酶引發的自由基聚合反應及檢測應用的製作方法

2023-12-05 05:01:41 1

本發明利用酶引發自由基聚合反應來實現檢測信號的放大，屬於生物檢測、螢光檢測領域。
背景技術：
：：螢光傳感因為靈敏度高、樣品用量少，在化學、生物檢測及臨床醫學診斷方面應用非常廣泛。螢光傳感離不開螢光探針的設計與合成，螢光探針可以與樣本中的目標分子結合或發生化學反應，從而使探針分子的螢光發生改變，再通過儀器或肉眼觀察即可判斷樣本中目標分子的含量。為了提高螢光信號的強度，一般將酶反應或者催化劑引入到檢測體系中，使螢光信號放大，從而提高檢測的靈敏度。酶聯免疫法，包括酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)在分析化學領域中應用廣泛，已經成為抗體抗原檢測的主要方法之一。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。其檢測原理和過程為：首先使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性；其次使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性；在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，故有信號放大的效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。核酸擴增是核酸聚合酶催化的特殊聚合反應，在檢測信號放大中應用廣泛。根據核酸擴增反應中溫度變化要求，可以將核酸擴增技術分為兩大類：一類是聚合酶鏈式反應（pcr）技術，另一類是核酸恆溫擴增技術。無論是pcr技術還是恆溫擴增技術，它們信號放大的本質都是擴增特定序列的dna片段，能將微量的dna數量級倍擴增，從而大大提高檢測靈敏度。一個pcr反應需要以下幾種物質的參與：模板序列，引物序列，dna聚合酶，核苷酸單體。模板序列為需要被放大的dna序列，含量很少，其他三種物質都是足量的。在一輪擴增反應中，引物與模板結合後在聚合酶催化下，與核苷酸單體發生聚合反應，形成新的dna鏈可以做為下一輪擴增反應的模板，因而每一輪擴增之後，模板數量翻倍，十幾輪擴增後模板dna數量增加了幾千上萬倍，結合雙鏈dna染料後螢光顯著增加。核酸等溫擴增技術是在pcr技術基礎上發展的核酸擴增技術，如鏈替代等溫擴增、滾環擴增及環介導等溫擴增等，這些擴增技術同樣用到模版序列和dna聚合酶，及核苷酸單體等，恆溫擴增技術在實際操作和儀器要求方面比pcr技術更為簡單方便，近些年在核酸檢測領域也有許多發展和應用（參考文獻：chem.rev.2015,115,12491−12545；j.am.chem.soc.2004,126,7430-743等）。正因為pcr等核酸擴增技術的序列特異性及擴增的高效性，這些技術可以用於非常微量的核酸序列檢測，已經在醫學臨床診斷和刑事偵查鑑定中有，例如傳染病病原體的確認、親子鑑定等。近些年結合核酸適配體技術，pcr等核酸擴增技術不僅用於序列特異性的檢測，還用於各種適配體靶標的檢測（如蛋白質、小分子、金屬離子等）。一種具體的實施方式為：適配體與靶標分子結合之後，核酸二級結構發生變化，釋放了核酸擴增的模板，使pcr等核酸擴增反應得以進行（參考中國專利：申請號：2004800276961、2008100276529、2013106651410、2012105913322等）。然而，pcr等核酸擴增技術也存在各種問題，核酸擴增技術的序列特異性不是絕對的，樣品易汙染，不同的核酸序列存在擴增差異，還存在非特異性擴增、脫靶效應等，因而會造成假陽性的結果。在臨床檢測中，為了避免樣本的汙染，國內外法律嚴格規定pcr反應需要由四個無菌實驗室進行。其中我國《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》明確規定：原則上臨床基因擴增檢驗實驗室應當設置以下區域：試劑儲存和準備區、標本製備區、擴增區、擴增產物分析區。這使得pcr檢測的成本及操作的複雜性大大增加。此外基於核酸擴增技術對引物設計，聚合酶和核苷酸單體（dntp）等試劑的要求較高，也提高了檢測價格。為了簡化操作、降低成本，急發展需其他的信號放大方式來彌補pcr等核酸擴增反應的不足。無論是核酸擴增還是酶聯免疫法，都是將酶等催化劑引入檢測體系。因而發展新型的催化劑並將其引入檢測體系中，就有望獲得新的信號放大方式。fenton反應由法國科學家fenton發現，主要反應過程是過氧化氫被亞鐵或鐵離子催化分解生成羥基自由基（參考文獻：環境化學，2006，25，《fenton及photo-fenton反應研究進展》）。後來的研究發現：許多其它金屬離子也能夠催化該反應，如cr、mn、fe、co、ni、cu、mo等金屬元素的離子，並且，當一些金屬離子與有機配體結合形成配合物之後（包括金屬卟啉、金屬酞菁、金屬希夫鹼等配合物），催化活性可顯著提高。最近幾十年的研究表明，上述一些金屬配合物與蛋白質或者核酸等生物分子結合之後，催化活性又有顯著提高。一個典型的例子是過氧化物酶，過氧化物酶種類繁多，以辣根過氧化物酶的研究應用最為廣泛。辣根過氧化物酶（hrp，ec.1.11.1.7）是一種來源廣泛的植物過氧化物酶，該酶由多肽鏈包裹血紅素構成，它可以在非常溫和的條件（常溫常壓和中性ph）下高效催化過氧化氫生成羥基自由基。另外一個提高金屬配合物過氧化物酶活性的方法是將配合物與核酸鏈結合。許多文獻報導血紅素可以與g四鏈體結構的dna形成特異結合，並且該複合物具有過氧化物酶活性（參考文獻chem.biol.1998,5,505-517；chem.biol.1999,6,779-787），在一定條件下可以產生自由基（參考文獻：j.am.chem.soc.2001,123,1337-1348），進而可以通過自由基反應使一些物質顏色改變或出現化學發光。此外能夠形成g四鏈體的dna在溶液中會存在兩種狀態：一種是無規則結構，不能結合血紅素等配合物；另一種是g四鏈體結構。這兩種結構可以在一定條件下相互轉換。利用這種性質可以設計出各種以g四鏈體為基礎的分子元件，並應用於核酸雜交的檢測以及適配體傳感器的構建（參考文獻：angew.chem.int.ed.engl.2008,47,3927-3931；j.am.chem.soc.2004,126,7430-7431；anal.chem.2009,81,2144-2149；chembiochem.2004,5,374-379；acc.chem.res.,2013,46，203–213；chem.rev.,2009,109,1948–1998；chem.rev.,2014,114,2881–2941）。無論是fenton反應（包括改進的fenton反應，以及金屬配合物催化的fenton反應），還是過氧化物酶催化反應，又或者是g四鏈體與血紅素的複合物的催化反應，催化速率雖然各不相同，但是這些過程都會產生高活性的羥基自由基，進而可以引發自由基反應，包括自由基聚合反應，因而這些反應或者催化劑廣泛應用於有機合成、聚合物合成、廢水處理、化學和生物學檢測等領域。其中fenton反應和辣根過氧化物酶在自由基聚合反應中有很多應用，可以引發烯烴、苯酚等物質的自由基聚合（參考文獻：polymer2000，41，8183-8192；polymer2013，54，1775-1778；macromolecules2015,48,7792−7802等）。相比之下，g四鏈體型的過氧化物酶還很少用於自由基聚合，只有少量文獻報導了g四鏈體-血紅素複合物可以催化聚苯胺的生成（參考文獻biosensorsandbioelectronics，2015，69，230–234；chem.sci.,2015,6,6659–6664；sensorsandactuatorsb，2014，190，384–388；acsnano,2013,7，1591–1598等）。自由基聚合是指烯炔類單體，通過自由基鏈式加成聚合形成聚合物的反應。由於許多單體能進行自由基聚合，能用水為介質進行懸浮和乳液聚合，聚合工藝操作簡便，其重現性好，因而自上世紀50年代以來已成為工業生產高分子產品的重要技術。自由基聚合的過程包括引發、鏈增長、鏈轉移、鏈終止等過程。由於存在鏈轉移和鏈終止反應，傳統自由基聚合不能較好地控制分子量及大分子結構。為此，人們發展了活性自由基聚合，（參考文獻：us．patent，6538091．2003；science，1996，1，769-776等），即向體系中加入一個與增長自由基之間存在著偶合-解離可逆反應的試劑，以抑制增長自由基濃度，減少雙基終止的發生。這種能夠與自由基發生可逆反應的試劑可以是自由基轉移劑、穩定自由基等。根據這種可逆反應的不同，人們分別發展了引發轉移終止劑（iniferter）法、穩定自由基聚合（stablefreeradicalpo1ymerization，sfrp）、氮氧自由基調控聚合（nitroxide-mediatedpo1ymeiization，nmp），可逆加成斷裂鏈轉移聚合（reversibleaddition-fragmentationchaintransfer，raft），原子轉移自由基聚合（atomtransferradicalpolymerization,atrp）等（參考文獻：高分子通報，2008，7，丘坤元《自由基聚合近20年的發展》）。2001年，唐本忠等人發現了聚集誘導發光（aie）現象：螢光分子在溶液狀態下螢光很弱甚至不發光，而在固態或者聚集態中發光。其原理是聚集態中的分子的旋轉受限導致非輻射弛豫受阻而使螢光增強。近十多年，人們發展了許多具有聚集誘導發光性能的螢光分子，並且這類分子已經廣泛應用於螢光探針的設計和螢光檢測成像（參考文獻chem.rev.2015,115,11718−11940；中國專利：cn104845607a、cn102219723a、cn104877665a、cn104004510a、cn103842472a、cn104326861a、cn104974745a、cn104447582a、cn103896825b、cn103788940b、cn101928559b、cn102702096b、cn101659865b等）。具有aie現象的分子的結構特徵是分子通過單鍵連接多個芳香環，大多包含苯乙烯單元，當分子以游離形式分散在溶液中時，分子內單鍵的旋轉導致激發態以非輻射方式弛豫到基態，而當分子聚集或者其它原因使分子內旋轉受阻時，導致非輻射弛豫渠道被抑制，輻射弛豫增強而發光。這類分子雖然大多是多芳環的共軛體系，但是由於空間位阻導致分子內的芳環不共平面，芳環之間存在較大的二面角，這種結構特點使其在聚集態中芳環不容易形成面對面的堆積，不會形成激基締合物或激基複合物，因而這類分子在聚集態中分子的螢光不容易被猝滅。用聚集誘導發光分子設計螢光探針的主要思路是：通過與靶標分子的結合使探針分子聚集，或者使探針分子的分子內旋轉受抑制，從而使螢光增強。在一些生物大分子（如核酸、蛋白質、肝素）的檢測中（參考文獻：chem.commun.2006,3705；chem.commun.2014,50,6494；acsappl.mater.inter.2014,6,18344），聚集誘導發光的探針可以通過氫鍵、靜電作用或疏水相互作用聚集到這些生物聚合物周圍，從而使螢光增強。然而，這些聚合物的單體並不能使聚集誘導發光的探針螢光增強。技術實現要素：本發明提供一種新型的螢光信號放大方法，不用dna聚合酶，不涉及核酸擴增反應，該方法適用範圍廣泛，可以用於離子、小分子、生物大分子的檢測，包括核酸序列的檢測、適配體靶標的檢測以及抗體抗原的檢測。為了實現上述目的，本發明利用過氧化物酶構建自由基引發體系，用於引發自由基聚合反應，並利用聚集誘導發光的螢光分子實現螢光信號放大。該信號放大體系的必要組成包括：過氧化物酶、螢光分子、單體分子。其中螢光分子和單體分子可以是一個整體，也可以是分開的兩類分子。該體系特徵在於：在沒有酶底物的時候，螢光分子分散游離，螢光很弱；當有底物時，過氧化物酶可以催化底物形成自由基，進而引發單體分子的聚合反應，進而使螢光基團聚集或者分子運動受限制，並導致螢光增強。下面詳細介紹上述體系的各種組分。上述體系中，過氧化物酶選自蛋白質構成的過氧化物酶或核酸構成的過氧化物酶，使用不同的過氧化物酶，可以用來檢測不同的物質。其中蛋白質構成的過氧化物酶通過從生物中提取獲得，本發明的優選的過氧化物酶來源於植物中的過氧化物酶，其中優選的植物過氧化物酶為辣根過氧化物酶。上述體系中，若採用核酸構成的過氧化物酶，則該過氧化物酶的特徵在於：由配合物結合一條或多條核酸鏈構成。所用的核酸不論是一條還是多條，都可以形成g四鏈體結構，符合要求的核酸序列通式如下：序列1：g(g)mg(x1……y1)g(g)mg(x2……y2)g(g)mg(x3……y3)g(g)mg序列2：g(g)mg(x1……y1)g(g)mg(x2……y2)g(g)mg序列3：g(g)mg(x1……y1)g(g)mg序列4：g(g)mg上述通式中，子序列g(g)mg被子序列(x1……y1)、(x2……y2)、(x3……y3)隔開，其中子序列(x1……y1)、(x2……y2)、(x3……y3)各自獨立選自長度為1-20個鹼基的核酸序列，其中的每個鹼基各自獨立選自核酸鹼基a、t、g、c、u及其他可以形成氫鍵配對的修飾的鹼基和非天然鹼基，m選自0到10的整數。以上序列均具有形成g四鏈體的潛力，其中序列1隻需要一條就可以形成g四鏈體，序列2、3、4相互組合可以形成g四鏈體。在具體的實施方式中，可以根據檢測體系中適配體的序列或者待測核酸序列的特點，設計合適的g四鏈體序列和使用的核酸鏈數，以達到最佳的檢測效果。上述核酸構成的過氧化物酶中，所用的配合物可以與g四鏈體結合，這些配合物或配體結構不一，具體化合物可以參考本領域的文獻。根據配體結構不同，這些化合物大致可以分為四類：卟啉和類卟啉配合物、希夫鹼（salphen）和類希夫鹼配合物、三聯吡啶和類三聯吡啶配合物、其它配合物。卟啉和類卟啉配合物結構通式如下：或或或或或或。希夫鹼基和類希夫鹼類配合物結構通式如下：或或。三聯吡啶和類三聯吡啶配合物的結構通式如下：或。上述所有通式中，n選自0-3的整數；xa，xb，xc，xd各自獨立，選自n、c-r、si-r等；xe，xf各自獨立，選自o、nr、cr1r2等；ya，yb，yc各自獨立，選自n、c；r1，r2，……r9，r10，各自獨立，選自h、f、cl、br、i、cn、硝基、亞硝基、r、or、sr、nrarb、nrarbrc、醛基、羧基、酯基、醯胺、醯肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、r取代的烷基、芳香環及芳香環衍生物等；其中r，ra，rb，rc，各自獨立，選自h、f、cl、br、i、cn、硝基、亞硝基、飽和烷基、不飽和烷基、環烷基、含取代基的烷基、烷氧基、烷基取代的氨基、醛基、羧基、酯基、醯胺、醯肼、肟、胍、磺酸基、磷酸基、芳香環及芳香環衍生物等；a1，a2，a3，a4，a5各自獨立，選自芳香環及芳香環衍生物等；芳香環選自苯環、呋喃、吡咯、咪唑、噻唑、噁唑、三氮唑、萘環、吡啶、嘧啶、喹啉、異喹啉、喹喔啉、薁等，以及上述芳香環的稠環化合物；芳香環衍生物選自含有取代基的上述芳香環化合物，芳香環的取代基參考r1，r2，……r9，r10的描述；a6選自環狀有機化合物，如環烷烴、環己烷、氧雜六環、氮雜六環、以及含有取代基的上述環化合物；取代基參考前面對r1，r2，……r9，r10的描述；m選自任意的金屬離子。ma選自任意的金屬離子，優先選自能夠形成平面型配合物的金屬離子，如pt2+、ni2+。上述通式中，一些卟啉和類卟啉配合物配體的優選結構如下：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。希夫鹼基和類希夫鹼類配合物配體的優選結構如下：、、、。三聯吡啶和類三聯吡啶配合物配體的優選結構如下：、、、、、、、、、、。除了上述幾類配合物之外，還有很多配合物可以結合g四鏈體，見參考文獻：acc.chem.res.2014,47,3614−3631；coordinationchemistryreviews2013，257，1764–1776；spectrochimicaactaparta，2014，132，84–90等。這些配合物及與其結構類似的配合物均可以結合g四鏈體，它們與g四鏈體形成的複合物均是潛在的自由基反應的引發劑。上述幾類配體可以與金屬離子配位形成相應的配合物，應用於本發明中。其中優選的金屬元素為：cr、mn、fe、co、ni、cu、mo、ru、rh、sn、ce等。上述配合物中的優選配合物有：、、，其中m選自：mn2+、fe2+、co2+、ni2+、cu2+、ru2+。其中血紅素結構為：。這些配體及配合物，有些通過化學合成獲得，有些可以從生物體中提取獲得，具體製備方法可以參考本領域已知的文獻。本發明所採用的配合物和配體不限於上述幾類化合物，凡是與g四鏈體具有較高結合常數的配體或配合物都可以應用於本發明中。這些g四鏈體與配合物的複合物與一些氧化劑聯用（氧化劑選自氧氣、過氧化氫、過氧化物、過硫酸鹽等）可以作為引發劑引發烯烴、炔烴、環氧丙烷、環氧乙烷、苯酚、苯胺等物質的自由基聚合反應以及巰基-烯炔點擊反應。除了應用於螢光信號放大之外，這類複合物還可以應用於有機合成或者高分子合成領域，其反應條件溫和，適合於一些水溶性單體的自由基聚合，而且作為引發劑的核酸成分，毒性小，對環境不產生汙染，相對於傳統的自由基引發劑，具有明顯的環保優勢。該信號放大體系使用一種自由基聚合反應就可以達到目的。為了使聚合反應能夠發生，該信號放大體系使用的單體需要含有能夠發生自由基反應的官能團。符合該要求的反應官能團有烯、炔、呋喃、苯胺、苯酚、巰基、環烷、含雜原子的環烷等。它們的結構通式如下：、、、、、、其中表示連接有取代基；x選自、、、；j選自、、、、、、。除巰基之外，其它任意一種官能團均可以發生自由基聚合反應，其中一些反應通式如下：，，，，，，上述官能團相互組合還可以發生共聚反應，不一一列舉。巰基在自由基引發條件下，可以與烯、炔發生下面的反應：，，。在一個單體中，反應官能團的個數可以不止一個，反應官能團的種類可以不止一種。單體中反應官能團的種類和個數不同，聚合反應可以是一種或者多種官能團的聚合反應，聚合產物可以是鏈狀、網狀、樹枝狀。當含有巰基的單體中還含有烯或者炔官能團時，該單體也可以通過均聚反應生成聚合物，其反應式可表示如下：；當單體含有多個巰基時，該單體可以與烯烴、炔烴單體通過共聚反應生成聚合物，其反應式可表示如下：；如果單體中只含有一個巰基，則多烯烴、多炔烴的化合物可以與很多這樣的單體反應，形成低聚物，其反應式可表示如下：。上述類型的反應均可以應用在本螢光信號放大體系中。聚合反應的產物可以為鏈式，也可以為樹枝狀聚合物，也可以為網狀聚合物。聚合反應的產物不一定是高分子，也可以是寡聚物、低分子量聚合物、樹枝狀分子，只要產物能夠達到使螢光分子螢光增強的效果即可。形成的聚合物可以通過非共價的分子間相互作用進一步形成超分子聚合物，從而誘導更多螢光分子螢光增強。為了使單體分子能夠在水溶液中發生聚合，所採用的單體應該有一定的水溶性。增強水溶性的方式就是在分子上修飾親水性的官能團，如羥基、氨基、胺、銨、鏻、烷氧鏈、羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯、烷基硼基、苯基硼等。該信號放大體系使用的螢光分子的結構特徵是分子通過單鍵連接多個芳香環，大多包含苯乙烯單元。這種分子的結構特點使得這類分子大多具有聚集誘導發光性質，即當分子以游離形式分散在溶液中時，分子內單鍵的旋轉導致激發態以非輻射方式弛豫到基態，而當分子聚集或者其它原因使分子內旋轉受阻時，導致非輻射弛豫渠道被抑制，輻射弛豫增強而發光。這類分子雖然大多是多芳環的共軛體系，但是由於空間位阻導致分子內的芳環不共平面，芳環之間存在較大的二面角，這種結構特點使其在聚集態中芳環不容易形成面對面的堆積，不會形成激基締合物或激基複合物，因而這類分子在聚集態中分子的螢光不容易被猝滅。螢光基團優先選自以苯乙烯為子單元的螢光基團，以及它們的衍生物，這類螢光基團種類繁多，可參考聚集誘導發光領域的已知文獻選擇合適的單元並設計、合成分子。其中一些優選的結構單元如下：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。從這些單元衍生出的螢光分子，有的具有較好的水溶性，可以直接用於該信號放大體系，而有的需要在其結構基礎上進行簡單修飾或功能化，增強水溶性，以避免螢光分子在水溶液中發生自聚集而螢光增強。一個螢光分子中所含螢光單元的種類不限於一種，螢光單元的個數也不限於一個，可以根據實際需要合理設計。這些聚集誘導發光的分子溶解在溶液中，發光較弱甚至不發光。為了使這種聚集誘導發光的螢光分子能夠在聚合反應之後聚集而螢光增強，本發明採用兩大類方式來實現：第一類方式中，螢光分子不參與聚合反應，聚合反應後生成的聚合物的主鏈或者側鏈含有具有結合功能的基團，這些具有結合功能的基團可以通過疏水作用、π-π作用、靜電作用、配位作用、氫鍵作用、可逆共價鍵結合螢光分子使其聚集在聚合物周圍而螢光增強；第二類方式中，螢光分子參與聚合反應，聚合反應後，螢光分子通過共價鍵連接而聚集到一起，進而使螢光基團的分子運動受限制而螢光增強。下面分別論述兩類方式的反應單體和螢光分子的設計。第一類方式中，為了使螢光分子可以結合聚合物，聚合反應後生成的聚合物的主鏈或者側鏈含有具有結合功能的基團，螢光分子也需含有具有結合功能的基團，以便結合到聚合物上。這些具有結合功能的基團不一定在聚合反應之前就存在，它們可以存在於聚合反應前的單體和螢光分子上，或者在聚合反應之後生成。這些具有結合功能的基團有羧基、磺酸基、磷酸基、磷酸酯基、連有芳香環的羥基、羥基、硼酸基、芳香環取代的硼酸基、氨基、胺基、含取代基的胺基、亞胺基、肟基、胍基、含取代基的胍基、膦基、含氮雜環的季銨鹽、含金屬的配合物基、含芳香環的基團、容易形成氫鍵的基團、巰基等。這些基團大致可以分為以下幾類：陰離子類、陽離子類、配合物類、其它結合基團。現列舉一些上述具有結合功能的基團如下：陰離子類：、、、、、、；其中，表示此處可以連接其他取代基團，如h、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根據具體情況選擇合適的取代基；其中一些優選結構如下：、、、、、、。陽離子類：、、；其中，表示此處可以連接其他取代基團，如h、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根據具體情況選擇合適的取代基；其中一些優選結構如下：、、、、、、、。配合物類：、；其中，表示此處可以連接其他取代基團，如h、烷基、苯、烷氧基、含取代基的烷基、含取代基的苯等，可以根據具體情況選擇合適的取代基；其中一些優選結構如：、、、。上述基團中，陰離子類和陽離子類基團可以通過靜電作用、氫鍵作用結合到一起，幾種優選的結合方式如下：、、。陰離子類基團還可以通過配位作用結合配合物類基團，例如：、、。除上述幾類基團外，還有許多基團可以通過π-π作用、氫鍵等弱相互作用結合另外一些基團，也可以應用於本發明中，其中一些基團的結構如下：、、、、、、、、、、、、。它們通過π-π作用、氫鍵結合其它基團的方式如下：、、、、、、、。π-π作用、氫鍵是分子間的弱相互作用，能夠形成π-π作用或氫鍵的分子遠不止上述幾種，均可應用與本發明中。除了上述幾種結合方式，可逆共價鍵也可以用來構建聚合物與螢光分子的結合，這些具有結合功能的基團有：、、、、、等。現列舉一些優選結構表示可逆共價鍵的結合：，，，。根據上述幾種結合方式，選擇並設計相應的單體和螢光分子。聚合反應的單體或者螢光分子不一定含有具有結合功能的基團，只需要在聚合反應之後生成的聚合物和螢光分子含有上述一種具有結合功能的基團即可。如果單體和螢光分子含有具有結合功能的官能團，則單體分子和相應的螢光分子的的設計思路如下：由於核酸是帶負電荷的，為了避免聚合反應的產物幹擾核酸g四鏈體的形成，因而聚合物的單體分子除含反應官能團之外，其所含的具有結合功能的基團優先選擇電中性、兩親性或者陰離子型基團，相對的，螢光分子所含的具有結合功能的基團優先選擇電中性、兩親性或者陽離子型基團。無論單體分子還是螢光分子，都不限於只含有一種符合要求的具有結合功能的基團，也可以是多種基團的組合，並且可以含有重複的基團。除了含有具有結合功能的基團外，單體還含有符合聚合反應條件的官能團，具體要求參考前面對聚合反應條件的敘述。具有結合功能的基團和反應官能團相互組合，通過共價鍵連接或者有機單元橋連可以構建無數符合要求的單體分子，均可以應用於本發明中。這類單體結構通式為：其中，rg為反應官能團，bg為具有結合功能的基團，l為連接基團，x、z為非0的整數，y為0-20的整數。該通式表示一個分子中連接有x個反應官能團和z個具有結合功能的基團。即使x和z為1，y為0，反應官能團和具有結合功能的基團的排列組合仍然太多，不一一列舉，只列出少數優選的單體分子結構如下，這些結構並不限制本發明的保護範圍，單體分子的優選結構有：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。除了含有具有結合功能的基團外，螢光分子還含有具有聚集誘導發光的螢光單元，具體要求參考前面的敘述。具有結合功能的基團和螢光基團相互組合，通過共價鍵連接或者有機單元橋連可以構建無數符合要求的螢光分子，均可以應用於本發明中。這類螢光分子結構通式為：其中，f為螢光單元，bg為具有結合功能的基團，l為連接基團，x、z為非0的整數，y為0-20的整數。該通式表示一個分子中連接有x個螢光單元和z個具有結合功能的基團。即使x和z為1，y為0，螢光單元和具有結合功能的基團的排列組合仍然太多，不一一列舉，只列出少數優選的螢光分子結構如下，這些結構並不限制本發明的保護範圍，螢光分子的優選結構有：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。參考前面對結合方式的敘述，可以選出一些優選的單體和螢光分子的組合來構建聚合誘導的螢光增強體系。例如：丙烯酸是常用的化工原料，以丙烯酸為單體，聚合反應生成聚丙烯酸，是陰離子型聚合物，可以誘導陽離子型的螢光分子的聚集，使其螢光增強。這類方式中，既可以採用均聚反應，也可以採用共聚反應，即使用的單體不限於一種，而且不需要每一種單體都符合上述要求。聚合反應的聚合物能夠使螢光分子聚集的必要條件是：不需要每個單體都含有具有結合功能的基團，只要其中一種單體含有具有結合功能的基團，可以結合螢光分子，該基團不參與聚合反應，即在聚合反應前後不改變。這樣，聚合反應前，單體與螢光分子結合分散游離在溶液中，不發光或者發光弱，聚合後，聚合物可以結合多個螢光分子而使螢光分子聚合，並使發光增強。如果單體或者螢光分子不含有具有結合功能的官能團，則單體和螢光分子的設計思路如下：單體或者螢光分子含有特定的官能團，在聚合反應過程中，這些特定的官能團可以順便發生化學反應，如水解、取代、開環、氧化還原等反應，並生成具有結合功能的官能團。例如聚合反應：，上述聚合反應中，首先是兩個單體發生共聚反應，在形成聚合物中，由於鄰基效應的存在，分子內的取代反應速率遠遠大於分子間的反應，因而側鏈的官能團進一步反應環化，使最終的產物帶上了磺酸基，即整個聚合物帶負電荷，相對於單體，能夠結合帶正電荷的螢光分子。類似的，又例如聚合反應：，上述聚合反應中，首先是兩個單體發生共聚反應，在形成聚合物中，由於鄰基效應的存在，分子內的取代反應速率遠遠大於分子間的反應，因而側鏈的官能團進一步反應環化，使最終的產物帶上了正電荷，相對於沒有電荷的單體，聚合物能夠結合帶負電荷的螢光分子。在一些結合方式中，需要多個官能團的協同參與，如果將這些官能團分布於兩個單體上，那麼單個單體分子由於缺乏協同作用，難以形成有效結合，而形成聚合物之後，多個側鏈的官能團協同作用就可以形成穩定的結合。例如下列聚合反應：上述單體分子也可以結合含多硼酸基的螢光分子，但是穩定性不夠，容易解離，而形成聚合物後，相鄰單體的殘基可以協同結合一個螢光分子，結合穩定性顯著提高。再例如下列聚合反應：上述反應中有兩種單體分子，雖然每種單體都可以以各自的方式結合螢光分子，但是穩定性不夠，容易解離，而形成聚合物後，相鄰單體的殘基可以協同結合一個螢光分子，結合穩定性顯著提高。以上聚合反應或分子結構並不作為本發明的限定，凡是具有類似特點的單體或者聚合反應都可以應用與本發明中。這類方式中，既可以採用均聚反應，也可以採用共聚反應，即使用的單體不限於一種，聚合反應的聚合物能夠使螢光分子聚集的必要條件是：其中一種單體或者螢光分子在聚合反應之後能夠生成具有結合功能的基團，可以結合螢光分子。這樣，聚合反應前，螢光分子分散游離在溶液中，不發光或者發光弱，聚合後，聚合物和螢光分子上生成了具有結合功能的基團，因而聚合物可以結合多個螢光分子而使螢光分子聚集，並使發光增強。相比含有具有結合功能的基團的單體或者螢光分子，這種單體在聚合反應之前不會結合螢光分子，因而具有更低的背景螢光。無論是單體或者螢光分子，其所必要的官能團大多是已知的有機官能團，單體或者螢光分子的製備方法可以參考本領域的已知文獻進行合成或者製備。有許多符合要求的單體可以直接購買獲得，例如：丙烯酸、丙烯醯胺、丙烯酸酯等。下面論述第二類反應單體和螢光分子的設計。第二類方式中，螢光分子參與聚合反應，聚合反應後，螢光分子通過共價鍵連接而聚集到一起。因而這類螢光單體的設計思路是：將聚合反應官能團和螢光基團相互組合，通過共價鍵連接或者有機單元橋連可以構建無數符合要求的螢光單體分子，均可以應用於本發明中。反應官能團和螢光基團的設計參考前面的論述。該方式中既可以採用均聚反應，也可以採用共聚反應，即使用的單體不限於一種，而且不需要每一種單體都符合上述要求，即不需要每個單體都是螢光單體。聚合反應後螢光增強的必要條件是，至少有一種單體分子的結構中含有至少一個螢光基團。螢光基團可以選自方式一中採用的螢光基團，具體結構參考前面的論述。這種單體的結構通式為：其中，rg為反應官能團，f為螢光基團，l為連接基團，x、z為非0的整數，y為0-20的整數。該通式表示一個分子中連接有x個反應官能團和z個螢光基團。即使x和z為1，y為0，螢光單元和反應官能團的排列組合仍然太多，不一一列舉，只列出少數優選的螢光分子結構如下，這些結構並不限制本發明的保護範圍，一些優選的螢光單體分子結構：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、。上述螢光單體分子，有的可以發生均聚反應生成高分子，而有的不容易發生均聚反應，可以與其他單體共聚生成高分子，例如含呋喃的螢光單體分子可以與丙烯酸等缺電子烯烴發生共聚反應。這類方式中，為了降低螢光單體分子的自身螢光，可以連接一些缺電子的反應官能團，這類官能團有可能通過電子轉移作用猝滅分子的螢光，而加成聚合反應之後，這些官能團共軛結構被打斷，因而不再猝滅螢光，結合聚集誘導發光的作用，螢光顯著增強。以上內容已經說明了該螢光信號放大體系的必要組成，按照上述要求選擇或設計試劑可以構建自由基聚合反應的螢光信號放大體系。為了增強螢光放大的效果，還可以添加一些物質，這些物質根據具體情況添加，也可以不加。根據功能不同，這些物質有自由基引發劑、鏈轉移劑、穩定自由基、穩定自由基前體、螢光猝滅劑等。下面分別介紹這幾種物質：自由基引發劑：用於加速自由基引發過程。一些單體的聚合活性可能不高，單純靠g四鏈體與配合物的複合物難以引發，適當添加這類物質，這些物質通過與g四鏈體複合物發生氧化還原或者自由基轉移反應形成初期的自由基，用於引發自由基聚合。這類物質有偶氮化物、叔胺、過氧化物、過氧酸、過氧酸酯、過硫酸鹽等。這類物質種類繁多，可參考自由基聚合領域的相關文獻選擇或設計合適的物質用於本發明中。簡單列舉幾種分子，不作為本發明保護範圍的限制，結構如下：、、。鏈轉移劑：用於轉移活性自由基，抑制活性自由基的鏈終止反應，增加單體反應的轉化率。這類物質有巰基化合物、β-二酮等。這類物質種類繁多，可參考自由基聚合領域的相關文獻選擇或設計合適的物質用於本發明中。簡單列舉幾種分子，不作為本發明保護範圍的限制，結構如下：、、。穩定自由基或穩定自由基前體：用於增加聚合度。這些物質或者這些物質形成的自由基可以與鏈增長的自由基發生可逆的鏈終止或加成消除反應，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合，提高聚合反應的聚合度。這類物質有胺氧自由基、烷氧胺、黃原酸酯、碘化物、碘等。其具體的反應原理，參考自由基聚合領域的文獻可知。這類物質種類繁多，可參考自由基聚合領域的相關文獻選擇或設計合適的物質用於本發明中。簡單列舉幾種分子，不作為本發明保護範圍的限制，結構如下：、、、、、、、、。螢光猝滅劑可以在聚合反應前與螢光分子形成非共價的超分子複合物，通過能量共振轉移或者電子轉移機理猝滅螢光分子的螢光，從而降低本底螢光；而聚合反應之後，螢光分子與聚合物結合力高於與單體的結合，或者螢光基團被包裹在聚合物中，使得猝滅劑與螢光分子解離，不再猝滅螢光。這類試劑的運用可以提高螢光增強倍數和檢測信噪比。這類物質種類繁多，可參考分子染料和螢光領域的相關文獻選擇或設計合適的物質用於本發明中。簡單列舉幾種分子，不作為本發明保護範圍的限制，結構如下：、、、、。其中有一些是常用的酸鹼指示劑，如甲基橙、酚酞、酚紅、鄰苯二酚紫等，可以直接從市面上購得。以上內容已經說明了該螢光信號放大體系的各種主要成分，下面詳細介紹上述信號放大方法的原理。若使用蛋白質構成的過氧化物酶，則該體系用於螢光檢測，主要包含兩個過程：一、過氧化物酶催化底物形成自由基，並引發自由基反應；二、自由基聚合的產物使聚集誘導發光的分子聚集而螢光增強。若使用核酸構成的過氧化物酶，則該體系用於螢光檢測，主要包含三個過程：一、靶標分子與核酸結合形成g四鏈體結構，並結合配合物，形成過氧化物酶；二、核酸構成的過氧化物酶引發自由基反應；三、自由基聚合的產物使聚集誘導發光的分子聚集而螢光增強。不管使用哪一種過氧化物酶，最後兩過程都類似。下面以核酸構成的過氧化物酶的體系為例，分別敘述每個過程的原理。第一過程的原理：選擇並設計合適的核酸鏈，當沒有檢測物存在時，核酸游離在溶液中自然捲曲，或者通過互補配對，形成一定的二級結構，但是不形成g四鏈體，因而就不能結合配合物，不會產生自由基；當有檢測物時，核酸與檢測物結合摺疊形成四鏈體結構，或者原先的二級結構解離，結合檢測物並形成g四鏈體結構，然後即可結合配合物。如果檢測物是一段核酸序列，則利用該核酸的互補序列設計檢測體系。作為檢測物的核酸可以與檢測體系中的核酸通過鹼基配對形成更加穩定的二級結構，這個新形成的二級結構與溶液中鉀離子進一步作用，並摺疊形成g四鏈體。如果檢測物不是核酸，是其它小分子、大分子、病毒或細胞，則利用該小分子、大分子、病毒或細胞的適配體序列設計檢測體系。體系中所使用的核酸含有適配體序列，該序列在沒有靶標存在的情況下自然捲曲，或者通過互補配對，形成一定的二級結構，但是不形成g四鏈體，當靶標即檢測物存在時，靶標結合適配體序列，形成新的二級結構，並摺疊形成g四鏈體。上述過程在核酸檢測和適配體傳感器的文獻中已經有詳細論述，根據這些文獻，可以選擇合適的策略設計相應的核酸序列。第二過程是本發明的關鍵過程。一些金屬配合物在一定條件下可以催化一些物質，如氧氣、雙氧水等過氧化物產生自由基，一些金屬配合物與g四鏈體結合後，可使上述催化速率提高很多倍，這些自由基可以引發其它的自由基反應，如巰基與烯炔的加成反應、烯烴或苯酚等化合物的自由基加成反應。為了增強自由基的引發速率，可以適當添加自由基引發劑、鏈轉移試劑、自由基穩定劑等。其作用是使g四鏈體複合物周圍的自由基更快傳遞到單體分子上。一旦反應被引發，就不再需要g四鏈體複合物的參與，在自由基聚合反應中，一個自由基可以與無數個單體加成反應形成聚合物，因而該過程是信號放大的關鍵過程。傳統基於g四鏈體-血紅素複合物的檢測中，每消耗一分子雙氧水，只產生一分子羥基自由基，只能使一分子的染料分子的顏色或發光等性質發生變化。而本發明中，g四鏈體複合物每消耗一分子雙氧水，雖然也只產生一分子羥基自由基，但是可以引發無數的單體聚合形成一條聚合物鏈，並誘導無數螢光分子的聚集，相比傳統基於g四鏈體複合物的檢測具有信號放大的效果，聚合度越大，則可以誘導聚集的螢光分子越多，信號放大效果越明顯，螢光信號也越強。由於增長的自由基鏈之間可以通過鏈終止反應而終止加成反應，所以聚合度不可能無限大。但是通過向體系中加入一些穩定自由基或穩定自由基前體，就可以利用引發轉移終止劑（iniferter）法、穩定自由基聚合（stablefreeradicalpo1ymerization，sfrp）、氮氧自由基調控聚合（nitroxide-mediatedpo1ymeiization，nmp），可逆加成斷裂鏈轉移聚合（reversibleaddition-fragmentationchaintransfer，raft），原子轉移自由基聚合（atomtransferradicalpolymerization,atrp）等方法降低自由基鏈的濃度，以抑制不可逆的鏈終止反應，達到增加聚合度的目的。這些方法都是自由基聚合領域常用的方法，具體原理和具體的試劑參考該領域的文獻即可選擇和設計。第三過程分兩類方式論述：第一類方式中，螢光分子不參與聚合反應，聚合反應形成的聚合物中含有單體的殘基，這些殘基通過分子相互作用結合螢光分子，一條聚合物含有多個殘基，因而可以結合多個螢光分子，由於聚集誘導發光的基團主要由芳環等疏水性官能團構成，因而這些螢光分子可以通過疏水作用發生進一步的聚集，從而限制分子單鍵的旋轉，使螢光增強。第二類方式中，螢光分子參與聚合反應，聚合產物中含有多個或許多螢光分子，這些聚合物中，螢光分子通過共價鍵連接在一起，相對於單體，其分子單鍵的旋轉受一定阻礙，而且這些聚合物還可以通過分子內的疏水作用發生摺疊，進一步限制單鍵旋轉，使螢光增強。除此之外，一些連接有強吸電子基的雙鍵可以猝滅螢光基團的螢光，而發生聚合反應之後，這些雙鍵轉變成單鍵，使螢光恢復。為了降低聚合反應前的背景螢光，可以添加螢光猝滅劑，其作用是與游離的螢光分子用過弱的分子相互作用結合，通過能量轉移猝滅螢光分子的自螢光。而聚合反應之後，螢光分子優先與聚合物結合，或者螢光分子被聚合物包裹，從而使猝滅基團遠離螢光分子，因而使螢光分子螢光恢復。經過上述三個過程，本發明的螢光信號放大體系可以實現對核酸序列的檢測和適配體靶標的檢測。由於適配體靶標範圍廣泛，可以是離子、小分子、蛋白質、病毒、細菌、細胞等，因而該方法可以檢測上述各種靶標，具有廣泛的適用性。在具體的檢測應用中，可以進行對照實驗以排除假陽性，對照實驗與檢測實驗的區別在於：對照實驗不含g四鏈體序列，其餘成分和條件與檢測實驗相同。相對傳統基於g四鏈體檢測的方法，該方法具有信號放大的作用，因而更高的靈敏度。本方法也可以在實驗室常用的螢光定量pcr儀上使用，即將各種需要的試劑配置成溶液放置於pcr管中，按照常規pcr過程操作pcr儀即可。在每一輪變性退火過程中，溫度的升高有利於自由基擴散，同時g四鏈體與配合物形成的複合物解離後又在降溫時重新複合，引發新一輪自由基聚合反應和螢光信號的增強，經過多輪循環，螢光信號隨之得到極大的放大，因而從pcr儀讀取螢光信號強度就可以獲得檢測物濃度。相對於pcr、滾環擴增等核酸擴增以放大信號的方法，本發明的方法不需要dna聚合酶、核苷酸單體等價格昂貴的試劑，所用的主要試劑都是有機小分子，可以大規模合成，有的是低廉的化工原料，如丙烯酸、丙烯醯胺等，不僅成本低，而且易於保存。由於本方法不涉及核酸擴增的過程，因而不存在核酸的非特異性擴增的問題，不會有新的核酸序列產生，因而在pcr儀器上使用時，每一輪變性退火都依靠原本的核酸序列引發自由基聚合，即具有更高的準確度。本發明的信號放大體系中，除了螢光變化之外，還會發生其他一些物理性質的變化，這些物理變化，也可以作為檢測依據。一些螢光分子在聚集前後也會發生紫外吸收的變化，例如有些分子如苯酚、苯胺類分子在聚合反應之後，共軛體系變大，在可見光區出現吸收，使顏色加深，因而通過肉眼觀察顏色的變化也可以判斷檢測物是否存在。依據該判斷方法，除了一些螢光分子外，一些非螢光的具有共軛結構的分子也可以用於本體系，例如螺吡喃類染料、偶氮類染料、三苯甲烷類染料等。參考染料領域的相關文獻可選擇並設計合適的分子。一些單體（如丙烯醯胺）在聚合之後形成大分子凝膠，使溶液成凝膠狀，流動性變差，通過肉眼即可判斷檢測物是否存在。該判斷方法不需要螢光分子的參與，只需要單體分子。為了使聚合產物容易形成凝膠，聚合產物所帶靜電荷應為零或接近於零。構建這類聚合物，可以由電中性，或兩親性的單體分子，進行均聚反應生成，也可以由陰離子型單體和陽離子型單體通過共聚反應生成。由於不需要螢光基團，因而這類單體分子的設計更簡單，選擇範圍更廣泛，在前面對單體的敘述中已經概括了這些單體的設計原理，參考前面的敘述即可。本發明的信號放大體系可以用於過氧化物酶底物的檢測，還可以與其他酶反應聯用，用於檢測酶或酶的底物。例如氧化酶在氧氣存在下可以催化底物生成過氧化氫。而過氧化氫可以在過氧化物酶或g四鏈體複合物存在下催化生成羥基自由基，並引發自由基聚合反應和螢光信號的放大。這些氧化酶有葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胺基酸氧化酶等，它們底物分別是葡萄糖、尿酸、胺基酸等。因而向本發明的體系加入這些酶，可以檢測它們各自的底物；或者向本發明的體系加入底物，可以檢測相應的酶及酶的活性。在上述基礎上，本發明的信號放大體系還可以結合酶聯免疫法，用於抗體或抗原的檢測信號放大。酶聯免疫法的關鍵是利用酶標記的抗原或者抗體催化底物來實現信號放大，其中常用的標記酶為氧化酶和辣根過氧化物酶。針對不同酶標記的酶聯免疫法，本發明可以有不同的聯用方法。聯用方法一：若酶聯免疫法使用氧化酶標記的抗體或抗原，則在檢測過程中或者檢測的最後一步加入本發明前面所述的體系中除過氧化氫之外的物質即可，包括過氧化物酶、單體分子、螢光分子等。該聯用方法所需的材料為：酶聯免疫法的所有試劑，以及本發明前面所述的體系中除過氧化氫之外的組分。聯用檢測過程為：在酶聯免疫法中的氧化酶催化底物產生過氧化氫之後，本發明體系的過氧化物酶接著催化過氧化氫產生自由基，之後是自由基引發單體分子的聚合反應，進而通過溶液粘度、顏色變化或螢光增強判斷抗體、抗原等物質的存在。聯用方法二：若酶聯免疫法使用過氧化物酶標記的抗體或抗原，則在檢測過程中或者檢測的最後一步加入本發明前面所述的體系中除過氧化物酶之外的物質即可，包括過氧化氫、單體分子、螢光分子等。該聯用方法所需的材料為：酶聯免疫法的所有試劑，及本發明前面所述的體系中除過氧化物酶之外的組分。聯用檢測過程為：在酶聯免疫法中的過氧化物酶催化過氧化氫產生羥基自由基之後，羥基自由基接著引發本發明體系的單體分子的聚合反應，進而通過溶液粘度、顏色變化或螢光增強判斷抗體、抗原等物質的存在。上述聯用方法中使用的過氧化物酶可以來源於酶聯免疫法常用的過氧化物酶，也可以使用核酸構成的過氧化物酶。其中核酸構成的過氧化物酶與抗體或抗原的連接方式可以是共價鍵，也可以是非共價鍵的特異結合方式。非共價鍵的特異結合方式主要有適配體靶標的結合，在這種結合方式中，構成過氧化物酶的核酸的序列特徵是：一條核酸鏈，包含g四鏈體序列和適配體序列，適配體為需要標記的抗體或抗原的適配體；適配體與抗體或抗原特異結合的同時，也使g四鏈體序列附著在抗體或抗原的表面，結合配合物後就具有了過氧化物酶活性。酶聯免疫法中應用較多的是酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)。elisa測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。具體原理和設計方法可以參考elisa檢測相關的文獻。與酶聯反應法一樣，本發明的信號放大體系也可以與elisa檢測聯用，聯用方法與前面一致，都是利用酶聯免疫檢測中產生的過氧化氫或自由基引發單體分子的聚合反應和螢光增強。本發明與elisa法聯用的一種方法是，使用親和素標記抗原或抗體，並使用生物素標記的g四鏈體核酸，還需要加入本發明所採用的配合物、單體分子、螢光分子、引發劑等，以引發聚合反應和螢光增強。使用該方法設計一種抗體的檢測，其過程和原理為：將這種抗體的抗原固定在固相薄膜上，再浸入待測溶液，該薄膜可以特異吸附待測溶液中的抗體，然後清洗薄膜，去除非特異吸附，再加入親和素標記的第二抗體，使之與吸附在薄膜上的第一抗體結合，然後清洗薄膜，去多餘的親和素標記的抗體，再加入生物素標記的g四鏈體核酸，生物素與親和素結合，使g四鏈體固定在薄膜上，然後清洗薄膜，去除多餘的g四鏈體，最後將薄膜浸入含有配合物、單體分子、螢光分子、引發劑等物質的溶液中。如果待測溶液含有抗體，則會引發單體分子的聚合和螢光的增強。如果將抗體固定於固相薄膜上，按上述類似的原理設計檢測試劑，就可以用於檢測抗原。本發明與elisa法聯用的另外一種方法是，使用氧化酶類標記抗原或抗體，除了酶相應的底物之外，還需要加入本發明所採用的單體分子和螢光分子等，以引發聚合反應和螢光增強。例如：使用該方法設計一種抗體的檢測，其過程和原理為：將這種抗體的抗原固定在固相薄膜上，再浸入待測溶液，該薄膜可以特異吸附待測溶液中的抗體，然後清洗薄膜，去除非特異吸附，再加入氧化酶標記的第二抗體，使之與吸附在薄膜上的第一抗體結合，然後清洗薄膜，去多餘的氧化酶標記的抗體，最後將薄膜浸入含有氧化酶底物的本發明體系的溶液中。如果待測溶液含有抗體，則會引發單體分子的聚合和螢光的增強。如果將抗體固定於固相薄膜上，按上述類似的原理設計檢測試劑，就可以用於檢測抗原。其中使用的氧化酶可以是葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胺基酸氧化酶等。本發明的螢光信號放大體系與酶聯免疫法的聯用方法不限於以上兩種方法，酶聯免疫檢測領域的文獻中所使用方法（包括雙抗體夾心法、雙位點一步法、間接法測抗體、競爭法等）都可以與本發明的體系聯用，並且用於相關物質的檢測。傳統elisa方法和其它酶聯免疫法的信號放大是基於酶催化底物反應的高效性，而上述改進的elisa方法是利用酶反應的自由基產物引發聚合反應，即酶反應和自由基聚合反應聯用，實現兩輪的信號放大，因而該方法具有更高的靈敏度。同時將檢測的底物範圍擴大到抗體抗原，具有更廣泛的適用性。本發明的信號放大體系還可以與核酸擴增反應聯用，實現信號的兩輪放大。以滾環擴增為例，與本發明聯用的過程和原理為：設計環狀核酸模板序列，其子序列含有g四鏈體的互補序列，將該環狀核酸、核苷酸單體和dna聚合酶代替g四鏈體核酸加入到本發明的體系中，除不含g四鏈體序列之外，體系中含有能夠與g四鏈體結合的配合物，還含有單體分子、螢光分子、引發劑等，具體試劑參考之前的敘述。該體系中，為了引發核酸擴增，還需要引物序列。如果將該體系用於核酸的檢測，則可以將靶標核酸序列作為引物序列，設計相應的環狀模版序列，當體系中存在靶標序列時，靶標序列與模版配對，然後dna聚合酶催化核酸擴增反應，擴增產物中含有許多g四鏈體序列的重複片段，因而該擴增產物與配合物結合形成多個g四鏈體複合物，進而引發單體分子的聚合和螢光分子的聚集螢光增強。如果將該體系用於核酸適配體靶標的檢測，則可以設計合適的引物序列和模版序列，其中引物序列包含適配體序列，序列特徵是3』端一段子序列可以與環模版配對。在沒有靶標分子時，引物序列通過自身鹼基配對形成一種二級結構，該結構中3』段子序列不被暴露，因而不能作為模版的引物，當靶標分子存在時，靶標分子與引物序列結合，形成另外一種二級結構，該結構中3』端子序列游離出來，因而可以與模版配對，並相繼引發核酸擴增、聚合反應、螢光增強。本發明的螢光信號放大體系與核酸擴增的聯用方法不限於以上兩種方法，核酸擴增領域的文獻中所使用核酸擴增方法都可以與本發明的體系聯用，並且用於相關的物質的檢測。本發明的信號放大體系還可以與酶聯免疫法和核酸擴增同時聯用，應用於相關物質的檢測。該聯用方法需要：酶聯免疫法中除了酶標記的抗體抗原之外的試劑和材料，還需要本發明體系中除過氧化物酶之外的組分，同時還包含適配體序列、模版序列，以及核酸聚合酶和核苷酸單體。聯用檢測過程中，靶標物質通過特異的結合方式（如抗體抗原結合或適配體-靶標結合等）富集到固相載體上，富集到固相上的靶標物質特異結合其適配體，之後含有適配體序列的核酸的3』末端可以與模版序列配對，在核酸聚合酶作用下發生核酸擴增，擴增的產物富含g四鏈體結構，結合配合物後可催化底物產生自由基，並引發單體分子的聚合反應，進而通過溶液粘度、顏色變化或螢光增強判斷物質的存在。本發明的螢光放大體系以及上述的各種改進方法都可以做成試紙或試劑盒應用於環境監測、醫學診斷等領域。附圖說明圖1為g四鏈體酶引發丙烯酸聚合的示意圖。圖2為凝血酶檢測的示意圖，101為dna序列，102為血紅素，103為凝血酶。圖3為dna檢測的示意圖，201為dna探針序列，202為靶標序列，203為配合物。圖4為dna配對的示意圖，301為dna探針序列1，302為dna探針序列2，303為靶標序列，304為血紅素。圖5為汞離子檢測示意圖，401為dna序列，402為汞離子，403為血紅素。圖6為蛋白質檢測示意圖，501為適配體序列，502為g四鏈體序列，503為靶標蛋白質，504為血紅素。圖7為elisa聯用法檢測蛋白質示意圖，601為固相薄膜，602為抗體，603為靶標蛋白，604為適配體序列，605為環模版，606為dna聚合酶，607為血紅素。具體實施方式為了說明本發明的原理以及其優勢，下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明，其目的在於幫助更好的理解本發明的內容，但這些具體實施方案不以任何方式限制本發明的保護範圍。在實際應用中，可以根據具體情況實施最合適的方案。實施實例1，g四鏈體過氧化物酶的構建及催化丙烯醯胺聚合反應。配置10mm的tris-hcl緩衝液，ph=7，含有的物質及濃度如下：kcl，100mm；血紅素，濃度0.02mm；乙醯丙酮，濃度0.01mm；丙烯醯胺2mm；g四鏈體序列的dna，序列：5』-gggtagggcgggttggg-3』（seqidno.1），濃度0.01mm。將上述溶液室溫攪拌1小時，仍是溶液狀。向上述混合液中加入過氧化氫0.02mm，即可引發聚合反應，反應時間1小時，溶液成凝膠狀。結果表明g四鏈體與血紅素可以催化烯的聚合反應。上述反應過程如下：g四鏈體序列與血紅素結合，形成的複合物具有過氧化物酶活性，可以催化過氧化氫生成羥基自由基；羥基自由基與乙醯丙酮反應生成乙醯丙酮自由基，反應如下：乙醯丙酮自由基引發丙烯醯胺聚合，反應如下：鏈引發：，鏈增長：，鏈終止：兩個自由基成鍵形成產物。根據上述反應原理，該體系可以檢測過氧化氫，判斷依據是溶液粘度是否增大，如果成凝膠狀，則通過肉眼即可判斷。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，dna序列可以用其它可形成g四鏈體的序列代替。上述體系中，乙醯丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替，如巰基化合物等。上述體系中，丙烯醯胺可以用其它單體代替，如各種丙烯酸或丙烯醯胺衍生物等。上述體系中，還可以加入黃原酸酯、碘化物等，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。例如鏈增長自由基可以與黃原酸酯發生如下可逆的加成消去反應：該反應可以降低鏈增長自由基濃度，因而抑制了鏈終止反應，並使鏈增長反應繼續進行，增加聚合度。該體系與葡萄糖氧化酶聯用，具體方法是，溶液中不加過氧化氫，加入葡萄糖氧化酶，其餘成分與之前的溶液相同，通過溶液粘度的變化可以檢測d-葡萄糖，而對其他糖類沒有響應。反之，溶液中不加過氧化氫，加入d-葡萄糖，可以檢測葡萄糖氧化酶活性。按上述類似的原理，該體系與尿酸氧化酶聯用，通過溶液粘度的變化可以檢測尿酸；與尿酸聯用，可以檢測尿酸氧化酶。按上述類似的原理，該體系可以檢測胺基酸氧化酶或其底物胺基酸，也可以用於其他能夠生成過氧化氫的酶的檢測以及其底物的檢測。實施實例2，基於聚丙烯酸的螢光信號放大體系。丙烯酸是常用的化工原料，廉價易得，並且相關的引發劑的研究也非常多，因而非常適合用於本發明的體系中。聚丙烯酸帶負電荷，可以誘導陽離子聚集在其周圍，因而可以設計陽離子型聚集誘導發光的分子用於實現螢光信號放大。配置20mm的磷酸鉀緩衝液，ph=8，含有：2-巰基乙醇，濃度0.005mm；丙烯酸0.5mm；g四鏈體序列的dna，序列：5』-gggtagggcgggttggg-3』（seqidno.1），濃度0.001mm；配合物，濃度0.002mm，配合物結構為：；螢光分子，0.01mm，所用螢光分子為：；黃原酸酯：0.002mm，；過氧化氫，0.005mm，加入過氧化氫後，混勻，反應1小時後，螢光增強。上述過程原理如下：g四鏈體序列與配合物結合，形成的複合物具有過氧化物酶活性，可以催化過氧化氫生成羥基自由基；羥基自由基與2-巰基乙醇反應生成巰基自由基，反應如下：巰基自由基引發丙烯酸聚合反應，鏈引發：鏈增長：鏈終止：兩個自由基成鍵形成產物。產物聚丙烯酸通過靜電作用結合許多螢光分子，使溶液螢光增強。上述全過程如附圖1所示。黃原酸酯的加入是為了增加反應的聚合度，其作用機理與實施實例1類似。為了降低體系的背景螢光，可以向體系中加入少量酚紅，濃度0至0.01mm。原理如下：酚紅在溶液中帶負電荷，與螢光分子可以通過靜電作用結合，通過能量轉移的機理猝滅螢光分子的螢光，當聚丙烯酸形成之後，由於聚丙烯酸所帶負電荷數量多，因而可以螢光分子優先與聚合物結合，並發生聚集，而受聚合物電荷排斥作用，酚紅不能結合聚合物，不再猝滅螢光。根據上述反應原理，該體系可以檢測過氧化氫，判斷依據是溶液螢光是否增強。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，配合物可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，dna序列可以用其它可形成g四鏈體的序列代替。上述體系中，巰基乙醇可以用β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替。上述體系中，丙烯酸可以用其它陰離子型單體代替，也可以達到類似的效果。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。上述體系中，黃原酸酯可以用碘化物等其他類似的試劑代替，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。該體系與葡萄糖氧化酶聯用，具體方法是，溶液中不加過氧化氫，加入葡萄糖氧化酶，其餘成分與之前的溶液相同，通過溶液粘度的變化可以檢測d-葡萄糖，而對其他糖類沒有響應。反之，溶液中不加過氧化氫，加入d-葡萄糖，可以檢測葡萄糖氧化酶活性。按上述類似的原理，該體系與尿酸氧化酶聯用，通過溶液粘度的變化可以檢測尿酸；與尿酸聯用，可以檢測尿酸氧化酶。按上述類似的原理，該體系可以檢測胺基酸氧化酶或其底物胺基酸，也可以用於其他能夠生成過氧化氫的酶的檢測以及其底物的檢測。實施實例3，烯烴類螢光單體應用於凝血酶的檢測。配置25mm的hepes緩衝液，ph=8，含有：kcl，1mm；血紅素，濃度0.001mm；乙醯丙酮，0.001mm；過氧化氫，0.001mm；g四鏈體序列的dna，序列：5』-ggttggtgtggttgg-3』（seqidno.2），濃度0.0005mm，該序列同時是凝血酶適配體序列；螢光單體，0.1mm，螢光單體為：。上述溶液可以用於凝血酶的檢測。加入凝血酶0.0005mm，混勻，20分鐘後，螢光增強十幾倍。檢測原理如附圖2所示：在沒有凝血酶103的時候，dna序列101難以形成穩定的g四鏈體，因而不能結合血紅素，當有凝血酶時，dna序列101與凝血酶103結合，形成穩定的g四鏈體結構，並結合血紅素102，進而可以催化過氧化氫生成羥基自由基，並引發螢光單體的自由基聚合反應，生成的聚合物中，側鏈的四苯乙烯分子通過疏水聚集使螢光增強。聚合反應方程式為：聚合反應機理與實施實例1類似。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，乙醯丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替，如巰基化合物等。上述體系中，還可以加入黃原酸酯、碘化物等，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。上述體系中，還可以加入丙烯醯胺單體，使聚合產物形成共聚物。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。上述體系中，螢光分子還可以不止含有一個反應官能團，例如以下分子：上述分子可以發生交聯聚合反應，形成網狀聚合物，因而相對於線性聚合物，分子內旋轉更加受限制，更利於螢光增強。上述各種分子都可以參考本領域已知的文獻使用已知的合成方法進行合成製備。實施實例4，巰基烯炔點擊反應應用於dna檢測。巰基烯炔點擊反應與烯烴聚合反應稍有不同，巰基在反應過程中起自由基轉移作用，因而極少量的自由基可以引發大量官能團的反應，直到巰基消耗完為止。配置25mm的hepes緩衝液，ph=7，含有：100mm的kcl；配合物，濃度0.001mm；巰基化合物單體，0.05mm；烯烴螢光單體，0.05mm；dna探針序列：5』-gggtagggcgggttgggagttagcacccaaccc-3』（seqidno.3），濃度0.0005mm。其中，配合物為酞菁錳，結構為；巰基化合物單體結構為：。螢光單體為：。上述溶液可以用於靶標dna檢測，靶標序列：5』-tgggtgctaact-3』（seqidno.4），與探針序列的子序列5』-agttagcaccca-3』完全互補配對。對照序列：5』-tgggtcctaact-3』（seqidno.5），為靶標序列的單個鹼基突變序列。設兩組溶液，第一組，加入靶標序列0.0005mm，混勻，20分鐘後，螢光增強十幾倍。第二組，加入對照序列0.0005mm，混勻，20分鐘後，螢光幾乎沒有增強。該實驗說明該方法可以用於特定序列的核酸檢測，並且可以區分單鹼基突變，具有較高的選擇性。檢測原理如附圖3所示：dna探針序列201的子序列5』-gggtagggcgggttggg-3』為g四鏈體序列，然而在沒有靶標序列的時候，dna探針序列201通過鹼基配對形成二級結構，不形成g四鏈體，因而不能結合配合物，當有靶標序列202時，dna與靶標序列通過鹼基配對形成另外一種二級結構，並使g四鏈體序列暴露出來，形成穩定的g四鏈體結構，並結合配合物203，進而可以催化巰基單體和烯烴單體的共聚反應。聚合反應產物之一為：除上述產物外，螢光單體雙鍵可能發生烯烴聚合反應，因而生成的聚合物中，螢光基團的分子運動受限制，使螢光顯著增強。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，配合物可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，按類似的原理，可以使用其它探針序列用於其他序列核酸的檢測，不僅可以檢測dna還可以檢測rna。上述體系中，巰基化合物可以用其它化合物代替，如：、等。上述體系中，聚合產物不一定需要形成高分子，也可以是寡聚物。例如：可以用以下兩個單體代替上述兩個單體，和，反應的主要產物為：該產物中有6個螢光基團，通過分子內的疏水聚集，也可以使螢光明顯增強。實施實例5，巰基烯炔點擊反應應用於dna檢測。配置25mm的hepes緩衝液，ph=7，含有：100mm的kcl；血紅素，濃度0.001m；過氧化氫，濃度0.0005mm；螢光單體，0.05mm；dna探針序列1：5』-atgactatctttaatgggtaggg-3』（seqidno.6），濃度0.001mm；dna探針序列2：5』-gggttgggcgtatggaaaatgag-3』（seqidno.7），濃度0.001mm。其中螢光單體分子為：。上述溶液可以用於靶標dna檢測，可檢測的靶標序列為：5』-ctcattttccatacattaaagatagtcat-3』（seqidno.8），其5』端子序列ctcattttccataca可以與探針序列2的3』端子序列cgtatggaaaatgag形成互補配對；其3』端子序列ttaaagatagtcat可以與探針序列1的5』端子序列atgactatctttaat形成互補配對。向溶液中加入靶標序列0.001mm，混勻，20分鐘後，螢光增強十幾倍。檢測原理如附圖4所示，說明如下：在沒有靶標序列303的時候，兩條探針序列301和302游離在溶液中，不形成g四鏈體，因而不能結合血紅素，當有靶標序列時，靶標序列同時與兩條探針序列部分互補配對，並使兩條探針序列的富g序列端游離出來，在鉀離子作用下，形成穩定的g四鏈體，並結合血紅素304，進而可以催化螢光單體的聚合反應。上述螢光單體即可能發生烯的聚合反應，又可能發生巰基與烯的加成反應，巰基與巰基之間還可能形成二硫鍵，因而產物為交聯聚合物。生成的聚合物中，螢光基團旋轉受限，因而螢光增強。聚合反應的可能產物有：上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，按類似的原理，可以使用其他探針序列用於其他序列核酸的檢測，不僅可以檢測dna還可以檢測rna。上述體系中，過氧化氫可以不加，也可以用其他過氧化物代替。上述體系中，螢光分子可以用其它分子代替，部分優選結構如下：這些分子可以發生交聯聚合反應，使螢光增強更加明顯。實施實例6，汞離子檢測。配置25mm的hepes緩衝液，ph=7，含有：1mm的kcl；血紅素，濃度0.001mm；乙醯丙酮，0.001mm；過氧化氫，0.001mm；單體分子，0.1mm；螢光分子，0.01mm；g四鏈體序列的dna，序列：5』-gttggaaggcggaaggttc-3』（seqidno.9），濃度0.0005mm。其中，單體分子為：；螢光分子為：。上述溶液可以用於汞離子的檢測，加入高氯酸汞0.001mm，混勻，20分鐘後，螢光增強十幾倍。檢測原理如附圖5所示：在沒有汞離子402的時候，dna序列401難以形成穩定的g四鏈體，因而不能結合血紅素403，溶液中單體的醇羥基雖然可以通過與螢光分子形成可逆的b-o鍵來結合螢光分子，但是該結合不夠穩定，所以螢光很弱。當有汞離子時，dna上的4個t鹼基可以結合2個汞離子，形成t-hg-t結構，因而dna可以形成穩定的g四鏈體結構，並結合血紅素403，進而可以催化過氧化氫生成羥基自由基，並引發單體的自由基聚合反應，生成的聚合物中，側鏈含有許多醇羥基，空間相鄰的4個羥基可協同結合一個螢光分子，因而螢光分子與聚合物的結合力，顯著大於與單體分子的結合力。結合到聚合物上的螢光分子通過疏水聚集而使螢光顯著增強。聚合產物與螢光分子的結合方式如：。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，乙醯丙酮可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替，如巰基化合物等。上述體系中，還可以加入黃原酸酯、碘化物等，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。上述體系中，還可以加入丙烯醯胺單體，使聚合產物形成共聚物。上述體系中，按類似的原理，dna序列可以用其它類似結構的序列代替。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。用在本例子中的一些優選分子有：、。實施實例7，苯酚類單體用於三磷酸腺苷的檢測。配置20mm的tris-hcl緩衝液，ph=7，含有血紅素，濃度0.002mm；乙醯丙酮，濃度0.001-0.002mm；過氧化氫，0.5mm；螢光單體分子，0.5mm；atp（三磷酸腺苷）適配體序列：5』-acctgggggagtattgcggaggaaggt-3』（seqidno.10），濃度0.001mm，該適配體序列可以形成g四鏈體結構。其中螢光分子為：。上述溶液可以用於三磷酸腺苷（atp）的檢測，加入0.001mm的atp，混勻，20分鐘後，螢光顯著增強。對照組，加入三磷酸鳥苷（gtp）等，沒有變化。檢測原理如下：在沒有atp的時候，dna序列難以形成穩定的g四鏈體，因而不能結合血紅素，當有atp時，dna與atp結合，形成穩定的g四鏈體結構，並結合血紅素，進而可以催化過氧化氫生成羥基自由基，並引發螢光單體的自由基聚合反應，聚合反應為：生成的聚合物為共軛聚合物，相對於單體，聚合物中的芳香環更加擁擠，分子旋轉受抑制，因而螢光顯著增強。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，乙醯丙酮可以不加，也可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替，如巰基化合物等。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。用在本例子中的一些優選分子有：。實施實例8，基於適配體的免疫球蛋白e的檢測。配製20mm磷酸緩衝液，ph=7，含有：kcl，100mm；血紅素，濃度0.001mm；乙醯丙酮，0.001mm；過氧化氫，0.001mm；螢光單體，0.1mm；適配體序列：5』-ggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgcccc-3』（seqidno.11），濃度0.0005mm，該適配體序列可以選擇性結合免疫球蛋白e；g四鏈體序列的dna，序列：5』-ggtaggagggacggataaac-3』（seqidno.12），濃度0.0005mm，該序列同時可以與適配體序列的部分互補配對。其中螢光單體為：或。上述溶液可以用於免疫球蛋白e的檢測。檢測原理如附圖6所示，檢測過程及原理如下：將待測樣本加入上述溶液中，如果樣本中不含免疫球蛋白e（503），則適配體序列501和g四鏈體序列502保持互補配對，因而不會形成g四鏈體結構，溶液不會發生變化。如果樣本中含有免疫球蛋白e，則適配體序列優先結合免疫球蛋白e，使g四鏈體序列502解離出來，並形成g四鏈體，結合血紅素504，引發螢光單體的聚合反應，使螢光增強。聚合反應的過程和原理與實施實例3相同。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，乙醯丙酮可以不加，也可以用其它β-二酮代替，也可以用其它自由基轉移試劑代替，如巰基化合物等。上述體系中，還可以加入黃原酸酯、碘化物等，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。上述體系中，還可以加入丙烯醯胺單體，使聚合產物形成共聚物。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。上述體系中，按照類似原理，使用其它蛋白質的適配體序列，可以用來檢測相關的蛋白質。實施實例9，與滾環擴增聯用用於檢測dna序列。配製50mmtris-hcl緩衝液,ph=7.5，含有：kcl，100mm；mgcl2，10mm；血紅素，濃度0.02mm；乙醯丙酮，0.001mm；過氧化氫，0.02mm；兩種單體，濃度均為0.1mm；核苷酸單體dntp，其中dctp為0.01mm，dgtp為0.1mm，datp為0.02mm，dttp為0.05mm；phi29dna聚合酶；環模版序列，濃度0.00001mm。其中，兩種單體為：和；環模版序列為：pcccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaccacacgatcctaa（seqidno.13），其中子序列aaccacacgatcctaa與靶標序列5』-ttaggatcgtgtggtt-3』（seqidno.14）完全互補配對，子序列cccaacccgccctaccc的互補序列可以形成g四鏈體。檢測過程及原理：將待測樣本加入上述溶液中，37攝氏度恆溫12小時，如果其中沒有靶標序列，或者所含有的dna與環模板不配對，則溶液不會發生反應。如待測樣本中含有靶標序列5』-ttaggatcgtgtggtt-3』，則可以與環模板互補配對，進而在phi29聚合酶催化下發生核酸擴增，擴增產物為模板的互補序列，因而在鉀離子存在下形成大量g四鏈體結構，並結合血紅素引發螢光單體的自由基聚合反應，並使螢光增強。聚合反應的過程和原理與實施實例1類似。聚合反應為：該反應中，四苯乙烯單體含有馬來醯亞胺結構，可猝滅周圍基團的螢光，導致分子本身光很弱，而聚合之後，該結構被破壞，結合聚集誘導發光機理，使螢光增強倍數顯著提高。上述體系中，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。上述體系中，乙醯丙酮可以用其它自由基轉移試劑代替，如其它β-二酮化合物等。上述體系中，還可以加入黃原酸酯、碘化物等，用於抑制鏈轉移和鏈終止反應，實現活性自由基聚合。上述體系中，還可以加入丙烯醯胺單體，使聚合產物形成共聚物。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。實施實例10，elisa聯用法檢測蛋白質。本例子中，以血小板生長因子b鏈（pdgf-bb，platelet-derivedgrowthfactorb-chain）的檢測為例說明本發明與elisa法聯用的方法。所需材料如下：固相，固定了pdgf-bb抗體的薄膜，參考免疫檢測相關的文獻製備。緩衝液1，清洗緩衝液：20mm磷酸緩衝液，ph=7，含有：140mmnacl，5mmkcl，1mmcacl2，1mmmgcl2。緩衝液2，適配體緩衝液：20mmtris-hcl緩衝液,ph=7，含有：140mmnacl，5mmkcl，1mmcacl2，1mmmgcl2；還有dna序列：5』-tactcagggcactgcaagcaattgtggtcccaatgggctgagtatttttgggtagggcgggttggg-3』（seqidno.15），濃度0.001mm，其中其子序列tactcagggcactgcaagcaattgtggtcccaatgggctgagta為pdgf-bb適配體序列，子序列gggtagggcgggttggg，可以形成g四鏈體。緩衝液3，擴增緩衝液：50mmtris-hcl緩衝液,ph=7.5，含有10mmmgcl2；含有phi29dna聚合酶；核苷酸單體dntp，其中dctp為0.01mm，dgtp為0.12mm，datp為0.01mm，dttp為0.07mm；環模板，濃度0.001mm。其中，環模板序列為：pcccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaa-3』（seqidno.16）。緩衝液4，聚合緩衝液：100mm乙酸鉀緩衝液，ph=5，含有血紅素，濃度0.02mm；乙醯丙酮，濃度0.001-0.002mm；過氧化氫，0.5mm；螢光單體分子，0.5mm，其中螢光單體為：。其中，緩衝液2中的序列的子序列gggtagggcgggttggg，不僅可以形成g四鏈體，還可以與緩衝液3中環模板序列互補配對，作為引物進行核酸擴展反應。上述的薄膜和4種緩衝液可以用於pdgf-bb的檢測。檢測流程與原理如附圖7所示，說明如下：（1）將薄膜601浸入待測液，如果待測液中有pdgf-bb，則發生抗體抗原結合，使pdgf-bb（603）與薄膜上的抗體602結合固定在薄膜上，（2）用緩衝液1洗薄膜數次，以去除非特異性吸附的物質，然後浸入緩衝液2，如果膜上有pdgf-bb，則適配體序列與之結合，使dna序列604固定在薄膜上，（3）用緩衝液1洗薄膜數次，以去除未被結合的dna，然後浸入緩衝液3，37攝氏度恆溫數小時，如果膜上有dna序列604，則3』端序列可以與溶液中模板序列605互補配對，並作為引物在dna聚合酶606作用下發生滾環擴增反應，擴增產物含有大量重複的g四鏈體序列，並且通過適配體與蛋白質的特異作用固定在薄膜上，（4）用緩衝液1洗薄膜數次，以去除環模板605、dna聚合酶606等物質，然後浸入緩衝液4，如果膜上有g四鏈體序列，則可以結合血紅素607，並引發聚合反應，聚合反應的機理參考前面的實施實例或相關文獻，聚合產物為聚苯胺衍生物，共軛增加，因而可觀察到顏色加深、螢光增強等現象。上述體系中，有三輪信號放大的過程，分別是：靶標蛋白富集於薄膜上，是第一輪；滾環擴增使g四鏈體數量倍增，是第二輪；g四鏈體複合物引發聚合反應，是第三輪。因而該體系具有非常高的靈敏度。其中，由於上述體系中滾環擴增的引物序列就是g四鏈體序列，因而也可以不經過第二輪信號放大過程，即省去緩衝液2的浸入和洗滌，直接浸入緩衝液3，以引發聚合反應。上述體系中，聚合反應不限於苯胺類單體的聚合，也可以使用烯烴聚合、巰基烯炔點擊反應等設計檢測溶液。上述體系中，可以加入其它單體，利用共聚反應改進檢測條件或靈敏度。上述體系中，血紅素可以用其他金屬配合物代替。類似於前面的實施實例，上述體系中使用的一些試劑可以用其它具有類似功能的試劑代替，各種物質的濃度、反應溫度和時間可以進一步優化，以提高檢測靈敏度。上述體系中，螢光分子可以用其他螢光分子代替，這類螢光分子的設計思路參考
發明內容的敘述。其中一些優選的單體結構如下：、、、、。上述體系中，按照類似原理，可以設計並使用其它蛋白質的適配體序列和抗體，用來檢測相關的蛋白質。上述體系中，適配體序列可以用抗體代替，將抗體和g四鏈體序列偶聯起來，利用雙抗體夾心法檢測靶標蛋白，並且不限於pdgf-bb的檢測。一些elisa試劑盒中的部分試劑可以直接應用於這類方法，用於相關物質的檢測。例如，上述體系的適配體序列可以用辣根過氧化物酶標記的抗體代替，同時省去核酸序列及滾環擴增過程，用於相關物質的檢測。序列表sequencelisting朱澤策酶引發的自由基聚合反應及檢測應用16patentinversion3.3117dna人工序列1gggtagggcgggttggg17215dna人工序列2ggttggtgtggttgg15333dna人工序列3gggtagggcgggttgggagttagcacccaaccc33412dna人工序列4tgggtgctaact12512dna人工序列5tgggtcctaact12623dna人工序列6atgactatctttaatgggtaggg23723dna人工序列7gggttgggcgtatggaaaatgag23829dna人工序列8ctcattttccatacattaaagatagtcat29919dna人工序列9gttggaaggcggaaggttc191027dna人工序列10acctgggggagtattgcggaggaaggt271137dna人工序列11ggggcacgtttatccgtccctcctagtggcgtgcccc371220dna人工序列12ggtaggagggacggataaac201375dna人工序列13cccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctaccca60accacacgatcctaa751416dna人工序列14ttaggatcgtgtggtt161566dna人工序列15tactcagggcactgcaagcaattgtggtcccaatgggctgagtatttttgggtagggcgg60gttggg661684dna人工序列16cccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctaccca60aaacccaacccgccctacccaaaa84當前第1頁12當前第1頁12