放線菌素d的類似物的製作方法

2023-12-05 12:44:21 3

專利名稱：放線菌素d的類似物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一類新的化合物，具體講是一類放線菌素D的類似物，以及這類化合物的製備方法。
背景技術：
放線菌素D(Actinomycin D，AMD，亦稱更生黴素)，是國家基本醫療保險藥物品種之一，在臨床廣泛用於治療多種惡性腫瘤，如小兒腎母細胞瘤(Wilm’s Tumor)、妊娠絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、何杰金氏惡性淋巴瘤(Hodgkin’s disease)等多種惡性腫瘤，有顯著的療效。近年來發現放線菌素D有抗HIV病毒作用，並對愛滋病患者易感染的Kaposi’s腫瘤細胞有誘導凋亡作用。
放線菌素D結構如下式所示，分子內含有兩個環五肽和平面結構的吩噁嗪酮，其中環五肽中2位胺基酸(Aa2)為D型纈氨酸(D-Valine，D-Val)，5位胺基酸(Aa5)為L型N甲基纈氨酸(L-MeVal)，1位、3位、4位分別是蘇氨酸(Threonine，Thr)、脯氨酸(Proline，Pro)和N甲基甘氨酸(Sarcosine，Sar)。其結構參見下式 放線菌素D通過與DNA結合，抑制DNA的轉錄過程從而表達一系列的生物活性，放線菌素D與DNA結合的機理是目前研究熱點之一，也為該類新藥設計提供了理論基礎。
但是，放線菌素D很強的毒性大大限制了應用範圍，放線菌素D對增殖期細胞的毒性與非增殖細胞毒性的差別說明其選擇性的毒性並非完全由RNA的合成被抑制而引起。藥理學研究表明放線菌素D在體內代謝緩慢，在宿主細胞核內產生積累，也會直接導致累積毒性，這些都限制了該藥物的應用範圍。
為解決放線菌D過強的毒性，現有技術中採用了多種方法對其進行改造，例如在吩噁嗪酮8位進行N取代(J.Am.Chem.Soc.，1994，1164154)；吩噁嗪酮7位氨基取代類似物(J.Med.Chem.，1983，26448；J.Med.Chem.，1988，311540等)；吩噁嗪酮2位氨基進行修飾改造或引入自由基(Chem.Ber.，1967，1001051；J.Med.Chem.，1979，221051等)；環五肽2、3、4、5位胺基酸分別替換和修飾的類似物(J.Med.Chem.，1991，941297；Biochemistry，1996，3513240等)。通過這些技術措施得到的類似物中，有一些表現出較好的生物活性，偶爾也有一些毒性有所降低，但是作為藥物來說，所得產物的毒性仍然較大。

發明內容
本發明提供一類新的經改造的放線菌素D類似物，預期這類的化合物具有更好的藥物活性或者更低的毒性。
本發明的第二個目的是提供一種前述新化合物的製備方法。
本發明的化合物參見下式 其式中的環五肽上的2位胺基酸(Aa2)為D型苯丙氨酸，或者為D型N甲基纈氨酸，或者為D型N甲基苯丙氨酸，而5位胺基酸(Aa5)為N甲基胺基酸。
更為具體的講本發明的化合物，環五肽上2位胺基酸Aa2為D型苯丙氨酸(D-Phenylalanine，D-Phe)時，5位胺基酸Aa5可以是D型N甲基纈氨酸(D-MeVal)，或者是D型N甲基苯丙氨酸(D-MePhe)，或者是L型N甲基苯丙氨酸(L-MePhe)，或者是D型N甲基亮氨酸(D-MeLeu)，或者是L型N甲基亮氨酸(L-MeLeu)，或者是D型N甲基丙氨酸(D-MeAla)，或者是L型N甲基丙氨酸(L-MeAla)，或者是L型N甲基絲氨酸(L-MeSer)，或者是L型N甲基酪氨酸(L-MeTyr)。
當環五肽上2位胺基酸Aa2是D-MeVal時，其5位胺基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
當環五肽上2位胺基酸Aa2是D-MePhe時，其5位胺基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
本發明的化合物的製備方法是將化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶於甲醇中，用10％鈀碳催化氫化，脫去Z保護基後，與N-苄氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通過DCC法縮合得到二肽，再經過催化氫化脫去Z保護基後，與2位胺基酸Aa2通過DCC法縮合得到三肽，再經過催化氫化脫去Z保護基後與N-苄氧羰基-蘇氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法縮合得到四肽；再將四肽與Aa5用DCC法縮合反應得到線性五肽，再用三氟乙酸脫除五肽N端BOC和C端OtBu保護後，用三乙胺將體系調為中性，用BOP-Cl作為縮合劑在二氯甲烷DCM中反應得到環五肽，再經催化氫化脫除Z-Thr的Z保護基後，用DCC/HOBt活化酯法與3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)縮合，產物再經催化氫化後，在磷酸緩衝液中用K3Fe(CN)6氧化得到終產物。
在本發明的放線菌D的類似物的製備方法中，在生成環五肽的反應中所採用二氯甲烷與溶質的比例為0.8～1毫升∶1毫克，反應溫度保持在25-29℃，這樣可以提高目的產物的產率。
研究表明，放線菌素D與DNA發生作用，從而選擇性的抑制RNA的合成而表現出抗腫瘤活性。對放線菌素D與DNA作用過程的研究結果表明，放線菌素D吩噁嗪酮部分插入到DNA的5』-GC-3』鹼基對中形成氫鍵，兩個環五肽位於DNA的小溝內，通過疏水堆積作用與DNA小溝表面作用。環五肽中2位D-Val的側鏈異丙基指向環外側，並不與DNA作用，而當D-Val被其它一些胺基酸如D-Phe替換後，胺基酸側鏈基團與DNA之間可通過某種相互作用(Side binding)而改變DNA結合的選擇性。活性實驗表明，2位採用D-Phe替換後，對DNA轉錄的抑制活性有顯著提高，而急性毒性相比母體有顯著下降。另外，α環與β環的2位D-Val之間形成了兩個環內氫鍵，這兩個氫鍵降低了1位Thr的柔性，進而限制了兩個環五肽的構象。而Thr的這種柔性是與DNA的鳥嘌呤形成複合物所必需的，因此用N甲基化的胺基酸D-MeVal、D-MePhe等替換D-Val，破壞或減弱α環與β環D-Val之間的氫鍵作用，可以提高環五肽的自由度，預計能夠提高與DNA的結合作用。
環五肽5位胺基酸側鏈基團的方向、體積和極性也直接影響DNA的結合選擇性，在DNA小溝中，嘌吟鹼基的體積要大於嘧啶鹼基，GC鹼基對的親水性要大於AT鹼基對，這些決定了5位胺基酸側鏈基團、側鏈基團的構型(L型與D型側鏈所指方向不同)、親水性還是疏水性都將決定藥物與DNA結合的選擇性。當5位N甲基纈氨酸(L-MeVal)被D-MeVal替換後，由於側鏈基團的朝向變化而改變了結合活性，同樣用D-MePhe替換後，D-MePhe的側鏈疏水基團與DNA小溝表面疏水區域更易結合而改變了與DNA的結合活性，在生物活性中表現出DNA轉錄的抑制活性的顯著提高，5位D-MePhe放線菌素D類似物，體外抗腫瘤活性六倍於臨床使用藥物放線菌素D母體，而毒性只有母體的五分之一。實驗表明，對小鼠移植P-388淋巴瘤的抑制率達到80.0％以上，小鼠存活時間較放線菌素D母體明顯延長。對移植肝腹水瘤的抑制率達到了56.6％；對RNA合成的抑制率達90.8％；K562腫瘤細胞經過藥物處理後呈現明顯的凋亡狀態，凋亡細胞比例達到63.5％。免疫組織化學和原位雜交技術對癌基因和抑癌基因表達的實驗結果表明，合成的類似物不同程度的抑制bcl-2，Pan ras和C-erbB-2的mRNA和蛋白的表達，而抑癌基因p53的mRNA和蛋白的表達明顯增強。
本發明所涉及的類似物在不改變類似物整體結構的基礎上，同時在環五肽2、5位進行替換，改變了藥物環五肽中2位與5位胺基酸位點的微觀結構2位D-Phe替換以增加與DNA之間的結合強度及選擇性；2位N甲基胺基酸替換以降低肽環的剛性；5位用不同種類、不同構型的N甲基胺基酸替換以提高DNA結合的選擇性，預計能夠有效地降低毒性並提高抗腫瘤活性。本發明的類似物的初步抗腫瘤活性已證實，類似物的體外抗腫瘤活性接近或優於AMD，如[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD對體外腫瘤細胞HL-60的抑制活性明顯優於放線菌素D。
具體實施例方式
實施例1[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD的合成I取化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯0.63g(2.26mmol)溶於6ml無水甲醇(MeOH)中，加入80mg10％Pd/C，加氫攪拌2小時後過濾，濃縮，向殘渣中加入Z-Pro 0.535g(2.15mmol)，用乾燥的二氯甲烷(DCM)溶解並冷卻到-10℃，加入0.44g(2.15mmol)DCC的二氯甲烷溶液，在-10℃反應2小時後，室溫反應過夜。過濾掉反應生成的DCU，濃縮濾液，殘渣溶於乙酸乙酯(EtOAc)，依次用10％檸檬酸水溶液，10％碳酸氫鈉(NaHCO3)水溶液，飽和氯化鈉(NaCl)水溶液洗滌，並用無水硫酸鈉(Na2SO4)乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶石油醚PE2∶1)，得到無色油狀產物N-苄氧羰基-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯
II取化合物N-苄氧羰基-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯2.87g(7.63mmol)溶於50ml無水MeOH中，加入300mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮，向殘渣中加入Z-D-Phe 3.38g(11.30mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入2.34g(11.34mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應2小時後，室溫反應過夜。後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到無色油狀產物N-苄氧羰基-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-苄氧羰基-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯300mg(0.57mmol)溶於10ml無水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護三肽。Z-Thr 170mg，(0.67mmol)與HOBt 102mg(0.75mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入152mg(0.74mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應15分鐘後，室溫反應一小時，將反應混合液轉入脫保護三肽中，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末狀的N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；Ⅳ取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯561.7mg(0.90mmol)與Boc-D-MeVal 270.3mg(1.17mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入241.4mg(1.17mmol)DCC的DCM溶液，以及二甲基氨基吡啶(DMAP)55mg(0.45mmol)，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末狀N-叔丁氧羰基-D-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯683.7mg(0.82mmol)溶於3ml TFA中，在0℃攪拌4小時，蒸除TFA，用無水乙醚沉澱出產物的TFA鹽，用50ml無水DCM溶解後，於0℃加TEA調pH至7，用500ml DCM稀釋反應體系，加入BOP-Cl 313mg(1.23mmol)，27-29℃反應5天，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基纈氨醯內酯；VI取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基纈氨醯內酯30mg(0.045mmol)溶於10ml無水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護環五肽。BMNBA 16mg(0.055mmol)與HOBt 8.3mg(0.061mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入12mg(0.058mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應15分鐘後，室溫避光反應一小時，將反應混合液轉入脫保護環五肽中，室溫避光反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末狀的3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基纈氨醯內酯；VII取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基纈氨醯內酯33mg(0.041mmol)溶於9ml無水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氫化2小時後過濾，濾液加至等體積的含有39.62mg(0.12mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩衝液中，空氣中攪拌反應20分鐘，用水稀釋反應體系，EtOAc萃取產物，產物用飽和NaHCO3溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-Phe2，D-MeVal5]2AMD，[α]D20＝-43(c＝0.295，MeOH)；1H NMR(CDCl3，400M)8.66(2H，d，NH)，8.11(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.27(1H，d，7-H)，2.95(3H，s，N-CH3)，2.93(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.76(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.26(3H，d，Thr-CH3)，1.17(3H，d，Thr-CH3)，0.95(3H，d，MeVal-CH3)，0.86(3H，d，MeVal-CH3)；ESI-MSm/z1351.4(M+H)，1373.4(M+Na+)；高分辨質譜(ESI-MS)m/z1373.6166(M+Na+)，C70H86N12O16Na，計算值1373.6182；實施例2[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD的合成本實施例中反應步驟I至III和合成過程與實施例1相同；IV取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯423mg(0.68mmol)與Boc-D-MeVal 264.8mg(0.95mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入195.5mg(0.95mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP82.7mg(0.68mmol)，室溫反應過夜，過濾掉反應生成的DCU，濃縮濾液，殘渣溶於EtOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，並用無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-D-N甲基苯丙氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯937.8mg(1.06mmol)溶於4ml TFA中，在0℃攪拌4小時，蒸除TFA，用無水乙醚沉澱出產物的TFA鹽，用50ml無水DCM溶解後，於0℃加TEA調pH至7，用600ml DCM稀釋反應體系，加入BOP-Cl 404.7mg(1.59mmol)，27-29℃反應5天，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基苯丙氨醯內酯；VI取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基苯丙氨醯內酯409.2mg(0.58mmol)溶於10ml無水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護環五肽。BMNBA 214.7mg(0.75mmol)與HOBt 101mg(0.75mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入154.2mg(0.75mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應15分鐘後，室溫避光反應一小時，將反應混合液轉入脫保護環五肽中，室溫避光反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基苯丙氨醯內酯；VII取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-D-N甲基苯丙氨醯內酯247.2mg(0.29mmol)溶於10ml無水MeOH中，加入30mg 10％Pd/C，避光氫化2小時後過濾，濾液加至等體積的含有279.8mg(0.85mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩衝液中，空氣中攪拌反應20分鐘，用水稀釋反應體系，EtOAc萃取產物，產物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-Phe2，D-MePhe5]2AMD，[α]D20＝-40°(c0.226，MeOH)；1H NMR8.71(2H，d，NH)，8.24(2H，dd，NH)，7.56(1H，d，8-H)，7.12(1H，d，7-H)，2.83(3H，s，N-CH3)，2.82(3H，s，N-CH3)，2.71(3H，s，N-CH3)，2.69(3H，s，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.24(3H，s，4-CH3)，1.30(3H，d，Thr-CH3)，1.19(3H，d，Thr-CH3)；高分辨質譜(ESI-MS)m/z1447.6344(MH+)，C78H87N12O16，計算值1447.6363。
實施例3[D-MeVal2]2AMD的合成本實施例中反應步驟I和合成過程與實施例1相同；II取化合物N-苄氧羰基-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯1.90g(5.05mmol)溶於25ml無水MeOH中，加入212mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮，向殘渣中加入Z-D-MeVal 1.47g(5.56mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入1.15g(5.56mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應2小時後，室溫反應過夜，過濾掉反應生成的DCU，濃縮濾液，殘渣溶於EtOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，並用無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到無色油狀產物N-苄氧羰基-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-苄氧羰基-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯3.80g(7.77mmol)溶於50ml無水MeOH中，加入310mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護三肽。Z-Thr 2.16g(8.53mmol)與HOBt 1.21g(8.97mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入1.85g(8.96mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應15分鐘後，室溫反應一小時，將反應混合液轉入脫保護三肽中，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；IV取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯182.9mg(0.31mmol)與Boc-L-MeVal 78.5mg(0.34mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入66.0mg(0.32mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP 18.9mg(0.15mmol)，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯176.7mg(0.22mmol)溶於3ml TFA中，在0℃攪拌4小時，蒸除TFA，用無水乙醚沉澱出產物的TFA鹽，用50ml無水DCM中溶解後，於0℃加TEA調pH至7，用200ml DCM稀釋反應體系，加入BOP-Cl 112.0mg(0.44mmol)，25-29℃反應5天，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 10∶1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯；VI取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯25.2mg(0.04mmol)溶於5ml無水MeOH中，加入5mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護環五肽。BMNBA 12mg(0.044mmol)與HOBt 7.0mg(0.051mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入9.5mg(0.046mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應15分鐘後，室溫避光反應一小時，將反應混合液轉入脫保護環五肽中，室溫避光反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯；VII取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-N甲基纈氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯15mg(0.02mmol)溶於6ml無水MeOH中，加入15mg 10％Pd/C，避光氫化2小時後過濾，濾液加至等體積的含有20mg(0.06mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩衝液中，空氣中攪拌反應20分鐘，用水稀釋反應體系，EtOAc萃取產物，產物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到紅色固體[D-MeVal2]2AMD，[α]D20＝-244°(c0.5，MeOH)；1H NMR6.35(1H，d，8-H)，6.20(1H，d，7-H)，2.95(6H，d，N-CH3)，2.85(6H，d，N-CH3)，2.62(6H，d，N-CH3)，2.54(3H，s，6-CH3)，2.30(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，m，Thr-CH3)，0.64-0.92(24H，m，Val-CH3)；高分辨質譜(ESI-MS)m/z1283.6665(MH+)，C64H91N12O16，計算值1283.6676。
實施例4[D-MePhe2]2AMD的合成本實施例中反應步驟I和合成過程與實施例1相同；II取化合物N-苄氧羰基-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯1.01g(2.69mmol)溶於20ml無水MeOH中，加入100mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮，向殘渣中加入Z-D-MePhe1.17g(3.73mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入0.77g(3.73mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應2小時後，室溫反應過夜，過濾掉反應生成的DCU，濃縮濾液，殘渣溶於EtOAc，依次用10％檸檬酸水溶液，10％NaHCO3溶液，飽和NaCl洗滌，並用無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色固體產物N-苄氧羰基-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；III取化合物N-苄氧羰基-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯932.3mg(1.74mmol)溶於30ml無水MeOH中，加入70mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護三肽。Z-Thr 658.9mg(2.60mmol)與HOBt 351.6mg(2.60mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入536.5mg(2.60mmol)DCC的DCM溶液，-10℃反應15分鐘後，室溫反應一小時，將反應混合液轉入脫保護三肽中，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；IV取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯636.7mg(1.00mmol)與Boc-L-MeVal 343.5mg(1.49mmol)，用乾燥的DCM溶解並冷卻到-10℃，加入306.3mg(1.48mmol)DCC的DCM溶液，以及DMAP72.6mg，(0.60mmol)，室溫反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶PE 2∶1)，得到白色粉末N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯；V取化合物N-叔丁氧羰基-N甲基纈氨醯-N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨酸叔丁酯151.2mg(0.18mmol)溶於2ml TFA中，在0℃攪拌4小時，蒸除TFA，用無水乙醚沉澱出產物的TFA鹽，用30ml無水DCM中溶解後，於0℃加TEA調pH至7，用200ml DCM稀釋反應體系，加入BOP-Cl 67.9mg(0.27mmol)，25-29℃反應5天，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 10∶1)，得到白色粉末N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯；VI取化合物N-苄氧羰基-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯80.3mg(0.12mmol)溶於10ml無水MeOH中，加入10mg 10％Pd/C，氫化2小時後過濾，濃縮得到脫保護環五肽。BMNBA 51.0mg，(0.18mmol)與HOBt 24.0mg(0.18mmol)溶於DCM中，並加入少量DMF至HOBt溶解，將反應液冷卻到-10℃，加入36.7mg(0.18mmol)DCC的DCM溶液，-10℃避光反應15分鐘後，室溫避光反應一小時，將反應混合液轉入脫保護環五肽中，室溫避光反應過夜，後處理過程同上，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 12∶1)，得到白色粉末3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯；VII取化合物3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲醯-蘇氨醯-D-N甲基苯丙氨醯-脯氨醯-N甲基甘氨醯-N甲基纈氨醯內酯46.2mg(0.057mmol)溶於8ml無水MeOH中，加入20mg 10％Pd/C，避光氫化2小時後過濾，濾液加至等體積的含有54.5mg(0.17mmol)K3Fe(CN)6的pH7.12的0.067M磷酸緩衝液中，空氣中攪拌反應20分鐘，用水稀釋反應體系，EtOAc萃取產物，產物用飽和NaHCO3水溶液洗滌三次，10％鹽酸洗滌三次，飽和NaCl洗滌，無水Na2SO4乾燥。過濾，減壓蒸除溶劑，粗產物經矽膠柱層析(EtOAc∶MeOH 5∶1)，得到紅色固體[D-MePhe2]2AMD，1H NMR7.54(1H，d，8-H)，7.72(1H，d，7-H)，7.26(10H，s，Phe-ArH)，3.09(6H，d，N-CH3)，3.00(6H，d，N-CH3)，2.80(6H，d，N-CH3)，2.56(3H，s，6-CH3)，2.27(3H，s，4-CH3)，1.25(6H，d，Thr-CH3)，0.88-0.99(12H，m，Val-CH3)；質譜(ESI-MS)m/z1379.6549(MH+)，C72H91N12O16，計算值1379.6676。
本發明的其他類似物的全合成過程與以上實施例相同並能得到類似的結果。
權利要求
1.如下式的放線菌素D的類似物， 其特徵是環五肽上的2位胺基酸Aa2為D型苯丙氨酸，或者為D型N甲基纈氨酸，或者為D型N甲基苯丙氨酸，而5位胺基酸Aa5為N甲基胺基酸。
2.根據權利要求1所述的放線菌D的類似物，其特徵在於環五肽上的2位胺基酸Aa2為D型苯丙氨酸(D-Phe)，而5位胺基酸Aa5可以是D型N甲基纈氨酸(D-MeVal)，或者是D型N甲基苯丙氨酸(D-MePhe)，或者是L型N甲基苯丙氨酸(L-MePhe)，或者是D型N甲基亮氨酸(D-MeLeu)，或者是L型N甲基亮氨酸(L-MeLeu)，或者是D型N甲基丙氨酸(D-MeAla)，或者是L型N甲基丙氨酸(L-MeAla)，或者是L型N甲基絲氨酸(L-MeSer)，或者是L型N甲基酪氨酸(L-MeTyr)。
3.根據權利要求1所述的放線菌D的類似物，其特徵在於環五肽上的2位的胺基酸Aa2為D-MeVal，而5位胺基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
4.根據權利要求1所述的放線菌D的類似物，其特徵在於環五肽上的2位的胺基酸Aa2是D-MePhe，5位的胺基酸Aa5可以是L-MeVal，或者是D-MeVal，或者是D-MePhe，或者是L-MePhe，或者是D-MeLeu，或者是L-MeLeu，或者是D-MeAla，或者是L-MeAla，或者是L-MeSer，或者是L-MeTyr。
5.放線菌素D的類似物的製備方法，其特徵是將化合物N-苄氧羰基-N-甲基甘氨酸叔丁酯溶於甲醇中，用10％鈀碳催化氫化，脫去Z保護基後，與N-苄氧羰基-脯氨酸(Z-Pro)通過DCC縮合得到二肽，再經過催化氫化脫去Z保護基後，與2位胺基酸Aa2通過DCC縮合得到三肽，再經過催化氫化脫去Z保護基後與N-苄氧羰基-蘇氨酸(Z-Thr)用DCC/HOBt活化酯法縮合得到四肽；再將四肽與Aa5用DCC縮合，並用DMAP催化反應得到線性五肽，再用三氟乙酸脫除五肽N端BOC和C端OtBu保護後，用三乙胺將體系調為中性，用BOP-Cl作為縮合劑在二氯甲烷(DCM)中反應得到環五肽，再經催化氫化脫除Z-Thr的Z保護基後，用DCC/HOBt活化酯法與3-苄氧基-4-甲基-2-硝基-苯甲酸(BMNBA)縮合，產物再經催化氫化後，在磷酸緩衝液中用K3Fe(CN)6氧化得到終產物。
6.根據權利要求5所述的放線菌D的類似物的製備方法，其特徵在於生成環五肽的反應中所採用二氯甲烷與溶質的比例為0.8～1毫升∶1毫克，反應溫度保持在25-29℃。
全文摘要
本發明涉及一類新的化合物，具體講是一類放線菌素D的類似物，以及這類化合物的製備方法。本發明的化合物參見前式。
文檔編號C07K7/64GK1563080SQ20041002609
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月20日 優先權日2004年4月20日
發明者王銳, 張邦治, 倪京滿 申請人:蘭州大學