選擇性核酸片段回收的製作方法

2023-12-04 19:21:21

選擇性核酸片段回收的製作方法
【專利摘要】本發明提供了用於核酸純化以及片段選擇與回收的方法和試劑盒。通過調節結合緩衝液的鹽濃度和/或pH，只有具有所需尺寸範圍的核酸片段能夠在某些鹽濃度和/或pH條件下可逆地並且非特異性地結合到固體表面，並且可以隨後在水和/或低鹽洗脫緩衝液中從所述固體表面洗脫和/或回收。
【專利說明】選擇性核酸片段回收
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年6月1日提交的美國臨時申請序列號61/689,221的優先權， 這個臨時申請以其全文引用的方式併入本文中。

【技術領域】
[0003] 本發明涉及用於核酸純化以及片段尺寸選擇與回收的方法。
[0004] 發明背景
[0005] 許多分子生物學應用，如毛細管電泳、核苷酸測序，需要分離高質量的核酸製劑。 質量是用於所有測序方法以及用於基因治療方案的毛細管電泳的特別重要的因素。數量也 是用於一些應用的同等重要的考慮因素，例如，大規模基因組作圖和測序計劃，其需要產生 成千上萬個高質量的DNA模板。
[0006] 如下一代測序（Next Generation Sequencing ;NGS)的新型技術的出現需要在 DNA片段的某些群組的精確尺寸控制下的高質量的DNA樣品製備。在DNA片段化或剪切之 後，用於下一代測序的文庫構建過程主要需要與平臺無關的片段選擇。片段選擇後獲得高 回收率正成為用於減小測序偏差的重要的貢獻因素。舉例來說，為了製備用於Illumina NGS平臺的DNA文庫，在150-500bp範圍內的DNA片段的回收對於較好的測序結果來說是關 鍵的。其它NGS平臺需要範圍介於300-700bp之間的DNA片段。
[0007] 存在兩種常用方法來進行尺寸選擇以用於NGS文庫製備。一種方法是將片段化的 DNA運行到瓊脂糖凝膠中，然後切割具有所選的DNA尺寸的凝膠，然後從凝膠回收DNA片段。 這種方法是精密的，但非常緩慢並且是勞動密集型的。
[0008] 用來準備片段化的DNA的尺寸選擇的另一種通常使用的方法是通過調節聚乙二 醇（PEG)和鹽的濃度使DNA結合於塗布有官能團（如羧基）的磁性小珠上。參看美國專利 號6, 534, 262。這種方法有效地使DNA片段化並且可以在自動化平臺中容易地適應以一次 性處理大量樣品。然而，當DNA片段大於400bp時，這種方法不會很好地工作以使DNA片段 化。不需要的大DNA片段降低了後續NGS結果的數據質量並且浪費了儀器的能力。對於需 要大DNA片段的NGS平臺，例如用於Roche 454 Genome Sequencer的NGS平臺，這種方法 並不適合。
[0009] 美國專利號5, 234, 809描述了一種使用固相粒子以在離液鹽存在下特異性地和/ 或非特異性地結合來自樣品的核酸的方法，這些離液鹽如胍鹽、碘化鈉和碘化鉀。然而，這 種方法並未提供對核酸片段的任何尺寸控制。
[0010] 因此，下一代測序（NGS)的不斷增長的應用需要新的核酸純化與片段尺寸選擇方 法，這些方法提供了高的核酸回收率和精確的片段尺寸控制。 發明概要
[0011] 本發明提供了用於核酸純化與片段尺寸選擇的方法和試劑盒。在某些實施方案 中，本發明提供了一種選擇性地回收核酸片段的方法，其包括：a)將目標核酸與具有選定 pH和鹽濃度的結合緩衝液混合以允許具有所需尺寸範圍的核酸片段結合到固體表面；b) 將來自步驟a)的混合物施加到固體表面以使得只有具有所需尺寸範圍的核酸片段可逆地 並且非特異性地結合到固體表面；以及c)通過用洗脫緩衝液從固體表面洗脫結合的核酸 片段來選擇性地回收具有所需尺寸範圍的結合的核酸片段。
[0012] 在某些實施方案中，本發明方法中所用的結合緩衝液包含離液鹽。離液鹽的實例 包括（但不限於）鹽酸胍（GHCl)、硫氰酸胍（GITC)、碘化鈉（NaI)和高氯酸鈉，以及其混合 物。在某些實施方案中，結合緩衝液的離液鹽的濃度經過調節以使得只有具有所需尺寸範 圍的某些核酸片段能夠可逆地並且非特異性地結合到固體表面，並且隨後用洗脫緩衝液從 固體表面洗脫。在某些實施方案中，鹽酸胍（GHCl)或硫氰酸胍（GITC)的濃度介於0. 8-5. OM 之間；碘化鈉（NaI)的濃度介於0. 8-7. OM之間；並且高氯酸鈉的濃度介於I. 0-7. OM之間。 在某些實施方案中，結合緩衝液中的離液鹽濃度是通過用水稀釋結合緩衝液來調節。
[0013] 本發明提供了，通過調節結合緩衝液中的離液鹽濃度，只有具有所需尺寸範圍的 某些核酸片段能夠結合到固體表面，不需要的核酸片段與結合緩衝液一起保留在樣品混合 物中，並且在離心後被棄去。在某些實施方案中，固體表面包括（但不限於）二氧化矽膜濾 柱或二氧化矽塗布的磁性微粒（小珠）。在某些實施方案中，核酸片段包括（但不限於）DNA 片段、RNA片段或PNA片段。
[0014] 在某些實施方案中，本發明提供了一種從二氧化矽膜濾柱選擇性地回收具有小於 或等於100bp、小於或等於200bp或小於或等於300bp的所需尺寸範圍的DNA片段的方法。 本發明方法包括將目標DNA樣品（例如，100 μ 1)與包含4M硫氰酸胍（GITC，pH 7.0)的結 合緩衝液（例如，100 μ 1)混合，其中在將每種混合物獨立地施加到二氧化矽膜柱中之前， 用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水進一步稀釋每種DNA樣品混合物（總共200 μ 1)。只有小於 或等於IOObp的DNA片段當用200 μ 1水稀釋時在約I. OM的GITC的最終濃度下、小於或等 於200bp的DNA片段當用300 μ 1水稀釋時在約0. 8Μ的GITC的最終濃度下、以及小於或等 於300bp的DNA片段當用400 μ 1水稀釋時在約0. 7Μ的GITC的最終濃度下，能夠結合到二 氧化矽膜柱，並且隨後從二氧化矽膜柱洗脫並在水和/或含有低鹽的洗脫緩衝液中回收。 每種混合物的PH為約7. 0並且由於與DNA樣品混合的結合緩衝液而可能稍有變化。
[0015] 在其它實施方案中，本發明提供了一種從二氧化矽塗布的微粒選擇性地回收具有 小於或等於200bp、小於或等於300bp或小於或等於400bp的所需尺寸範圍的DNA片段的方 法。本發明方法包括將目標DNA樣品與包含4M硫氰酸胍（GITC)的結合緩衝液混合，其中 在將每種混合物進一步與二氧化矽塗布的微粒組合之前，用200 μ 1、300 μ 1或400 μ 1水進 一步稀釋每種DNA樣品混合物。只有小於或等於200bp的DNA片段當用200 μ 1水稀釋時 在約I. OM的GITC的最終濃度下、小於或等於300bp的DNA片段當用300 μ 1水稀釋時在約 0. 8Μ的GITC的最終濃度下、以及小於或等於400bp的DNA片段當用400 μ 1水稀釋時在約 0. 7Μ的GITC的最終濃度下，能夠結合到二氧化矽塗布的微粒，並且隨後從微粒洗脫並在水 和/或含有低鹽的洗脫緩衝液中回收。類似地，每種混合物的PH為約7. 0並且由於與DNA 樣品混合的結合緩衝液而可能稍有變化。
[0016] 本發明進一步提供了一種通過調節過程中所用的結合緩衝液的鹽濃度或pH或兩 者來選擇性地回收具有所需尺寸範圍的核酸片段的方法。在某些實施方案中，本發明提供 了一種選擇性地回收具有所需尺寸範圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段的方法。本 發明方法包括以下步驟：a)通過將目標核酸與第一結合緩衝液混合來提供第一樣品混合 物，其中所述第一結合緩衝液的鹽濃度或PH經過調節以只允許較大的核酸片段，例如大於 700bp的DNA片段結合到固體表面；b)將來自步驟a)的所述第一樣品混合物施加到第一固 體表面；c)收集從第一固體表面與第一樣品混合物離心而得的流通溶液；d)通過將流通溶 液與第二結合緩衝液混合來提供第二樣品混合物，其中所述第二結合緩衝液的鹽濃度或pH 經過調節以只允許具有較小的所需尺寸範圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段結合 到固體表面；e)將來自步驟d)的第二樣品混合物施加到第二固體表面；以及e)通過從所 述第二固體表面洗脫結合的核酸片段並在水和/或包含低鹽的洗脫緩衝液中將其回收來 選擇性地洗脫並回收具有較小的所需尺寸範圍的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段。
[0017] 本發明提供了，DNA結合能力隨著結合緩衝液中的離液鹽濃度與pH的組合而變 化。在某些實施方案中，當結合緩衝液含有最終濃度為約I. OM的GITC時，在約5. 33的pH 下，具有500bp或更高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約4. 92的pH下，具有 400bp或更高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約3. 44的pH下，具有300bp或更 高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約2. 57的pH下，具有250bp或更高的大多數 DNA片段能夠結合到固體表面（參看下表的說明）。
[0018] 在其它實施方案中，當結合緩衝液含有最終濃度為約2. 5M的GITC時，在約5. 67 的pH下，具有IOObp或更高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約5. 75的pH下，具 有IlObp或更高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約5. 83的pH下，具有120bp或 更高的大多數DNA片段能夠結合到固體表面；在約5. 90的pH下，具有130bp或更高的大多 數DNA片段能夠結合到固體表面；在約5. 96的pH下，具有HObp或更高的大多數DNA片段 能夠結合到固體表面；並且在約6. 02的pH下，具有150bp或更高的大多數DNA片段能夠結 合到固體表面（參看下表的說明）。
[0019]

【權利要求】
1. 一種選擇性地回收具有所需尺寸範圍的核酸片段的方法，其包括： a) 將目標核酸與具有選定pH和鹽濃度的結合緩衝液混合以允許具有所述所需尺寸範 圍的所述核酸片段結合到固體表面； b) 將來自步驟a)的混合物施加到所述固體表面以使得具有所述所需尺寸範圍的所述 核酸片段可逆地並且非特異性地結合到所述固體表面；以及 c) 通過用洗脫緩衝液從所述固體表面洗脫所述結合的核酸片段來選擇性地回收具有 所述所需尺寸範圍的所述核酸片段。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述結合緩衝液包含選自由以下組成的群組的離液 鹽：濃度介於〇. 8-5. 0M之間的鹽酸胍（GHC1)、濃度介於0. 8-5. 0M之間的硫氰酸胍（GITC)、 濃度介於〇. 8-7. 0M之間的碘化鈉（Nal)、濃度介於1. 0-7. 0M之間的高氯酸鈉，以及其混合 物。
3. 如權利要求2所述的方法，其中所述結合緩衝液的所述離液鹽濃度是用一定量的水 來調節，這允許具有所述所需尺寸範圍的所述核酸片段結合到所述固體表面並且隨後從所 述固體表面洗脫。
4. 如權利要求3所述的方法，其中所述固體表面是二氧化矽膜濾柱或二氧化矽塗布的 磁性微粒。
5. 如權利要求4所述的方法，其中所述核酸片段是DNA片段、RNA片段或PNA片段。
6. 如權利要求5所述的方法，其中當所述結合緩衝液中GITC的最終濃度為約1. 0M時， 具有小於或等於l〇〇bp的所需尺寸範圍的DNA片段結合到二氧化矽膜濾柱並且隨後從二氧 化矽膜濾柱洗脫。
7. 如權利要求5所述的方法，其中當所述結合緩衝液中GITC的最終濃度為約0. 8M時， 具有小於或等於200bp的所需尺寸範圍的DNA片段結合到二氧化矽膜濾柱並且隨後從二氧 化矽膜濾柱洗脫。
8. 如權利要求5所述的方法，其中當GITC的最終濃度為約0. 7M時，具有小於或等於 300bp的所需尺寸範圍的DNA片段結合到二氧化矽膜濾柱並且隨後從二氧化矽膜濾柱洗 脫。
9. 一種選擇性地回收具有所需尺寸範圍的核酸片段的方法，其包括： a) 通過將目標核酸與第一結合緩衝液混合來提供第一樣品混合物，其中所述第一結合 緩衝液的鹽濃度或pH經過調節以允許較大的核酸片段結合到固體表面； b) 將來自步驟a)的所述第一樣品混合物施加到第一固體表面； c) 收集從所述第一固體表面與所述第一樣品混合物離心而得的流通溶液； d) 通過將所述流通溶液與第二結合緩衝液混合來提供第二樣品混合物，其中所述第二 結合緩衝液的鹽濃度或pH經過調節以允許具有較小的所需尺寸範圍的核酸片段結合到固 體表面； e) 將來自步驟d)的所述第二樣品混合物施加到第二固體表面；以及 f) 通過用洗脫緩衝液從所述第二固體表面獨立地洗脫所述結合的核酸片段來選擇性 地回收具有所述較小的所需尺寸範圍的所述核酸片段。
10. 如權利要求9所述的方法，其中所述第一或第二結合緩衝液包含選自由以下組成 的群組的離液鹽：濃度介於0. 8-5. 0M之間的鹽酸胍（GHC1)、濃度介於0. 8-5. 0M之間的硫 氰酸胍（GITC)、濃度介於0. 8-7. 0M之間的碘化鈉（Nal)，以及濃度介於1. 0-7. 0M之間的高 氯酸鈉。
11. 如權利要求9所述的方法，其中所述第一結合緩衝液包含酸或其酸性鹽，以降低所 述結合緩衝液的pH以便促進較大的核酸片段結合到所述固體表面。
12. 如權利要求9所述的方法，其中所述第二結合緩衝液包含鹼或其鹼性鹽，以提高所 述結合緩衝液的pH以便去除較小的核酸片段。
13. 如權利要求9所述的方法，其中具有較小的所需尺寸範圍的所述核酸片段介於 150bp 與 700bp 之間。
14. 如權利要求9所述的方法，其中所述結合緩衝液的pH範圍介於5. 5與7. 5之間。
15. -種用於核酸片段選擇與回收的試劑盒，其包含： a) 用於核酸片段選擇性地結合到固相的一種或多種結合緩衝液； b) 塗布有官能團的一種或多種固相； c) 用於核酸純化與回收的其它試劑；以及 d) 提供用於核酸片段選擇與回收的方案的說明書。
16. 如權利要求15所述的試劑盒，其中所述固相是二氧化矽膜濾柱或二氧化矽塗布的 磁性微粒。
17. 如權利要求15所述的試劑盒，其中所述用於核酸純化與回收的試劑包含洗滌緩衝 液、洗脫緩衝液或水。
【文檔編號】C12N15/10GK104350152SQ201380030305
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年6月3日 優先權日:2012年6月1日
【發明者】奇·郭 申請人:歐米伽生物技術公司