串行線掃描編碼多色螢光顯微術及成像流式細胞儀的製作方法

2023-12-10 02:06:16 1

專利名稱：串行線掃描編碼多色螢光顯微術及成像流式細胞儀的製作方法
技術領域：
本申請要求於2009年3月20日提交的美國臨時專利申請No. 61/162，072和於 2009年8月7日提交的美國臨時專利申請No. 61/232，113的優先權，所述兩個臨時專利申請的公開內容通過引用併入本文中。
背景技術：
細胞儀是關於生物細胞的計數和特徵化的一門技術專業。圖1示出了一種被稱為流式細胞儀的技術的簡圖。在流式細胞儀的基本形式中，細胞101懸浮在流體中並以一列縱隊的方式在一個狹窄的透明管子102內輸送。該輸送可以通過幾種包括流體力學聚焦的方法中的任一種實現。當細胞101通過測量位置104時光源103照射每一個細胞101。光源103可以為例如雷射器。來自光源103的光由被測細胞101散射。一些光105在行進到達細胞101時通常沿同一方向散射。光105有時被稱作「前向散射」，可以被前向傳感器106 收集。一些光也可以沿著其它方向散射。該光被稱為「側向散射」，側向散射的光107中的一些可以被一個或多個其它的傳感器108收集。傳感器106和傳感器108的輸出信號被發送到計算機109，計算機109可以存儲並分析這些信號。通過分析散射光的量和分布，可以辨識每一個細胞的信息，例如細胞的大小和關於其內部結構的一些信息。流式細胞儀可以直接測量散射光，或者可以利用螢光。在螢光細胞儀中，細胞可以以一種或多種螢光團進行標記，螢光團被來自光源103的光激發從而通過螢光性產生光。圖1示出的技術完全依賴散射光的測量來推斷細胞結構的信息，但不產生任何特定細胞的圖像。在另一種稱為「圖像細胞儀」的技術中，單個細胞的圖像可以被相機或顯微鏡記錄。

發明內容
一種改進的圖像細胞儀系統使用線性光傳感器執行高速、高解析度的細胞儀功能。在一些實施例中，來自光源的光被集中到一個橢圓形的掃描區域，照射被輸送通過掃描區域的細胞。光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到線性光傳感器上。系統重複讀取落在線性傳感器上的光。系統可以包括位於線性光傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。在一些實施例中，來自光源的光照射被輸送通過掃描區域的細胞。光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少兩個平行的線性光傳感器上。系統重複讀取落在線性光傳感器上的光。系統可以包括位於線性光傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。在一些實施例中，各線性光傳感器採集的圖像被組合以形成與通過單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。所述組合可以通過將各圖像的對應於細胞上基本相同的各位置的像素值進行數位化組合來執行。所述組合可以通過時間延遲積分來執行。在一些實施例中，來自光源的光被集中到掃描區域的一個橢圓形場上。在另一個實施例中，用於執行細胞儀功能的系統包括被包括至少第一波長帶和第二波長帶的光照射的掃描區域；以及用於將細胞輸送通過掃描區域使得細胞被照射的裝置。所述系統還包括光學系統和第一組和第二組線性光傳感器，每組線性光傳感器包括至少一個線性光傳感器。所述光學系統將從細胞發射的光選擇性地導向兩個線性光傳感器組，使得在第三波長帶的發射光主要導向第一線性光傳感器組，而在第四波長帶的發射光主要導向第二線性光傳感器組。當細胞被輸送通過掃描區域時系統重複讀取落在線性傳感器上的光。每一線性光傳感器組可以包括至少兩個線性光傳感器。可以由於螢光輻射而發射出所述發射光。所述系統可以包括用於接收和重導向(redirect)從細胞發射的光的物鏡；以及用於將重導向光的第一部分反射到第一線性光傳感器組並透射重導向光的第二部分的鏡子。系統可以包括第一鏡筒透鏡，第一鏡筒透鏡接收光的第一部分並與物鏡配合在第一線性光傳感器組上形成細胞的圖像。在一些實施例中，系統還可以包括第二鏡筒透鏡， 第二鏡筒透鏡接收光的第二部分並與物鏡配合在第二線性光傳感器組上形成細胞的圖像。 系統可以包括位於線性光傳感器組中至少一組的附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。在一些實施例中，每一組線性光傳感器包括至少兩個線性光傳感器，並且對於每一組線性光傳感器，組中的各線性光傳感器採集的圖像被組合以形成與通過組中的單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。所述組合可以通過將對應於細胞上基本相同的各位置的各圖像的像素值進行數位化組合來執行。所述組合可以通過時間延遲積分來執行。在另一個實施例中，用於執行細胞儀功能的系統包括被包括至少第一波長帶和第二波長帶的光照射的掃描區域；以及用於將細胞輸送通過掃描區域使得細胞被照射的裝置。所述系統還包括光學系統以及包括至少一個線性光傳感器的線性光傳感器組。所述光學系統將從細胞發射的光選擇性地導向線性光傳感器組的兩個部分，使得在第三波長帶的發射光主要導向線性光傳感器組的第一部分而在第四波長帶的發射光主要導向線性光傳感器組的第二部分。所述系統在細胞被輸送通過掃描區域時，重複讀取落在線性光傳感器組上的光。所述線性光傳感器組可以包括至少兩個線性光傳感器。可以由於螢光輻射而發射出所述發射光。所述系統可以包括位於線性光傳感器組附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。在一些實施例中，線性光傳感器組包括至少兩個線性光傳感器，並且組中的各線性光傳感器採集的圖像被組合以形成與通過組中的單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。所述組合可以通過將對應於細胞上基本相同的各位置的各圖像的像素值進行數位化組合來執行。所述組合可以通過時間延遲積分來執行。在另一個實施例中，用於執行細胞儀功能的系統包括被光源照射的掃描區域； 包括至少一個線性光傳感器的線性光傳感器組；以及將掃描區域的一部分的圖像聚焦到線性光傳感器組的光學系統。所述系統當細胞被輸送通過掃描區域並被光源照射時，重複讀取落在線性光傳感器組上的光。在本實施例中，所述系統是可配置的，以使得在第一實驗中創建第一圖像，所述第一圖像在對應於線性光傳感器組的長度的方向(dimention)上具有第一數量的像素；以及在第二實驗中創建第二圖像，所述第二圖像在對應於線性光傳感器組的長度的方向上具有第二數量的像素，第二數量的像素少於第一數量的像素。所述線性光傳感器組可以包括至少兩個線性光傳感器。可以通過選取少於來自線性光傳感器組的全部像素的像素來降低第二圖像中的像素的數量。可以通過對來自線性光傳感器組的部分或全部的像素進行重新分級來降低第二圖像中的像素的數量。對落在線性光傳感器中的特
7定一個上的光的每一次讀取可以產生單個落在所述特定傳感器上的光的量的數字表示。在另一個實施例中，用於產生橢圓形照射場的系統包括產生光束的雷射器；接收所述光束並使光束僅沿著第一軸線會聚的柱面透鏡；以及接收柱面透鏡之後的光束的物鏡。物鏡是無限遠校正光學系統的一部分，其引起光束沿著與第一軸線正交的第二軸線會聚。所述系統可以包括在柱面透鏡和物鏡之間的波長選擇鏡。在一些實施例中，物鏡與柱面透鏡間隔小於柱面透鏡的焦距的距離。在一些實施例中，物鏡與柱面透鏡間隔大於柱面透鏡的焦距的距離。在一些實施例中，光束在離開物鏡後在第一軸線方向上是發散的。在一些實施例中，光束在離開物鏡後在第一軸線方向上是會聚的。在另一個實施例中，用於執行細胞儀功能的方法包括使用光源照射掃描區域的一個橢圓形場，其中照射所述橢圓形場還包括使用光成形元件將來自光源的光集中到橢圓形場。所述方法還包括使用光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到線性光傳感器，以及當細胞被輸送通過掃描區域並被光源照射時重複讀取落在線性傳感器上的光。在一些實施例中，所述方法還包括使落在線性光傳感器上的光通過位於線性光傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。在另一個實施例中，用於執行細胞儀功能的方法包括使用光源照射掃描區域； 以及使用光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少兩個平行的線性光傳感器上。該實施例的方法還包括當細胞被輸送通過掃描區域並被光源照射時重複讀取落在所述兩個平行的光傳感器上的光。在一些實施例中，所述方法還包括將各線性光傳感器採集的圖像進行組合以形成與單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。將各圖像進行組合還包括將對應於細胞上基本相同的各位置的各圖像的像素值進行數位化組合。將各圖像進行組合還包括使用時間延遲積分來組合圖像。在一些實施例中，光源產生包括至少第一和第二波長帶的光的照射，並且所述方法還包括使用光學系統將從細胞發射的在第三波長帶的光主要導向兩個平行的光傳感器中的一個，以及使用光學系統將從細胞發射的在第四波長帶的光主要導向兩個平行的線性光傳感器中的另一個。在一些實施例中，所述方法還包括使用光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少兩組平行的線性光傳感器上，每一組線性光傳感器包括至少兩個線性光傳感器。


圖1示出了一種被稱為流式細胞儀的技術的簡圖。圖2示出了根據本實施例的高速、高解析度線掃描圖像細胞儀系統的簡化概念圖；圖3A至圖3C示出了圖像的形成過程。圖4示出了根據本發明的另一實施例的系統的正交視圖。圖5示出了根據本發明的另一實施例的系統的正交視圖。圖6示出了根據本發明的另一實施例的系統的正交視圖。圖7示出了根據本發明的又一實施例的系統的正交視圖。圖8示出了根據另一實施例的系統的正交視圖。以及圖9A至圖9C示出了用於產生橢圓形照射場的系統的實施例。
具體實施例方式圖2示出了根據實施例的高速、高解析度線掃描圖像細胞儀系統200的簡化概念圖。圖2所示的系統是一個流式細胞儀系統，然而本領域的普通技術人員將會認識到本發明的實施例也可以應用於其它類型的細胞儀。細胞101在流體中輸送並以一列縱隊的方式行進通過管子102。所述系統可以用於特徵化不同類型的細胞，但在通常的應用中，細胞101可以例如為大約10微米至20微米寬，並且可以以例如每秒10毫米的速度行進通過管子102。光源201提供管子102上的光場203。光源201可以是雷射器、發光二極體、白熾燈光源、螢光光源或其它類型的光源。 光源201可以產生基本上單色的光、寬頻譜的光或包括兩個或更多個窄帶波長的光。可選的光成形元件202可以包括各種透鏡、稜鏡、反射鏡或其它可選的光學元件，以將來自光源 201的光集中到橢圓形或狹縫形的場203，細胞101被輸送通過該橢圓形或狹縫形的場203。 如下面所描述地，因為僅掃描狹窄的線圖像，所以僅需要照射狹窄的場，這不同於傳統的需要照射整個物鏡視場的落射照射(印i-illumination)。光成形元件202所提供的集中可使得有效照射水平比通常的對稱落射照射增加2至6個量級之多。來自光源201的一些光被傳輸通過其中一個細胞101或被該細胞散射，該細胞101 的至少一部分在場203內。所述光的一部分被一個或更多個透鏡204重導向到線性傳感器205。線性傳感器205可以例如是電荷耦合器件(CCD)傳感器、互補金屬氧化物半導體 (CMOS)傳感器或其他類型的具有以行設置的多個光敏位點(site)的傳感器。透鏡204和傳感器205可以例如是線掃描相機的部件，所述線掃描相機例如為來自於德國阿倫斯堡的巴勒斯公司的巴斯勒斯普林特線掃描互補金屬氧化物半導體(CMOS)傳感器相機。傳感器位點有時被稱為「像素」。在掃描線處的被傳感器像素感測的相應的位點有時也被稱為像素。 傳感器205可以包括例如一行或多行像素，每一行包括512個、1024個、2048個或其他合適數量的像素。可以通過如下方式讀取落在像素行上的光的強度清除像素陣列；使在預定的曝光時間內在像素位點中累積電荷；然後將累積的電荷量轉換為表示光強度的數值。當細胞通過掃描區域時，重複執行上述過程。在一個示例性實施例中，所述系統每20微秒執行一次讀取(「掃描一條線」)或者說是以50kHZ的掃描速度執行讀取。使用每秒10毫米的細胞輸送速度和50kHZ的掃描速度可產生200nm的成像像素尺寸。也可以是其它的輸送速度和掃描速度，並且可以產生其它的成像像素尺寸。得到的測量陣列可被重組成細胞的近似圖像。圖3A至圖3C描述了圖像的形成過程。在圖3A中，掃描線301包括像素a、b、c、 d和e。細胞101被輸送通過掃描線301，如圖:3B所示，其示出了在連續的採樣時間T1-T7 處疊加在細胞101上的掃描線301。(儘管圖:3B示出了細胞恰好以每採樣時間穿過一個像素，但這並不是必須的，事實上上述僅針對細胞行進速度、採樣率和像素大小的特定組合才會發生。實際上，連續的掃描線可以在成像細胞上重疊，或在連續的掃描線讀取的細胞的區域之間可以存在間隙。)像素a、b、c、d和e讀取的光水平會受到細胞101的結構的影響。 例如，當沒有細胞通過掃描線301時，相對高的光水平被記錄。當細胞101的相對透明的部分通過像素時，該像素記錄的光水平有所下降。當細胞101的核在像素內時，在該像素處記錄的光水平會明顯下降。圖3C示出了根據時間的在像素a、b、c處記錄的光水平的軌跡 (範圍從0到1的任意標度)。圖3D示出了重構圖像，其通過將數次連續線掃描期間掃描
9的數據堆疊在一起並以印刷灰度水平表示每次的數字光讀數而形成。儘管圖3D使用了僅少數次採樣的少量像素構成，並因此示出了對細胞101的相對粗糙的描繪，然而在實際中根據本發明的實施例的系統，可以在每個細胞通過期間掃描更多或更少的線，並且每條線可以包括比圖示更多或更少的像素。在一個實施例中，系統可以在每個細胞通過期間掃描大約50條的線，而且每條線可以包括大約50個像素。每個細胞的掃描的線和受影響的像素的確切數量取決於細胞的大小、掃描線頻率、細胞通過掃描線的速度和所使用的特定傳感器和光學元件。系統的理論解析度主要取決於物鏡的品質。系統的實際掃描解析度還取決於掃描速度、細胞被輸送通過掃描線的速度和所使用的特定傳感器和光學系統。在Y方向的像素解析度由包括所使用的特定透鏡和傳感器的成像系統確定。在X方向的像素解析度等於 V · dt，其中V是樣品傳輸速度，dt是相機的曝光時間。優選的，V是一個已知的參數，或者在特定的流式實驗之前被預先確定，或者在細胞通過系統的過程中測量到。理想地，被掃描的細胞在通過掃描線期間是無旋轉和無抖動的。上述在直接光成像的背景下對圖2中的系統的操作進行了描述，其中來自光源 201的散射光被傳感器205測量。基於相同的原理操作的系統還可用於執行螢光成像，事實上，該系統在螢光成像中特別有用。在該情形下，來自光源201的光激發所測細胞101中的螢光，得到的發射光被傳感器205收集和測量。上述發射光的波長通常比來自光源201的激發光的波長長。在螢光成像中，理想的是使用各種濾光器或元件的幾何排列，保護傳感器205不接收來自光源201的光，使得光源光不淹沒或幹擾螢光發射的光的測量。通常，螢光發射的光比光源光的強度小，與直接成像相比，螢光成像需要更長的曝光時間、更強的照射或者更敏感的傳感器。圖3C中所示的瞬時信號變化的形狀在螢光成像中與直接成像中是不同的。在直接成像中，細胞的附加結構趨向於引起傳感器205的相應像素接收較少的光。在螢光成像中，附加的結構可承載額外的螢光團，與對應於具有小結構的細胞部分的像素相比，可引起更多的光到達相應的傳感器像素。圖4示出了根據本發明的另一個實施例的系統400的正交視圖。圖4所示的實施例特別適合於單色螢光成像細胞儀。在圖4示出的實施例中，光源401發射光。光源401 可以是雷射器、發光二極體、白熾燈光源、螢光光源或其他類型的光源。光源401可以產生基本上單色的光、寬頻譜光或者包括兩個或更多個窄帶波長的光。在一個示例性的實施例中，光源401是發射標稱波長為488nm的光的雷射器。激發濾光器402可以用來進一步縮窄系統所使用的光的波長帶，特別是在光源401是寬頻譜光，或者另外地產生對特定的細胞儀實驗來說不理想的波長的情況下。可選的光成形元件或聚光透鏡403可以將發射的光集中到細胞101被輸送通過的掃描區域404。優選的，細胞101已使用在被光源401發射的光激發時發射出螢光的一種或多種螢光團進行了標記。已知有各種不同的螢光團，包括來自美國加利福尼亞州的卡爾巴斯德生命科技協會的ALEX FLOUR 系列的螢光團。光成形元件或聚光透鏡403提供的集中提高了細胞101的有效照射，並產生了較強的螢光信號。所述較強的信號導致系統使用的傳感器在曝光時間上的較少的限制。橢圓形或狹縫形照射場特別適合於具有自然非對稱照射模式的光源，例如半導體雷射器或發光二極體。從細胞101散射的光被物鏡405收集和重導向，並從分色鏡406反射，通過鏡筒透鏡408到達線掃描相機409，在線掃描相機409處掃描區域404的連續線圖像被收集以用於處理單元410的分析。可以在所述系統中放置發射濾光器407用於縮窄傳輸到相機409 的光的波長帶。分色鏡406也可以提供濾光。該濾光可以降低來自光源401的可能被細胞 101散射的直射光的影響。物鏡405和鏡筒透鏡408優選地形成無限遠校正光學系統，使得在物鏡405和鏡筒透鏡408之間形成「無限空間」。在這樣一個系統中(現有技術已知)， 系統的性能對物鏡和鏡筒透鏡之間的距離相對不敏感，從而允許為諸如分色鏡406和發射濾光器407的其它元件的插入留下空間。圖5示出了根據本發明的另一個實施例的系統500的正交視圖。圖5所示的系統被配置成用於執行同時雙色螢光成像細胞儀。在圖5所示的系統中，向待成像的細胞101 提供包括兩個波長帶的激發光。這在圖5中表示為產生兩種不同波長的光的兩個光源501， 它們分別用實線和虛線表示。所述光可以被一個或更多個濾光器502進一步約束。其它布置方式也是可以的。例如，可以使用單個寬頻譜光源，優選地，通過濾光器502選擇特定波長帶。或者，可以使用單光源來激發兩種不同螢光波長的光。在一個優選的實施例中，光源 501包括兩個雷射器，一個產生標稱波長為532nm的第一窄帶光而另一個產生標稱波長為 633nm的第二窄帶光。所述光可以通過光成形元件或聚光透鏡503集中到掃描區域504。元件503可以包括各種單獨的或組合在一起的透鏡、稜鏡、反射鏡或者其它的光學元件，並優選地將光源501產生的光集中到掃描區域504的橢圓形場。優選的，細胞101被一種或多種螢光團進行標記，使得當來自光源501的激發光到達細胞101時，通過螢光產生至少兩種不同顏色特性的光。例如，一種螢光團可以強烈地對532nm的激發光起反應，產生發射峰值在大約550nm的發射光，第二種螢光團強烈地對 633nm的激發光起反應，產生發射峰值在大約650nm的發射光。在圖5中，以與表示雙色激發光相似的方式用實線和虛線分別近似地表示不同的發射，但是要理解的是由特定線類型表示的光在發射之後通常不具有與相同線類型所表示的激發光相同的頻譜特性。然後來自掃描區域504的光被物鏡505收集，並導向分色鏡506。分色鏡506提供一定的濾光，使得主要來自某個波長帶的光被分色鏡506反射，而其餘的光則通過分色鏡 506。從分色鏡506反射的光可以通過另一個發射濾光器507從而進一步限制光的頻譜特性，然後光通過鏡筒透鏡508到達相機509。因此，相機509優選地接收細胞101中第一螢光團標記物發射的光，所述光具有來自光源510或者第二螢光團標記物發射的光的較少的汙染。即，到達相機509的光優選地落入從第一螢光團的螢光發射中選擇的第三波長帶。通過分色鏡506的光然後被另一個分色鏡510反射，可以通過另一個分色發射濾光器511，通過第二鏡筒透鏡512到達相機513。因此，相機509優選地接收細胞101中第二螢光團標記物發射的光，所述光具有來自光源510或者第一螢光團標記物發射的光的較少的汙染。即，到達相機513的光優選地落入從第二螢光團的螢光發射中選擇的第四波長
市ο相機509和513可以掃描細胞101的不同發射頻譜的同時圖像。相機509和513 的輸出結果被傳送到處理單元514用於存儲、分析、顯示或其它目的。處理單元514可以例如是計算機系統或其它的能夠處理圖像數據的基於處理器的系統。處理單元514可以是外部獨立設備，或者集成到測試儀器中。所述系統可以進行多種變化。例如，可以去除分色鏡510，濾光器511、鏡筒透鏡 512和相機513可以定位成直接接收通過分色鏡506的光。系統中的一些濾光器取決於所使用的特定光源和螢光物質是可選的。可以增加另外組的光源、濾光器、鏡子、透鏡或相機以使得同時完成3個、4個或甚至更多個頻譜帶的成像。本領域的普通技術人員會意識到到目前為止已描述的分色鏡和濾光器不具有理想的波長鑑別或理想的效率。在一定波長帶的、意在通過特定的濾光器的一些光可能會被吸收或反射。在一定波長帶的、意在被特定的濾光器阻止的一些光可能會通過或會被反射。 然而，濾光器和鏡子可以執行得足夠好以優選地使指定的波長通過或阻止指定的波長，使得所述系統可以有效鑑別不同的發射光顏色。在其它的變化中，可以使用除了分色鏡之外的元件用於分色，包括稜鏡、光柵或其它光學元件。圖6示出了根據本發明的另一個實施例的系統600的正交視圖。系統600與系統 500相似，除了在相機509和513前面分別設置了狹縫孔601和602之外。狹縫孔601和602 具有傾向於阻止或排除從所述系統的焦平面之外其它位置收集的光到達各相機的效果。所述效果在圖6中通過從細胞101之上的未對準焦點的位置發出的細虛線射線束603表示。 因而得到從透鏡508出來的射線束604與來自於系統的焦平面的光相比更靠近透鏡508而聚焦。當射線束604中的光到達狹縫孔601時，射束604已開始發散，使得射線束604的中心的一小部分可以通過狹縫孔601到達相機509。因此，所述系統優選地接收來自系統的焦平面的細胞101的光，並至少排除接收的來自其它更遠位置一些光。當在上述方式中使用小的圓形孔來限制單個傳感器接收的光時，這種技術被稱為共焦成像。在圖6所示的系統中，孔601和602為狹縫，因此排除僅在一個軸線方向上的光。 出於本公開的目的，上述技術被稱為「半共焦」成像。與沒有使用半共焦成像的系統記錄的圖像相比，這種技術提高了上述系統所記錄的圖像的對比度。實施本發明的細胞儀系統的另一個優點是所述系統可被修改成或配置成一個點檢測器類型的系統，其中，只有位於線性檢測器的中間的少量像素起作用，或者像素行中的部分或所有像素被重新分級(binning)成一個像素或幾個像素。這導致在對應於線性光傳感器的長度的方向上(圖6中的Y方向)解析度下降的圖像。例如如果所有的傳感器像素被重新分級，光傳感器的每次曝光甚至可以導致落在傳感器上的光的量的單個數字表示。 可選地，照射場可被成形為一個較小的圓或橢圓，以提高系統在該方式下操作的速度。這種系統的優點是可以生成細胞的非常高速的單個橫截面圖像。當電子通信帶寬有限但可獲得充足照度時，這種系統會特別有用。可以上述方式配置的系統既可應用於線掃描成像細胞儀又可以用於非成像流式細胞儀。圖7示出了根據本發明的又一個實施例的系統700的正交視圖。在圖7所示的系統中，可以通過僅使用一個線性光傳感器或線掃描相機實現同時雙色螢光成像細胞儀。系統700的照射系統可以是例如上述參照圖5中所示系統500而描述的照射系統中的任一個。即，一個或多個光源激發兩種不同的螢光頻譜，例如來自於細胞101中的兩種不同螢光團的螢光頻譜。細胞101中的螢光所發射的光中的一部分被物鏡505收集並重導向到分色鏡701。圖7中的實線和虛線表示包括兩種不同螢光頻譜的光到達分色鏡701。鏡子702 選擇性地對這些光進行濾光，以使得一種波長帶優選地被鏡子701反射，而其它的波長優選地通過分色鏡701並繼續朝向鏡子702。視需要可以在光學系統中放置附加的鏡子和濾光器，以導向和約束光。例如，鏡子703將來自鏡子702的光重導向至鏡筒透鏡705，同時鏡子703還可以提供附加的濾光。相似的，鏡子704將來自鏡子701的光重導向至鏡筒透鏡705，同時鏡子704還可提供濾光。可以在光路上放置一個或多個附加濾光器，例如發射濾光器707和708。鏡筒透鏡705將所述光重聚焦到線性光傳感器706上，該線性光傳感器可以是線掃描相機的一部分，並且可以被處理單元514讀取。鏡子的布置方式提供到達傳感器706的兩個波長帶的光之間的幾何偏移，使得傳感器706的一部分接收一個波長帶的光，所述光選自以其中一個螢光頻譜發射的光，而傳感器706的另一部分接收另一個波長帶的光，所述光選自另一個螢光頻譜發射的光。例如， 如果傳感器706包括以行布置的512個像素，那麼在前的大約256個像素可以接收一個波長帶的光，而剩餘的大約256個像素可以接收另一個波長帶的光。如上所述，處理單元514 接收來自傳感器706的重複線掃描，並且可以重構細胞101的兩個圖像，一個圖像對應於一個波長帶。這樣的系統僅需要一個線性光傳感器或線掃描相機，與具有兩個線性光傳感器或線掃描相機的系統相比，該系統可以以降低的成本來構造。也可以使用其它類型的光學系統將兩個波長帶的光導向到線性光傳感器的不同部分。例如，這樣的光學系統可以包括光柵。在諸如系統700的系統中也可以包括狹縫孔，以使系統執行半共焦成像。圖8示出了根據又一個實施例的系統800的正交視圖。系統800以圖4中所示的系統400的變型示出，但本領域的普通技術人員會認識到系統800的附加特徵可以應用於其它系統，包括實現多色成像、螢光成像或其它技術的系統。系統800應用了一個示例性的相機801，相機801包括三個相互平行成行的、緊密間隔開的傳感器802、803、804(傳感器行示出在圖8的端部)。根據系統的光學元件的操作，傳感器行中的每一個傳感器對細胞101上的不同「帶條」成像。當細胞101通過掃描區域404時，相機801有三次不同的機會來對細胞101的任何特定部分成像。即，細胞101的特定部分首先將成像到傳感器行802上。細胞101的相同部分將在稍後的時間成像到傳感器行803上，並在更後一段時間成像到傳感器行804上。在圖8中，只示出了連接細胞101 和傳感器行802、803、804的中心射線束，以避免不必要的細節使系統的操作模糊。在一種技術中，可以採集細胞101的三個不同的圖像，每一個圖像分別由傳感器行802、803、804中的一個產生。不同的圖像相對於彼此在時間上是偏移的，或者可以認為在空間的X方向上是偏移的。這些多個圖像可用來創建具有改進的信噪比特性的合成圖像。例如，如果將所述三個圖像數位化地偏移至對齊，並將來自對應於細胞101上的基本相同位置的三個圖像的像素值疊加，這樣產生的合成圖像與任何單個圖像相比具有提高大約 VJ倍的噪信比。儘管相機被示出有三條掃描線，但相機可以有2條、4條或任一個可用數字 η條掃描線。通過這種數字疊加或平均技術從具有η條掃描線的相機產生的合成圖像與單個圖像相比具有提高大約^倍的信噪比。在掃描圖像線可用的情況下可以「快速(on the fly)」地完成圖像組合，使得單個線性傳感器構建不成特定細胞的完整的圖像。可以附加地或替換地配置具有多行像素的相機801，以執行時間延遲積分(TDI)。 在時間延遲積分中，由對細胞101的曝光引起的在各個像素中的電荷在轉換成數字值之前在像素行內進行累積。傳感器對細胞101的曝光是基本上同步的，以使得細胞101上的特定位置在一次曝光期間被曝光到傳感器行802，在下一次曝光期間曝光到傳感器行803，以及在又一次曝光期間曝光到傳感器行804。在第一次曝光期間在傳感器行802中累積的電荷被轉移至傳感器行803並與第二次曝光疊加，然後所得到的電荷被轉移至傳感器行804 並與第三次曝光疊加。然後累積的電荷被轉換成數字值。與單個圖像相比，時間延遲積分也引起信噪比的大約^倍的提高。無論使用數字圖像組合還是使用時間延遲積分，同時掃描平行的圖像線條的優點之一是所述技術較好地利用了可用照射。諸如元件403的光成形元件通常不會將光聚焦到掃描線的單像素寬的帶條上。照射場具有一定的可測量寬度，在單線(single-line)相機系統中會浪費部分照射。這樣的系統的另一個優點是不損害解析度，因為它可以用於簡單地對像素進行重新分級以提高信噪比特性的系統中。本領域的普通技術人員會認識到諸如圖5中所示系統500的系統也可以適用於使得每個相機509、513包括兩個或更多個線性光傳感器組成的組。每個相機509、513可以如上面參照相機801的描述一樣來執行成像，使得可以通過數字圖像組合或時間延遲積分來執行多色成像。類似地，諸如圖7所示系統700的系統可適用於使得以至少兩個線性傳感器組成的線性傳感器組替代傳感器706。所述系統然後將經過波長選擇的光分別導向線性光傳感器組的兩個部分。圖2、4、5、6和7所示的系統可被認為包括具有單個線性光傳感器的線性傳感器組。另外，無論是通過數字組合還是通過時間延遲積分，可以使用重新分級或其它降低解析度技術對來自至少兩個平行的線性光傳感器的組合圖像進行組合。即使是在降低的解析度的情況下，重新分級可以產生具有進一步改進的信噪比特性的圖像。圖9A至圖9C示出了用於提供便於實現線掃描細胞儀的橢圓形照射場的另外的技術。線掃描細胞儀技術可以不需要在所有的實施例中都使用橢圓形照射場。可以使用傳統的圓形的落射照射，只要照射功率足夠高。對於使用散射的、非螢光光來成像，足夠功率的照射源並不難實現。然而，為了實際感測由螢光發射的光，將激發光集中到橢圓形場可以更加節能，例如將所需的激發用雷射器的功率從以數十或數百瓦的計量水平降到以數十或數百毫瓦的計量水平。圖9A示出了包括一種用於提供橢圓形照射場的技術的實施例的系統900的視圖。 系統900使用了類似於圖4中所示系統400中的一些元件和裝置，但本領域的技術人員會認識到圖9A所示出照射技術也可以與其它感測裝置一起使用。在系統900中，雷射901從與執行感測方向相同的方向提供照射，使得樣本上方的空間不受阻擋。這種布置方式可以因此容納比先前所述述布置方式更大的樣品，前述布置方式限制了樣品不能厚於樣品臺與聚光透鏡之間的距離。圖9A所示的系統的另一個優點是物鏡405參與了照射場的形成。物鏡405通常可以為高品質的透鏡，以便於可以嚴格地限定物鏡所產生的照射場。在圖9A所示的示例性系統中，雷射器901產生導向細胞101的光束902。光束902 通過柱面透鏡903。為了本公開的目的，柱面透鏡是具有僅沿著一個方向的曲率的任何柱面透鏡。柱面透鏡可以具有但是不是必須具有被圓柱體限定的彎曲表面。在圖9A的示圖中，柱面透鏡903被定位成使它的柱軸線與X方向平行，並且透鏡903看起來對光束902沒有任何影響。光束902繼續通過分色鏡406到達物鏡405，物鏡405將光束聚焦到細胞101 上。從細胞101出來的光通過物鏡405，優選地從鏡子406反射，可能會遇到一個或多個濾光器407，通過透鏡408併到達相機409。圖9B示出了圖9A的沿X軸線觀看的照射部分的實施例。S卩，圖9B示出了圖9A 的示圖旋轉90度後的示圖。在該視圖中，管子102的投影是個圓，而柱面透鏡903示出為具有曲線輪廓。在圖9B所示的示例性的實施例中，選擇柱面透鏡903的材料和尺寸，使得透鏡903具有相對長的焦距，大於柱面透鏡和物鏡之間的距離。光束902在通過柱面透鏡 903之後，如視圖中所示相對地逐漸會聚。物鏡405然後會聚並沿著Y方向重新擴大光束， 使得照射場變寬。如圖9A所示，物鏡405同時沿著X方向聚焦光束。得到的照射場可以在它遇到細胞101時具有嚴格限定的橢圓形狀。圖9C示出了圖9A的從X軸線觀看的照射部分的另一個實施例。在本實施例中， 選擇柱面透鏡903的材料和尺寸，使得透鏡903具有相對短的焦距，短於柱面透鏡和物鏡之間的距離。光束902在通過柱面透鏡903之後，在到達物鏡405之前先會聚然後重新發散。 物鏡405重導向光束902使得光束902再次會聚，但會聚要足夠緩慢以使得當光束902到達細胞101時還有足夠的寬度來涵蓋被相機409掃描的線條的至少一部分。再一次，物鏡 405同時沿著X軸方向聚焦光束。所得到的照射場可以在當它遇到細胞101時具有嚴格限定的橢圓形狀。儘管本發明的實施例已示出為掃描在線性管子中約束的細胞，本領域的技術人員將認識到本發明的實施例也可以用於使用任一種寬範圍細胞傳輸技術的系統，包括電泳法、壓力驅動流、光鑷法、電動平移臺和其它技術。細胞可作為在油乳劑、電潤溼驅動液滴中的有效載荷進行輸送或者可以通過磁珠標記輔助的磁場傳輸進行輸送。上述意圖在於，所附權利要求不受所使用的細胞傳輸方法限制。在所附權利要求中，名詞性術語意在表示一個或多個。在描述步驟或元件時，術語 「包括」以及類似用語意在表示另外的步驟或元件的添加是可選的，並不排除在外。為了清楚和理解的目的，已詳細地描述了本發明。然而，本領域的普通技術人員將認識到可以在所附權利要求的保護範圍之內進行一些變化和修改。
1權利要求
1.一個用於執行細胞儀功能的系統，所述系統包括 光源；光成形元件，所述光成形元件用於將來自所述光源的光集中到掃描區域的橢圓形場上；線性光傳感器；以及光學系統，所述光學系統用於將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到線性光傳感器上；其中，當細胞被輸送通過所述掃描區域並被所述光源照射時，所述系統重複讀取落在所述線性傳感器上的光。
2.根據權利要求1所述的系統，還包括位於所述線性傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。
3.一種用於執行細胞儀功能的系統，所述系統包括 照射掃描區域的光源；至少兩個平行的線性光傳感器；以及光學系統，所述光學系統用於將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到所述至少兩個平行的線性光傳感器上；其中，當細胞被輸送通過掃描區域並被所述光源照射時，所述系統重複讀取落在所述線性傳感器上的光。
4.根據權利要求3所述的系統，還包括位於所述線性傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。
5.根據權利要求3所述的系統，其中，所述線性光傳感器採集的各圖像被組合以形成與單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。
6.根據權利要求5所述的系統，其中，通過將對應於所述細胞上基本相同位置的各圖像的像素值進行數位化組合來組合所述各圖像。
7.根據權利要求5所述的系統，其中，通過時間延遲積分來組合所述各圖像。
8.根據權利要求3所述的系統，還包括光成形元件，所述光成形元件用於將來自所述光源的光集中到所述掃描區域的橢圓形場上。
9.一種用於執行細胞儀功能的系統，所述系統包括掃描區域，所述掃描區域被包括至少第一和第二波長帶的光照射； 用於將細胞輸送通過所述掃描區域使得所述細胞被照射的裝置； 第一和第二線性光傳感器組，每組線性光傳感器包括至少一個線性光傳感器；以及光學系統，所述光學系統選擇性地將從所述細胞發射的光導向所述兩個線性光傳感器組，使得在第三波長帶的發射光主要導向所述第一線性光傳感器組而在第四波長帶的發射光主要導向所述第二線性光傳感器組；其中，當所述細胞被輸送通過所述掃描區域時所述系統重複讀取落在所述線性傳感器上的光。
10.根據權利要求9所述的系統，其中，每一個線性光傳感器組包括至少兩個線性光傳感器。
11.根據權利要求9所述的系統，其中，所述發射光由於螢光輻射而發射出。
12.根據權利要求9所述的系統，其中，所述光學系統還包括物鏡，所述物鏡用於接收和重導向從所述細胞發射的光；鏡子，所述鏡子用於將重導向的光的第一部分反射到所述第一線性光傳感器組並透射重導向的光的第二部分。
13.根據權利要求12所述的系統，還包括第一鏡筒透鏡，所述第一鏡筒透鏡用於接收所述光的第一部分並與所述物鏡配合在所述第一線性光傳感器組上形成所述細胞的圖像。
14.根據權利要求13所述的系統，還包括第二鏡筒透鏡，所述第二鏡筒透鏡用於接收所述光的第二部分並與所述物鏡配合在所述第二組線性傳感器上形成所述細胞的圖像。
15.根據權利要求9所述的系統，還包括位於所述線性光傳感器組中的至少一組的附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。
16.根據權利要求9所述的系統，其中，每一組線性光傳感器包括至少兩個線性光傳感器，對於每一組線性光傳感器，所述組中的各線性光傳感器採集的圖像被組合以形成與所述組中的單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。
17.根據權利要求16所述的系統，其中，通過將對應於所述細胞上基本相同位置的各圖像的像素值進行數位化組合來組合所述各圖像。
18.根據權利要求16所述的系統，其中，通過時間延遲積分來組合所述各圖像。
19.一種用於執行細胞儀功能的系統，所述系統包括掃描區域，所述掃描區域被包括至少第一和第二波長帶的光照射；用於將細胞輸送通過所述掃描區域使得所述細胞被照射的裝置；線性光傳感器組，所述線性光傳感器組包括至少一個線性光傳感器；以及光學系統，所述光學系統選擇性地將從所述細胞發射的光導向所述線性光傳感器組的兩個部分，使得在第三波長帶的發射光主要導向所述線性光傳感器組的第一部分而在第四波長帶的發射光主要導向所述線性光傳感器組的第二部分；其中，當細胞被輸送通過所述掃描區域時所述系統重複讀取落在所述線性傳感器組上的光。
20.根據權利要求19所述的系統，其中，所述線性光傳感器組包括至少兩個線性光傳感器。
21.根據權利要求19所述的系統，其中，所述發射光由於螢光輻射而發射出。
22.根據權利要求19所述的系統，還包括位於所述線性光傳感器組附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。
23.根據權利要求19所述的系統，其中，所述線性光傳感器組包括至少兩個線性光傳感器，其中所述組中的各線性光傳感器採集的圖像被組合以形成與所述組中的單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。
24.根據權利要求23所述的系統，其中，通過將對應於所述細胞上基本相同位置的各圖像的像素值進行數位化組合來組合所述各圖像。
25.根據權利要求23所述的系統，其中，通過時間延遲積分來組合所述各圖像。
26.一種用於執行細胞儀功能的系統，所述系統包括掃描區域，所述掃描區域被光源照射；線性光傳感器組，所述線性光傳感器組包括至少一個線性光傳感器；以及光學系統，所述光學系統用於將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到所述線性光傳感器組；其中，當細胞被輸送通過所述掃描區域並被所述光源照射時，所述系統重複讀取落在所述線性光傳感器組上的光；其中，所述系統能夠配置成使得在第一實驗期間創建第一圖像，所述第一圖像在對應於所述線性光傳感器組的長度的方向上具有第一數量的像素；在第二實驗期間創建第二圖像，所述第二圖像在對應於所述線性光傳感器組的長度的方向上具有第二數量的像素，所述第二數量的像素少於所述第一數量的像素。
27.根據權利要求沈所述的系統，其中，所述線性光傳感器組包括至少兩個線性光傳感器。
28.根據權利要求沈所述的系統，其中，通過選取少於來自所述線性光傳感器組中全部像素的像素來降低所述第二圖像的像素數量。
29.根據權利要求沈所述的系統，其中，通過對來自所述線性光傳感器組中的部分或全部像素進行重新分級來降低所述第二圖像的像素數量。
30.根據權利要求沈所述的系統，其中，對落在特定線性光傳感器上的光的每一次讀取產生單個落在所述特定傳感器上的光的量的數值表示。
31.一種用於產生橢圓形照射場的系統，所述系統包括雷射器，所述雷射器產生光束；柱面透鏡，所述柱面透鏡用於接收所述光束並使所述光束僅沿著第一軸線會聚；物鏡，所述物鏡是無限遠校正光學系統的一部分，所述物鏡用於接收在所述柱面透鏡之後的所述光束，並使所述光束沿著與所述第一軸線正交的第二軸線會聚。
32.根據權利要求31所述的系統，還包括位於所述柱面透鏡和所述物鏡之間的波長選擇鏡。
33.根據權利要求31所述的系統，其中，所述物鏡與所述柱面透鏡間隔開一定的距離， 所述距離小於所述柱面透鏡的焦距。
34.根據權利要求31所述的系統，其中，所述物鏡與所述柱面透鏡間隔開一定的距離， 所述距離大於所述柱面透鏡的焦距。
35.根據權利要求31所述的系統，其中，所述光束在離開所述物鏡時在所述第一軸線方向上是發散的。
36.根據權利要求31所述的系統，其中，所述光束在離開所述物鏡時在所述第一軸線方向上是會聚的。
37.一種用於執行細胞儀功能的方法，所述方法包括使用光源照射掃描區域的橢圓形場，其中，照射所述橢圓形場還包括使用光成形元件將來自所述光源的光集中到所述橢圓形場上；使用光學系統將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到線性光傳感器上；以及當細胞被輸送通過所述掃描區域並被所述光源照射時，重複讀取落在所述線性傳感器上的光。
38.根據權利要求37所述的方法，還包括使落在所述線性光傳感器上的光通過位於所述線性光傳感器附近的狹縫孔，以使所述系統執行半共焦成像。
39.一種用於執行細胞儀功能的方法，所述方法包括使用光源照射掃描區域；使用光學系統將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少兩個平行的線性光傳感器上；以及當細胞被輸送通過所述掃描區域並被所述光源照射時，重複讀取落在所述兩個平行線性光傳感器上的光。
40.根據權利要求39所述的系統，還包括將各線性光傳感器採集到的圖像進行組合以形成與單個線性光傳感器採集的圖像相比具有改進的信噪比特性的圖像。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，對各圖像進行組合還包括將對應於所述細胞上基本相同位置的各圖像的像素值進行數位化組合。
42.根據權利要求40所述的方法，其中，對各圖像進行組合還包括使用時間延遲積分來組合所述各圖像。
43.根據權利要求39所述的方法，其中，所述光源產生包括至少在第一和第二波長帶的光的照射，所述方法還包括使用所述光學系統將從所述細胞發射的在第三波長帶的光主要導向所述兩個平行的光傳感器的其中一個，以及使用所述光學系統將從所述細胞發射的在第四波長帶的光主要導向所述兩個平行的光傳感器中的另一個。
44.根據權利要求39所述的方法，還包括使用所述光學系統將所述掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少兩組平行的線性光傳感器上，每一組包括至少兩個線性光傳感器。
全文摘要
一種用於使用線掃描傳感器執行高速、高解析度成像細胞儀功能的系統。待特徵化的細胞被輸送通過掃描區域。光學系統將掃描區域的一部分的圖像聚焦到至少一個線性光傳感器，當細胞被輸送通過掃描區域時，重複讀取落在傳感器上的光。所述系統可以直接對細胞成像，或者可以激發細胞中的螢光，使由於螢光輻射而從細胞發射出的光成像。所述系統可以在掃描區域提供一個窄帶的照射。所述系統可以包括能夠實現同時多色螢光成像細胞儀的各種濾光器和成像光學元件。可以提供多個線性傳感器，可以將各傳感器採集的圖像進行組合，以構造具有改進的信噪比特性的圖像。
文檔編號G01N21/00GK102439416SQ201080021662
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月18日 優先權日2009年3月20日
發明者保羅·帕特, 衡欣 申請人:伯樂實驗室有限公司