一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法
2023-12-05 15:18:11 1
專利名稱：一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法
技術領域：
本發明涉及一種自植物中製備天然化學品的方法，具體的說是一種自南蛇藤根皮中提取 雷公藤紅素的方法。
二背景技術：
雷公藤紅素(tripterine)分子式為C29H380又 名南蛇藤素(Celastrol)，是一種存在於衛矛科植 物雷公藤、南蛇藤等植物中的五環三萜類物質， 其結構式如圖。
以往研究表明，雷公藤紅素能抑制多種癌細 胞的增值，包括白血病、神經膠質瘤、前列腺 癌等。此外，有證據顯示，雷公藤紅素能參與 促炎症細胞因子、誘導性一氧化氮合酶、黏附 分子、蛋白酶體活性、拓撲異構酶、鉀通道以
及熱休克應答等調控。在體內研究方面，雷公藤紅素能顯著的抑制前列腺癌以及胰腺癌細胞 小鼠腫瘤抑制模型中癌細胞的增值，並且在系統性紅斑狼瘡、哮喘、類風溼性關節炎以及膠 原誘導的關節炎等動物模型中顯示有效的抗炎症作用。因此，無論在科研還是藥物研發中雷 公藤紅素的需求越來越大。雷公藤紅素在已報導的植物中含量極低，目前多採用常壓反覆矽 膠柱層析進行分離，得率低，毒性大，而且有毒溶劑消耗也大。
中國專利20071002543.3公開了南蛇藤莖總萜提取物及其製備方法及用途。特點是從南 蛇藤屬植物南蛇藤莖中提取分離而得到含有南蛇藤莖總二、三萜的提取物。工藝採用95% 乙醇提取，乙酸乙酯萃取後即得南蛇藤莖總二、三萜，優點在於原料提取率高，成本低，操 作簡便，但是未提及雷公藤紅素的單體製備。
中國專利200710041518.X公開了南蛇藤素的鹼金屬鹽化合物及其製備方法。其特點是 一種水溶性南蛇藤素鹼金屬鹽化合物及其製備方法，可製成藥學上的各種劑型，包括注射劑， 特別是用於製造注射劑用粉針劑。
中國專利200710039694.X公開了南蛇藤葡甲胺炎及其製備方法。其特點是採用選擇性 的只有南蛇藤分子中羧基參與成鹽的南蛇藤葡甲胺鹽，可製成藥學上的各種劑型。
中國專利200510121360.8公開了一種南蛇藤中成藥及其在抗類風溼關節炎中的應用。其特點是從衛茅科南蛇藤屬植物南蛇藤中提取分離而得到含有南蛇藤總萜類的提取物，經藥 效學及毒理學實驗證明，該提取物對類風溼關節炎具有較好的治療作用。
美國專利號US4328309公開了用植物細胞培養方法來製備雷公藤甲素、雷公藤紅素等 活性成分。
發明內容
本發明旨在提供高純度的雷公藤紅素，所要解決的技術問題是遴選雷公藤紅素含量豐富 的植物源及其提取方法。
研究表明，在植物源南蛇藤中，雷公藤紅素含量最為豐富，且多集中在其根皮部位。所 以本發明的技術方案是以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化、重結晶，所述的提 取包括動態回流提取和靜態醇沉萃取，動態回流提取是南蛇藤根皮粉按1 : 3 20的質量比 加入低級氯代垸烴加熱回流提取不少於2小時，冷卻、分離、提取液脫溶得到暗紅色浸膏狀 初提物；靜態醇沉萃取是向上述初提物中加入濃度50 70vty。(體積百分比，下同)的甲醇或 乙醇溶液，充分攪拌後靜置萃取，待白色析出物沉澱完全後分離，萃取液脫溶得到紅色稠膏 狀粗提物所述的純化是將粗提物溶於甲醇中用固定相為正相矽膠或者反相ds或Cs矽膠的 柱色譜分離純化，等度洗脫，收集洗脫液，脫溶、乾燥後得到紅色粉末狀精提物，精提物經 重結晶得到純度》98%紅色結晶狀雷公藤紅素。
所述的低級氯代烷烴選自三氯甲烷(氯仿)或1， 2-二氯乙垸(均二氯乙烷)或1， 1， 1-三氯乙烷(偏三氯乙院)等a
所述的正相矽膠柱色譜固定相為200 300目正相矽膠，洗脫液(流動相)為氯仿-甲醇 (體積比70 : 30 50 : 50)混合液。
所述的反相ds或C8矽膠柱色譜固定相相為U或C8反相矽膠，洗脫液(流動相)為pH值 3 4的75 87vt。/。乙醇或甲醇溶液。
重結晶所用溶劑為乙醇一水(體積比90: 10 70: 30)混合溶劑。
具體操作如下
1、 回流提取選取南蛇藤根皮部粉末，按質量比加入3 20倍量的1， 2-二氯乙烷，加 熱回流提取2-6小時，然後冷卻靜置、分離、過濾，濾液減壓濃縮回收溶劑得初提物，呈暗 紅色浸膏狀。
2、 醇沉萃取將1步驟所得的雷公藤紅素初提物溶於50%—70討％的甲醇或乙醇溶液， 靜置取上清液或過濾取濾液濃縮得到粗提物，呈紅色稠膏狀。。
3、 將2步驟得到的粗提物溶於甲醇中進行固定相為正相矽膠的柱色譜分離，洗脫方式為氯仿與甲醇混合體系(70: 30-50: 50)等度洗脫，TLC跟蹤監測雷公藤紅素餾分，收集
餾分濃縮。
4、 將2步驟得到的粗提物溶於甲醇中進行固定相為反相ds或C8矽膠的柱色譜分離， 流動相為加酸調整pH值為3 4的濃度75 87vt。/。的乙醇或者甲醇溶液等度洗脫，HPLC-UV 監測收集洗脫液。
5、 柱色譜分離後的餾分或洗脫液濃縮，乾燥後得到紅色粉末，採用兩相溶劑結晶法進 一步純化得到純度達98%的紅色結晶產品，所用溶劑為75 90vt。/。乙醇溶液。
雷公藤紅素的測定方法為
1、 高效液相製備色譜法(HPLC—UV)，色譜固定相為十八烷基矽烷鍵合矽膠，檢測波長 425nm，流動相為甲醇-1%醋酸(體積比87: 13)，流速為lml/min，柱溫27。C，進樣量 10u 1。
2、 200-300目G矽膠鋪板，展開劑l:氯仿-甲醇(體積比65: 35)， pH調至3-4;展開劑2:
環己垸一丙酮(體積比1: 3);
顯色方式碘顯色或者香草醛硫酸乙醇溶解，105。C加熱顯色
本申請利用雷公藤紅素既溶於氯代烷烴又溶於50 70vt。/。甲醇或乙醇溶液的物理性質以 及氯代烷烴與醇溶液極性差異的特點，首先使用氯代烷烴提取，將僅溶於醇溶液而不溶於氯 代垸烴的非目標產物分離，然後用醇溶液萃取，將在醇溶液中有較小溶解度的另一些非目標 產物沉澱分離，這時醇溶液中所含非目標產物大大減少，使粗提物中雷公藤紅素含量較初提 物大幅度提高，從而簡化以後的分離純化過程。
四
圖1為2步驟製備的粗提物HPLC檢測圖譜
圖2為4步驟製備的精提物的HPLC檢測圖譜
圖3、圖4為4步驟製備的精提物的"C麗R1， H畫R檢測圖譜
圖5為4步驟製備的精提物的EI-MS檢測圖譜
五具體實施方式
實施例一
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按1: 5的質量比加入1， 2-二氯乙烷， 加熱回流提取4小時，回流提取兩次。過濾，合併濾液減壓濃縮回收l， 2-二氯乙烷後，得 暗紅色浸膏0. 39g(初提物)，紅素含量9. 2%。加50vt。/。甲醇溶液溶解，溶液中析出白色沉澱， 靜置，取上清液濃縮後重複處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量51.3%。
5將粗提物甲醇溶解進行固定相為反相Ci8製備色譜上進行分離，洗脫劑為83vt^甲醇水溶液， 醋酸調pH至3，根據製備色譜圖收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸乾後得雷公藤紅素粉末(精提 物)，採用乙醇/水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產品。 實施例二
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 7的質量比加入偏三氯乙烷，加熱 回流提取5小時，回流提取兩次。過濾，合併濾液減壓濃縮回收偏三氯乙烷後，得暗紅色浸 膏0.41g(初提物)，雷公藤紅素含量10.3%。加入60vtX乙醇溶液充分溶解，溶液中析出 白色沉澱，過濾後取濾液，濃縮後再次重複同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公 藤紅素含量48.2%。將粗提物甲醇溶解進行固定相為反相d8製備色譜上進行分離，洗脫劑 為85"%甲醇溶液，醋酸調pH至3，根據製備色譜圖收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸乾後得 雷公藤紅素粉末(精提物)，釆用乙醇/水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素
實施例三
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: IO的質量比加入氯仿，加熱回流 提取5小時，回流提取兩次。過濾，合併濾液減壓濃縮回收氯仿後，得暗紅色浸膏0.47g(初 提物)，雷公藤紅素含量10. 1%。加入60vt^甲醇溶液，溶液混濁，靜置，過濾取濾液濃縮 後再次重複同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量53. 1% 。將粗提物 甲醇溶解矽膠拌樣進行固定相為正相矽膠常壓柱分離，洗脫劑為氯仿/甲醇(60: 40)等度洗 脫，TLC跟蹤監測，收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸乾後得到雷公藤紅素產精提物，採用乙醇 /水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產品。 實施例四
選取粒度為20目的南蛇藤根皮部分粗粉300g，按l: 15的質量比加入氯仿，加熱回流 提取5小時，回流提取兩次。過濾，合併濾液減壓濃縮回收氯仿後，得暗紅色浸膏0.41g(初 提物)，雷公藤紅素含量9.2%。加入50vtX乙醇溶液，溶液混濁，靜置，過濾取濾液濃縮 後再次重複同樣處理2-3次，得到雷公藤紅素粗提物，雷公藤紅素含量50. 1% 。將粗提物 甲醇溶解矽膠拌樣進行固定相為正相矽膠常壓柱分離，洗脫劑為氯仿/甲醇(70:30)等度洗 脫，TLC跟蹤監測，收集雷公藤紅素餾分，濃縮蒸乾後得到雷公藤紅素精提物，採用乙醇/ 水重結晶處理得到純度達98%的紅色結晶雷公藤紅素產品。
權利要求
1、一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法，以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化和重結晶，其特徵在於所述的提取首先以低級氯代烷烴為溶劑，加熱回流提取，根皮粉與溶劑的質量比1∶3～20，時間不少於2小時，提取液脫溶後得到浸膏狀初提物，然後向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分攪拌、靜置萃取，萃取液脫溶後得到稠膏狀粗提物；所述的純化是粗提物用甲醇溶解後用固定相為正相矽膠或反相矽膠的柱色譜分離純化，收集洗脫液，脫溶乾燥後得到粉末狀精提物，最後用乙醇-水混合溶劑重結晶。
2、 根據要得要求1所述的方法，其特徵在於所述的低級氯化垸烴選自氯仿或均二氯 乙烷或偏三氯乙烷。
3、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於正相矽膠柱色譜固定相為200 300 目正相矽膠，洗脫液為氯仿-甲醇混合溶劑，體積比70 : 30 50 : 50。
4、 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於反相矽膠柱色譜固定相為C,8或Cs 反相矽膠；洗脫液為pH3 4的75 87"%甲醇或乙醇溶液。
全文摘要
一種自南蛇藤根皮中提取雷公藤紅素的方法，以南蛇藤根皮粉為原料，包括提取、分離、純化和重結晶，所述的提取首先以低級氯代烷烴為溶劑，加熱回流提取，根皮粉與溶劑的質量比1∶3～20，時間不少於2小時，提取液脫溶後得到浸膏狀初提物，然後向初提物中加入50～70vt％甲醇或乙醇溶液，充分攪拌、靜置萃取，萃取液脫溶後得到稠膏狀粗提物；所述的純化是粗提物用甲醇溶解後用固定相為正相矽膠或反相矽膠的柱色譜分離純化，收集洗脫液，脫溶乾燥後得到粉末狀精提物，最後用乙醇-水混合溶劑重結晶。本方法分離、純化工藝簡單，得到純度達98％的雷公藤紅素。
文檔編號C07J63/00GK101638425SQ200910144620
公開日2010年2月3日 申請日期2009年8月24日 優先權日2009年8月24日
發明者楊 呂, 許舒雯, 蘭 陳, 陳龍勝 申請人:安徽省科學技術研究院