一種金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒的製作方法

2023-12-10 05:25:36 3

專利名稱：一種金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種汞離子的檢測方法，尤其是涉及一種金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒。
背景技術：
汞(Hg)，是常溫下唯一的液態金屬，是重金屬之一。近年來，人類對重金屬汞的開採、冶煉、加工及商業製造活動日益增多，大量的汞進入大氣、水、土壤中存留、積累和遷移。汞的毒性大，在生物體內和環境中殘留時間長，嚴重威脅人類健康，故美國、歐盟、加拿大以及我國等許多國家和地區對食品、生活用品、環境中汞含量都做了嚴格限定，汞汙染的檢測 與監控已經成為重點關注的問題。自然界中的汞主要以離子形式(Hg2+)存在，故實現對汞離子的準確、靈敏、快速的現場檢測非常重要。目前檢測汞離子的方法主要有紫外一可見分光光度法、冷原子吸收光譜法、螢光光譜法、電化學法、離子色譜法、毛細管電泳法、重金屬快速測定儀法、試紙條法等。紫外一可見分光光度法選擇性差，檢出限高；原子吸收光譜法、螢光光譜法、電化學法、離子色譜法、毛細管電泳法，準確度和靈敏度高，但均需使用特定的儀器，價格昂貴，操作繁瑣，且要求檢測人員具備一定的專業知識，分析成本高，無法應用於現場檢測，難以普及；重金屬快速測定儀法可應用於現場檢測，但靈敏度不高、選擇性差，樣品預處理複雜；試紙條法以其快速、簡便、靈敏而在現場檢測中別具優勢，但其只能夠定性判斷是否含有檢測限含量以上的Hg2+，無法定量分析得到Hg2+的準確濃度。金標銀染(Gold label silver stain)技術是採用一個「夾心式」的基因雜交系統，通過探針DNA識別靶DNA或者其他研究對象，並將納米金顆粒與DNA雜交系統結合在一起後，浸入含銀離子的銀染試劑中，由於納米金顆粒對銀離子的還原有催化作用，銀染試劑中的銀離子在納米金顆粒表面被還原為單質銀而沉積，呈現出黑色的銀染信號。納米金顆粒數目越多，銀染信號的灰度值越大，而納米金顆粒數目取決於體系中靶DNA或者其他研究對象的數目，因此根據銀染信號的灰度值即可定量檢測靶DNA或者其他研究對象的濃度。目前，國內外還沒有關於將金標銀染技術應用於定量檢測汞離子的相關研究報導。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種高靈敏度、高選擇性且可定量分析汞離子濃度的金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種金標銀染定量檢測汞離子的方法，具體包括以下步驟
(I)娃燒化載玻片的製備
將載玻片置於piranha洗液中，於90-100°C加熱20-40 min後取出，用蒸餾水洗滌三次，置於N2氛中乾燥後，浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶液中，於室溫下矽烷化處理2-6h，再用乙醇洗淨後，於110-130°C真空乾燥l_3h後，得到矽烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7 3的比例混合得到；
(2)特異性DNA-納米金探針溶液的製備
將 30-40ul 的 100 uM 序列為 HS-5』-TTTTTTTTTT-3』的 DNA 和 O. 5-1. 5 mL 濃度為 20-25nM的納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育12-20小時後，加蒸餾水稀釋50-100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液；
(3)探針與樣品反應及銀染放大
將步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液按體積比1-3 :2-6混合，振蕩搖勻10-20 min後,取2-4 uL滴在娃燒化載玻片上,於室溫下至試樣點完全乾燥後,在試樣點上滴銀染試劑4-6 uL，室溫下暗箱靜置10-20 min後，立即用蒸餾水衝去多餘銀染試齊U，然後乾燥載玻片；
(4)金標銀染信號的定量分析
將乾燥後載玻片上的金標銀染試樣點掃描成圖片獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度。步驟(2)中所述的納米金顆粒的直徑為15-30 nm，所述的特異性DNA-納米金探針的結構為 AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。步驟(3)中所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,組分B為O. 0425 g/mL的氫醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑。步驟(4)的具體過程如下
A.用掃描儀將載玻片上的金標銀染試樣點掃描成圖片；
B.利用Matlab軟體的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，令信號的灰度值=255一讀出的灰度值，使信號的灰度值仍介於O至255之間,無色最小為O,全黑色最大為255,顏色越深，信號的灰度值越大；
C.設置信號的灰度值閾值為10，取信號的灰度值>10時的有效像素點，求出有效像素點數目；
D.將所有的有效像素點的金標銀染信號的灰度值加和，即得金標銀染信號的灰度總
值；
E.用金標銀染信號的灰度總值除以有效像素點數目，即得到金標銀染信號的灰度平均
值；
F.配製一系列不同濃度的汞離子溶液，按照前述步驟獲得金標銀染信號及其灰度平均值，建立金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係；
G.根據上述步驟獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度。一種金標銀染定量檢測汞離子的試劑盒，包括矽烷化載玻片、特異性DNA-納米金探針和銀染試劑，所述的特異性DNA-納米金探針在納米金上結合有特異性DNA，所述的特異性 DNA 的序列如下HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。所述的納米金顆粒的直徑為15-30 nm，所述的特異性DNA-納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』 ；
所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含O. 25 g/mL的AgNO3溶液，組分B為O. 0425 g/mL的氫醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑。發明原理納米金顆粒表面結合有含10個T鹼基的DNA，Hg2+存在時，不同納米金顆粒表面結合的DNA通過T一Hg2+—T錯配相互絞合,使納米金顆粒聚集，納米金顆粒數目減少，其對銀離子的還原能力降低，還原出來的銀離子量減少，產生的金標銀染信號顏色變淺，金標銀染信號灰度平均值降低。Hg2+濃度越高，納米金顆粒聚集程度越高，其對銀離子的還原能力越低，還原出來的銀離子量越少，產生的金標銀染信號顏色越淺，金標銀染信號灰度平均值越低。另外，通過控制DNA用量以控制同一納米金顆粒表面DNA相互之間的距離，可以確保納米金顆粒表面結合的DNA之間並不會發生T一Hg2+— T錯配。與現有技術相比，本發明的優點在於(1)高選擇性，常見金屬離子如Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 對檢測均無幹擾。原因在於特異性DNA-納米金探針的T-Hg2+-T錯配對汞離子具有高特異性的識別能力，其它金屬離子的幹擾可忽略；
(2)高靈敏度，檢測限達到O.I nM的Hg2+ ；
(3)可定量分析，通過建立金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，可以得到待測汞離子溶液的準確濃度；
(4)操作簡單，無需使用特定的儀器，一臺掃描儀即可，價格低廉，操作簡單，不要求檢測人員具備一定的專業知識，分析成本低，可應用於現場檢測，易於普及。綜上所述，本發明一種基於納米金(AuNPs)、特異性DNA、金標銀染技術的金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒，具有高靈敏度、高選擇性且可定量分析汞離子濃度，不僅操作簡單而且可現場檢測。


圖I為本發明金標銀染信號灰度平均值與汞離子濃度的對數之間的線性關係圖。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。實施案例I
本發明一種金標銀染定量檢測汞離子的方法，具體包括以下步驟
(1)娃燒化載玻片的製備
將載玻片置於piranha洗液中，90-100°C加熱20-40 min後取出，用蒸餾水洗滌三次，置於N2氛中乾燥後，浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶液中，於室溫下矽烷化處理2-6h，再用乙醇洗淨後，於110-130°C真空乾燥l_3h後，得到矽烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7 3的比例混合得到；
(2)特異性DNA-納米金探針溶液的製備
將 30-40ul 的 100 uM 序列為 HS-5』-TTTTTTTTTT-3』的 DNA 和 O. 5-1. 5 mL 濃度為 20-25nM的納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育12-20小時後，加蒸餾水稀釋50-100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液；上述納米金顆粒的直徑為15-30 nm，特異性DNA-納米金探針的結構為 AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』 ；
(3)探針與樣品反應及銀染放大
將步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液按體積比1-3 :2-6混合，振蕩搖勻10-20 min後,取2-4 uL滴在娃燒化載玻片上,於室溫下至試樣點完全乾燥後,在試樣點上滴銀染試劑4-6 uL，室溫下暗箱靜置10-20 min後，立即用蒸餾水衝去多餘銀染試齊U，然後乾燥載玻片；上述銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,組分B為O. 0425 g/mL的氫醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑；
(4)金標銀染信號的定量分析
將乾燥後載玻片上的金標銀染試樣點掃描成圖片獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度，具體過程如下
A.用掃描儀將載玻片上的金標銀染試樣點掃描成圖片；
B.利用Matlab軟體的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，每個像素點讀出的灰度值介於O至255之間,全黑色最小為O,無色最大為255。考慮數據處理的方便,令信號的灰度值=255 —讀出的灰度值，通過這種處理，信號的灰度值仍介於O至255之間，無色最小為0，全黑色最大為255，顏色越深，信號的灰度值越大；
C.由於金標銀染信號大致為圓形，掃描出的圖片周圍有很多空白，不能計為有效像素點。因此，設置信號的灰度值閾值為10，也就是信號的灰度值>10時才計為有效像素點，求出有效像素點數目；
D.將所有的有效像素點的金標銀染信號的灰度值加和，即得金標銀染信號的灰度總
值；
E.用金標銀染信號的灰度總值除以有效像素點數目，即得到金標銀染信號的灰度平均
值；
F.配製一系列不同濃度的汞離子溶液，按照前述步驟獲得金標銀染信號及其灰度平均值，建立金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係；
G.根據上述步驟獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度。實施案例2
本發明一種金標銀染定量檢測汞離子的試劑盒，包括矽烷化載玻片、特異性DNA-納米金探針和銀染試劑，特異性DNA-納米金探針在納米金上結合有特異性DNA，特異性DNA的序列如下HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。在此具體實施例中，納米金顆粒的直徑為15-30 nm，特異性DNA-納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含
O.25 g/mL 的 AgNO3 溶液,組分 B 為 O. 0425 g/mL 的氫醌、O. 064 g/mL 的朽1 檬酸、O. 059 g/mL 的檸檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑。
在此具體實施例中，娃燒化載玻片過程為將載玻片置於piranha洗液中，90-100°C加熱20-40 min後取出，用蒸懼水洗漆三次,置於N2氛中乾燥後,浸入l-3wt%的3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶液中，於室溫下矽烷化處理2-6h，再用乙醇洗淨後，於110-130°C真空乾燥l_3h後，得到矽烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7 3的比例混合得到。實施案例3
本發明金標銀染信號灰度平均值與汞離子濃度的定量關係的建立，具體包括以下步
驟
(1)載玻片的矽烷化
將載玻片置於Piranha洗液中，90°C加熱40 min後取出，用蒸餾水洗滌三次，置於N2氛中乾燥後，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶液於室溫下矽烷化處理6 h，再用 乙醇洗淨後110°C真空乾燥3 h，上述piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水以7 : 3的體積比例混合得到；
(2)特異性DNA-納米金探針溶液的製備
將 34 μ L 的 100 μ M 序列為 HS-5』 -TTTTTTTTTT-3 的 DNA 和 I mL 濃度為 22. 4 nM的納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育18小時後，加蒸餾水稀釋100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液。上述納米金顆粒的直徑為30 nm,特異性DNA-納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』 ；
(3)探針與樣品反應及銀染放大
取10 μ L上述步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液，分別與20 μ L濃度為O. IηΜ、0·2 ηΜ、0·5 ηΜ、1·0 ηΜ、10·0 ηΜ、20· O ηΜ、50· O ηΜ、100·0 ηΜ、200· O ηΜ、500· O ηΜ 的硝
酸汞混合，振蕩搖勻，20 min後，取3 μ L所得的混合溶液滴在矽烷化處理過的載玻片上，室溫至試樣點完全乾燥後，在試樣點上滴銀染試劑5 μ L，準確計時，室溫下暗箱靜置20 min後，立即用蒸餾水衝去多餘銀染試劑，乾燥載玻片；上述銀染試劑由組分A、組分B組成，其中，組分A為含O. 25 g/mL的AgNO3溶液,組分B為O. 0425 g/mL的氫醌、O. 064 g/mL的朽1檬酸、O. 059 g/mL的檸檬酸三鈉的混合溶液，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑；
(4)金標銀染信號的定量分析
第一步、用掃描儀將乾燥後載玻片上的金標銀染試樣點掃描成圖片；
第二步、利用Matlab軟體的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，每個像素點讀出的灰度值介於O至255之間,全黑色最小為O,無色最大為255。考慮數據處理的方便,令信號的灰度值=255 —讀出的灰度值，通過這種處理，信號的灰度值仍介於O至255之間，無色最小為0，全黑色最大為255，顏色越深，信號的灰度值越大；
第三步、因為金標銀染信號大致為圓形，掃描出的圖片周圍有很多空白，不能計為有效像素點。因此，設置信號的灰度值閾值為10，也就是信號的灰度值>10時才計為有效像素點，得到有效像素點數目分別為0. I ηΜ 45735個、0.2 ηΜ 50471個、O. 5 ηΜ 43718個、LOnM 34316 個、10.0 ηΜ 56682 個、20. O ηΜ 38969 個、50. O ηΜ 37001 個、100. O ηΜ38916 個、200. O ηΜ 35288 個、500. O ηΜ 34705 個；
第四步、將所有的有效像素點的金標銀染信號的灰度值加和，得到金標銀染信號的灰度總值為 O. I ηΜ 3833656,0. 2 ηΜ 4189917,0. 5 ηΜ 3569275、I. O ηΜ 2716516、10. O ηΜ4346359,20. O ηΜ 2900466,50. O ηΜ 2633438、100. O ηΜ 2707007,200.O ηΜ 2411092、500. O ηΜ 2277350 ；
第五步、用金標銀染信號的灰度總值除以有效像素點數目，得到金標銀染信號的灰度平均值為 O. I ηΜ 83. 8232425,0. 2 ηΜ 83. 0163262,0. 5 ηΜ 81. 6431447、I. O ηΜ79.1617904、10. O ηΜ 76.6797043,20. O ηΜ 74.4300854,50. O ηΜ 71.1720764、100. O ηΜ69.5602579,200. O ηΜ 68.3261165,500. O ηΜ 65.6202276 ；
第六步、由以上步驟獲得的金標銀染信號及其灰度平均值，建立金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係；
以灰度值(y)為縱坐標，汞離子濃度(X，ηΜ)為橫坐標作圖，如圖I所示，金標銀染信號灰度平均值與汞離子濃度的對數之間呈現線性關係，線性方程為y = 79.75303 -4. 9000*logxo 線性相關係數 R= — 0.9911。 實施案例4
本發明金標銀染定量檢測樣品溶液中汞離子的方法，具體步驟如下
(1)載玻片的矽烷化
將載玻片置於piranha洗液中，95°C加熱30 min後取出，用蒸懼水洗漆三次,置於N2氛中乾燥後，浸入2%的3-氨丙基三乙氧基矽烷(APTES)溶液於室溫下矽烷化處理4h，再用乙醇洗淨後120°C真空乾燥2 h，上述piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水以7 : 3的體積比例混合得到；
(2)特異性DNA-納米金探針溶液的製備
將 35 μ L 的 100 μ M 序列為 HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』 的 DNA 和 I mL 濃度為 22. 4 ηΜ的納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育18小時後，加蒸餾水稀釋80倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液，上述納米金顆粒的直徑為25 nm,特異性DNA-納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。(3)探針與樣品反應及銀染放大
取10 μ L上述步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液，與20 μ L的未知濃度的Hg2+試樣混合,振蕩搖勻15 min後,取3 μ L所得的混合溶液滴在娃燒化處理過的載玻片上，室溫至試樣點完全乾燥後，在試樣點上滴銀染試劑5 μ L，準確計時，室溫下暗箱靜置15min後，立即用蒸餾水衝去多餘銀染試劑，乾燥載玻片。上述銀染試劑由組分A、組分B組成，其中，組分A為O. 25 g/mL的AgNO3溶液，組分B為含O. 0425 g/mL的氫醌、O. 064 g/mL的檸檬酸、O. 059 g/mL的檸檬酸三鈉的混合溶液，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑；
(4)金標銀染信號的定量分析
第一步、用掃描儀將載玻片上的金標銀染信號掃描成圖片；
第二步、利用Matlab軟體的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，每個像素點讀出的灰度值介於O至255之間,全黑色最小為O,無色最大為255。考慮數據處理的方便,令信號的灰度值=255 —讀出的灰度值，通過這種處理，信號的灰度值仍介於O至255之間，無色最小為0，全黑色最大為255，顏色越深，信號的灰度值越大；
第三步、因為金標銀染信號大致為圓形，掃描出的圖片周圍有很多空白，不能計為有效像素點。因此，設置信號的灰度值閾值為10，也就是信號的灰度值>10時才計為有效像素點，得到有效像素點數目為32825個；
第四步、將所有的有效像素點的金標銀染信號的灰度值加和，得到金標銀染信號的灰度總值為2297685 ；
第五步、用金標銀染信號的灰度總值除以有效像素點數目，得到金標銀染信號的灰度平均值為69. 9980198 ；
第六步、未知濃度的汞離子溶液，按照上述步驟獲得金標銀染信號及其灰度平均值，根據實例2建立的金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，求算出其準確濃度。根據求得的平均灰度值，帶入線性方程y = 79. 75303 - 4. 9000*Igx，可知Hg2+濃度為 97. 7 ηΜ。實施案例5
聞選擇性和聞靈敏性的檢測試驗
按照實施例3的方法分別檢測混合溶液(含Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Μη2+、Ζη2+，各離子濃度均為O. I mM)、0. I ηΜ的Hg2+溶液及空白溶液，結果如表I所示，說明本發明金標銀染汞離子定量檢測方法具有高選擇性。表I
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表 I 所示的數據表明混合溶液(含 Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+，各離子濃度均為O. I mM)的平均灰度值與空白溶液的平均灰度值基本一致，而遠遠大於O. IηΜ的Hg2+溶液的平均灰度值，表明本檢測方法具有高選擇性且具有高靈敏度，常見金屬離子 Pb2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 對檢測無幹擾。當然，上述說明並非對本發明的限制，本發明也並不限於上述舉例。本技術領域的普通技術人員在本發明的實質範圍內，作出的變化、改型、添加或替換，也應屬於本發明的保護範圍。
權利要求
1.ー種金標銀染定量檢測汞離子的方法，其特徵在於具體包括以下步驟 (1)娃燒化載玻片的製備 將載玻片置於piranha洗液中，90-100°C加熱20-40 min後取出，用蒸餾水洗滌三次，置於N2氛中乾燥後，浸入l-3wt%的3-氨丙基三こ氧基矽烷(APTES)溶液中，於室溫下矽烷化處理2-6h，再用こ醇洗淨後，於110-130°C真空乾燥l_3h後，得到矽烷化載玻片，所述的piranha洗液為98%的濃硫酸和30%雙氧水按體積比7 3的比例混合得到； (2)特異性DNA-納米金探針溶液的製備 將 30-40ul 的 100 uM 序列為 HS-5』-rmTmTT-3』的 DNA 和 0. 5-1. 5 mL 濃度為 20-25nM的納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育12-20小時後，加蒸餾水稀釋50-100倍，即得特異性DNA-納米金探針溶液； (3)探針與樣品反應及銀染放大 將步驟(2)所得的特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液按體積比1-3 :2-6混合，振蕩搖勻10-20 min後,取2-4 uL滴在娃燒化載玻片上室溫至試樣點完全乾燥後,在試樣點上滴銀染試劑4-6 uL，室溫下暗箱靜置10-20 min後，立即用蒸餾水衝去多餘銀染試劑，然後乾燥載玻片； (4)金標銀染信號的定量分析 將載玻片上的金標銀染信號掃描成圖片獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度。
2.根據權利要求I所述的ー種金標銀染定量檢測汞離子的方法，其特徵在於步驟(2)中所述的納米金顆粒的直徑為15-30 nm，所述的特異性DNA納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。
3.根據權利要求I所述的ー種金標銀染定量檢測汞離子的方法，其特徵在於步驟(3)中所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含0. 25 g/mL的AgNO3溶液，組分B為0. 0425 g/mL的氫醌、0. 064 g/mL的朽1檬酸、0. 059g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑。
4.根據權利要求I所述的ー種金標銀染定量檢測汞離子的方法，其特徵在於步驟(4)的具體過程如下 A.用掃描儀將載玻片上的金標銀染信號掃描成圖片； B.利用Matlab軟體的imread命令，讀出每個像素點的灰度值，令信號的灰度值=255一讀出的灰度值，使信號的灰度值仍介於0至255之間,無色最小為0,全黑色最大為255,顔色越深，信號的灰度值越大； C.設置信號的灰度值閾值為10，取信號的灰度值>10時的有效像素點，求出有效像素點數目； D.將所有的有效像素點的金標銀染信號的灰度值加和，即得金標銀染信號的灰度總值； E.用金標銀染信號的灰度總值除以有效像素點數目，即得到金標銀染信號的灰度平均值； F.配製一系列不同濃度的汞離子溶液，按照前述步驟獲得金標銀染信號及其灰度平均值，建立金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係； G.根據上述步驟獲得待測樣品溶液的金標銀染信號及其灰度平均值，根據金標銀染信號灰度平均值與汞離子溶液濃度之間的定量關係，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度。
5.一種金標銀染定量檢測汞離子的試劑盒，其特徵在於包括矽烷化載玻片、特異性DNA-納米金探針和銀染試劑，所述的特異性DNA-納米金探針在納米金上結合有特異性DNA，所述的特異性DNA的序列如下HS-5』 -mmnTT-3』。
6.根據權利要求5所述的一種金標銀染定量檢測汞離子的試劑盒，其特徵在於所述的納米金顆粒的直徑為15-30nm，所述的特異性DNA-納米金探針的結構為AuNPs-HS-5』 -TTTTTTTTTT-3』。
7.根據權利要求5所述的一種金標銀染定量檢測汞離子的試劑盒，其特徵在於所述的銀染試劑由組分A和組分B組成，所述的組分A為含0. 25 g/mL的AgNO3溶液，組分B為0.0425 g/mL的氫醌、0. 064 g/mL的朽1檬酸、0. 059 g/mL的朽1檬酸三鈉按等體積比混合而成，臨用前將組分A、組分B按體積比3 : 100混合即得銀染試劑。
全文摘要
本發明公開了一種金標銀染定量檢測汞離子的方法及其試劑盒，特點是包括將載玻片加熱清洗乾燥，浸入APTES溶液中，於室溫下矽烷化處理再用乙醇洗淨後，於110-130℃真空乾燥1-3h後得到矽烷化載玻片的步驟；將DNA和納米金溶液混合，振蕩搖勻，室溫下溫育加水稀釋得到特異性DNA-納米金探針溶液的步驟；將特異性DNA-納米金探針溶液與樣品溶液混合後，滴在矽烷化載玻片上室溫至試樣點完全乾燥後，滴銀染試劑暗箱靜置後，立即用蒸餾水衝洗再乾燥的步驟；最後進行金標銀染信號的定量分析，計算得到待測樣品溶液中汞離子的準確濃度的步驟。優點是具有高靈敏度、高選擇性且可定量分析汞離子濃度，不僅操作簡單而且可現場檢測。
文檔編號G01N21/78GK102759526SQ201210225980
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者杜書平, 王澤波, 郝婷婷, 郭智勇, 馬青青 申請人:寧波大學