多環芳烴好氧降解菌的富集篩選方法

2023-12-05 15:46:46 1

專利名稱：多環芳烴好氧降解菌的富集篩選方法
技術領域：
本發明屬於受汙染土壤與水的生物修復技術領域，具體地說，涉及多環芳烴好氧降解菌的快速富集、篩選方法。
背景技術：
多環芳烴(PAHs)是指兩個或兩個以上苯環連在一起構成的烴類化合物，其中許多種類具有致癌、致畸、致突變作用，而且其毒性和致癌性隨著苯環數目的增加而增加。由於PAHs分子中存在共扼大π鍵電子體系，具有較高的穩定性，而成為環境中持久性汙染物。環境中PAHs主要來源於人類活動，如石油冶煉、運輸業、煤氣製造等。由於石油及石油產品的大量使用，環境中多環芳烴有不斷增多的趨勢，而且分布廣泛，在大氣、水體、土壤、沉積物和食品中都檢測到多種PAHs的存在。環境中的PAHs主要依靠微生物的降解作用去除，而PAHs的好氧生物降解比厭氧生物降解的速率要快很多倍，因此，篩選出高效好氧降解菌是多環芳烴汙染土壤生物修復技術的一個關鍵。目前常用的篩選方法是液體搖瓶培養法，其是在無機鹽液體培養基中添加固體或有機溶劑溶解的多環芳烴，然後接入土壤等菌源，搖床培養，富集並篩選多環芳烴降解菌。 例如，Singleton等人在無機鹽培養基中加入菲，搖瓶培養後平板稀釋，從而得到菲降解菌 (Appliedand Environmental Microbiology,75(9) :2613-2620,2009)。但是，由於四環及其以上的多環芳烴的分子量大、疏水性強、水溶性低，因此目前常用的搖瓶培養法僅適合於篩選三環及三環以下多環芳烴的降解菌，而對於四環及其以上多環芳烴的降解微生物的篩選，會出現周期長、篩出機率小，篩出的降解菌系穩定性差、降解率不高等問題。

發明內容
本發明的目的在於提供一種多環芳烴好氧降解菌的富集篩選方法，該方法篩選時間短，更易得到高效降解菌系和降解菌，特別適合於篩選四環及其以上多環芳烴的降解菌。為了實現上述目的，本發明的多環芳烴好氧降解菌的富集、篩選方法包括1)製備多環芳烴降解菌系、幻篩選多環芳烴降解菌及幻對純化的降解菌進行復篩三個步驟，其中，所述步驟1)是在無機鹽培養基中加入水稻秸稈和濾紙，高溫蒸氣滅菌後，再加入多環芳烴；以受多環芳烴汙染的土壤為菌源，將其接入上述培養基中，搖床避光培養至培養液變為深棕色；將上述培養液進行傳代培養，每次傳代培養時培養基中水稻秸稈的加入量均比上一代減少，且不再添加濾紙，每次傳代培養均以培養液變為深棕色為傳代標準，傳代培養在五代以上，最後一代培養時培養基中不再添加水稻秸稈。其中，所述多環芳烴包括芘或熒蒽，或其他四環以上多環芳烴；多環芳烴的加入量是使其終濃度為200mg/L。
所述水稻秸稈的加入量為無機鹽培養基重量的0. 3 0. 5%，傳代培養時水稻秸稈的加入量均比上一代減少1/3 ；所述濾紙為5cmXlcm的濾紙條。所述菌源是將受多環芳烴汙染的土壤製成濃度為12. 5g/mL的菌懸液，並按培養液體積的5 10%接種；所述搖床避光培養的條件為溫度觀 30°C、轉速150rpm、培養時間為14 21天。此外，步驟2~)篩選多環芳烴降解菌用本領域常用方法即可，例如按如下方法進行篩選在無機鹽培養基中加入瓊脂，高溫蒸氣滅菌後，倒於平板上，待培養基凝固後，加入步驟1)中所述多環芳烴的丙酮溶液，分布均勻後靜置使丙酮揮發；將步驟1)製得的多環芳烴降解菌系培養液經梯度稀釋後塗布於上述平板上，30°c溫度下培養7 14天；挑取周圍有透明圈的菌落，接種於新的上述固體平板上劃線分離，得到純化的降解菌。其中，所述瓊脂的添加量為無機鹽培養基重量的1. 5 2% ；所述多環芳烴的丙酮溶液的濃度為5g/L;所述無機鹽培養基與多環芳烴的丙酮溶液的體積比為50 100 1 ； 所述梯度稀釋是將上述多環芳烴降解菌系培養液按體積分別稀釋103、IO4UO5倍。此外，步驟幻對純化的降解菌進行復篩使用本領域常用方法即可，也可以使用如下方法進行復篩所述步驟幻是將步驟幻得到的降解菌接種於LB平板培養基中，長出菌落後，製成濃度為OD6tltl = 1的菌液，備用；在血清瓶中加入上述多環芳烴的丙酮溶液，待丙酮揮發後，加入無機鹽培養基，將上述菌液接入血清瓶中，30°C溫度下避光搖床培養7 14天；用高效液相色譜(HPLC)方法測定剩餘的多環芳烴，計算降解率，選取降解率在90%以上的菌株。其中，所述菌液按本領域常用方法製備即可，如將菌種刮於含玻璃珠的無菌水中， 將菌打散形成菌液。所述多環芳烴的丙酮溶液的濃度為5g/L ；所述菌液、多環芳烴的丙酮溶液及無機鹽培養基的體積比為2. 5 5 1 100;所述LB平板培養基的組成為酵母粉5g、蛋白腖 IOg, NaCl 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂粉 15g、pH 為 7. 2 7. 4。本發明所述的無機鹽培養基的組成為=Na2HPO4 · 12H20 8. 8g、KH2P043. 0g、 NH4NO3L 0g、MgSO4 · 7H20 0. 246g、FeCl3O. 05g、CaCl2O. 02g、微量元素溶液 2. 5mL、蒸餾水 1000mL。其中，所述微量元素溶液的組成為=MnSO4· 2H20 0. 06g、H3BO3O. 03g、CoCl2. 6H20 0. 04g、CuCl2. 2H20 0. 01g、NiCl2. 6H20 0. 02g, Na2MoO4 · 2H20 0. 03g、ZnCl2O. 05g、pH = 7、蒸餾水 1000mL。本發明方法在培養基的配製過程中，添加了一定量的水稻秸稈和濾紙，利用水稻秸稈和濾紙的協同作用，縮短降解菌的篩選時間，有利於得到高效降解菌系和降解菌。其原理是水稻秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，三者相互交織形成植物細胞壁， 結構複雜且難以降解；但濾紙降解可以為秸稈中纖維素的降解提供大量微生物和誘導物， 從而誘導秸稈的降解；而秸稈的降解為培養液富集了大量強力降解難降解天然有機物的微生物，從而為PAHs的降解提供更多的菌株；此外，四環及其以上的多環芳烴的水溶性低，極易吸附到顆粒物上，而濾紙可以作為載體，增加了微生物與多環芳烴的接觸機會，從而進一步縮短降解菌的篩選時間，並且更易得到高效降解菌系和降解菌。本發明提供的篩選方法可以在傳代培養5次(約3個月)後即可獲得四環及其以上多環芳烴降解菌的菌系，大大縮短了篩選時間；並且得到的降解菌系降解效果穩定，連續傳代三次，每次對四環及其以上多環芳烴的降解率均在90 96% ；經過復篩得到的純化的降解菌，培養14天對30mg/L的多環芳烴的降解率可以達到90%以上。
具體實施例方式以下通過具體實施例來進一步說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1(1)菌源的採集和菌懸液的製備採集焦化廠周圍受多環芳烴汙染的土壤，立即置於4°C冰箱內保存備用；取20g採集的土壤置於250mL的無菌水中，30°C振蕩12小時，製成菌懸液；(2)富集、篩選培養基的配製在50mL無機鹽培養基中加入0. 3% (重量)水稻秸稈和5cmX Icm的濾紙條，高溫蒸氣滅菌；滅菌後向培養基中加入0. Olg熒蒽，使其終濃度達到200mg/L，配製成以熒蒽為唯一碳源的無機鹽培養基；無機鹽培養基的組成為=Na2HPO4· 12H20 8. 8g、KH2P043. Og^NH4NO3L 0g、MgS04 ·7Η20 0. 246g、FeCl3O. 05g、CaCl2O. 02g、微量元素溶液2. 5mL、蒸餾水IOOOmL ；其中，微量元素溶液的組成為:MnS04 · 2H20 0. 06g、H3BO3O. 03g、CoCl2 · 6H20 0. 04g、CuCl2 · 2H200. Olg、 NiCl2 · 6H20 0. 02g、Na2MoO4 · 2H20 0. 03g、ZnCl2O. 05g、pH = 7、蒸溜水 IOOOmL (注以下使
用的無機鹽培養基的組成均與此相同)；(3)熒蒽降解菌的富集在上述培養基中加入5mL步驟(1)製得的菌懸液，搖床避光培養至培養液變為深棕色，培養溫度為30°C，轉速為150rpm，約培養21天；(4)傳代培養按照步驟( 方法配製熒蒽無機鹽培養液，但水稻秸稈的加入量減少1/3，且不再添加濾紙；將5mL步驟(3)得到的培養液接種於新的培養基中進行傳代培養，接種比例為10% (體積)，按步驟幻的培養條件培養至菌液變為深棕色；重複傳代培養，每傳代一次，培養基中水稻秸稈的加入量均比上一代減少1/3，且培養時間逐代縮短；至第五代時培養基中不再添加水稻秸稈，且培養時間縮短為14天，此時得到降解熒蒽的菌系；(5)配製無機鹽熒蒽的固體平板培養基在25mL無機鹽培養基中添加1. 5% (重量)的瓊脂，高溫蒸氣滅菌後，倒於滅菌的平板上，待培養基凝固後，加入0. 5mL濃度為5g/L 的熒蒽的丙酮溶液，轉動培養皿使丙酮溶液分布均勻，將培養皿在超淨臺中放置2天，使丙酮揮發；(6)獲得純化的熒蒽降解菌將步驟⑷得到的熒蒽降解菌系分別稀釋103、104、 IO5倍(體積)，塗布於上述固體平板上，30°C培養14天；挑取周圍有透明圈的菌落，接種於新的固體平板上劃線分離，最終得到純化的熒蒽降解菌；(7)對純化的降解菌進行復篩將步驟(6)得到的熒蒽降解菌接種於LB平板培養基中，培養6天，待長出菌落後，將菌種刮於含玻璃珠的無菌水中，將菌打散形成菌液，調節菌液的濃度為OD6tltl=I,備用；血清瓶中加入0.2mL 5g/L的多環芳烴丙酮溶液，待丙酮揮發後，加入20mL無機鹽培養基，培養基中熒蒽的最終濃度為100mg/L，取0. 5mL上述菌液接入血清瓶中，30°C溫度下避光搖床培養14天；用高效液相色譜方法HPLC測定剩餘的熒蒽，選取降解率在90%以上的菌株作為高效降解菌；其中，LB培養基的組成為酵母粉5g、蛋白腖10g、NaCl 5g、蒸餾水1000ml、瓊脂粉 15g、pH 7. 2 7. 4 ；最終得到的熒蒽降解菌系能夠以熒蒽為底物生長，好氧降解試驗結果表明菌群能夠對熒蒽進行有效的好氧降解；當熒蒽的初始濃度為50mg/L時，14天後降解率達到96%。 此外，該降解菌還能夠降解芘，好氧降解試驗表明該降解菌能夠以芘或芘和熒蒽的混合物為底物生長，當以芘和熒蒽的混合物為底物時，14天後芘的降解率達到96% (初始濃度為 114mg/L)；熒蒽的降解率達到99% (初始濃度為140mg/L)。實施例2(1)菌源的採集和菌懸液的製備與實施例1相同；(2)富集、篩選培養基的配製在50mL無機鹽培養基中加入0. 5% (重量)水稻秸稈和5cmX Icm的濾紙，高溫蒸氣滅菌，然後加入0. Olg芘，使其終濃度達到200mg/L，配製成以芘為唯一碳源的無機鹽培養基；(3)降解菌的富集在上述培養基中加入2. 5mL步驟(1)製得的菌懸液，搖床避光培養至培養液變為深棕色，培養條件為溫度為^°C，轉速為150rpm，約培養21天；(4)傳代培養在步驟幻的培養條件下，按實施例1方法進行傳代培養；(5)配製無機鹽熒蒽的固體平板培養基在50mL無機鹽培養基中添加2%的瓊脂， 高溫蒸氣滅菌後，倒於滅菌的平板上，待培養基凝固後，加入0. 5mL濃度為5g/L芘的丙酮溶液，轉動培養皿使丙酮溶液分布均勻，將培養皿在超淨臺中放置2天，使丙酮揮發；(6)獲得純化的熒蒽降解菌將步驟⑷得到的降解菌系分別稀釋103、104、105倍 (體積)，塗布於上述固體平板上，30°C培養14天；挑取周圍有透明圈的菌落，接種於新的固體平板上劃線分離，最終得到純化的熒蒽降解菌；(7)對純化的降解菌進行復篩將步驟(6)得到的芘降解菌接種於LB平板培養基中，培養3天，待長出菌落後，將菌種刮於含玻璃珠的無菌水中，將菌打散形成菌液，調節菌液的濃度為OD6tltl = 1，備用；血清瓶中加入0. 2mL 5g/L的多環芳烴丙酮溶液，待丙酮揮發後，加入20mL無機鹽培養基，培養基中熒蒽的終濃度為100mg/L，取ImL上述菌液接入血清瓶中，30°C溫度下避光搖床培養14天；用HPLC方法測定剩餘的熒蒽，選取降解率在90%以上的菌株作為高效降解菌；其中，LB培養基的組成與實施例1相同。最終得到的芘降解菌系能夠以芘為底物生長，好氧降解試驗結果表明菌群能夠對芘進行有效的好氧降解；當芘的初始濃度為100mg/L時，14天後降解率達到96%。此外，該降解菌還能夠同時降解熒蒽，好氧降解試驗表明該降解菌能夠以芘或芘和熒蒽的混合物為底物生長，當以芘和熒蒽的混合物為底物時，14天後芘的降解率達到98. 3% (初始濃度為 75mg/L)；熒蒽的降解率達到97. 6% (初始濃度為S^ig/L)。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方式
，對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
1.多環芳烴好氧降解菌的富集篩選方法，包括1)製備多環芳烴降解菌系、幻篩選多環芳烴降解菌及；3)對純化的降解菌進行復篩三個步驟，其特徵在於，所述步驟1)是在無機鹽培養基中加入水稻秸稈和濾紙，高溫蒸氣滅菌後，再加入多環芳烴；以受多環芳烴汙染的土壤為菌源，將其接種於上述培養基中，搖床避光培養至培養液變為深棕色；將上述培養液進行傳代培養，每次傳代培養時培養基中水稻秸稈的加入量均比上一代減少，且不再添加濾紙，每次傳代培養均以培養液變為深棕色為傳代標準，傳代培養在五代以上。
2.根據權利要求1所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述多環芳烴為芘或熒蒽；多環芳烴的加入量為使終濃度達到200mg/L。
3.根據權利要求1或2所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述水稻秸稈的加入量為無機鹽培養基重量的0. 3 0. 5%。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述搖床避光培養的條件為溫度28 30°C、轉速150rpm、培養時間為14 21天。
5.根據權利要求1所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述步驟幻是在無機鹽培養基中加入瓊脂，高溫蒸氣滅菌後，倒於平板上，待培養基凝固後，加入所述多環芳烴的丙酮溶液，分布均勻後靜置使丙酮揮發；將步驟1)製得的多環芳烴降解菌系培養液經梯度稀釋後塗布於上述平板上，30°C溫度下培養7 14天；挑取周圍有透明圈的菌落，接種於新的上述固體平板上劃線分離，得到純化的降解菌。
6.根據權利要求5所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述多環芳烴的丙酮溶液的濃度為5g/L ；所述瓊脂的添加量為無機鹽培養基重量的1. 5 2%;所述無機鹽培養基與多環芳烴的丙酮溶液的體積比為50 100 1 ；所述梯度稀釋是將培養液按體積分別稀釋103、 IO4UO5 倍。
7.根據權利要求1所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述步驟幻是將步驟幻得到的降解菌接種於LB平板培養基中，在降解菌長出菌落後，製成濃度為OD6tltl= 1的菌液，備用； 在血清瓶中加入所述多環芳烴的丙酮溶液，待丙酮揮發後，加入無機鹽培養基，將上述菌液接入血清瓶中，30°C溫度下避光搖床培養7 14天；用高效液相色譜方法測定剩餘的多環芳烴，計算降解率，選取降解率在90%以上的菌株。
8.根據權利要求7所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述多環芳烴的丙酮溶液的濃度為5g/L;所述菌液、多環芳烴的丙酮溶液及無機鹽培養基的體積比為2. 5 5 1 100 ； 所述LB平板培養基的組成為酵母粉5g、蛋白腖10g、NaCl 5g、蒸餾水1000mL、瓊脂粉15g、 pH 為 7. 2 7. 4。
9.根據權利要求1-8任意一項所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述無機鹽培養基的組成為:Na2HP04 · 12H20 8. 8g、KH2P043. 0g、NH4NO3L 0g、MgSO4 · 7H20 0. 246g、FeCl3O. 05g、 CaCl2O. 02g、微量元素溶液2. 5mL、蒸餾水1000mL。
10.根據權利要求9所述的富集篩選方法，其特徵在於，所述微量元素溶液的組成為 MnSO4 · 2H20 0. 06g、H3BO3O. 03g、CoCl2 · 6Η200· 04g、CuCl2 · 2Η20 0. 01g、NiCl2 · 6Η20 0. 02g、 Na2MoO4 · 2Η20 0. 03g、ZnCl2O. 05g、pH = 7、蒸餾水 IOOOmL0
全文摘要
本發明提供了一種多環芳烴好氧降解菌的富集篩選方法，包括1)製備多環芳烴降解菌系、2)篩選多環芳烴降解菌、3)對純化的降解菌進行復篩三個步驟，所述步驟1)是在無機鹽培養基中加入水稻秸稈和濾紙，高溫蒸氣滅菌後，再加入多環芳烴；以受多環芳烴汙染的土壤為菌源，將其接入上述培養基中，搖床避光培養至培養液變為深棕色；將上述培養液進行傳代培養，每次傳代培養時培養基中水稻秸稈的加入量均比上一代減少，且不再添加濾紙，每次傳代培養均以培養液變為深棕色為傳代標準，傳代培養在五代以上。本發明方法縮短了篩選時間，且能夠得到高效降解菌系和降解菌。
文檔編號C12N1/00GK102373155SQ20101024976
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月10日 優先權日2010年8月10日
發明者劉洪娟, 宮小燕, 陸雅海 申請人:中國農業大學