家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶1基因的應用及其重組載體的製作方法

2023-12-10 01:44:16 2

專利名稱：家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶1基因的應用及其重組載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的應用，還涉及含有家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的重組載體和製備方法。
背景技術：
家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物，在我國已經有5000多年的飼養和馴化歷史。蠶絲業是許多地區農民的主要經濟收入來源之一，為世界經濟、文化、社會發展做出了重要貢獻。但是，當家蠶遭遇病毒侵害的時候，通常會對蠶絲業造成巨大的損 失。據統計，我國養蠶的幾個主產區，每年因病毒性疾病所造成的損失，約佔蠶病總損失的70-80%ο其中家蠶核型多角體病毒病是三大病毒病中最常見、危害最為嚴重的一種，該病傳染性強，難以控制。引起核型多角體病毒病的病原為家蠶核型多角體病毒iBombyx mori NuclearPolyhedrosis Virus, BmNPV)。BmNPV屬於杆狀病毒科,真杆狀病毒亞科,核型多角體病毒屬，病毒粒子呈杆狀，全基因組大小為128413bp。病毒結構主要由外層的囊膜和內層的核衣殼組成，在不同感染時期分別以出芽型病毒粒子(budded virus, BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus, ODV)兩種形態存在,而多角體是在感染細胞的核或質中產生的包含和保護病毒粒子的一種蛋白質結晶，很穩定。多角體病毒對不良環境、消毒藥劑等有較強的抵抗性，在環境中可以長期存活，但極易溶於鹼性溶液。BmNPV主要通過經口食下感染家蠶，當家蠶食下多角體病毒，在中腸強鹼性消化液(PH9. 2^9. 4)作用下，多角體被溶解，釋放的病毒粒子ODV借囊膜與中腸上皮細胞微絨毛膜的融合作用脫去囊膜，核衣殼進入中腸細胞開始原發感染(Primary infection),在細胞內複製核衣殼並通過「出芽」方式產生BV進入血體腔，繼而感染其他組織細胞。最終，蠶體多以體壁破裂，流出病毒多角體濃汁而死。病毒多角體濃汁中含有大量的病毒粒子，汙染蠶座環境，使得周圍健康蠶感染病毒。可見，家蠶核型多角體病毒病是蠶業生產中的一個重要的危害原，一旦產生，極易爆發。由於家蠶核型多角體病毒病在蠶業生產中危害嚴重，蠶業界一直希望能夠培育出對此病毒具有較高抗性的蠶品種。但是，由於目前病毒致病分子機制研究較少，加之主要通過傳統的方法進行遺傳篩選，周期長而且定向性差，所以收效甚微。轉基因技術在生物素材創新、現代遺傳育種等方面發揮著重要的作用。自2000年日本科學家報導首次成功培育轉基因家蠶以來，國內外已陸續報導轉基因家蠶成功的消息。2007年，印度學者報導通過轉基因幹涉病毒基因的方法來提高家蠶的抗性，他們利用的是家蠶多化性品系的非滯育卵，主要是因為多化性家蠶品種所產的卵為生種卵，其不需要任何的人工處理便能夠在適當的溫溼度下連續發育直至孵化，這個特點極大地方便了轉基因實驗中的操作控制。但是，通過轉基因幹涉利用多化性家蠶品種製備的抗病毒品系具有以下兩個方面明顯的缺陷①生產用種普遍為二化性滯育種，用多化性家蠶品種製備的抗病毒品系不利於生產推廣，同時與滯育性的家蠶品種相比較，多化性家蠶品種不具有滯育期，對其繼代維持只能依靠連續的飼養繁殖，這樣需要耗費大量的人力物力對獲得的轉基因家蠶品系進行維持和繼代，同時也大大增加了獲得的轉基因家蠶品種資源丟失的風險。②轉基因幹涉品系只能在病毒入侵後抑制病毒的複製增殖，不能在病毒侵染的其他階段發揮作用。因此，利用家蠶滯育品種，製備一種能在BmNPV病毒侵染的多個階段發揮抑制作用的轉基因品系是一個製備高抗病毒品種的有效方法。在前期研究中，我們製備了增量表達家蠶內源抗性基因Bmlipase-I的轉基因品系，檢測結果顯示該品系能顯著提高家蠶對BmNPV的抵抗力。Bmlipase-I在家蠶中腸特異表達，然後分泌到家蠶腸液中發揮作用，該蛋白在腸液中能夠抑制滅活BmNPV病毒，減少侵入家蠶中腸細胞的ODV病毒數量，從而提高家蠶對BmNPV的抗性，但是抗性提高有限
發明內容

本發明的目的之一在於提供家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的應用；本發明的目的之二在於提供含有家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的重組載體；本發明的目的之三在於提供重組載體的製備方法。I.家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因在製備重組載體中的應用，所述多基因反向重複序列的正向序列如SEQ ID NO. I所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示，所述家蠶脂肪酶I基因如SEQ ID NO. 11第1081-1965位所示核苷酸。更優選的，所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列的正向序列和反向序列之間連入家蠶肌動蛋白基因Actin 3內含子A3intron,所述家蠶肌動蛋白基因Actin 3內含子A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。2.含所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的重組載體。優選的，所述家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列的5』端為IEl啟動子，所述家蠶脂肪酶I基因的5』端連接家蠶中腸特異表達啟動子P2。更優選的，所述重組載體的IEl啟動子的5』端連接Hr3增強子。最優選的，所述重組載體是由SEQ ID NO. 12所述的載體序列經Asc /酶切後回收含家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的片段，連接經Asc /酶切的 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]載體而得。3.所述重組載體的製備方法，包括如下步驟
(1)合成SEQID NO. I所示的核苷酸序列，經及^7 I取BernH I酶切後連接經同樣雙酶切的含家蠶肌動蛋白基因Actin 3內含子的pMD-19載體，得pMD-19-FS-A3intron載體；克隆如SEQ ID NO. 4所示的序列，連入所得pMD-19-FS-A3intron載體的家蠶肌動蛋白基因Actin 3 內含子的 3』 端,得 pMD-19-FS-A3intron-FA 載體；
(2)將步驟(I)所得pMD-19-FS-A3intron-FA載體用EcoRI和Xba /進行雙酶切，將含SEQ ID NO. I、家蠶肌動蛋白基因Actin 3內含子和SEQ ID NO. 4的片段FS-A3intron-FA連入L4440載體的IEl啟動子IElP和SV40終止信號序列之間，得L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 載體；(3)克隆家蠶中腸特異表達啟動子P2和家蠶脂肪酶I基因，將家蠶中腸特異表達啟動子P2用治μ /和Afoi /酶切後連接經同樣酶切的含SV40終止信號序列的pSLfall80fa載體，得1180-P2-SV40載體，然後同時用Afoi /和通ο /酶切所得1180-P2-SV40載體和克隆的家蠶脂肪酶I基因，連接後得1180-P2-Bmlipase-l-SV40載體，載體序列如SEQ ID NO. 11所示；
(4)克隆Hr3增強子，連接進pSLfall80fa載體得1180_Hr3載體；將步驟(2)所得L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 載體中的含 IEl 啟動子 ffilP 和 FS-A3intron_FA 的片段連接入所得1180-Hr3載體，得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA_SV40載體，然後將所得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 載體用 Kpn I 和歷TZT進行雙酶切，同時用 Kpn I和Viz7i////雙酶切所得1180-P2-Bmlipase-l-SV40載體，將含家蠶中腸特異表達啟動子P2和家蠶脂肪酶I基因的序列連接酶切後的1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40載體，得 1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-l-SV40 載體，載體序列如 SEQ IDNO. 12所示；
(5)將步驟(4)所得1180-Hr3-IElP-FS-A3intron-FA-SV40-P2-Bmlipase-l-SV40 重組載體經Asc /酶切後回收含家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列和家蠶脂肪酶I基因的片段，連接經Asc /酶切的piggyBac[3Xp3 EGFP afm]載體,得重組載體。本發明的有益效果在於為了獲得高抗家蠶核型多角體病毒的家蠶品系，將家蠶核型多角體病毒多基因反向重複序列與家蠶脂肪酶I基因進行聯合應用，在同一載體中實現同時表達抗性基因家蠶脂肪酶I和表達幹擾家蠶核型多角體病毒複製的反向重複序列，反向重複序列中含有家蠶核型多角體病毒的iel、gp64、lefl Jef2和DNA聚合酶基因的雙鏈RNA，經家蠶體內加工後，形成小分子雙鏈RNA，因此能在病毒侵染的多個階段抑制病毒，控制家蠶核型多角體病毒在家蠶體內繁殖，降低家蠶核型多角體病毒在體內的含量，從而達到抗家蠶核型多角體病毒的效果。利用該載體轉化家蠶後，抗病毒效果明顯，與未轉化的相比，存活率提高51. 11%，並且轉化該載體後不影響家蠶的經濟形狀，因此用於育種，獲得高抗家蠶核型多角體病毒的家蠶品系。


圖I為Pb-HFPL重組載體結構圖。圖2為轉基因家蠶和非轉基因家蠶抗性檢測結果圖(SW-H1、SW-H2和SW-H3分別為不同轉基因品系；sw為非轉基因品種)。圖3為轉基因系統SW-Hl和非轉基因品種SW感染病毒後沿基因的螢光定量PCR結果。圖4為轉基因家蠶和非轉基因品種的全繭量和繭層率(A :全繭量；B :繭層率)。
具體實施例方式 為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。·實施例中使用的家蠶品種為「芙蓉」品種，由中國西南大學家蠶基因資源庫提供。
實施例I、構建轉基因載體
一、構建 L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 載體
(I)根據已經報導的BmNPV基因組序列及家蠶核型多角體病毒的(GenBank:NO. X58442. I),gp64 (GenBank: NO. AB253773. I),IefI (GenBank: NO. L09723. I),Ief2(GenBank: AF036245. I)和β財聚合酶基因(GenBank: NO. D16231. 1)5 個基因的序列，人工合成包括以上所述5個基因部分序列的串聯DNA雙鏈序列，命名為FS，如SEQ ID NO. I所示。在FS的5』端設置有/酶切位點，FS的3』端設置有及 # I酶切位點。根據人工合成的FS序列設計擴增FS的反向互補序列FA,上遊引物為FA sense :5』 -cccaagcttcgctgtctgaactatcacaa-3』 (SEQ ID NO. 2),下劃線為III酶切位點；下遊引物為 FA anti : 5'-gctctagaatatcatgacaatattgcgag-3' (SEQ ID NO. 3),下劃線為 ZAa / 酶切位點，以人工合成的FS為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然後94°C變性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸45秒，共30個循環，最後72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑑定並回收，然後與PMD19-T simple載體連接，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然後轉化DH5a感受態細胞，獲得陽性克隆後送往上海生工生物技術有限公司測序，測序結果表明本實施例成功克隆了 FS的反向互補序列FAjB SEQ ID NO. 4所示核·酸序列。(2)將人工合成的FS序列用及^7 I熱BamH I進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑑定並回收，得FS酶切片段，同時用EcoR I和BamH I雙酶切已經包含家蠶肌動蛋白基因Actin 3內含子(簡稱A3intron)的pMD-19載體，A3intron的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，經瓊脂糖電泳鑑定並回收，得pMD-19載體酶切片段。將FS酶切片段和pMD-19載體酶切片段連接，然後進行轉化，篩選陽性克隆，得到含FS和A3intron的載體，命名為pMD-19-FS_A3intron ;將反向互補片段 FA 和 pMD-19-FS_A3intron 載體分別用/ ￠/TZ/和Xba I進行雙酶切，回收目的條帶後連接轉化，篩選陽性克隆，得到含FS、A3intron和FA的載體，命名為 pMD-19-FS-A3intron_FA 載體。pMD-19-FS-A3intron_FA 載體中，A3intron 位於FS序列和FA序列之間，因此表達含FS、A3intron和FA的片段(命名為FS-A3intron_FA)後能形成迴文結構。(3)將已經包含IEl啟動子(簡稱IE1P)和SV40終止信號序列的L4440載體用和/進行雙酶切，收集L4440載體骨架，同時用/和/酶切pMD-19-FS-A3intron-FA載體，回收含有FS、A3intron和FA的片段，然後與L4440載體骨架連接，轉化，篩選陽性克隆，得到L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40載體，序列如SEQ IDNO. 6 所示。L4440-IElP-FS-A3intron-FA-SV40 載體即在 L4440 載體的 IEl 啟動子和 SV40終止信號序列之間插入了 FS-A3intron-FA序列。(二)構建 1180-P2-Bmlipase-l_SV40 載體
(I)根據
發明者蔣亮, 夏慶友, 程廷才, 趙萍, 王根洪 申請人:西南大學