一種高活力β-澱粉酶的製備方法

2023-12-10 02:22:06 1

專利名稱：一種高活力β-澱粉酶的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種植物中的澱粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業化生產高活力β -澱粉酶的方法。
背景技術：
β-澱粉酶(E.C3.2.1.2)是澱粉酶的一種，又稱1，-3-麥芽糖苷酶。β -澱粉酶廣泛存在於大麥，小麥，甘薯，豆類等植物中，還有不少微生物能產生β_澱粉酶。β_澱粉酶在食品工業中作為生物催化劑，可以應用於麥芽糖、啤酒、麵包等的生產和製造。在食品點心上使用β_澱粉酶可以防止澱粉老化，在醫藥工業上製造注射用麥芽糖，可以和α-澱粉酶一起作為消化劑。近年來，以β_澱粉酶作為生物催化劑製造麥芽糖漿，補足了我國食糖不足的狀況。隨著科技進步，人們對高麥芽糖漿，超高麥芽糖漿研究非常活躍。但國內由甘薯，小麥來生產澱粉酶的活力低(50萬u/ml)，耐溫性差(58°C)，不符合高麥芽糖，超高麥芽糖漿的生產要求。進口的高活力β -澱粉酶雖然能夠符合高麥芽糖漿的生產，但由於其耐溫性不及大豆β-澱粉酶，在用於生產高麥芽糖時β-澱粉酶的使用量大，且生產高麥芽糖時所必需的普羅蘭酶用量也要大於大豆β_澱粉酶(大麥β_澱粉酶的使用PH窄和普羅蘭酶pH不一致所造成的)。上述高活力大豆β_澱粉酶的工藝應用於工業化生產，使用範圍受到限制，價格高，不能滿足需求。與此同時，國內科研部門雖然取得了不少澱粉酶的製備方法科研成果，但是大部分能耗高，環境汙染高(鹽析方法`)，原料的綜合利用率低，成本高(原料採用低溫豆柏，價格3500元/噸以上)(參見名稱為《大豆β -澱粉酶的製備工藝》、專利號為99102506的中國發明專利)。

發明內容
本發明的目的是提供一種消耗資源少，得率高、活力高、性能好的β -澱粉酶製備方法。依據該製備方法獲得的產品具有耐溫、耐酸優於同類產品的優點，且保存穩定性好，是應用效果較好的高活力β_澱粉酶。本發明提供了一種β -澱粉酶的製備方法，包括分離水收集，預處理，沉澱並溶出β -澱粉酶，採用聚丙烯酸與溶液中的β -澱粉酶形成複合沉澱物，溶解複合沉澱物，調節PH大於等於6.0溶出β-澱粉酶，經淨化，濃縮，配以穩定劑，精製後獲得高活力澱粉酶
上述方法中，可以採用廢棄的植物提取液作為原料。例如，本發明的優選例中，以大豆蛋白分離水作為分離水原料。上述方法中，可以採用聚凝劑及篩選的濾材對分離水進行固液分離，使濾液不會堵塞超濾膜。其中，分離水收集後，調整溫度10-50°c，pH 3.2-5.0。
加入濃度為0.05-5%的PAA (聚丙烯酸)。加入PAA後分離沉澱物，再中和沉澱物溶出澱粉酶。在本發明的一個優選實施例中，上述的PAA.Ε (聚丙烯酸.澱粉酶)複合沉澱物，加水溶解並加入碳酸鈣中和至ΡΗ6.0以上，促進Ca2+能與沉澱物中PAA形成溶解度更小的複合物沉澱，而使酶蛋白釋放溶於水中。上述方法中，溶出澱粉酶後，還包括聚凝除雜質，超濾的步驟。超濾過程中，可以採用10Κ-30Κ道爾頓分子量的濾材進行濃縮。所述的濾材可以是有機膜、無機膜或者金屬膜。超濾到一定倍數後，調整pH和聚凝劑使得殘餘蛋白及膠體物質沉澱。超濾可以分二段進行，第一段對濃縮液進行聚凝處理並調整pH，使得濃縮液中非含酶物質得到沉澱；第二段對第一段獲得的產物過濾後再進行二次濃縮。超濾分二次進行，首先對粗酶液進行聚凝處理並調整PH4.5-5.5，使得非酶物質得到沉澱，過濾後的粗酶液再進行超濾濃縮。從而有效地提高了濃縮倍數從而得到高活性的β _澱粉酶。在本發明的優選例中，加入了酶穩定劑(含有食鹽，糊精，醋酸鈉)，以進一步提升所得大豆澱粉酶的性能。上述方法中，可以採用助濾劑進行固液分離或微孔膜進行精製，和去除微生物 本發明的製備方法，以廢棄植物提取液為原料，不僅變廢為寶，綠色環保，而且能夠大
幅度的減少大豆蛋白質工·廠分離水中C0D。化學需氧量COD (Chemical Oxygen Demand)是以化學方法測量水樣中需要被氧化的還原性物質的量。水樣在一定條件下，以氧化I升水樣中還原性物質所消耗的氧化劑的量為指標，折算成每升水樣全部被氧化後，需要的氧的毫克數，以mg/L表示。它反映了水中受還原性物質汙染的程度。該指標也作為有機物相對含量的綜合指標之一。利用本發明的製備方法，生產I噸高活力β -澱粉酶可以節約10餘噸豆柏，同時還可以減少大豆蛋白質工廠分離水中COD約20-30%。另一方面，本發明還提供了依據上述製備方法生產的大豆澱粉酶，其特性為最適作用溫度60-63°C，作用溫度範圍40-65°C，最適作用pH5.5，作用pH範圍3.8-7.0。本發明製備的β_澱粉酶，其酶活最高可以達到100萬u/ml (lu即I個酶活力單位，它是指定適宜反應條件下，每小時產生I毫克麥芽糖的酶量)。由於該產品具備上述優異特性，保證製糖高效率，又增強了抗禦微生物對糖化液汙染的危害。圖1顯示，本發明的製備方法生產的大豆β -澱粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥澱粉酶的活性就迅速下降。圖2顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -澱粉酶在pH彡4.5時，幾乎沒有活性，當pH大於4.5後，活性逐步提高，在pH=5.5時達到最高峰，隨後立即下降；而本發明的製備方法生產的大豆β-澱粉酶在較寬的PH範圍內，活性穩定。本發明高活力β -澱粉酶製備方法優異效果:
採用廢棄大豆蛋白分離液提取β_澱粉酶達到綜合利用，變廢為寶，能夠減少大豆蛋白質工廠分離水中C0D，對改善環境起到很好作用。
採用PAA沉澱分離獲得β_澱粉酶方法簡單，收率高，採用超濾濃縮可以獲得高活力β_澱粉酶。更重要的是，運用本發明獲得比其他植物提取的β_澱粉酶更優異的產品特性，保證製糖高效率又增強了抗禦微生物對糖化液汙染的危害。本發明高活力β_澱粉酶適合於上述工業產品的製造。特別是製造高麥芽糖漿，超高麥芽糖糖漿及防止澱粉老化的優選產品。比較試驗顯示，在生產高麥芽糖時，大豆β -澱粉酶的使用量相比大麥β -澱粉酶可以減少20%，普羅藍酶的用量也可減少20%。


圖1是大豆β -澱粉酶和大麥β -澱粉酶對溫度的耐受比較圖。其中，橫坐標是溫度(攝氏度)，縱坐標是相對酶活。SBA是大 β -澱粉酶,BBA是大麥β_澱粉酶。圖1顯示，本發明的製備方法生產的大豆β_澱粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥澱粉酶的活性就迅速下降。圖2是大豆β -澱粉酶和大麥β -澱粉酶對酸鹼度的耐受比較圖。其中，SBA=Soyβ-amylase (大豆 β-澱粉酶)，BBA=Barley β -amylase (大麥β -澱粉酶);
橫坐標是pH值，縱坐標是相對酶活。SBA是大豆β -澱粉酶，BBA是大麥β -澱粉酶；圖中顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -澱粉酶在pH彡4.5時，幾乎沒有活性，當pH大於4.5後，活性逐步提高，在 pH=5.5時達到最高峰，隨後立即下降；而本發明的製備方法生產的大豆澱粉酶在較寬的PH範圍內，活性穩定。圖3是330個單位(330u/g澱粉)的大豆β -澱粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應條件:pH4.562°C。圖4是330個單位(330u/g澱粉)的大麥β -澱粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應條件:pH4.562°C。圖5是在普羅藍酶添加0.5ASPU情況下，大麥β -澱粉酶和大豆β _澱粉酶生成麥芽糖的表現。圖6是在普羅藍酶添加1.0ASPU情況下，大麥β -澱粉酶和大豆β _澱粉酶生成麥芽糖的表現。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計
笪
ο除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練、人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1優選製備例I取分離水(蛋白分離後的廢水)IOOL (活性4125u/ml)，調整溫度45°C，pH3.4加入
0.P/oPAA獲得沉澱，經溶解加入IOOg碳酸鈣，中和pH6.30，經300cm2過濾器過濾，得到濾液用中孔纖維膜濃縮，配以酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精製得71.64萬u/ml成品416ml。實施例2優選製備例2
取收集分離水1500L (活性4380u/ml)，調整溫度44°C，pH3.3加入0.2%PAA獲得沉澱，加水1:5溶解，加入1.1kg碳酸鈣中和pH6.05，用Im2板框過濾得到濾液，用4寸卷式膜超濾濃縮，配以酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精製得到74.58萬u/ml成品6589ml。實施例3優選製備例3
取收集分離水IOM3 (活性4217u/ml)調整溫度44°C，中和pH3.4加入0.50%PAA獲得沉澱，經溶解加入1:5水溶解，加入IOkg碳酸鈣中和pH6.18，用8寸卷式膜超濾濃縮，經酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精製後得到91.64萬u/ml成品34787ml。實施例4優選製備例4
取收集分離水1000L (4530u/ml)，採用篩選的硅藻土過濾處理，濾液用膜超慮濃縮到20倍，第一次濃縮液用聚合氯化鋁(PAC)0.03%聚凝並調整pH到4.0-6.0,使濃縮液中的蛋白及膠體物質得到沉澱，過濾去除雜質，濾液進行二次超濾，二次濃縮液經酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精製得到90萬u/ml成品4836ml。實施例5大豆β-澱粉酶和大麥β-澱粉酶生成麥芽糖的性能比較
用實施例3獲得的大豆β-澱粉酶和目前中國普遍在用的大麥β-澱粉酶作比較製造麥芽糖方面的應用。所使用的普羅蘭酶(GCI 0ΡΤΙΜΑΧ L-1000)活性為1000 ASPU/g。所使用的大豆β-澱粉酶和大麥β -澱粉酶的活性相近，分別為大豆β澱粉酶705870U/ml，大麥β澱粉酶 708840u/mlo糖化試驗的條件設定如下:
基質濃度:日本澱粉 100，33%W/V濃度(DE = 11相當)/50mM冰醋酸-醋酸鈉緩衝溶液。酶的添加量:根據表I和表2的組合添加。
糖化pH溫度:大豆β -澱粉酶為ρΗ4.5，62.(TC ;大麥β -澱粉酶為ρΗ5.5，58.5°C。
糖化時間:O 48小時。
糖化目標:70%以上。按照大豆β -澱粉酶和大麥β -澱粉酶的最適合條件，就糖化能力作比較。表I中大豆β -澱粉酶在比大麥β -澱粉酶減少20%添加量時,糖化40小時後能夠同樣達到相同的糖化效果。另外由於大麥β -澱粉酶的適用pH和普羅藍酶不一致，因此對普羅藍酶有依存性(添加大於2ASPU)，而大豆β -澱粉酶和普羅藍酶的適用pH —致，因此當普羅藍酶添加到
0.75ASPU後對麥芽糖的增長作用不大了，所以生產高麥芽糖時普羅藍酶的添加量可以減少20%。這說明本發明的大豆澱粉酶生產製造麥芽糖時，成本相對較低。

注:Gl=葡萄糖，G2=麥芽糖，G3=麥芽三塘，G4=四糖。表I大豆β -澱粉酶和大麥β -澱粉酶的糖化比較試驗
權利要求
1.一種β-澱粉酶的製備方法，包括分離水收集，預處理，沉澱並溶出β-澱粉酶，其特徵在於，其包括步驟:採用聚丙烯酸與溶液中的β-澱粉酶形成複合沉澱物，溶解複合沉澱物，調節PH大於等於6.0溶出β -澱粉酶，經淨化，濃縮，配以穩定劑，精製獲得高活力的β -澱粉酶。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，分離水收集後，調整溫度10-50°C，pH3.2_5.0 ο
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，加入聚丙烯酸的終濃度為0.05-5%。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，溶出澱粉酶後，還包括超濾和除雜質的步驟。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，超濾採用10Κ-30Κ道爾頓分子量的有機膜、無機膜或者金屬膜進行濃縮。
6.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，超濾到一定倍數後，調整pH和聚凝劑使得殘餘蛋白及膠體物 質沉澱。
7.如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，超濾分二段進行，第一段對濃縮液進行聚凝處理並調整PH，使得濃縮液中非含酶物質得到沉澱；第二段對第一段獲得的產物過濾後再進行二次濃縮。
8.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於採用助濾劑進行固液分離或微孔膜進行精製和去除微生物。
9.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，採用大豆蛋白分離水作為分離水原料。
10.根據權利要求1所述的製備方法獲得的β-澱粉酶。
全文摘要
本發明涉及一種植物中的澱粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業化生產高活力β-澱粉酶的方法。本發明的β-澱粉酶的製備方法，包括分離水收集，預處理，沉澱並溶出β-澱粉酶，採用聚丙烯酸與溶液中的β-澱粉酶形成複合沉澱物，溶解複合沉澱物，調節pH大於等於6.0溶出β-澱粉酶。本發明是一種消耗資源少，得率高(收率75%左右)，活力高(通常70-90萬u/ml)的β-澱粉酶製備方法，所得產品對溫度和酸鹼度的耐受性好，應用於麥芽糖生產成本較低。
文檔編號C12N9/24GK103232982SQ201310177110
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月15日 優先權日2013年5月15日
發明者霍國昌, 許建中 申請人:常熟市諾科生化工程有限公司