一種戊糖片球菌菌株和以該菌株製成的發酵劑及該發酵劑在肉食品中的應用的製作方法

2023-11-07 06:56:57 2

專利名稱：一種戊糖片球菌菌株和以該菌株製成的發酵劑及該發酵劑在肉食品中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種戊糖片球菌菌株和以該菌株製成的發酵劑及該發酵劑在肉食品中的應用。
背景技術：
發酵香腸最初是由古羅馬人發明的一種發酵肉製品，目前已經形成多種類型和多種風格。發酵香腸在加工過程中經過微生物發酵作用，將糖轉化為各種酸和醇，使香腸的pH值降低；將脂肪和蛋白降解成醛和酮，使香腸具有良好的發酵風味；並經乾燥脫水使Aw下降。因此，發酵香腸具有獨特的風味品質，並具有較長的貨架期。發酵肉製品的發酵方式主要有非接種發酵法和接種發酵法兩種。其中非接種發酵易受雜菌感染，發酵啟動慢，發酵周期長；而接種發酵法就是通過接種優良的肉製品發酵菌種進行工業化生產。接種發酵縮短了發酵周期，提高了產品質量的穩定性，有利於工藝控制。雖然發酵香腸品種繁多，工藝各不相同，但接種發酵已經成為目前生產使用的主要方法，因此，篩選優良肉製品發酵微生物是接種發酵的基礎，而乳酸菌、微球菌和非致病性葡萄球菌是接種發酵最常使用的菌種。
目前，發達國家肉製品深加工比例高達30％以上，其中發酵肉製品佔據重要地位。當今的歐美國家，通過對微生物發酵肉製品的特性進行了較為深入的研究，已經完成了從傳統的自然發酵向微生物定向接種發酵的工業化生產的轉變，發酵肉製品的生產已具備相當成熟的生產工藝。目前，國外發酵肉製品主要研究內容之一是加強了優良微生物發酵菌種的選育工作。因此，通過對傳統發酵肉製品中發酵微生物的純種分離培養技術和微生物育種技術，篩選和構建具有優良性狀的微生物發酵劑菌種是研究的中心目標。
1940年，美國人L.B.Jenson在專利中第一次描述了乳酸菌在發酵香腸中的應用，從而開始了使用純培養的微生物發酵劑生產發酵香腸的第一步；1961年Deibel等發現片球菌可用作製作半乾香腸發酵劑的菌種；1974年Everson等申請了植物乳桿菌的專利，與此同時，其他菌株如微球菌、鏈球菌以及乳酸菌與其他混合菌種發酵劑的研究與應用也有所發展。目前應用於肉製品上的發酵劑主要包括細菌、酵母和黴菌等。
我國地域廣闊，生態條件複雜，生產實踐表明，在我國傳統肉製品主產區廣泛存在著優良的自然菌株，但由於分離篩選較為困難和對優良菌種在生產中重要性的認識程度不夠，使我國發酵肉製品乳酸菌資源研究與利用至今仍很薄弱。為此，我們系統地對我國的發酵肉製品微生物資源進行考查，希望從中優選出適合生產要求的菌株。

發明內容
本發明的目的是提供一種戊糖片球菌菌株和以該菌株製成的發酵劑，該發酵劑能應用於肉食品的發酵生產過程中。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.0918將所述戊糖片球菌I9放在改良MRS培養基中培養至對數生長晚期即獲得發酵劑。
所述改良MRS培養基的配製過程如下首先按下述配方配製培養液(單位/L)蛋白腖 10g酵母粉 5g 牛肉膏 10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25gK2HPO42g檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g 葡萄糖 20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10～20％(v/v)然後將按上述比例配好的培養液調pH至6.2-6.4，115℃溼熱滅菌30min。
將戊糖片球菌I9在改良MRS培養基中培養時，改良MRS培養基為28～32℃靜止狀態。
本發酵劑可以應用於肉食品發酵生產中，即可以在發酵肉食品生產過程中接種本發酵劑。
所述肉食品為發酵香腸，在灌腸前接種重量比為0.5～1％的發酵劑，在溫度20℃、相對溼度95％發酵至pH5.0；在溫度15℃、相對溼度90％繼續發酵pH4.6。
採用上述技術方案後，由於發酵劑為單菌株，避免了複合發酵劑製備的複雜性；本發酵劑在發酵適應性方面具有優良特性(1)耐鹽性氯化鈉在發酵香腸中的添加量通常為2.5～3.0％，而在某些類型發酵香腸，如義大利Salami中的添加量會更高一些，故篩選菌株必須有良好的食鹽耐受性，要求能夠在至少3.0％的食鹽濃度下能正常生長。經試驗本發酵劑菌種能耐受6.0％的食鹽溶液。
(2)耐NaNO2或NaNO3發酵香腸(幹發酵香腸除外)一般添加亞硝酸鹽，添加濃度可達到150mg/Kg；而於發酵香腸通常加入硝酸鹽，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工過程中，起發色和抑菌作用的主要是亞硝酸鈉，一般要求菌種至少在50mg/Kg的亞硝酸鹽濃度下能良好的生長。經試驗本發酵劑菌種在80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液中仍能生長。
同時，本發酵劑發酵風味濃鬱，不產生異味，產生生物胺的量很小，發色效果良好，提高了產品的風味品質。最適溫度為28℃，在57～60℃範圍內滅活。


圖1為細菌的分離流程圖；圖2為細菌在MRS-瓊脂培養基(+5％CaCO3)上產酸情況觀察圖；圖3為菌體形態特徵觀察圖；圖4為不同菌株發酵香腸中組胺生成量對比圖；圖5為不同菌株發酵香腸中腐胺和屍胺生成量對比圖。
本發明的戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)已於2003年4月8日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)予以保藏，保藏編號為CGMCC No.0918。
具體實施例方式
一、發酵香腸細菌菌種篩選標準1、安全性作為發酵香腸細菌菌種，必須對人體無害，具體內容包括①必須是革蘭氏陽性菌，無致病性，不得產生細菌毒素(尤其在葡萄球菌的篩選中)；②不產生生物胺。某些細菌有降解蛋白質和胺基酸的能力，降解過程中的某些代謝產物對人體有一定的危害。其中，有些細菌具有胺基酸脫羧能力，能夠代謝胺基酸生成生物胺，生物胺(尤其是組胺)在發酵食品中含量過高時，人食用後可能會引起過敏性反應；③不產生氨基甲酸乙酯(EC)。EC是自然發酵食品中一種常見的致癌物質，它主要是由某些LAB代謝精氨酸產生的，通過優良菌株的篩選能夠克服這一問題。
2、發酵適應性(1)耐鹽性氯化鈉在發酵香腸中的添加量通常為2.5～3.0％，而在某些類型發酵香腸，如義大利Salami，中的添加量會更高一些，故篩選菌株必須有良好的食鹽耐受性，要求能夠在至少3.0％的食鹽濃度下能正常生長。
(2)耐NaNO2或NaNO3發酵香腸(幹發酵香腸除外)一般添加亞硝酸鹽，添加濃度可達到150mg/Kg；而幹發酵香腸通常加入硝酸鹽，添加量200～600mg/Kg，甚至更高一些。但在加工過程中，起發色和抑菌作用的主要是亞硝酸鈉，一般要求菌種至少在50mg/Kg的亞硝酸鹽濃度下能良好的生長。
(3)產酸特性發酵香腸在常溫下之所以有一個較長的貨架期，是因為它自身固有的「二低一高」，低pH值、低水分及高的含鹽量。這就要求LAB能快速發酵葡萄糖或蔗糖產酸，這是決定發酵成功與否及發酵食品安全性的一個重要工藝條件。這項標準主要針對LAB中的桿菌和部分球菌。對於產酸速度比較緩慢的菌種，要求在3d內能使發酵香腸的pH值降至5.1±0.1；而對於產酸速度快的菌株，能在40h左右把發酵香腸的pH值降至5.0以下。
3、發酵特性優良發酵香腸橫切面組織結構緻密細膩，色澤呈可人的玫瑰紅色，中間脂肪乳白色或淡黃色，這些表觀現象均與微生物的發酵特性有關。
(1)有NO2-和NO3-還原能力肉製品的發色機理是硝酸鹽在還原細菌的作用下，還原成亞硝酸鹽，隨後與肉中乳酸發生反應形成亞硝酸，後者分解產生氧化氮(NO)，NO與肌紅蛋白或血紅蛋白結合生成亞硝基肌(血)紅蛋白，使肉具有鮮豔的玫瑰紅色。由此發色機理來看，所選菌株必須具有良好的硝酸鹽還原能力。但從現代發酵香腸加工工藝來講，非乾燥發酵香腸(最終aw在0.94～0.96之間)和半乾發酵香腸(最終aw在0.90～0.95之間)的發酵成熟期短，主要添加亞硝酸鹽及發色助劑抗壞血酸鈉，對添加菌種硝酸鹽還原能力的要求不太嚴格；而幹發酵香腸，兼顧發色和風味兩方面因素，主要添加硝酸鹽，這就要求所選菌株具有良好的硝酸鹽還原能力。經試驗本發明發酵劑菌株在80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液中仍能生長。
(2)接觸酶試驗陽性亞硝基肌紅蛋白或亞硝基血紅蛋白的生成是香腸發色的主要原因，但發酵成熟過程中微生物可能形成的H2O2會導致香腸顏色變灰發暗。H2O2酶陽性菌株能產生H2O2還原酶，把生成的H2O2分解成H2O和O2。因此，如果使用單菌種發酵，此菌必須為接觸酶陽性菌株；若為復配菌種發酵，那麼其中必須有接觸酶陽性菌株存在。
(3)發酵過程中不得有大量氣體產生，不得有粘液生成在發酵過程中，如乳酸菌異型發酵菌株，產生大量CO2，會影響到香腸的結構緻密性；而且某些菌類的代謝產物中有粘液狀物質，同樣也會損壞香腸的內部組織狀態。在菌株的篩選中，這些標準必須考慮。
(4)所選菌種在其生長代謝過程中能使香腸產生良好的發酵風味發酵香腸的風味組成非常複雜，它包括揮發性成分和非揮發性成分。從目前的研究來看，發酵香腸的風味形成涉及到脂肪、蛋白質的降解和胺基酸的異化等。微球菌和葡萄球菌是風味物質形成的主要菌系，但有些LAB如片球菌屬細菌也有類似特性。微球菌或葡萄球菌分泌脂肪酶，切裂大分子脂肪為短鏈或支鏈的脂肪酸；分泌蛋白酶，降解蛋白質成各種肽和胺基酸，胺基酸又進一步被其對應的酶類異化為各種醛或酮類風味物質。此外，在微生物代謝過程中還可能會產生具有不良氣味的代謝產物，如H2S。鑑於以上分析，篩選的微球菌或葡萄球菌的應具有以下特徵①能降解脂肪；②能分解蛋白質；③能異化胺基酸；④不產生影響風味的不良物質。
4、具有抗冷凍乾燥特性肉製品發酵劑生產一般採用真空冷凍乾燥法，因此要求優選菌株必須有較強地抗冷凍乾燥能力。主要表現在①在最佳培養條件下具有較大生物量(菌密度＞109cfu/ml)；②凍幹後具有較高的存活率。雖然影響存活率的因素很多(保護劑、凍幹工藝等)，但不同菌株間抗冷凍乾燥的能力還是存在很大的差異；③凍幹菌種的活力能夠保持較長時間。一般要求凍幹菌粉在存放一年後活菌數不低於109cfu/g。
二、菌株分離本菌株分離培養基分離採用MRS-瓊脂、改良MRS-瓊脂、MSA-瓊脂等固體培養基；活化採用MRS液體培養基。培養基配方如下(1L)(1)MRS培養基酵母浸出物4g，牛肉膏8g，細菌蛋白腖10g，葡萄糖20g，檸檬酸鈉2g，醋酸鈉5g/L，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O0.05g，Tween80 1mL，用400mL蒸餾水溶解。另外，用500mL蒸餾水溶解20g瓊脂，在沸水浴中完全溶解後，加入上述溶液，定容至1000mL，用1M的NaOH或1M HCl調整pH至5.0。121℃滅菌15min。
(2)改良MRS培養基配方蛋白腖10g；酵母粉5g；MgSO4·7H2O 0.58g；MnSO4·4H2O 0.25g；牛肉膏10g；K2HPO42g；檸檬酸二銨2g；乙酸鈉5g；葡萄糖20g；Tween80 1mL；番茄汁10％(v/v)；鹽酸半胱氨酸0.5g/L；調pH至6.2-6.4，115℃溼熱滅菌30min。
(3)MSA培養基牛肉膏1g，細菌蛋白腖10g，D-甘露醇10g，NaCI75g，酚紅0.025g，用400mL蒸餾水溶解(酚紅除外)，用1M HCl或NaOH調pH至7.4±0.2；加1％的酚紅溶液2.5ml，混勻；另外，用500mL蒸餾水溶解20g瓊脂，在沸水浴中完全溶解後，加入上述溶液，定容至1000mL。121℃滅菌15min。
採用平板劃線法對自然發酵肉製品(火腿和臘腸)中的乳酸細菌進行分離。取25g樣品與225ml生理鹽水於無菌均質袋中，用拍擊式均質器Bagmixer均質120sec(臘腸)或210sec(火腿)。吸取0.1ml的酒樣在分離培養基上劃線，30℃條件下培養2d後觀測菌落形成情況，經多次劃線分離，直到獲得純菌落。分離流程如圖1所示。
菌密度的測定採用平板計數法，計數結果並換算成菌落形成單位(cfu/mL)，每個培養試驗均重複三次，結果取平均值。乳酸測定採用氣相色譜法。pH值及總酸的測定按GB方法進行。生活力測定按最大菌密度法。具有硝酸鹽或亞硝酸鹽還原能力按《工業微生物學實驗技術》(杜連祥編著)進行。H2O2酶活性測定按《微生物學實驗》(範秀蓉編著)進行操作。食鹽耐受性測試是把測試菌接種於pH4.5的MRS液體培養基，觀察其生長狀況；食鹽耐受性的測定同乳酸耐受性的測定。氣體及黏液產生狀況研究是否有氣體產生採用半固體軟瓊脂柱法；是否有黏液產生可直接從挑起菌落的狀態進行觀察。
採用PCR方法對分離株I9的16SrRNA基因進行擴增。PCR採用原核生物通用引物27f(5』-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』)和1541R(5』-AAGGAGGTGATCCAGCC-3』)。PCR反應條件反應混合物總體積為50μl，內含2.5mM Mg2+，20mM Tris-HCl(pH9.0)，0.1％Triton-100(v/v)，100μM的dNTP，2.5UTaqDNA聚合酶，300ng的模板DNA，40pmol的引物，用25μl礦物油覆蓋並加蓋。PCR反應進行前，DNA模板94℃變性5min，隨後進行30個循環，每個循環包括94℃變性1min，52℃復性2min，72℃延伸3min，最後一個循環在72℃延伸2-3h。PCR反應在Thermolyne AmplitronI(Barnstead Thermolyne Corporation)中進行。
三、菌株16SrRNA測序及以該菌株為菌種製成的發酵劑PCR產物電泳純化後，聯結在質粒pSK-T中，攜帶有16SrRNA的重組質粒轉化E.coli DH5α中，然後在含氨卞青黴素Ap/IPTG/X-gal的平板上篩選白斑，用鹼解法提取質粒，經酶切後用聚乙二醇純化產物。16SrRNA的測序由中國科學院微生物研究所完成，用BLAST軟體將測定序列與GenBank中的16SrRNA序列進行同源性分析比較。
1、主要實驗儀器與設備手提式高壓滅菌鍋，101C型電熱鼓風乾燥箱，JA3003電子天平，DMB5-5數碼顯微鏡，Ph/ORH酸度離子計，厭氧操作培養箱，YJ超淨工作檯，微量移液器(上海求精)，BS-2F振蕩培養箱，pHB5型酸度計，超低溫冰箱，Lyostar真空冷凍乾燥機，GM-21低溫高速離心機，BS-2F恆溫培養箱，自動發酵室。
2、菌種鑑定個體形態特徵、菌落形態特徵、Gram染色、過氧化氫酶實驗、對不同脅迫環境的耐受性以及其他生理生化特徵的測定按凌代文主編的「乳酸細菌分類鑑定及實驗方法」和Holt J G，Krieg N R and Snath P H A，et al.Bergey’smanual of determinative bacteriology(9thedition).BatimoreWilliams Wilkins，1993兩部參考文獻的方法進行；菌種鑑定按Holt J G，Krieg N R and Snath P HA，et al.Bergey’s manual of determinative bacteriology(9thedition).BatimoreWilliams Wilkins，1993進行。
3、結果與分析3.1、發酵微生物的分離結果篩選優良肉製品發酵菌株，應根據菌種的發酵特性，結合產品特點對菌株進行篩選。優選菌株發酵特性研究的主要內容包括①食鹽耐受性(＞3％的食鹽溶液)；②亞硝酸鹽耐受性(在80-100mg/Kg濃度條件下仍能生長)；③能在27-43℃範圍內生長，最適溫度為30～32℃；④發酵副產物不產生異味；⑤無致病性；⑥產組胺量要小。
3.2、菌種分離本實驗從金華火腿、國外發酵火腿、國外肉製品發酵劑、從DSM C型和Yogurt type II型牛奶發酵劑等生境中共分離得到120餘株乳酸菌，分離結果如下
(1)從金華火腿中分離29株以無菌操作取金華火腿適量，加滅菌生理鹽水，均質，吸取上清液作梯度稀釋，傾注平板培養。依據菌落特徵，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之後轉接斜面，4℃保藏，備用。
(2)從國外發酵火腿中分離29株以無菌操作取金華火腿適量，加滅菌生理鹽水，均質，吸取上清液作梯度稀釋，傾注平板培養。依據菌落特徵，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之後轉接斜面，4℃保藏，備用。
(3)從國外肉製品發酵劑中分離12株以無菌操作取發酵劑適量，加滅菌生理鹽水梯度稀釋，傾注平板培養。依據菌落特徵，逐一挑取單菌落，以平板劃線兩次純化，之後轉接斜面，4℃保藏，備用。
(4)從DSM C型和Yogurt type II型牛奶發酵劑中分離共11株以無菌操作取發酵劑適量，加滅菌生理鹽水梯度稀釋，傾注平板培養。依據菌落特徵，逐一挑取單菌落，以平板劃線二次純化，之後轉接斜面，4℃保藏，備用。
另外，從其他發酵肉製品樣品中分離得到42株分離物。
3.3、菌株鑑定3.3.1、I9的鑑定(1)形態學特徵固體培養特徵在30℃條件下培養2d後，I9在MRS+5％CaCO3固體培養基上形成明顯的透明圈，表面光滑溼潤，如圖2所示。
細胞形態特徵I9菌株革蘭氏染色陽性，經亞甲藍單染色後與光學顯微鏡(1600×)下觀察，細胞球狀，四聯或成片狀排列，細胞直徑約1μm，如圖3所示。
液體培養特徵 在無菌條件下，用接種針挑取1個菌落于澄清的MRS液體培養基中30℃靜止培養，細菌在培養基中生長緩慢而均勻，達到最大渾濁度後，菌體逐漸沉澱到培養基的底部，菌體呈白色。
(2)生理生化特徵表1分離菌株I9的表型特徵

根據I9細菌表型特徵和生理生化特點(表1)，按照Bergey’s細菌鑑定手冊有關乳酸菌的鑑定標準，初步可以將I9歸類為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。
(3)I9的16SrRNA測序分析通過對分離菌株的16SrRNA序列(長度1477bp)與GenBank基因庫中所有已知序列進行了同源性比較，結果顯示分離株I9與戊糖片球菌(P.pentosaceus)具有高度的同源性(99％)。這從分子系統學角度證實分離株I9為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，結果如下CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGGTTAAGAAGAACGTGGGTAAGAGAACTGGTTACCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGA
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所述改良MRS培養基可按如下比例配製首先按下述配方配製培養液(單位/L)蛋白腖 10g酵母粉 5g 牛肉膏 10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25gK2HPO42g檸檬酸二銨 2g 乙酸鈉 5g 葡萄糖 20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸 0.5g 番茄汁 10％(v/v)然後將按上述比例配好的培養液調pH至6.4，115℃溼熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養基中培養時，改良MRS培養基為30℃靜止狀態。
在配製上述改良MRS培養基時，番茄汁也可按15％(v/v)的比例配製，並將按此比例配製的培養液調PH至6.3，115℃溼熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養基中培養時，改良MRS培養基為28℃靜止狀態。
在配製上述改良MRS培養基時，番茄汁還可按20％(v/v)的比例配製，並將按此比例配製的培養液調PH至6.2，115℃溼熱滅菌30min。戊糖片球菌I9在改良MRS培養基中培養時，改良MRS培養基為32℃靜止狀態。
四、該菌株製成的發酵劑在肉食品中的應用在發酵肉食品生產過程中可接種本發明的發酵劑。如在發酵香腸的生產過程中，在灌腸前接種重量比為0.5％的發酵劑，在溫度20℃、相對溼度95％發酵至pH5.0；在溫度15℃、相對溼度90％繼續發酵至pH4.6，發酵後在溫度14℃，相對溼度70％～80％下進行熟化。本發明的發酵劑發酵力適中，發酵進程平緩，酸味柔和，產品成熟後發酵香氣濃鬱，發色好，產品切片性良好。
在發酵香腸的生產過程中，也可按0.8％、1％或0.5％～1％之間的任意比例接種發酵劑。
發酵劑使用戊糖片球菌I9(Pediococcus pentosaceus I9)單菌種發酵劑。發酵香腸工藝流程第一步切肉、預凍(-18℃，24h)；第二步斬拌混合；第三步接種發酵劑(107個/g)；第四步灌腸；第五步發酵(溫度20℃、相對溼度95％發酵至pH5.0；溫度15℃、相對溼度90％繼續發酵至pH4.6)；第六步成熟(溫度14℃，相對溼度為70％-80％)。不添加香辛料。
在發酵食品如發酵香腸、酸奶、泡菜及葡萄酒中，大都含有生物胺。胺在生活細胞中具有重要的生理功能，但當人體吸收過量時，可能會引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等過敏性反應。此外，生物胺還是亞硝胺的前體，後者具有致癌效應。Vandekerckhove(1977)曾報導在老化的和黴菌成熟型的發酵香腸中，生物胺的含量可達100mg/Kg，有時甚至高達1000mg/Kg，因此，近年來，發酵食品中的生物胺含量問題已引起了人們的重視。
發酵香腸中生物胺是由胺基酸脫羧而產生的。其生成量取決於原料肉組織酶和微生物酶活力以及生物胺前體物(胺基酸、寡肽)的豐度。通過採用優質的新鮮生肉、適當的發酵劑和合理的發酵工藝，可以降低產品中的生物胺產量。其中，發酵劑菌種的相關胺基酸脫羧酶活性直接影響著產品中生物胺的含量，因為生產發酵香腸所使用的乳酸菌如乳桿菌、片球菌和微球菌等的大多數菌株具有對相關胺基酸脫羧能力，因而能夠在發酵過程中產生生物胺。通過篩選胺基酸脫羧酶活性低或無脫羧酶活性的突變株對於降低發酵香腸中的生物胺含量具有重要的意義。通過對本發明優選菌株的生物胺產生特性分析，以考查其在生產上的利用價值。
1、生物胺的測定生物胺(組胺、屍胺、腐胺、酪胺、亞精胺、精胺和色胺)的測定採用反相離子對柱後衍生法。
高效液相色譜儀日本島津LC10A型；色譜柱C18反相柱(DISCOVERY)；離子對試劑辛烷磺酸鈉；流動相10mmol/L辛烷磺酸鈉、0.1mol/L乙酸鈉溶液和乙腈；衍生液0.1鄰苯二甲醛溶液；激發波長340nm；發射波長440nm；流動相流速1.0ml/min；衍生液流速0.5ml/min。
取適量樣品用0.6mol/L的高氯酸提取後上機分析。
2、結果與分析2.1、不同菌株的組胺生成量組胺是發酵香腸中最重要的生物胺成分之一，由組氨酸脫羧而成。在生物胺中，組胺的生理毒性最強。生物胺在人體細胞內會被一些酶促代謝反應降解，但是酒精和有些藥物能抑制這些酶的活性，從而降低了脫毒效率。長期以來，研究者們認為只有Pediococcus屬細菌能夠產生組胺，但研究表明，乳桿菌屬(Lactobacillus)和葡萄酒菌屬(Staphylococcus)的一些菌株也有組氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase，HDC)活性，因此也能產生組胺。
從圖4能夠看出，所有的供試菌株均能在發酵過程中產生組胺，但含量隨著菌株的不同而異，即存在著菌株效應。L.sake 54的組胺產生量最高，達1.98mg/Kg，而L.pentosus R1的生成量最低，為0.831.98mg/Kg，P.pentosaceusI9和P.parvus M7的組胺產量也高於對照。
2.2不同菌株的腐胺和屍胺生成量賴氨酸脫羧基作用生成屍胺，精胺酸脫羧基作用生成腐胺。與組胺的生理作用相似，屍胺和腐胺也有升血壓的作用，同時具有較強的生理毒性，二者更是水產品和肉製品腐敗變質的特徵產物。圖5表明，供試的4株菌株都能在發酵過程中產生不等量的屍胺和腐胺，所有的菌株產生的屍胺量都比腐胺量高，而且存在著菌株效應。與對照(BactofermTMF-1)相比，乳桿菌(L.sake 54和L.pentosus R1)產生的腐胺比片球菌(P.pentosaceus I9和P.parvus M7)的相對要低。
本實驗還對發酵香腸中的酪胺、亞精胺、精胺和色胺的含量進行了測定，研究表明(表2)，所有菌株都能產生酪胺、亞精胺和精胺，但都不產生色胺。這表明，供試菌株都沒有色氨酸脫羧酶活性。
表2不同菌株發酵香腸中其他種類生物胺含量Table1 Other Biogenic amines in fermented sausage with different strains生物胺含量(mg/Kg)菌株酪胺亞精胺 精胺色胺P.pentosaceus I9 8.412.604.03未檢出L.sake 54 9.282.513.89未檢出L.pentosus R1 5.922.293.29未檢出P.parvus M76.182.023.88未檢出BactofermTMF-1 5.243.273.50未檢出2.3菌株復配對生物胺生成量的影響發酵香腸生產中通常使用的發酵劑大多為2種或兩種以上的菌株復配復配而成的發酵劑。發酵劑中各單個菌株間實際上可以看作是一種特殊的互生關係。一般而言，發酵劑中的乳酸菌如乳桿菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)的作用主要是在較短的時間內將香腸的pH降至5.0以下，以抑制其他有害微生物的生長。而與之互生的葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)主要與香腸的風味形成有密切關係。在香腸發酵基質中，各組分菌株可以單獨生活，但當它們在同一基質中生長時，又能夠通過各自的代謝活動而影響對方的代謝行為。表3表明，戊糖片球菌I9和木糖葡萄球菌I2復配後，能夠顯著降低發酵香腸中生物胺含量。其中，組胺的含量從1.42mg/Kg降到不能檢出，腐胺和酪胺的含量也有明顯的降低。此外，I9和I2復配發酵劑發酵產生的生物胺總量也低於I9單菌種發酵和商業發酵劑發酵產生的生物胺總量。
表3菌株復配對發酵香腸中生物胺含量的影響Table1 Effecf of coculture Starter on Biogenic amine content in fermented sausage生物胺含量(mg/Kg)生物胺總量菌株組胺 腐胺 屍胺酪胺 亞精胺 精胺色胺 (mg/Kg)P.pentosaceus I9 1.42 3.85 7.908.41 2.60 4.03未檢出 28.21P.pentosaceus I9+S.xylosus I2 未檢出1.53 7.203.14 2.61 3.45未檢出 17.93BactofermTMF-1 0.89 2.72 8.255.24 3.27 3.50未檢出 23.87注P.pentosaceus I9和S.xylosus I2的復配比例為1∶13.結論與討論由於酶和細菌的作用，肉中蛋白質、脂肪及糖類發生分解變化而腐敗變質。在肉品腐敗過程中，蛋白質分解產生氨(NH3)和胺類(R-NH2)等鹼性含氮的有毒物質如酪胺、組胺、屍胺、腐胺和色胺等，它們統稱為有毒胺。有毒胺具有一定的毒性，可引起食物中毒。如酪胺能引起血管收縮，組胺能使血管擴張，屍胺、腐胺等也能引起明顯的中毒反應，因此，在發酵香腸產生中要通過篩選優良的發酵劑和工藝措施來降低產品中生物胺的含量。本實驗結果表明，在香腸發酵過程中，所有供試菌株與商業發酵劑都能產生組胺、腐胺、屍胺、酪胺、亞精胺和精胺，但都不產生色胺，各供試菌株生物胺的生成量存在著菌株效應。將片球菌與葡萄球菌復配製得的複合型發酵劑接種發酵，能夠顯著降低產品中生物胺總量尤其是組胺、腐胺和酪胺的含量。本研究結果也為篩選優良生產性能而且生物胺生產量低的自然菌株提供了參考依據。
權利要求
1.一種戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCCNo.0918。
2.一種以權利要求1所述戊糖片球菌菌株製成的發酵劑，其特徵在於將所述戊糖片球菌I9放在改良MRS培養基中培養至對數生長晚期即獲得發酵劑。
3.如權利要求2所述的發酵劑，其特徵在於所述改良MRS培養基的配製過程如下首先按下述配方配製培養液(單位/L)蛋白腖10g 酵母粉5g 牛肉膏10gMgSO4·7H2O 0.58g MnSO4·4H2O 0.25g K2HPO42g檸檬酸二銨2g 乙酸鈉5g 葡萄糖20gTween80 1mL 鹽酸半胱氨酸0.5g 番茄汁10～20％(v/v)然後將按上述比例配好的培養液調pH至6.2-6.4，115℃溼熱滅菌30min。
4.如權利要求2或3所述的發酵劑，其特徵在於將戊糖片球菌I9在改良MRS培養基中培養時，改良MRS培養基為28～32℃靜止狀態。
5.權利要求2所述的發酵劑在肉食品中的應用，其特徵在於在發酵肉食品生產過程中接種本發酵劑。
6.如權利要求5所述的發酵劑在肉食品中的應用，其特徵在於所述肉食品為發酵香腸，在灌腸前接種重量比為0.5～1％的發酵劑，在溫度20℃、相對溼度95％發酵至pH5.0；在溫度15℃、相對溼度90％繼續發酵至pH4.6。
全文摘要
本發明公開了一種戊糖片球菌菌株和以該菌株製成的發酵劑，本發明的戊糖片球菌I9菌株(Pediococcus Pentosaceus I9)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.0918。本發明戊糖片球菌I9菌株能耐受6.0％的食鹽溶液和80～100mg/Kg濃度條件下的亞硝酸鹽溶液，以其為菌種製成的發酵劑可以應用於肉食品的發酵生產中，製作出的發酵香腸發酵風味濃鬱，不產生異味，產生生物胺的量很小，發色效果良好，提高了產品的風味品質。最適溫度為28℃，在57～60℃範圍內滅活。
文檔編號C12N1/20GK1566324SQ0312622
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月26日 優先權日2003年6月26日
發明者李紅偉, 張春暉, 王玉芬 申請人:河南雙匯投資發展股份有限公司