一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針及其應用的製作方法
2023-12-05 05:22:16 1
一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針及其應用的製作方法
【專利摘要】一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針及其應用，其屬於精細化工領域。這種螢光探針為4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物；按比例將4-取代基香豆素與三乙胺混合，再滴加丙烯醯氯醯氯，最後採用矽膠色譜法進行純化，得螢光探針。該螢光探針及相應半胱氨酸含量檢測過程不會受生物體系基質及雜質的幹擾，可用於各種生物體系中半胱氨酸含量的定量測定。這種應該探針具有高特異性，可以與半胱氨酸特異性環化後水解，即7位酯鍵斷裂的水解產物；廉價易得，可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行；靈敏度高，具有具有良好的螢光發射光譜特性（400～500nm），通過繪製標準曲線進行半胱氨酸定量測定。
【專利說明】一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針及其應用，其屬於精細化工領域。
【背景技術】
[0002]氣基酸(amino acid)是構成生物體蛋白質並與生命活動有關的最基本的物質，與生物的生命活動有著密切的關係。例如，含巰基的胺基酸，半胱氨酸(Cysteine，Cys)與高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)是同時表達在真核細胞內的含巰基胺基酸，分子結構只有一個亞甲基的區別，功能差異則非常明顯:Cys作為人體必須的胺基酸之一，是參與蛋白質合成的20種胺基酸中的一種，同時也是構建重要的穀胱甘肽的三個胺基酸之一；而Hcy,為甲硫氨酸代謝的中間產物，本身不參與蛋白質的合成，體內高半胱氨酸含量的大小與許多疾病相關聯。現代醫學研究表明，細胞內Hcy的高表達與心血管疾病及阿爾茨海默(進行性老年痴呆)有直接關聯。因此，研製高選擇性地識別半胱氨酸和高半胱氨酸螢光探針並實現其在活細胞中的螢光成像具有十分重要的意義。
[0003]眾所周知，細胞是生命的基礎，但是目前人們對細胞內的很多生命現象卻知之甚少，所以能夠實現活細胞中各種分子的螢光顯微成像具有很大的開發潛力和研究價值。在眾多具有生物功能的分子中，巰基化合物是生物體中許多蛋白質和分子的重要組成部分，在細胞抗氧化系統中具有重要的作用:比如半胱氨酸(Cysteine, Cys)和高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy),分子結構差別極小，僅有一個亞甲基差別，但其生物功能卻完全不同。它們在生物體內含量的變 化均會導致一些疾病的發生，通過檢測它們在生物體內含量的變化，可以為體內某些疾病的診斷提供正確的依據。因此，定量檢測生物體系中Cys和Hcy的含量變化在化學、生物化學、臨床醫學等領域具有重要意義。
[0004]本發明提供了一類4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物用於特異性識別半胱氨酸的探針，其與半胱氨酸水解後可生成具有螢光屬性的水解產物。該反應具有高選擇性、高靈敏度、反應迅速的特點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種識別半胱氨酸(Cys)的特異性螢光探針，該探針本身具有微弱的螢光，與半胱氨酸反應後產物具有極強的螢光屬性。利用該探針反應可對多種生物樣本中半胱氨酸含量進行定量評價。
[0006]本發明的技術方案為:一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針，所述螢光探針為4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物，其結構通式如下:R
O
其中，R為三氟甲基、氯甲基、溴甲基中的一種；
所述螢光探針的製備方法包括如下步驟:
(1)按照4位取代基香豆素:三乙胺摩爾比為1:廣2的比例加入到反應瓶中，再向反應瓶中緩慢滴加丙烯醯氯醯氯，控制反應溫度在0°C，所述丙烯醯氯醯氯:4位取代基香豆素的摩爾比為廣2:1 ;冰浴條件下攪拌I h後，將溶液溫度升至室溫，攪拌8-12h ;所述4位取代基香豆素為4-三氟甲基香豆素、4-氯甲基香豆素或4-溴甲基香豆素；
(2)將上述反應液經過減壓除去溶劑，殘留的固體採用矽膠色譜法進行純化，採用乙酸乙酯:正己烷體積比為1: 3進行洗脫，得螢光探針。
[0007]所述螢光探針應用於生物樣本中半胱氨酸含量的定量評價。該探針作為半胱氨酸的特異性探針，發生水解反應，通過定量檢測水解產物的螢光強度來測定血漿及細胞中半胱氨酸的含量；具體測定方法為:
體系中以4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物作為特異性探針；探針濃度選擇I廠10 μ M ;在PBS或Tris-HCl等常用緩衝液:乙醇混合溶液(體積比9:1)中，反應溫度為20°C至60°C之間，優選25°C為最優反應時間；反應體系pH介於5.5^10.5之間，優選pH7.4為最優反應pH值；反應時間為5~120分鐘；測定水解產物螢光強度作為半胱氨酸含量的評價指標。
[0008]探針本身具有微弱螢光`，其水解產物均具有極強的螢光，可採用螢光檢測器實現產物及底物的快速靈敏檢測；螢光檢測條件為:激發波長30(T400 nm，在40(T500 nm進行螢光發射譜的檢測。
[0009]本發明的有益效果為:這種螢光探針為4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物；按照比例將4-取代基香豆素與三乙胺混合，再滴加丙烯醯氯醯氯，最後採用矽膠色譜法進行純化，得螢光探針。該螢光探針及相應半胱氨酸含量檢測過程不會受生物體系基質及雜質的幹擾，可用於各種生物體系中半胱氨酸含量的定量測定。這種應該探針具有高特異性，可以與半胱氨酸特異性環化後水解，即7位酯鍵斷裂的水解產物；廉價易得，可經化學合成獲得，合成工藝簡單易行；靈敏度高，具有具有良好的螢光發射光譜特性(400~500 nm)，通過繪製標準曲線進行半胱氨酸定量測定。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖14-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的1H-NMR譜圖。
[0011]圖24-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的13C-NMR譜圖。
[0012]圖34-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的高分辨質譜。
[0013]圖44-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與半胱氨酸反應後螢光強度變化結果。
[0014]圖54-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與半胱氨酸反應後紫外吸收變化結果。
[0015]圖6 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與不同胺基酸反應後螢光變化結果O
[0016]圖7 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與不同濃度半胱氨酸反應後螢光強度變化曲線。
[0017]圖8 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與半胱氨酸反應螢光強度變化與時間的關係。
[0018]圖9細胞共聚焦成像圖，圖中由左到右分別為探針加巰基捕捉劑、探針、亮場。
[0019]圖10 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成路線。
【具體實施方式】
[0020]下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但並不因此而限制本發明。
[0021]實施例1 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素的化學合成 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素合成步驟如下:
(1)向10mL含有0.5 mmol的4-三氟甲基-7-羥基香豆素和0.625 mmol三乙胺的四氫呋喃溶液中，30 min內向反應瓶中緩慢滴加0.6 mmol的丙烯醯氯醯氯(溶於5 mL的四氫呋喃中)，控制溫度在0°C ；
(2)冰浴條件下攪拌Ih後，將溶液溫度升至室溫，攪拌過夜。；
(3)反應液經過減壓除去溶劑，殘留的固體採用矽膠色譜法進行純化，採用乙酸乙酯-正己烷(1: 3 v/v)進行洗脫，得44mg白色固體粉末；
實施例2 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素對於不同胺基酸的選擇性
(I)預先準備99 μ?代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩衝液(10 mM):乙醇(體積比9:1)，L-丙氨酸(50 μ M)、L-精氨酸(50 μ M)、L-天門冬醯胺(50 μ M)、L-天門冬氨酸(50 μ M)、L-半胱氨酸(50 μ M)、L-穀氨醯胺(50 μ M)、L-穀氨酸甘氨酸(50 μ M)、L-組氨酸(50 μ M)、L-異亮氨酸(50 μ M)、L-亮氨酸(50 μ M)、L-賴氨酸(50 μ Μ)、甲硫氨酸(50 μ Μ)、苯丙氨酸(50 μ M)、L-脯氨酸(50 μ Μ)、L-絲氨酸(50 μ Μ)、L-蘇氨酸(50 μ Μ)、L-色氨酸(50 μ Μ)、L-酪氨酸(50 μ Μ)、L-纈氨酸(50 μ Μ)、高半胱氨酸(50 μ Μ)、還原型穀胱甘肽(50μΜ)。
[0022](2)向反應體系中加入I μ?終濃度為10 μ M 4_三氟甲基_7_丙烯羰氧基香豆素起始反應；
(3)30 min後，進行螢光檢測(λΕχ=380 nm, λ Em=500 nm);計算各體系中螢光強度(見圖6)；
實施例3 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素與半胱氨酸濃度線性關係
(I)預先準備99 μ?代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩衝液(10 mM):乙醇(體積比9:1)，半胱氨酸(0-100 μ M)，於25°C條件下反應30分鐘;
(2向反應體系中加入I μ?終濃度為100 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反應;
(3)30 min後，進行螢光檢測(λΕχ=380 nm, λ Em=500 nm);計算各體系中螢光強度，建立螢光強度與半胱氨酸濃度標準曲線(見圖7);標準曲線為y = 14905x + 3122.5，其中y代表螢光強度，X代表半胱氨酸濃度。
[0023]實施例4 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素為探針與半胱氨酸反應螢光強度變化與時間的關係
(I)預先準備99 μ?代謝反應體系，包括pH 7.4的PBS緩衝液(10 mM):乙醇(體積比9:1)，半胱氨酸(50 μΜ)；
(2向反應體系中加入I μ?終濃度為10 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反應;
(3)90 min 內，每隔 I mn 進行一次突光檢測(λ Ex=380 nm, λ Em=500 nm);(見圖 8); 實施例5定量測定人肺腺癌A549細胞中半胱氨酸含量
(I)人肺腺癌A549細胞系培養於蓋玻片上，採用的培養基是DMEM培養基(含10%小牛血清)以及100 μ g/ml的雙抗，培養環境為25°C的5% 二氧化碳培養箱中。
[0024](2)使用之前，貼壁細胞採用不含血清的DMEM培養基衝洗3次，加入終濃度為10μ M的4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素，於25°C溫孵40分鐘。
[0025](3)之後，採用PBS緩衝液衝洗3次。在雷射共聚焦顯微鏡下觀察細胞，通過螢光分布位置與強度來顯示細胞中含量(見圖9)。
[0026]實施例6定量測定人血中半胱氨酸含量
(1)向380μ I的經PBS:乙醇溶液(體積比9:1)稀釋的10%正常人血漿中加入20 μ I最終半胱氨酸濃度分別為2μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、30μΜ、40 μ Μ、50 μ M半胱氨酸溶液；
(2)向反應體系中加入Iμ?終濃度為10 μ M 4-三氟甲基-7-丙烯羰氧基香豆素起始反應;
(3)進行螢光檢測(λΕχ=380nm, λ Em=500 nm);計算信噪比S/N>10，檢測不同半胱氨酸含量血漿中螢光強度信號。
【權利要求】
1.一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針，其特徵在於:所述螢光探針為4位含有不同取代基團的7-羥基香豆素衍生物，其結構通式如下:
2.根據權利要求1所述的一種用於識別半胱氨酸的特異性螢光探針，其特徵在於:所述螢光探針應用於生物樣本中半胱氨酸含量的定量評價。
【文檔編號】G01N21/64GK103755672SQ201410037292
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】崔京南, 馮磊 申請人:大連理工常熟研究院有限公司