生，它們仍具有通過本領域內熟知技術可驗證的功能。
根據本發明此方面的這一優選實施方案，其中所構建的植物表達載體為pcab1000，農桿菌介導的葉盤轉化法及轉基因植株的GUS檢測按本領域的已知技術進行(參見Horsch，et al.1985，2271229-1231；Jefferson，et al.EMBO J.1987，63901-3907)。
對根據本發明此方面的這一優選實施方案，所用的轉基因受體植物是水稻(Oryza sativa)或菸草(Nicotiana tabacum)，但並不限於水稻或菸草，它可以是任一裸子植物或被子植物，如單子葉植物和雙子葉植物，並包括植物細胞、愈傷組織、整株植株及其部分。
本發明的中棉Gacab基因啟動子是棉屬植物中分離獲得的第一個cab啟動子，因此，本發明除構建了1009bp全長啟動子外，還分別構建了199bp、504bp、779bp的5』端缺失型中棉Gacab啟動子，通過檢測其驅動GUS基因的表達發現199bp、504bp、779bp和1009bp的中棉Gacab啟動子都可以驅動GUS基因在水稻愈傷組織中瞬時表達，其中504bp中棉Gacab啟動子表達強度明顯高於CaMV35S啟動子。
根據本發明此方面的一個優選實施方案，其中所說的779bp、504bp、199bp的5』端缺失型中棉Gacab啟動子，分別具有如SEQ ID NO2、3、4所示的核苷酸序列或其功能等同物或其變異體，其中所述的功能等同物或變異體包含分別對應於SEQ ID NO2、3、4所示的核苷酸序列進行的置換、加入、重複或缺失。
根據本發明此方面的這一優選實施方案，其中所說的779bp、504bp、199bp的5』端缺失型中棉Gacab基因啟動子均以PCR法擴增獲得，構建的相應植物表達載體分別為pcab800、pcab500及pcab200。
根據本發明的另一方面，本發明通過分析中棉Gacab全長啟動子及不同的5』端缺失型啟動子驅動GUS基因在水稻愈傷組織中的瞬時表達，推測相應於SEQ ID NO1中的-199bp～-1bp為Gacab基因的基本啟動子，-504bp～-199bp間包含正調控元件，-1009bp～-504bp強烈抑制基因表達，包含負調控元件。
在根據本發明此方面的一個優選實施方案中，其中可用本發明的啟動子驅動的基因為GUS基因，但不限於GUS基因，它可以是抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或質量性狀有關的任一目的基因。
根據本發明的另一方面，本發明根據以上實驗推測通過對中棉Gacab啟動子的進一步修飾，包括置換、加入、重複、缺失，或與其他啟動子融合，可望獲得對植物基因工程具有重要意義的高效的光誘導特異表達啟動子。
因此，根據本發明的第一個方面，本發明提供了一種來自中棉Gacab基因的表達調控元件，其特徵在於它含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或其片斷，或其片斷以任何方式的組合，或其功能等同物或變異體，其中所述的功能等同物或變異體包含對相應於SEQ ID NO1所示的核苷酸序列進行的置換、加入、重複或缺失。該表達調控元件還可含有其他啟動子，並與之連接形成一種融合啟動子。優選的是，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件是含有SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的啟動子。更優選的是，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件是含有SEQID NO3所示的核苷酸序列的啟動子。還有更優選的是，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件是含有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的啟動子。甚至更優選的是，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件是含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的啟動子。另外，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件可以是含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列片斷-1009bp～-504bp的負調控元件。此外，本發明所述的來自中棉Gacab基因的表達調控元件還可以是含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列片斷-504bp～-199bp的正調控元件。
根據本發明的第二個方面，本發明提供了一種植物表達載體，其特徵在於它含有上述任一種來自中棉Gacab基因的表達調控元件。優選的是，本發明所說的植物表達載體還含有目的基因的編碼序列，其中該目的基因選自抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或品質性狀有關的結構和調控基因。優選的是本發明所述的植物表達載體是圖3-1所示的質粒pcab1000。更優選的是，本發明所述的植物表達載體是圖3-2所示的質粒pcab800。本發明另一優選的植物表達載體是圖3-3所示的質粒pcab500。本發明還有另一優選的植物表達載體是圖3-4所示的質粒pcab200。
根據本發明的第三個方面，本發明提供了一種轉化的宿主細胞，其特徵在於它含有上述任一種植物表達載體。其中該宿主細胞可來源於任何一種裸子植物和被子植物。最優選的是，該宿主細胞來源於水稻或菸草。
根據本發明的第四個方面，本發明提供了一種轉化的植物愈傷組織，其特徵在於它含有上述任一種植物表達載體。其中該植物愈傷組織可來源於任何一種裸子植物和被子植物。最優選的是，該植物愈傷組織來源於水稻或菸草。
根據本發明的第五個方面，本發明提供了一種製備轉基因植物的方法以及由此製備的轉基因植物，包括從上述任一種轉化的植物細胞或上述任一種轉化的愈傷組織再生成轉基因植物。
圖1中棉cab基因啟動子PCR產物電泳圖，大小為1009bp。其中，MλDNA/EcoR I+Hind III；1中棉cab啟動子產物；圖2中間載體pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2的構建；
圖3植物表達載體pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200的構建及質粒圖譜；圖3-1、圖3-2、圖3-3、圖3-4分別表示pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200植物表達載體的構建流程及基因表達盒；圖4不同長度的金華中棉cab啟動子(Gacab P)驅動gus基因在水稻愈傷組織中瞬時表達的愈傷組織照片。其中，a、b、c、d和e分別表示轉pcab200、pcab500、pcab800、pcab1000及pBin121的水稻愈傷組織的GUS組織化學檢測結果。pcab200、pcab500、pcab800、pcab1000四種不同長度的Gacab P都能驅動gus基因的表達，但表達水平有差異，其中轉pcab500愈傷組織的GUS表達水平最高，且明顯高於pBin121中35S啟動子的表達強度，pcab200、pcab800和pcab1000的表達強度減弱。因pcab200僅包含TATA box和CAAT box，故可認為-197bp～-1bp為Gacab的基本啟動子；-504bp～-197bp間包含Gacab啟動子的正調控元件，增強基因的表達；-1009bp～-504bp間存在負調控元件，抑制啟動子的活性；圖5.金華中棉Gacab啟動子驅動gus在菸草不同器官中穩定表達的GUS組織化學分析照片。其中，a根；b葉片；Gacab P驅動gus基因在葉片表達，在根中gus基因不表達，表現明顯的組織特異性；圖6.轉基因菸草經光、暗培養後金華中棉Gacab啟動子驅動gus在菸草葉片中表達的照片。其中，a和b表示光誘導條件下轉基因菸草葉片中的GUS組織化學分析；c和d表示暗培養條件下轉基因菸草葉片中的GUS組織化學分析暗處理的葉片中沒有GUS出現，而在光處理的葉片中有gus基因的高效表達，表現明顯的光誘導特性。
具體實施方案下面提供如下實施例進一步說明本發明，應理解本文提供的實施例僅僅是對本發明技術方案的舉例性解釋，而不構成對本發明範圍的限制。本領域的技術人員在不偏離本發明精神的前提下可對本發明的技術方案作出各種修改或變化，這些修改或變化應在本發明要求保護的範圍內。
實施例1金華中棉Gacab基因啟動子的克隆及序列的測定1.1金華中棉Gacab基因啟動子的克隆取1～3克金華中棉鮮葉片，加等量Al2O3用液氮研磨，將粉末置於50ml離心管中，加入20ml DNA提取緩衝液(100mM Tris.HCl pH8.0，500mM NaCl，10mMβ-巰基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，劇烈振蕩1分鐘，加入4ml 10％ SDS，輕輕混勻，於65℃加熱10～20分鐘，至顏色翠綠，加入冰冷5M KAc 4ml，冰上放置30分鐘，然後在4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清，用0.6倍異丙醇沉澱後，用Rnase處理，純化得到基因組DNA備用。
按照TaKaRa LA PCRTMin vitro Cloning Kit(TaKaRa公司，產品目錄號為#DRR015)說明書，取上述製備的基因組DNA 2.5μg，用Hind III 37℃徹底消化3～6h後，將整個消化產物用乙醇沉澱回收，溶於10μL去離子水中，與具有如下序列的Hind III銜接頭(adaptor)(TaKaRa LA PCRTMinvitro Cloning Kit中含有該銜接頭)連接，以此為模板，用具有如下序列的引物Cassette primer C1/p-R1和Cassette primer C2/p-R2進行兩輪巢式PCR，其中引物Cassette primer C1和Cassette primer C2由TaKaRa LAPCRTMin vitro Cloning Kit提供，引物p-R1和p-R2為本發明根據已知的陸地棉cab基因編碼區序列合成。
PCR引物HindIII adaptor
5′HO GTACA TATTG TCGTI AGAAC GCGTA AIACG ACTCA CTATA GGGAGA3′3′CATGT ATAAC AGCAA TCTTG CGCAT TATGC TGAGT GATAT CCCTCTTCGA OH 5′Cassette primer C15′GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA 3′p-R15′AGAACTTCACTGCCTTACCGGCGAATGATG 3′Cassette primer C25′CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA 3′p-R25′GAGCCATGGTTGTAGAGGCCATTGTGAAGC 3′擴增條件為94℃，30″，55℃，2′，72℃，1′，循環數30個。PCR獲得約1kb片段(圖1)，回收PCR產物連接到pMD18-T-vector(TaKaRa公司，產品目錄號為#D5o4A)中，命名為pcabP(圖2)。
1.2金華中棉Gacab啟動子序列的測定pcabP測序結果表明PCR擴增所得金華中棉Gacab啟動子的序列，從起始密碼子ATG上遊第一個鹼基起，長度為1009鹼基對(序列如SEQID No1)。序列分析證實，中棉Gacab啟動子與Genebank中所有登錄序列都沒有明顯的同源性。
根據真核生物基因啟動子結構的一般特徵，CAAT box的序列為C(T)A2～5G(T)NGA2～4TT；TATA box 的序列為TC(G)TATAT(A)A1～3C(T)A。據此推測在Profilin2啟動子的-86～-80處存在一個TATA box，在-142～-136處有一個CAAT box，見序列SEQ ID No1。
實施例2植物表達載體pcab1000及不同長度缺失啟動子表達載體的構建2.1中間載體pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2的構建以pcabP質粒DNA為模板，根據實施例1中獲得的金華中棉Gacab啟動子的DNA序列設計具有如下序列的引物p-F1000/p-R、p-F800/p-R、p-F500/p-R和p-F200/p-R，分別進行PCR擴增，PCR擴增條件為94℃，30″，50℃，1′，72℃，1′，循環數30個。所獲得的PCR產物用Hind III/BamHI雙酶切處理，回收目的片段；同時用Hind III/BamH I雙酶切處理pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司，產品目錄號為#212207)質粒，回收2.9kb的載體片段。將載體片段與目的基因片段連接，分別獲得中間載體pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2(圖2)。
PCR引物如下p-R5′CTGGATCCGGTTGTAGAGGCCATTGTG 3′BamH Ip-F10005′GCAAGCTTGTCTAATAAATAATG 3′Hind IIIp-F8005′GCAAGCTTAGACCAACACCACTGACT 3′Hind IIIp-F5005′CTAAGCTTCAACATCAAGGGAGTTGT 3′Hind IIIp-F2005′CTAAGCTTGTGGATTAAAGATTGCC3′Hind III
2.2植物表達載體pcab1000和缺失啟動子表達載體pcab200、pcab500、pcab800的構建提取pcab1、pcab0.8、pcab0.5及pcab0.2質粒DNA，用Hind III/BamHI雙酶切，分別回收約1.0kb、0.8kb、0.5kb及0.2kb的目的片段，用HindIII/BamH I酶切pBI121(CLONTECH，#6018-1)回收約11.5kb載體片段，將此載體片段與四種不同長度的目的片段連接，即以不同長度的金華中棉Gacab啟動子取代CaMV35S啟動子，得到pcab1000(圖3-1)、pcab800(圖3-2)、pcab500(圖3-3)及pcab200(圖3-4)。
至此獲得了含有金華中棉Gacab啟動子全長1009bp(序列如SEQ IDNo1)(pcab1000)及779bp(序列如SEQ ID No2)(pcab800)、504bp(序列如SEQ ID No3)(pcab500)和199bp(序列如SEQ ID No4)(pcab200)共四種不同長度啟動子/GUS的植物表達載體。不同植物表達載體gus基因表達盒如附圖3-1、圖3-2、圖3-3、圖3-4所示。
實施例3Gacab啟動子/GUS基因的瞬時表達3.1水稻愈傷組織的製備用水稻品種中花11(中國農業科學院國家種質庫，#ZD-03874)按Hiei等人(Hiei Y，et al.Plant Journal，6271～282，1994)所述製備水稻愈傷組織。先將去殼的水稻種子用70％乙醇浸泡1min，再用1％次氯酸鈉溶液滅菌30min，無菌水衝洗5次，置於MS(GIBCOBRL，產品目錄號為#10632-040)培養基上26℃避光培養20d，將從成熟胚盾片處長出的愈傷組織剝下，進行繼代培養，直至胚性愈傷組織出現。
3.2基因槍轟擊水稻愈傷組織提取pcab1000、pcab800、pcab500、pcab200及pBin121質粒DNA1μg，轟擊基因槍採用BioRad公司生產的PDS-1000/He型基因槍，使用金粉直徑為0.4～1.0μm，轟擊用氦氣壓為7 584kPa，每皿用80μg金粉和1μg質粒DNA轟擊20塊左右的水稻愈傷組織，其他轟擊條件參照Becker等人(Becker D，et al.Plant Journal，5299～307，1994)的方法。水稻愈傷組織在MS培養基(Murashige T Skoog F，Physiol Plant，15473～497，1962)上25℃培養3天，以非轉化的水稻愈傷組織和轉pBin121的水稻愈傷組織為對照，研究不同長度中棉Gacab啟動子驅動GUS基因的瞬時表達。
3.3水稻愈傷組織GUS瞬間表達檢測將轉化愈傷組織浸入適量X-gluc(Sigma公司，產品目錄號為#B6650)溶液(5mg X-gluc溶於1ml二甲基甲醯胺，繼續加入pH7.0、濃度為50mM的NaPO4至終體積為10ml)中，用石蠟膜(parafilm)封口，37℃避光放置過夜，鏡檢前，以FAA(50％酒精85毫升福馬林10毫升冰醋酸5毫升)固定15min，之後分別用75％、85％、95％、100％乙醇脫色，除去色素。結果表明，四種不同長度的中棉Gacab啟動子都能驅動gus基因的表達，但表達水平有差異，其中轉pcab500愈傷組織的GUS表達水平最高，且明顯高於pBin121中35S啟動子的表達強度，與pcab500相比，pcab200、pcab800和pcab1000的表達強度減弱，非轉化愈傷組織無GUS表達(圖4)。
實施例4菸草的轉化及金華中棉Gacab啟動子驅動GUS基因的穩定表達4.1 LBA4404感受態細胞的製備挑取LBA4404(CLONTECH公司，產品目錄號為#6027-1)單菌落接種於5ml YEB(含鏈黴素100μg/ml，蔗糖5g+蛋白腖5g+牛肉膏5g+酵母提取物1g+MgSO4.7H2O 0.049g/L，pH7.2)中，28℃，250rpm培養過夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培養基中，繼續培養至OD600值約為0.6。將菌液轉至無菌離心管中，冰浴30分鐘，5000rpm離心5分鐘，用2ml 20mM的CaCl2重懸菌體，按每管200μl分裝於無菌小離心管中。
4.2重組質粒轉入LBA4404細胞在200μl LBA4404感受態細胞中分別加入2μg重組質粒pcab1000，置冰浴5分鐘，然後轉至液氮中冷凍8分鐘，迅速於37℃水浴中溫育5分鐘後，加入800μl YEB培養基，28℃ 250rpm預培養4～5小時，然後塗鋪含有卡那黴素(50μg/ml)的YEB固體平板，28℃培養24～48小時。長出的農桿菌菌落帶有相應的轉化質粒。
4.3菸草的遺傳轉化(1)農桿菌的準備28℃過夜分別培養帶有植物表達載體的農桿菌50ml，5000rpm離心5分鐘，收集菌體沉澱，用液體MS培養液洗滌一次，再用MS重懸至OD600＝0.2～0.4。
(2)浸染取菸草品種NC89(Nicotiana tabacum L.cv.NC89)(中國農業科學院國家種質庫，#00002293)無菌苗葉片，用刀切成邊長約0.5釐米的小方塊，在農桿菌懸液中浸泡5～10分鐘，然後用滅菌濾紙吸乾。
(3)共培養將葉塊擺放在不加抗生素的共培養培養基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L)中(上面墊兩層濾紙)於25℃避光共培養3天。
(4)選擇培養將葉片繼代到選擇培養基(MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)中在光照培養箱中(光照12小時，黑暗12小時)培養至抗性芽的出現。
(5)抗性小苗的獲得將愈傷組織轉移至生根培養基(MS+Kan 100mg/L+Carb 500mg/L)，每隔兩周繼代培養一次，最後種植到裝有滅菌土壤的小塑料缽中。
4.4轉基因菸草GUS穩定表達的檢測取再生植株頂部的第三個葉片和根，以非轉基因菸草的葉片和根為對照，按實施例3.2所述方法進行GUS組織染色，結果顯示，中棉Gacab啟動子驅動gus基因在葉片特異地表達，在根中gus基因不表達，非轉基因菸草不同器官中無GUS表達(圖5)。
實施例5轉基因菸草經光、暗培養後中棉Gacab啟動子驅動gus在菸草葉片中的表達取實施例4中獲得的10株轉pcab1000的菸草植株，以非轉基因菸草作對照，25℃暗培養6天，在頂部第三黃化葉上取樣，按實施例3.2所述方法進行GUS檢測，然後將菸草置於25℃、光照時間16h、光強20001x的光照條件下，培養6天，繼續在同一葉片上取樣，按實施例3.2所述方法進行GUS組織化學分析。結果表明暗處理的葉片中沒有GUS出現，而在光處理的葉片中有gus基因的高效表達(圖6)，光、暗處理的非轉基因菸草葉片中均無GUS表達。
序列表110中國農業科學院生物技術研究所120光誘導表達Gacab啟動子及其不同區段的表達功能160421012111009212DNA213金華中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)220
223Gacab啟動子核苷酸序列4001AAGCTGTC TAATAAATAA TGTTAATGTT TATGGAAATG ATTATGTTTA-961TGTTTCATCT TGTTTCTTGA TGAAGCCTAA TGAATCATAT AGTTTTCGAC ACTGATAATT-901AGACTACTCG TGGGTATTTT TAGAAACTAT TAAGTCAATT ACATAATTAA ATTTTTGGGT-841TTTTAAAAAT AAATTTCGAG TTTTCTTTAT AAGGGTTAAA AGGACGAGAC TTGGTATAAA-781CTAGACCAAC ACCACTGACT AGTTGACATC AATTTAAAGT ATTTTGATAG TGCCGCAAAA-721CAAATTAAGC CAGATTTTTA TTCGTAAGAT ATTTTACATT TATGTATTAT CAACCACTCA-661AATCCTGTAA TTTGTATTTT TATGCTGCCA TGATTTCAGC ATCAATAAAC TTCACCAAAA-601GAAAGGAAAA TCTATTTCAT ATGGCTCAAA GAAACTTCTT TCTATGAAAA CTCCATCTAT-541TTTTCCATGA AAATGAAAAG GGAGGGAGAG AGAAAATCAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481
TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGCTC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121CAAT boxATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTTCCTATATAATAAACGC ATCGGATTGC-61TATA boxCCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-12102211779212DNA213金華中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)220
2235′端缺失型Gacab啟動子核苷酸序列4002AGACCAAC ACCACTGACT AGTTGACATC AATTTAAAGT ATTTTGATAG TGCCGCAAAA-721CAAATTAAGC CAGATTTTTA TTCGTAAGAT ATTTTACATT TATGTATTAT CAACCACTCA-661AATCCTGTAA TTTGTATTTT TATGCTGCCA TGATTTCAGC ATCAATAAAC TTCACCAAAA-601GAAAGGAAAA TCTATTTCAT ATGGCTCAAA GAAACTTCTT TCTATGAAAA CTCCATCTAT-541TTTTCCATGA AAATGAAAAG GGAGGGAGAG AGAAAATCAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241
TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGCTC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121CAAT boxATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTTCCTATATAATAAACGC ATCGGATTGC-61TATA boxCCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-12103211504212DNA213金華中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)220
2235′端缺失型Gacab啟動子核苷酸序列4003CAA CATCAAGGGA GTTGTTTAAT-481TTATCAAGTA ATATTTGTGT GTATTAATTA TAATCACTAA AAATATTGAT TGAATCACAA-421GTGAAGATTT TATATTTAAT TCATAATTGA AAAAAATTTT AAACTTTATT TTTGAATTAT-361TTTTCATACA AAACAATCCA TTTACCTGTT GTAGCATTGC TTCATTGTTC TAAACAAAAC-301AAACAAAAAG GGTTCGAAAA TTTTCAACAG TCGAATTTCC GTCACTATGG TGGCCAAGCC-241TATGATCCTT AAAAAATATT GGTAGCCTGT TAAGTGAAAT TTTGTGGATT AAAGATTGCC-181AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGCTC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121CAAT boxATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTTCCTATATAATAAACGC ATCGGATTGC-61TATA boxCCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-1
2104211199212DNA213金華中棉(Gossypium arboreum var.jinhua)220
2235′端缺失型Gacab啟動子核苷酸序列4004TTGTGGATT AAAGATTGCC-181AAGTGGACAT GCATGGCCAA CATCAAAATC TTGGAAGCTC CAATGAAATG AAAGATAGAG-121CAAT boxATATTACGTA GATAAGGAAC CTTACTCTCA CCTTCCTATATAATAAACGC ATCGGATTGC-61TATA boxCCCTTCAATC ACTCACCCAT CACCAACAAA ATCAACTGCT TCACAATGGC CTCTACAACC-權利要求
1.一種來自中棉Gacab基因的基本啟動子，其特徵在於它由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成，或者是對所述序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。
2.一種來自中棉Gacab基因的啟動子，其特徵在於它含有權利要求1所述的基本啟動子且由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列組成，或者是對所述序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。
3.一種來自中棉Gacab基因的啟動子，其特徵在於它含有權利要求1所述的基本啟動子且由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列組成，或者是對所述序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。
4.一種來自中棉Gacab基因的啟動子，其特徵在於它含有權利要求1所述的基本啟動子且由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列組成，或者是對所述序列進行一個或幾個核苷酸的缺失、添加和/或取代，但功能不變的序列。
5.一種來自中棉Gacab基因啟動子的負調控元件，其特徵在於它由SEQ IDNO1所示的核苷酸序列片斷-1009bp~-504bp組成。
6.一種來自中棉Gacab基因啟動子的正調控元件，其特徵在於它由SEQ IDNO1所示的核苷酸序列片斷-504bp~-199bp組成。
7.一種植物表達載體，其特徵在於它含有權利要求1所述的來自中棉Gacab基因的基本啟動子或權利要求5或6所述的來自中棉Gacab基因啟動子的負調控元件或正調控元件。
8.根據權利要求7所說的植物表達載體，其特徵在於它含有權利要求2-4任一項所述的來自中棉Gacab基因的啟動子。
9.根據權利要求8所說的植物表達載體，其特徵在於它還含有目的基因的編碼序列。
10.根據權利要求9所述的植物表達載體，其特徵在於所述的目的基因選自抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗除草劑、抗蟲、抗逆以及與產量或品質性狀有關的結構和調控基因。
11.根據權利要求7-10任一項所述的植物表達載體，其特徵在於它是圖3-1所示的質粒pcab1000。
12.根據權利要求7-10任一項所述的植物表達載體，其特徵在於它是圖3-2所示的質粒pcab800。
13.根據權利要求7-10任一項所述的植物表達載體，其特徵在於它是圖3-3所示的質粒pcab500。
14.根據權利要求7所述的植物表達載體，其特徵在於它是圖3-4所示的質粒pcab200。
15.一種轉化的宿主細胞，其特徵在於它含有權利要求7-14任一項所述的植物表達載體。
16.根據權利要求15的轉化的宿主細胞，其特徵在於該宿主細胞來源於任何一種裸子植物和被子植物。
17.根據權利要求16的轉化的宿主細胞，其特徵在於該宿主細胞來源於水稻或菸草。
18.一種轉化的植物愈傷組織，其特徵在於它含有權利要求7-14任一項的植物表達載體。
19.根據權利要求18的轉化的植物愈傷組織，其特徵在於該植物愈傷組織來源於任何一種裸子植物和被子植物。
20.根據權利要求19的轉化的植物愈傷組織，其特徵在於該植物愈傷組織來源於水稻或菸草。
21.一種製備轉基因植物的方法，包括從權利要求16或17的轉化的宿主細胞或權利要求18-20任一項的轉化的愈傷組織再生成轉基因植物。
全文摘要
本發明分離獲得了金華中棉捕光葉綠素a/b蛋白複合體基因Gacab編碼區5′上遊的表達調控序列1009bp(SEQ ID NO1)。對該表達調控序列及不同區段的系統分析發現，其中－199bp～－1bp為Gacab基因的基本啟動子，－504bp～－199bp間包含正調控元件，－1009bp～－504bp間包含負調控元件。因此1)其5′端缺失的504bp片段至少在單子葉植物中與CaMV35S啟動子一樣地有用；2)通過對Gacab啟動子的進一步修飾(包括插入、缺失、置換、重複等)或與其它啟動子融合，可望獲得良好的光誘導和葉片特異表達啟動子，這在植物基因工程中的應用中具有重要的實踐意義和巨大的市場經濟價值。
文檔編號C07H21/00GK1609216SQ20031010186
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月21日 優先權日2003年10月21日
發明者賈士榮, 李為民, 王志興 申請人:中國農業科學院生物技術研究所