乳腺特異性表達水牛prl基因載體、構建及其應用的製作方法

2023-11-06 06:04:52 2

專利名稱：乳腺特異性表達水牛prl基因載體、構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其是涉及一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、 構建及其應用。
背景技術：
催乳素(prolactin，PRL)是腦垂體分泌的一種單鏈多肽類激素，在動物體內具有多種重要的生物學功能，目前已發現的生物學功能超過300種，其中對啟動和維持泌乳具有重要意義，對乳蛋白、乳糖和乳脂等重要乳成分的合成起主要調控作用，因而PRL基因是與產奶量密切相關的基因之一。Brym等研究表明，PRL-RsaI位點對奶牛的產奶量和乳脂率具有顯著影響。PRL基因缺陷性小鼠中，純合體雌性小鼠乳腺不發育，切片結果顯示，其乳腺腺泡未得到正常發育。假孕兔注射PRL，能引起乳腺腺泡分化，高爾基氏囊泡膨大，腺泡腔內出現大量的脂肪球和蛋白質膠粒。體外實驗表明，PRL有促進未分化的乳腺細胞分裂的作用。而乳腺腺泡細胞的發育則需要雌二醇、孕酮與催乳素的協同作用。由此可見，催乳素 PRL基因對奶牛泌乳性能具有重要調節作用。
目前，對PRL的有關研究日益增多，開展實驗需要大量PRL蛋白，例如Elisa試劑盒需要標準品；生產各類抗體過程中，也需要PRL蛋白作為抗原。然而，由於PRL僅在垂體組織中大量表達，而垂體是一個很小的內分泌腺(例如成人垂體大小約為1x1. 5x0. 5cm3，重僅約0. 5 0. 6克)，從垂體中提取純化的催乳素價格極其昂貴，遠不能滿足市場需求。通過原核表達方法純化出的PRL蛋白，由於無法確保其序列空間摺疊的正確性，生產的蛋白難以保證具有生理活性。市場上的PRL蛋白主要依靠細胞系表達法生產，可是生產成本依然昂貴。因此，急需發展一種可以大量獲得廉價RPL蛋白的方法。
此外，2004年中國人均奶類年佔有量僅18. 4公斤，在世界上排在百名之後，不及世界平均水平的1/5、亞洲平均水平的1/2。因而，現階段急需一種可提高動物產奶量的方法，以滿足市場對奶製品的需求。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、構建及其應用，利用該乳腺特異性表達水牛PRL基因載體可生產轉基因動物，用於生產水牛PRL蛋白並能提高轉基因動物的產奶量，以滿足市場對廉價RPL蛋白和奶製品的大量需求。
為解決上述技術問題本發明採用如下技術方案乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，該載體是
載體一pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpo lyA-cmv-EGFP-SV40polyA，
或載體二pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
上述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構建方法，主要包括以下步驟
提取水牛垂體總mRNA，經反轉錄後，採用特異性引物進行PCR擴增得到全長水牛PRL的cDNA序列，經膠回收純化PCR產物後，將其TA克隆插入到pMD18T載體中，得到PMD18T-PRL 載體；
以步驟中得到的載體為模板，用加有酶切位點和His標籤的引物進行PCR 擴增，得到水牛PRL基因的CDS片段，並將其TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T_PRL/ His載體；
以 pMD18T 為載體骨架，依次酶切連入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-PRL/ His-KpnI, SalI-NotI-BCN-BamHI, SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 Sal I-EF3 21-EGFP-1 RES-NE0-SV40polyA-NotI四個片段，得到載體一或載體二。
步驟 引物為上遊引物 5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下遊引物 5，-GGGGTACC GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3『；
步驟 引物為上遊引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下遊引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
上述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體在生產轉基因動物中的應用。
採用原核注射法，將載體一或載體二轉移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉基因小鼠或水牛。
SalI和PvuI酶切載體一，回收片段溶於TE溶液中，線性化載體質粒經稀釋後注入到小鼠的受精卵原核中，再將受精卵移植入同期發情的代孕母鼠的輸卵管處，待產出子鼠， 經鑑定得到轉基因小鼠。
上述轉基因動物在生產水牛PRL蛋白中的應用。
本發明利用β-酪蛋白啟動子啟動水牛PRL基因，構建了乳腺特異性表達水牛PRL 基因載體，並採用原核注射法，將乳腺特異性表達水牛PRL基因載體轉入動物基因組中，使 PRL基因僅在乳腺中表達，建立乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉基因動物。通過對轉水牛 PRL基因小鼠的分析檢測，確定小鼠乳汁中表達水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表達可以顯著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1，4-半乳糖甘轉移酶的表達水平。本發明既保證了在乳腺中表達PRL基因，以增加轉基因動物的產奶量，又避免了全身表達PRL基因對轉基因動物的嚴重傷害；同時乳腺中表達的PRL蛋白隨乳汁排出，可在奶水中純化得到PRL蛋白，由於生產的PRL蛋白帶有His標籤，可為後期提純PRL蛋白提供便利，節約成本。因此，應用本發明可望通過轉PRL水牛的製備，獲得有大量廉價的的PRL蛋白，並提高水牛的產奶量和乳液中的酪蛋白水平，產生巨大的經濟效益和社會效益。


圖1是本發明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體圖，圖中雙標為 cmv-EGFP-SV40polyA 或 EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA，BCN 為 β-酪蛋白啟動子，PRL 為牛催乳素⑶S，polyA為β-酪蛋白3 『非翻譯區。
圖2是本發明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構建路線圖。
圖3是水牛PRL基因⑶S序列PCR擴增片段電泳圖。
圖4是本發明乳腺特異性表達水牛PRL基因載體一瞬時轉染Bcap37細胞系4 後螢光檢測圖，圖中A為常光，B為螢光。
圖5是瞬時轉染Bcap37細胞系後RT-PCR檢測電泳圖，圖中3. 8kb和5. 2kb分別是由不同長度的BCN啟動子構建的質粒。4
圖6是FO代轉PRL基因小鼠尾尖基因組DNA PCR檢測電泳圖，圖中1為陰性對照，18道為陽性對照。
圖7是轉PRL基因母鼠乳汁中PRL濃度Elisa檢測中的標準曲線圖。
圖8是乳腺特異性表達PRL基因對泌乳相關基因表達水平的QRT-PCR檢測圖。
具體實施方式
一、實驗材料和方法
所用載體、細胞系和試劑來源pMD18T載體(購自Takara公司)， PHC79-EF321-EGF P-IRES-NE0 由中國農大提供，pMD18T-BCNpolyA、pMD18T_BCN為發明人自行製備。引物合成以及序列測定由華大基因有限公司完成，Taq酶、T4DNA連接酶、內切酶、 QPT-PCR相關試劑均購自Takara公司，小提質粒以及膠回收試劑盒購自TIANGEN公司，去內毒小提質粒試劑盒購自OMEGA公司，細胞轉染以及胞質內注射用外源基因膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，細胞轉染作用的Bcap37細胞係為申請人保存，體細胞克隆所用試劑均來自 Sigma公司，Western Blot所用抗體來自康為公司，牛PRL Elisa檢測試劑盒購自Cusabio 公司。
所用基因組提取、總RNA提取、總蛋白提取、PCR擴增、反轉錄、酶切、膠回收、連接、 轉化、質粒提取、脂質體轉染法、顯微注射法、精子介導法、Western Blot、Southe rnBlot, Elisa、QRT-PCR等實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》(2000年，科學出版社)或相應的試劑盒說明書。轉基因小鼠的生產由廣州賽業公司代理。
二、乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構建
如圖1和圖2所示，根據NCBI上公布的牛PRL的mRNA序列(NM_173953. 2)設計合成的特異性引物，上遊引物5』 -AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，(見序列表SEQ. ID. No. 2的鹼基序列)，下遊引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 3 的鹼基序列)。從屠宰場取新鮮的水牛垂體組織，保存於液氮中運回到實驗室。採用Trizol 試劑提取總RNA，電泳檢測總RNA質量後進行反轉錄反應。取2uL反轉產物為模板，用上述引物進行 PCR擴增，擴增條件:94°C,30sec ；61°C，30sec ；72°C，55sec ；共 35 個循環。1. 5% 的瓊脂糖電泳檢測到901bp的特異性片段(見序列表SEQ. ID. No. 1的鹼基序列)，將該片段進行膠回收後TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T-PRL載體並進行測序。
以pMD18T-PRL載體為模板，用加有酶切位點和His標籤的引物擴增得到PRL的 CDS 區。上遊引物 5』 -CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGGTTCTACCCCCGTCTG TCCCAAT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 5 的鹼基序列)；下遊引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGC TACAGAGT-3，(見序列表 SEQ. ID. No. 6 的鹼基序列)。擴增條件:94 V，30sec ；61°C，30sec ； 72°C，5kec;共35個循環。1. 5%的瓊脂糖電泳檢測到804bp的特異性片段(見圖3，見序列表SEQ. ID. No. 4的鹼基序列)，將該片段進行膠回收後TA克隆插入到pMD18T載體中，得到pMD18T-PRL/His載體並測序。
將事先製備的p-BCNpolyA載體和環狀的pMD18T載體用McI和KpnI酶切連接，轉化DH5 α菌，篩選出陽性克隆，得到pMDIST-BCNpolyA載體；將該載體與上述pMD18T-PRL/His載體用BamHI和KpnI酶切連接，轉入DH5 α中篩選出陽性克隆， 得到pMD18T-PRL-BCNpolyA載體；將該載體與事先製備的p-BCN載體用BamHI和Sal酶切連接，轉入DH5 α中篩選出陽性克隆，得到pMD18T-BCN-PRL-BCNpolyA載體；將該載體分別與事先製備的p-BCNcmV-EGFP-SV40pOlyA載體和經過酶切位點改造的 pEF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA載體用NotI和Sal酶切連接，轉入DH5 α中篩選出陽性克隆,得到供原核注射的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 載體(載體一)和可供篩選的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA 載體 (載體二)。
三、細胞水平上檢測乳腺特異性表達水牛PRL基因載體
將pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 載體用 Lipo2000 脂質體轉染法，轉染Bcap37細胞系。如圖4所示，4 後觀察螢光，可見綠色螢光表達，收集細胞提取總RNA和總蛋白。總RNA經反轉錄後，PCR方法檢測PRL基因的表達情況，檢測引物 上遊引物 5，-ACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，；下遊引物 5，-GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。擴增條件:94°C,30sec ；6rC,30sec ；72°C,55sec ；共35個循環。1. 5%的瓊脂糖電泳檢測證明 (如圖5所示，將Bcap37細胞系分為四組，用脂質體2000分別轉染這3. 81ABCN啟動的PRL 載體、5. 21ABCN啟動的PRL載體、EGFP-Nl載體以及空白對照(只加脂質體2000)；圖中A 顯示，3. 81ABCN啟動子與5. 21Λ啟動子啟動的水牛PRL兩個載體RT-PCR擴增得到與相應質粒PCR擴增相同的804bp的PRL陽性片段，而EGFP-Nl以及空白對照則沒有擴增得到陽性片段；圖中B顯示，四組細胞均可擴增得到190bp的β -action內參基因的陽性片段)，BCN 可啟動PRL基因在Bcap37中轉錄。總蛋白進行^festern Blot檢測，一抗為小鼠抗6XHis 蛋白抗體，二抗為羊抗鼠抗體，檢測結果呈陽性。以上結果表明，BCN啟動子可在Bcap37細胞系中啟動PRL/His的表達。
四、乳腺特異性表達水牛PRL蛋白轉基因小鼠的生產與檢測
採用去內毒素質粒提取試劑盒提取pMD18T-BCN-PRL/ His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA質粒，用SalI和PvuI雙酶切該質粒，進行膠回收，回收片段溶於TE溶液中。線性化質粒載體稀釋後注入到小鼠的受精卵原核中，將受精卵移植入同期發情的代孕母鼠的輸卵管處，待產出子鼠。取產出的子鼠尾尖組織，提基因組DNA後進行PCR檢測，得到8隻陽性小鼠(如圖6所示，2、3、7、9、10、12、14和15道)。將經鑑定得到的轉基因小鼠進行EGFP螢光檢測，發射光525nm，激發光488nm，添加了螢光背景濾光片425nm，曝光時間為^ec,其中4隻小鼠中檢測明顯的綠色螢光，1隻檢測到微弱的綠色螢光，3隻未檢測綠色螢光。
將FO代轉基因小鼠與野生型小鼠交配，得到Fl代轉基因小鼠。提取其尾尖組織基因組DNA進行PCR檢測篩選，為避免假陽性，選擇兩對引物進行擴增，電泳檢測均為陽性的小鼠留種傳代。
將哺乳期轉PRL基因母鼠與仔鼠隔離4小時後，腹腔注射0. 3IU的縮宮素，IOmin 後腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有溫水的棉球輕敷乳頭周圍後採奶。將採集到的奶水按 1 10的體積加ddH20稀釋後，4°C 5000g離心lOmin，取中間溶液層做狗8丨6111 Blot檢測。 一抗為小鼠抗6XHis蛋白抗體，二抗為羊抗鼠抗體，檢測結果呈陽性。由此證明，BCN啟動子可在活體小鼠乳腺中啟動PRL/His的表達，並在奶水中檢測到PRL/His蛋白。
五、轉基因小鼠奶水中水牛PRL蛋白濃度檢測
將產仔第十天的母鼠與仔鼠隔離4小時後，腹腔注射0. 3IU的縮宮素，IOmin後腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有溫水的棉球輕敷乳頭周圍後採奶。將採集到的奶水按 1 10的體積加ddH20稀釋後，4°C 5000g離心lOmin，取中間溶液層用作水牛PRL Elisa 檢測。如圖7所示，將標準品組數據做擬合曲線分析，y = 51091Xe(-6 1022x), R2 = 0.9991， 計算得到小鼠奶水中水牛PRL的平均濃度為56. 71ng/ml，個體最高濃度為104. 8ng/ml。
六、乳腺特異性表達PRL基因對泌乳相關基因表達的影響
提取產仔第十天的母鼠的乳腺組織總RNA，反轉錄後，用去離子水稀釋到lOOng/μΙ左右，作為實時定量的模板。檢測引物乳脂合成相關基因——乙醯輔酶A羧化酶ACACA的上遊引物5』 -GAGGAGAACATCAAATACATCAG-3』，下遊引物 5，-ATCCTTACAACTTCT GCTCG-3，；乳糖合成相關基因——β -1,4-半乳糖基轉移酶B4galtl 的上遊引物5，-CGGCATTCAAGAGACAAGA-3，，下遊引物5，-CGCATCGTTTCCTTTGTA-3，； 乳蛋白相關基因——β酪蛋白CSN2的上遊引物5，-TAGCACCCTTCCTTCCAC-3，，下遊引物5，-GTACATTTCCAGTTTCAGTCAG-3，；PRL 的上遊引物5，-GCTGCCATACCTCCTCC, 下遊引物5，-GGTGACTAGGTGATACAGAGG-3，；內參基因β-actin的上遊引物 5，-CATCCGTAAAGACCTCTATGC-3，，下遊引物 5，-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，。擴增條件 95°C,20sec ；60°C,20sec ；72°C,30sec ；共40個循環。實驗結果表明(見圖8，小鼠分為四組第一組為奶水中檢測到PRL蛋白，紫外燈下見綠色螢光，尾尖組織基因組檢測PRL與 EGFP基因為陽性的轉PRL基因小鼠；第二組為奶水中未檢測到PRL蛋白，紫外燈下見綠色螢光，尾尖組織基因組檢測PRL與EGFP基因為陽性的轉PRL基因小鼠；第三組為奶水中未檢測到PRL蛋白，紫外燈下未見綠色螢光，尾尖組織基因組檢測PRL與EGFP基因為陽性的轉PRL基因小鼠；第四組為非轉基因小鼠。取以上四組泌乳第10天母鼠乳腺，QRT-PCR檢測 ACACA、B4galtl、CSN2、PRL基因的表達水平，結果顯示PRL基因表達的小鼠乳腺中B4galtl 和CSN2基因的表達水平較其他組顯著提高，其中CSN2基因的表達水平極顯著提高)，與對照組相比，水牛PRL基因的表達顯著提高了乳糖合成相關基因和乳蛋白中β酪蛋白基因的表達水平，而對乳脂相關基因的表達無顯著影響。
權利要求
1.一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，其特徵在於該載體是載體一 pMDIST-BCN-PRL/Hi s-BCNpo IyA-Cmv-EGFP-SV4OpolyA,或載體二 pMD18T-BCN-raL/His-BCNpolyA-EF32l-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
2.根據權利要求1所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構建方法，其特徵在於主要包括以下步驟提取水牛垂體總mRNA，經反轉錄後，採用特異性引物進行PCR擴增得到全長水牛PRL的cDNA序列，經膠回收純化PCR產物後，將其TA克隆插入到pMD18T載體中，得到 PMD18T-PRL 載體；以步驟中得到的載體為模板，用加有酶切位點和His標籤的引物進行PCR擴增，得到水牛PRL基因的CDS片段，並將其TA克隆到pMD18T載體中，得到pMD18T_PRL/His 載體； 以 pMD18T 為載體骨架，依次酶切連入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-raL/His-KpnI、 SalI-NotI-BCN-BamHI、SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 SalI-EF321-EGFP-IRES-NE0_S V40polyA-NotI四個片段，得到所述載體一或載體二。
3.根據權利要求2所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體的構建方法，其特徵在於 步驟所述引物為上遊引物5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下遊引物5，-GGGGTACCGATT TTGACATCGCTACAGAGT-3 『；步驟 所述引物為上遊引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下遊引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
4.根據權利要求1所述乳腺特異性表達水牛PRL基因載體在生產轉基因動物中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於採用原核注射法，將所述載體一或載體二轉移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉基因小鼠或水牛。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於Aall和PvuI酶切所述載體一，回收片段溶於TE溶液中，線性化載體質粒經稀釋後注入到小鼠的受精卵原核中，再將受精卵移植入同期發情的代孕母鼠的輸卵管處，待產出子鼠，經鑑定得到所述轉基因小鼠。
7.根據權利要求4所述轉基因動物在生產水牛PRL蛋白中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種乳腺特異性表達水牛PRL基因載體、構建及其應用，利用β-酪蛋白啟動子啟動水牛PRL基因，構建了乳腺特異性表達水牛PRL基因載體，並將該載體轉入動物基因組中獲得乳腺特異性表達水牛PRL蛋白的轉基因動物，其乳汁特異性表達水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表達可以顯著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1,4-半乳糖甘轉移酶的表達水平。因此，應用本發明可望通過轉PRL水牛的製備，獲得有大量廉價的的PRL蛋白，並提高水牛的產奶量和乳液中的酪蛋白水平，產生巨大的經濟效益和社會效益。
文檔編號C07K14/575GK102492722SQ20111040087
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月6日 優先權日2011年12月6日
發明者任豔萍, 劉慶友, 李湘萍, 石德順, 陸鳳花 申請人:廣西大學